Summary
La surface oculaire normale exposée est constituée de cornée et de conjonctive. Les cellules épithéliales, les cellules caliciformes et les cellules immunitaires sont présentes dans la conjonctive. Ici, une technique non invasive de cytologie d'impression est décrite en utilisant un dispositif de cytologie d'impression et une cytométrie de flux pour analyser les cellules immunitaires dans la conjonctive.
Abstract
Traditionnellement, la cytologie de surface oculaire est étudiée avec des techniques telles que la technologie des spatules et la technologie de la brosse. Le problème avec ces techniques est qu'elles peuvent induire des lésions traumatiques à la surface de l'œil, qui peuvent progresser vers les cicatrices, la déformation des paupières, la carence en cellules souches limbales et, dans certains cas, causer un grand inconfort au sujet. Pour éviter ces problèmes cliniques, la cytologie d'impression (IC) a été développée pour diagnostiquer une maladie des yeux secs et plus tard une néoplasie, une maladie atopique, une kératoconjonctivite verte et une kératoconjonctivite sicca. Généralement, les cliniciens coupent manuellement les papiers filtrants dans les formes requises et les appliquent à la surface oculaire. Ici, nous décrivons comment effectuer l'IC à l'aide d'un dispositif médical disponible dans le commerce. Cette technique est expliquée ici, suivie d'un immunophénotypage par cytométrie de flux. Cette technique nécessite moins de manutention manuelle et cause moins de blessures à la surface oculaire.
Introduction
La cytologie d'impression (IC) a d'abord été réalisée en 1977 par Thatcher et al . 1 . Ils ont utilisé un disque d'impression plastique pour collecter les cellules conjonctivales des patients au lieu d'autres techniques disponibles à ce moment-là, telles que le raclage, le tamponnage ou le pipetage 1 . La technique actuelle de l'IC utilise un papier filtre absorbant 2 pour imprimer la conjonctive bulbeuse et palpebrale et collecter la couche la plus superficielle des cellules conjonctivales. Ces cellules, ayant atteint leur stade final de différenciation, se répandent continuellement dans les larmes 3 . Trois cellules majeures de cellules se trouvent dans les spécimens de CI: cellules épithéliales 4 , cellules caliciformes 3 , 5 et tissu lymphoïde associé aux muqueuses, à savoir des cellules T effectrices associées à l' épithélium ou des cellules dendritiques 6 . Cellules de surface oculaire dans IC samLes analyses peuvent être analysées par microscopie, immunotransbrantation et réaction en chaîne par polymérase en transcriptase inverse (RT-PCR) 7 . La cytométrie de flux a récemment été utilisée pour analyser les cellules immunitaires collectées en grattant la membrane IC 8 . Fait intéressant, IC 6 , 9 a été utilisé pour évaluer de nombreuses maladies de la surface oculaire, y compris la keratoconjonctivite sicca, la carence en vitamine A, la pemphigoïde cicatricielle, la maladie atopique, la kératoconjonctivite limbique supérieure, la kératoconjonctivite vernal et la métaplasie squameuse épithéliale. IC a également été utilisé pour évaluer l'impact du port de lentilles de contact, détecter les microbes de surface oculaire et tester l'efficacité thérapeutique et la tolérance des interventions thérapeutiques dans les études longitudinales 10 , 11 , 12 .
Le dispositif médical (EyePrim) est pris en charge par un type de polyLa membrane d'éthersulfone (PES) de 0,2 μm, validée pour la technique de la cytologie d'empreinte oculaire avec cytométrie de flux (OSIC-flow) et ouvre des possibilités d'échantillonnage longitudinal pour surveiller la progression de la maladie et la réponse au traitement ( p . Ex . Analyse des leucocytes intra-épithéliaux définis comme des marqueurs putatifs de la maladie pour une fibrose conjonctivale progressive dans la pemphigoïde des muqueuses) 13 . Les premiers chercheurs ont utilisé des filtres PES autoclavés qui nécessitaient une impression manuelle. En conséquence, le rendement était variable et dépendait de l'utilisateur. L'avantage de ce dispositif médical est la facilité d'utilisation, la pression standardisée (Pa ou N / m 2 ), et permet la répétabilité, la reproductibilité et la récupération cellulaire cohérente. Cette technique est utile dans une clinique ambulatoire car elle n'est pas chirurgicale, facile à réaliser et rapide. Il s'agit d'un dispositif médical de classe I (stérile) selon la directive 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Cela nécessite seulementS anesthésie topique pendant la procédure, ce qui assure le maintien de l'intégrité de la surface oculaire. Après IC, les cellules peuvent être traitées immédiatement pour la cytométrie en flux. En outre, il est possible pour les techniciens non-ophtalmologiques et les infirmières d'être formés pour échantillonner la surface oculaire.
Malgré l'amélioration de l'IC sur d'autres techniques, plusieurs défis demeurent. Par exemple, il peut y avoir des variations en raison de la zone de l'échantillonnage et des différences régionales dans la conjonctive bulbaire en fonction de la position de l'IC. Une autre source de variation est due à l'application de différentes quantités de pression pendant l'IC. D'autres problèmes méthodologiques impliquent la normalisation du traitement cellulaire: ceux-ci impliquent une durée et une méthode de fixation, ainsi que les conditions de stockage possible, ce qui peut avoir une incidence sur la stabilité du matériau échantillonné.
L'objectif global de cette technique est de développer une méthode d'isolement des échantillons d'empreintes oculaires thaT est facile à utiliser, non invasif et peut être appliqué à la caractérisation immunologique des échantillons cliniques.
Protocol
Tous les échantillons oculaires utilisés dans cette étude ont été recueillis dans la Clinique des yeux secs du Centre national des yeux de Singapour, approuvé par SingHealth Central Centralized Institutional Review Board et le Nanyang Technological University Institutional Review Board, à Singapour.
NOTE: Les sujets ont subi des tests cliniques pour évaluer l'étendue de l'inflammation et la gravité du dysfonctionnement de la larme avant l'IC. Les tests cliniques comprenaient le temps de rupture non invasif des larves (NI-TBUT) 14 et la rougeur conjonctivale (hyperémie) 15 , 16 évaluées avec un instrument de diagnostic, le test de Schirmer 17 , le questionnaire standard de l'évaluation du patient sur la sécheresse des yeux (SPEED) 18 et la cornée Coloration 19 .
1. Collecte d'échantillons oculaires par IC
- Après détermination de l'état clinique, anesthésierLes yeux du participant en appliquant 1 à 2 gouttes d'anesthésie topique, chlorhydrate de proparacaïne, à la conjonctive bulbaire supérieure et au fornix inférieur. Attendez pendant 4 à 5 minutes pour que la sensation de pointe de l'anesthésie soit éteinte.
- Recueillir des échantillons de la conjonctive bulbaire nasale et temporelle avec deux dispositifs de cytologie d'impression.
REMARQUE: Un appareil est utilisé pour la collecte de deux échantillons d'impression. Ici, deux dispositifs ont été utilisés pour la collecte de quatre membranes d'impression.- Positionnez le dispositif de cytologie d'impression tangentiellement sur la conjonctive. Appuyez doucement sur le bouton-poussoir et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 s.
REMARQUE: L'appareil est livré avec la membrane. La pression est relâchée automatiquement après avoir poussé le bouton. Il ne faut que quelques secondes pour libérer la pression et retirer l'appareil.
- Positionnez le dispositif de cytologie d'impression tangentiellement sur la conjonctive. Appuyez doucement sur le bouton-poussoir et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 s.
- Libérer la membrane dans un tube de microcentrifugeuse contenant 1 mL de milieu de culture (milieu de l'Institut Memorial Roswell Park (RPMI) + 10% de sérum bovin fœtal(FBS) + 1% de pénicilline-streptomycine (Pen Strep)) par un scalpel.
- Isoler les cellules de la membrane de l'appareil par un raclage continu pendant environ 1 min avec une pointe de pipette de 10 μL.
REMARQUE: Le raclage est terminé lorsque la surface de la membrane devient inégale. Les nombres de cellules de chaque membrane sont variables (100 à 500 cellules / membrane). Traiter les échantillons dans les 2 à 3 heures de la collecte.
2. Immunophénotypes cellulaires par cytométrie de flux
- Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 min à température ambiante pour enlever le support. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 50 μL de tampon de coloration par cytométrie en flux (solution salée tamponnée au phosphate (PBS) + 0,05% d'albumine de sérum bovin (BSA)).
- Tachez les cellules avec un panneau d'anticorps ( p . Ex. , CD3 brillant violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoérythrine (PE) -A, CD45RO PE-cyanine 7 (PE- Cy7) -A, et la marque live / dead cell 7-ADD) à température ambiante pendant 20 à 30 minutes dans lefoncé. Utiliser des anticorps directement à partir du stock selon le protocole du fabricant.
NOTE: Pour la concentration d'anticorps, utilisez 2,5 μL de CD3-BV510, 1,25 μL de CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD et 10 μL de CCR7-PE. Utiliser des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) pour titrer les différentes concentrations d'anticorps. Pour le titrage, prenez la concentration d'anticorps mentionnée dans le protocole du fabricant et utilisez la moitié et le quart de la concentration recommandée. Utilisez la concentration minimale d'anticorps pour éviter les retombées sur d'autres canaux de fluorochrome. Des signaux clairs ont été observés avec les concentrations d'anticorps mentionnées. La compensation a été effectuée en testant les PBMC initialement selon le protocole mentionné dans Williams et al . 20 Pour les tests, les PBMC ont été incubées avec le même ensemble d'anticorps utilisés ici et compensées par la comparaison de taches d'anticorps simples et multiples. - Après la période d'incubationOd, ajouter 1 mL de tampon de coloration au tube, bien mélanger et centrifuger à 450 xg pendant 5 minutes à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon de coloration.
- Exécutez des échantillons sur une machine de cytométrie en flux.
- Avant d'acquérir les données, calibrez les tensions du canal de cytomètre de flux avec des perles de configuration et de suivi du cytomètre (CS & T) pour normaliser l'acquisition de données à différents jours selon les instructions du fabricant.
- Ouvrez le logiciel de collecte de données de cytométrie de flux, cliquez sur le bouton "Configurer et QC", choisissez le numéro de lot CSA et CS, chargez les perles, puis cliquez sur le bouton "Démarrer".
- Remise en suspension des cellules en tapotant doucement le tube avant de charger les échantillons sur la machine. Ouvrez le logiciel de collecte de données et cliquez sur "Aperçu". Lorsque le taux de seuil est stable, cliquez sur "Acquérir". Surveillez le niveau de l'échantillon et cliquez sur «Arrêter» lorsque les échantillons sont épuisés.
REMARQUE: Acquérir 10 000 événements par échantillon. Après avoir acheté 10 000 événements, générez un tracé de points SSC-A et FSC-A dans la feuille de calcul.- Cliquez sur le bouton "Polygon Gate" et tracez une porte (c'est P1) sur tous les événements avec une valeur FSC-A> 5 x 10 4 pour exclure les débris. Cliquez sur le bouton "Créer un tracé de points" pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris sur le point, choisissez "Propriétés" pour ouvrir la fenêtre "Éditeur de tableaux", puis choisissez "P1". Cliquez sur le FSC-A sur l'axe des x du tracé de points P1, modifiez-le sur CD3-BV510. Dessinez une '' Porte Polygone '' pour choisir la population CD3 + et nommez-la '' P2 ''.
- Cliquez sur le bouton "Créer un tracé de points" pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris, choisissez "Propriétés" pour ouvrir la fenêtre "Éditeur de plots". Cliquez sur le FSC-A sur l'axe des x du diagramme de points P2 et changez-le en 7-AAD. Dessinez un '' Polygon Gate '' pour 7-AAD - population et choisissez '' P3 ''. P3 est ici CD3 +Cellules vivantes.
- Cliquez sur le bouton "Créer un tracé de points" pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris, choisissez "Propriétés" pour ouvrir la fenêtre "Éditeur de plots". Cliquez sur le CD3-BV510 sur l'axe des x et CD4-APCH7 sur l'axe des y de la trame de points P3. Dessinez des rectangles Gates sur les côtés supérieur et inférieur du quadrant et choisissez '' P4 '' et '' P5 '', respectivement. P4 est en direct CD3 + CD4 + et P5 est en direct CD3 + CD4 - cellules T.
- Cliquez sur le bouton "Créer un tracé de points" pour générer un nouveau tracé de points, cliquez avec le bouton droit de la souris, choisissez "Propriétés" pour ouvrir la fenêtre "Éditeur de plots". Cliquez sur le CD45RO PE-Cy7 sur l'axe des abscisses et CCR7-PE sur l'axe y des parcelles P4 et P5. Dessinez '' Quad Gate '' sur ce tracé de points.
REMARQUE: le côté gauche supérieur, le côté droit supérieur, le côté inférieur droit et le côté gauche inférieur sont ici naïfs, mémoire centrale (T CM ), eLes cellules T de mémoire ffectorale (T EM ), à mémoire différentielle différenciée (T EMRA ), respectivement.
- Avant d'acquérir les données, calibrez les tensions du canal de cytomètre de flux avec des perles de configuration et de suivi du cytomètre (CS & T) pour normaliser l'acquisition de données à différents jours selon les instructions du fabricant.
Representative Results
IC par ce dispositif clinique nous a permis d'isoler les cellules immunitaires de surface oculaire tout en conservant la surface oculaire intacte. La figure 1 décrit comment l'IC a été effectuée. Les différents sites de l'oeil d'où ont été recueillis les échantillons sont marqués. La figure 2 montre le résultat représentatif de la cytométrie de flux recueillie à partir de 10 témoins sains. Pour le gating, utilisez SSC et 7-AAD pour distinguer entre les cellules vivantes et les cellules mortes. Les cellules 7-AAD sont identifiées comme des cellules vivantes. Ces cellules vivantes sont encore caractérisées par des marqueurs CD3 + et CD4 + . En outre, les populations CD4 + et CD4 se caractérisent chacune par Naïve, T EM , T CM et T EMRA avec les marqueurs CCR7 et CD45RO. Parmi les cellules T CD3 +, les cellules T de mémoire effectorale prédominent dans la surface oculaire humaine. Dans l'ancien eXperiments, il a également été montré que les cellules de mémoire CD8 + sont les populations principales dans les cellules T épithéliales conjonctivales chez les personnes en bonne santé 20 . La figure 3 montre que les cellules T de mémoire effectorale CD4 + et CD8 + (T EM et T EMRA ) sont le sous-ensemble majeur de la surface oculaire humaine dans 10 contrôles sains étudiés. Chaque population mentionnée dans la figure est notifiée avec son marqueur phénotype et noms (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Les nombres en rouge indiquent le pourcentage de la population. Les données de cette figure sont représentées par la moyenne ± SEM
Figure 1: Collecte d'échantillons IC à partir de la surface oculaire par le dispositif de cytologie d'impression. Les échantillons ont été prélevés à partir de l'ampoule temporelleAr région comme indiqué.
Figure 2: Dot Plot Graph utilisant la cytométrie de flux. Les cellules Live 7-AAD ont été sélectionnées. Les cellules CD3 + ont d'abord été fermées, puis cette population a été classée dans les sous - groupes CD4 + et CD4. Les proportions des sous-ensembles naïfs (CCR7 + CD45RO - ), mémoire centrale (CCR7 + CD45RO + ) et effecteur (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) ont été déterminées à l'aide des marqueurs CCR7 et CD45RO. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
FFigure 3: Sous-types de cellules immunitaires dans les cellules T CD4 + et CD8 + de surface oculaire humaine saine. Répartition des sous-ensembles conjonctivaux CD4 + et CD8 + naïfs, mémoire centrale (T CM ) et effecteur (T EM et T EMRA ) dans des contrôles humains sains; Chaque point de données représente une moyenne individuelle séparée ± SEM montrée. Le pourcentage de la population est marqué comme rouge au-dessous du nom de chacune des populations. Le pourcentage total de la population est de 98%, car la population CD4 + T EMRA n'était pas incluse dans le diagramme de dispersion mentionné (modifié par Bose et al., 21 ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Il s'agit d'une technique facile, rapide et moins invasive qui peut être utilisée dans les cliniques ambulatoires pour un profil immunitaire relativement rapide contrairement aux techniques classiques comme le grattage, le tampon, le pipetage ou le papier filtre absorbant 1 , 2 . Une variante de cette technique est déjà utilisée dans les paramètres de recherche 22 . L'application future de la méthodologie proposée est la stratification des patients dans les essais cliniques avec des maladies oculaires, en particulier ceux nécessitant un immunophénotypage.
Un défi majeur avec cette technique est le nombre relativement peu de cellules immunitaires récupérées après la collecte et le raclage des empreintes. Le nombre total de lymphocytes T CD3 + récupérés à partir de quatre impressions par individu variait de ~ 500 à 1000 cellules. Les échantillons oculaires ont été lavés avant l'analyse de cytométrie en flux pendant un nombre minimal de fois pour éviter une perte supplémentaire de cellulesS. Les étapes et les défis critiques qui subsistent dans le protocole sont la collecte efficace d'échantillons oculaires et le raclage correct de la membrane pour atteindre un nombre de cellules plus élevé. Néanmoins, il est peu probable que cette limitation entraîne un biais vers un phénotype immunitaire spécifique. Le dépannage effectué ici pour maximiser le rendement des cellules était de réduire le nombre d'étapes de lavage après et avant l'incubation des anticorps.
Il existe d'autres limitations à l'utilisation de l'IC. Chez les patients atteints de surface oculaire gravement kératinisée ou fibrosée, comme dans le syndrome de Steven Johnson, le rendement cellulaire peut être encore inférieur à celui de cette étude. La proportion de cellules immunitaires peut changer si les échantillons sont stockés au lieu d'analyser le même jour. Il est difficile de prédire si certains types de cellules sont plus résistants au stockage que d'autres. Des études antérieures ont rapporté des niveaux élevés d'expression de HLA-DR dans les cellules épithéliales conjonctivales 23 , donc ce serait interAfin d'évaluer la corrélation entre HLA-DR et les niveaux de cellules immunitaires spécifiques. Les cellules immunitaires peuvent également être associées au niveau d'expression des chimiokines. Ces questions devraient être abordées dans les études futures.
Disclosures
Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier Nandini Nallappan et Sharon Yeo d'avoir aidé aux étapes techniques. L'étude a été financée par une Subvention de démarrage à KGC de l'École de médecine Lee Kong Chian, de l'Université technologique de Nanyang et d'un Prix principal des scientifiques cliniciens du Conseil national de recherches médicales (NMRC) du Ministère de la Santé de Singapour à LT (NMRC / CSA / 045/2012) et par une subvention du NMRC et administrée par le Centre national d'innovation en santé à KGC et LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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