Summary
La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.
Abstract
Tradizionalmente, la citologia di superficie oculare viene studiata con tecniche come la tecnica della spatola e la tecnologia a spazzola. Il problema con queste tecniche è che possono indurre lesioni traumatiche sulla superficie dell'occhio, che possono progredire per la cicatrice, la deformità delle palpebre, la carenza di cellule staminali limbali e in alcuni casi causare grande disagio al soggetto. Per evitare questi problemi clinici, è stata sviluppata la citologia di impronta (IC) per diagnosticare la malattia degli occhi asciutti e successivamente la neoplasia, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite vera e la keratoconjunctivitis sicca. Tipicamente i medici tagliano manualmente i filtri nelle forme richieste e applicarle alla superficie oculare. Qui descriviamo come eseguire IC utilizzando un dispositivo medico disponibile in commercio. Qui viene spiegata questa tecnica seguita da immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso. Questa tecnica richiede meno movimentazione manuale e provoca minori lesioni alla superficie oculare.
Introduction
La citologia di impressione (IC) è stata eseguita per la prima volta nel 1977 da Thatcher et al . Hanno usato un disco di impressione in plastica per raccogliere le cellule congiuntivali dai pazienti anziché altre tecniche disponibili in quel momento come raschiatura, svuotamento o pipettatura 1 . La tecnica attuale di IC utilizza una carta filtrante assorbente 2 per imprimere la bulbar e la congiuntiva palpebrale e raccogliere lo strato superficiale delle cellule congiuntivali. Queste cellule, dopo aver raggiunto la loro fase finale di differenziazione, vengono continuamente sparse in lacrime 3 . Tre principali popolazioni di cellule sono presenti nei campioni IC: cellule epiteliali 4 , cellule calde 3 , 5 e tessuto linfoidale associato alla mucosa, ovvero cellule T efficaci associate all'epitelio o cellule dendritiche 6 . Cellule di superficie oculari in IC samPossono essere analizzati mediante microscopia, reazione a catena di polimerasi di polimerasi a reazione inversa-transcriptasi (RT-PCR) 7 . La citometria a flusso è stata recentemente usata per analizzare le cellule immunitarie raccolte raschiando la membrana IC 8 . È interessante notare che IC 6 , 9 è stato usato per valutare molte malattie della superficie oculare, tra cui la cheratoconjunctivitis sicca, la carenza di vitamina A, la pemfigoide cicatrici, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite limbica superiore, la cheratoconjunctivite viverna e la metaplasia squamosa epiteliale. IC è stato utilizzato anche per valutare l'impatto delle lenti a contatto usurate, rilevare microbi superficiali oculari e verificare l'efficacia terapeutica e la tolleranza degli interventi terapeutici negli studi longitudinali 10 , 11 , 12 .
Il dispositivo medico (EyePrim) è supportato da un tipo di poliEterosolfone (PES) membrana da 0,2 μm, precedentemente convalidata per la tecnica della citometria oculare con citometria a flusso (flusso OSIC) e apre opportunità di utilizzare campionamenti longitudinali per monitorare la progressione della malattia e la risposta al trattamento ( ad es . Analisi dei leucociti intraepiteliali definiti come marker di malattia supposto per la fibrosi progressiva congiuntivale nella pemfigoide della membrana mucosa) 13 . I primi ricercatori hanno utilizzato filtri PES autoclavati che richiedevano l'impressione manuale. Di conseguenza, la resa era variabile e dipendente dall'utente. Il vantaggio di questo dispositivo medico è la facilità d'uso, la pressione standardizzata (Pa o N / m 2 ) e consente ripetibilità, riproducibilità e recupero cellulare coerente. Questa tecnica è utile in una clinica out-patient perché non è chirurgica, è facile da eseguire e veloce. Si tratta di un dispositivo medico di classe I (sterile) secondo la direttiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Richiede soloL'anestesia topica durante la procedura, che garantisce la manutenzione dell'integrità della superficie oculare. Dopo IC, le cellule possono essere trattate immediatamente per la citometria a flusso. Inoltre, è possibile che i tecnici e gli infermieri non oftalmologici siano addestrati per campionare la superficie oculare.
Nonostante il miglioramento del CI rispetto ad altre tecniche, rimangono diverse sfide. Ad esempio, potrebbero esservi variazioni dovute all'area del campionamento e alle differenze regionali nella congiuntiva bulbar a seconda della posizione dell'IC. Un'altra fonte di variazione è dovuta all'applicazione di diverse quantità di pressione durante l'IC. Altre questioni metodologiche riguardano la standardizzazione dell'elaborazione delle cellule: queste riguardano la durata e il metodo di fissazione e le condizioni di possibili stoccaggi che possono influenzare la stabilità del materiale campionato.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di sviluppare un metodo di isolamento dei campioni di impressione oculare thaT è facile da usare, non invasivo e può essere applicato alla caratterizzazione immunologica dei campioni clinici.
Protocol
Tutti i campioni oculari utilizzati in questo studio sono stati raccolti dalla Clinica Occhio Dell'occhio presso il National Eye Center di Singapore approvato da SingHealth Centralized Institutional Review Board e dal Nanyang Technological University Institutional Review Board di Singapore.
NOTA: I soggetti sono stati sottoposti a test clinici per valutare l'entità dell'infiammazione e la gravità della disfunzione della lacrima prima dell'esecuzione dell'IC. I test clinici hanno incluso il tempo di rottura non strappante (NI-TBUT) 14 e l'arrossamento congiuntivale (iperemia) 15,16 valutati con uno strumento diagnostico, il test di Schirmer 17 , il questionario 18 di valutazione del paziente standard di secchezza d'occhio (SPEED) e corneali Colorazione 19 .
1. Raccolta di campioni Ocular da IC
- Dopo la determinazione dello stato clinico, anestetizzanoGli occhi del partecipante applicando 1 - 2 gocce di anestesia topica, proparacaina cloridrato, alla congiuntiva bulbar superiore e fornix inferiori. Attendere 4 - 5 minuti per la sensazione di stinging dell'anestesia da indossare.
- Raccogliere campioni sia dalla congiuntiva bulbare nasale che temporale con due dispositivi di citologia impressionante.
NOTA: Un dispositivo è utilizzato per la raccolta di due campioni di impressioni. Qui sono stati utilizzati due dispositivi per la raccolta di quattro membrane di impressione.- Posizionare il dispositivo della citologia di impressione tangenzialmente sulla congiuntiva. Premere delicatamente il pulsante e tenere premuto per 2 - 3 secondi.
NOTA: Il dispositivo viene fornito con la membrana. La pressione viene rilasciata automaticamente dopo aver premuto il pulsante. Ci vogliono pochi secondi per liberare la pressione e rimuovere il dispositivo.
- Posizionare il dispositivo della citologia di impressione tangenzialmente sulla congiuntiva. Premere delicatamente il pulsante e tenere premuto per 2 - 3 secondi.
- Rilasciare la membrana in un tubo di microcentrifuga contenente 1 mL di supporto di coltura (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% di siero fetale fetale(FBS) + 1% Penicillina-Streptomicina (Pen Strep)) da un bisturi.
- Isolare le cellule dalla membrana del dispositivo mediante strisciamento continuo per circa 1 min con una punta pipetta da 10 μL.
NOTA: il raschiamento è completato quando la superficie della membrana diventa irregolare. I numeri delle cellule da ogni membrana sono variabili (100-500 cellule / membrana). Processare i campioni entro 2 - 3 ore di raccolta.
2. Cellule di immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso
- Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il supporto. Resuspendere il pellet cellulare con 50 μl di buffer di colorazione citometrica (fosfato tamponato salina (PBS) + 0,05% albumina bovina serba (BSA)).
- Le cellule macchie con un pannello di anticorpi ( ad esempio , CD3 brillante violetta (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE-cianina 7 (PE- Cy7) -A, e segnale di cellule vivo / morte 7-ADD) a temperatura ambiente per 20 - 30 minbuio. Usare gli anticorpi direttamente dalla scorta secondo il protocollo del produttore.
NOTA: Per la concentrazione di anticorpi, utilizzare 2,5 μL di CD3-BV510, 1,25 μL di CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD e 10 μL di CCR7-PE. Utilizzare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per titolare le diverse concentrazioni degli anticorpi. Per la titolazione, prendere la concentrazione di anticorpi menzionata nel protocollo del produttore e utilizzare metà e un quarto della concentrazione raccomandata. Utilizzare la concentrazione minima di anticorpi per evitare lo spargimento di altri canali fluorochromici. Sono stati osservati segnali chiari con le citate concentrazioni di anticorpi. La compensazione è stata effettuata sperimentando inizialmente PBMC secondo il protocollo citato in Williams et al . 20 Per la sperimentazione, i PBMCs sono stati incubati con lo stesso insieme di anticorpi utilizzati qui e compensati confrontando singole e multiple anticorpi. - Dopo il periodo di incubazioneAggiungere 1 ml di tampone di colorazione al tubo, mescolare bene e centrifugare a 450 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Riposizionare le cellule in 200 μl di tampone di colorazione.
- Eseguire campioni su una macchina di citometria a flusso.
- Prima di acquisire i dati, calibrare le tensioni del canale del citometro di flusso con le perle di configurazione e tracciamento dei citometri (CS & T) per normalizzare l'acquisizione di dati in giorni diversi secondo le istruzioni del produttore.
- Aprire il software di raccolta dati di cytometria a flusso, fare clic sul pulsante "Imposta e QC", scegliere il numero corretto di lotto per CS & T, caricare le sfere e quindi fare clic sul pulsante "Avvio".
- Riposizionare le celle premendo delicatamente il tubo prima di caricare i campioni sulla macchina. Aprire il software di raccolta dati e fare clic su "Anteprima". Quando la soglia di soglia è stabile, fare clic su "Acquisisci". Monitorare il livello del campione e fare clic su "Stop" quando i campioni esauriscono.
NOTA: acquisire 10.000 eventi per campione. Dopo aver acquisito 10.000 eventi, generare un diagramma a punti SSC-A e FSC-A nel foglio di lavoro.- Fai clic sul pulsante "Polygon Gate" e disegna una porta (questo è P1) su tutti gli eventi con un valore FSC-A> 5 x 10 4 per escludere i detriti. Fai clic su "Crea un grafico a punti" per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli "Proprietà" per aprire la finestra "Plot Editor" e quindi scegliere "P1". Fai clic sul FSC-A sull'asse x del puntino P1, cambialo su CD3-BV510. Disegna un '' Polygon Gate '' per scegliere la popolazione CD3 + e denominarla '' P2 ''.
- Fai clic su "Crea un grafico a punti" per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli "Proprietà" per aprire la finestra "Plot Editor". Fai clic sul FSC-A sull'asse x della trama del puntino P2 e cambiala in 7-AAD. Disegna un '' Polygon Gate '' per 7-AAD - popolazione e scegli '' P3 ''. P3 qui è CD3 +Cellule vive.
- Fai clic su "Crea un grafico a punti" per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli "Proprietà" per aprire la finestra "Plot Editor". Fare clic sul CD3-BV510 sull'asse x e sul CD4-APCH7 sull'asse y del tracciato dot P3. Disegnare i Rectangle Gates sui lati superiore e inferiore del quadrante e scegliere rispettivamente "P4" e "P5". P4 è live CD3 + CD4 + e P5 è CD3 + CD4 - T live.
- Fai clic su "Crea un grafico a punti" per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli "Proprietà" per aprire la finestra "Plot Editor". Fare clic sul CD45RO PE-Cy7 sull'asse x e sul CCR7-PE sull'asse y di entrambe le tracce P4 e P5. Disegna "Quad Gate" su questa trama di punti.
NOTA: Il lato superiore destro, il lato destro superiore, il lato inferiore destro e i quadranti laterali inferiori a sinistra sono ingenui, la memoria centrale (T CM ), e(T EM ), rispettivamente, le cellule T EMRA (TEMRA) differenziate terminalmente.
- Prima di acquisire i dati, calibrare le tensioni del canale del citometro di flusso con le perle di configurazione e tracciamento dei citometri (CS & T) per normalizzare l'acquisizione di dati in giorni diversi secondo le istruzioni del produttore.
Representative Results
IC da questo dispositivo clinico ci ha permesso di isolare le cellule immunitarie della superficie oculare, mantenendo intatte la superficie oculare. La Figura 1 descrive come è stata eseguita l'IC. Sono contrassegnati i diversi siti dell'occhio da dove sono stati raccolti i campioni. La Figura 2 mostra il risultato rappresentativo della citometria a flusso prelevata da 10 controlli sani. Per il gating, utilizzare SSC e 7-AAD per distinguere tra cellule vive e morte. 7-AAD - le cellule sono identificate come cellule vive. Queste cellule vive sono ulteriormente caratterizzate da marker CD3 + e CD4 + . Inoltre, le popolazioni CD4 + e CD4 sono state ulteriormente caratterizzate come Naïve, TEM , T CM e T EMRA con i marcatori CCR7 e CD45RO. Tra le cellule CD3 + T, le cellule T della memoria efficace predominano nella superficie umana umana. In precedenza eXperimenti, è stato anche dimostrato che le cellule di memoria CD8 + sono le principali popolazioni nelle cellule T epiteliali congiuntivali tra le persone sane 20 . La Figura 3 mostra che le cellule T (T EM e T EMRA ) di memoria efficace CD4 + e CD8 + sono il principale sottoinsieme della superficie umana umana in 10 controlli sani studiati. Ogni popolazione menzionata nella figura viene notificata con il loro fenotipo di marcatori e con i nomi (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). I numeri in rosso indicano la percentuale della popolazione. I dati in questa figura sono rappresentati come media ± SEM
Figura 1: Raccolta di campioni IC dalla superficie dell'occhio dal dispositivo di citologia di impressione. I campioni sono stati raccolti dalla lampadina temporaleRegione dell'ar come mostrato.
Figura 2: Grafico a punti con la citometria di flusso. Sono state selezionate le cellule live 7-AAD. Le cellule CD3 + sono state prima gated, e questa popolazione è stata gated in CD4 + e CD4 - subsets. Le proporzioni di sottoinsiemi naïve (CCR7 + CD45RO - ), memoria centrale (CCR7 + CD45RO + ) e memoria degli effetti (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) sono stati determinati con l'aiuto di marcatori CCR7 e CD45RO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
FIgure 3: sottotipi di cellule immunitarie in cellule CD4 + e CD8 + T di sana superficie umana umana. Distribuzione di sottoinsiemi di CD4 + e CD8 + congiunti, memoria centrale (T CM ) e memoria degli effetti (T EM e T EMRA ) in controlli umani sani; Ogni punto dati rappresenta una media individuale separata ± SEM mostrata. La percentuale della popolazione è contrassegnata come rosso sotto il nome di ciascuna delle popolazioni. La percentuale totale della popolazione è del 98%, poiché la popolazione CD4 + T EMRA non è stata inclusa nella suddetta scatterplot (modificata da Bose et al. 21 ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Si tratta di una tecnica facile, veloce e meno invasiva che può essere utilizzata nelle cliniche di out-patient per una profilatura immunitaria relativamente veloce in contrasto con le tecniche convenzionali come il raschiamento, la tamponatura, la pipettazione o la carta filtrante assorbente 1 , 2 . Una variante di questa tecnica è già stata utilizzata nelle impostazioni di ricerca 22 . La futura applicazione della metodologia proposta è quella di stratificare pazienti in studi clinici con malattie oculari, in particolare quelle che richiedono l'immunofenotipizzazione.
Una grande sfida con questa tecnica è la relativamente poche cellule immunitarie recuperate dopo la raccolta e lo strappo delle impressioni. Il numero totale di CD3 + T cellule recuperate da quattro impressioni per singolo varia da ~ 500 a 1.000 cellule. I campioni oculari sono stati lavati prima dell'analisi della citometria di flusso per un numero minimo di volte per evitare ulteriori perdite di celluleS. I passi critici e le sfide che rimangono all'interno del protocollo sono una raccolta efficiente di campioni oculari e una corretta raschiatura della membrana per ottenere numeri superiori di cellule. Tuttavia, questa limitazione è improbabile che si propaghi verso un determinato fenotipo immunitario. La risoluzione dei problemi effettuata qui per massimizzare la resa delle cellule era ridurre il numero di passi di lavaggio dopo e prima dell'incubazione degli anticorpi.
Ci sono altre limitazioni per l'utilizzo dell'IC. Nei pazienti con superficie oculare gravemente cheratinizzata o fibrose, come nella sindrome di Steven Johnson, il rendimento cellulare può essere anche inferiore a quello di questo studio. La percentuale di cellule immunitarie può cambiare se i campioni vengono memorizzati anziché analizzati nello stesso giorno. È difficile prevedere se determinati tipi di cellule sono più resistenti all'archiviazione rispetto ad altri. Studi precedenti hanno riportato elevati livelli di espressione HLA-DR nelle cellule epiteliali congiuntivali 23 , pertanto sarebbe interPer valutare la correlazione tra HLA-DR e livelli di cellule immunitarie specifiche. Le cellule immunitarie possono anche essere associate al livello di espressione delle chemochine. Questi temi dovrebbero essere affrontati negli studi futuri.
Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero ringraziare Nandini Nallappan e Sharon Yeo per aver contribuito con i passi tecnici. Lo studio è stato finanziato da una concessione di start-up per KGC presso la Lee Kong Chian School of Medicine, l'Università Tecnologica di Nanyang e da un Senior Clinician Scientist Award del National Medical Research Council (NMRC) di Singapore Ministry of Health a LT (NMRC / CSA / 045/2012) e da una sovvenzione del NMRC e somministrata dal National Health Innovation Centre a KGC e LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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