Summary
Den synlige normale okulære overflaten består av hornhinne og konjunktiv. Epitelceller, bobberceller og immunceller er tilstede i bindekremen. Her beskrives en ikke-invasiv, teknikk for inntrykkscytologi ved bruk av en inntrykkscytologisk enhet og flytcytometri for å analysere immunceller i bindehinden.
Abstract
Tradisjonelt studeres okular overflatecytologi med teknikker som spatelteknologi og børsteknologi. Problemet med disse teknikkene er at de kan indusere traumatiske lesjoner på overflaten av øyet, noe som kan utvikle seg til arrdannelse, øyelokkdeformitet, lymfestamme mangel og i noen tilfeller forårsake stort ubehag for motivet. For å unngå disse kliniske problemene ble det utviklet trykkcykologi (IC) for å diagnostisere tørr øyesykdom og senere neoplasi, atopisk sykdom, vernal keratokonjunktivitt og keratokonjunktivitt sicca. Vanligvis kutter klinikere manuelt filterpapirene i nødvendige former og bruker disse til okularoverflaten. Her beskriver vi hvordan du utfører IC ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig medisinsk enhet. Denne teknikken er forklart her etterfulgt av immunfenotyping ved hjelp av flytcytometri. Denne teknikken krever mindre manuell håndtering og forårsaker mindre skade på okularoverflaten.
Introduction
Inntrykkscytologi (IC) ble først utført i 1977 av Thatcher et al. 1 . De brukte en plasttrykkskive til å samle konjunktivceller fra pasienter i stedet for andre teknikker som var tilgjengelige på den tiden, for eksempel skraping, sveising eller pipettering 1 . Den nåværende teknikken til IC bruker et absorberende filterpapir 2 for å avtrykke bulbar og palpebral conjunctiva og samle det mest overfladiske laget av konjunktivalceller. Disse cellene, som har nådd sin siste fase av differensiering, blir kontinuerlig kaste i tårer 3 . Tre store populasjoner av celler finnes i IC-eksempler: epitelceller 4 , bobellceller 3 , 5 og mukosalassosiert lymfoidvev, viz epitel-assosiert effektor-T-celler eller dendritiske celler 6 . Okulære overflateceller i IC samPles kan analyseres ved mikroskopi, immunblotting og revers-transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) 7 . Flowcytometri har nylig blitt brukt til å analysere immunceller samlet ved å skrabe IC-membranen 8 . Interessant nok har IC 6 , 9 blitt brukt til å evaluere mange okulære overflatesykdommer, inkludert keratokonjunktivitt sicca, vitamin A-mangel, cicatricial pemphigoid, atopisk sykdom, overlegen limbisk keratokonjunktivitt, vernal keratokonjunktivitt og epithelial squamous-metaplasi. IC har også blitt brukt til å evaluere virkningen av bruk av kontaktlinser, påvisning av okulære overflatemikroer, og testing av terapeutisk effekt og toleranse for terapeutiske inngrep i longitudinelle studier 10 , 11 , 12 .
Den medisinske enheten (EyePrim) støttes av en type polyEtersulfon (PES) 0,2 μm membran, som tidligere har blitt validert for teknikken med okulærtrykkscytologi med strømningscytometri (OSIC-strømning) og åpner opp muligheter for å bruke langsgående prøvetaking for å overvåke sykdomsprogresjon og respons på behandling ( f.eks . Detaljert Analyse av intraepiteliale leukocytter definert som formodede sykdom markører for progressiv conjunctival fibrose i slimhindepemifigoid) 13 . Tidlige forskere brukte autoklaverte PES-filtre som krevde manuell inntrykk. Som et resultat var utbyttet variabelt og brukeravhengig. Fordelen med denne medisinske enheten er brukervennlighet, standardisert trykk (Pa eller N / m 2 ), og muliggjør repeterbarhet, reproduserbarhet og konsistent cellulær gjenvinning. Denne teknikken er nyttig i en klinisk klinikk fordi den er ikke-kirurgisk, lett å utføre og rask. Dette er en medisinsk utstyr i klasse I (steril) i henhold til direktiv 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Det krever bareS lokal anestesi under prosedyren, som sikrer vedlikehold av integriteten til den okulære overflaten. Etter IC kan celler behandles umiddelbart for flytcytometri. Videre er det mulig for ikke-oftalmologi teknikere og sykepleiere å bli trent til å prøve okularoverflaten.
Til tross for forbedringen av IC over andre teknikker, forblir flere utfordringer. For eksempel kan det variere på grunn av området for prøvetaking og regionale forskjeller i bulbar conjunctiva avhengig av IC-posisjonen. En annen kilde til variasjon skyldes anvendelsen av forskjellige trykkbelastninger under IC. Andre metodologiske problemer involverer standardisering av celleprosessering: disse involverer varighet og fikseringsmetode, og betingelsene for mulig lagring, som kan påvirke stabiliteten til det samplede materialet.
Det overordnede målet med denne teknikken er å utvikle en metode for isolering av de okulære inntrykksprøver thaT er lett å bruke, ikke-invasiv og kan brukes på den immunologiske karakteriseringen av de kliniske prøvene.
Protocol
Alle okulære prøver som ble brukt i denne studien ble samlet fra Dry Eye Clinic ved Singapore National Eye Center godkjent av SingHealth Centralized Institutional Review Board og Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapore.
MERK: Emner gjennomgikk kliniske tester for å vurdere omfanget av betennelse og alvorlighetsgraden av tårefunksjon før IC ble utført. Kliniske tester inkluderte ikke-invasiv tårebruddstid (NI-TBUT) 14 og konjunktiv rødhet (hyperemi) 15 , 16 vurdert med et diagnostisk instrument, Schirmer test 17 , Standard pasientevaluering av øyeørhet (SPEED) spørreskjema 18 og hornhinnen Farging 19 .
1. Innsamling av okulære prøver av IC
- Etter bestemmelse av den kliniske statusen bedøvesDeltakerens øyne ved å bruke 1 - 2 dråper lokal anestesi, proparakainhydroklorid, til overlegen bulbar-konjunktiv og dårligere fornix. Vent i 4 - 5 minutter for aninghetens stikkende følelse å slites av.
- Samle prøver fra både nasal og temporal bulbar conjunctiva med to inntrykk cytologi enheter.
MERK: En enhet brukes til innsamling av to inntrykksprøver. Her ble to enheter brukt til innsamling av fire inntrykksmembraner.- Plasser inntrykkscytologienheten tangentielt på konjunktivene. Trykk på trykknappen forsiktig og hold den nede i 2 - 3 s.
MERK: Enheten kommer med membranen. Trykk slippes automatisk etter at du har trykket på knappen. Det tar bare få sekunder å frigjøre trykket og fjerne enheten.
- Plasser inntrykkscytologienheten tangentielt på konjunktivene. Trykk på trykknappen forsiktig og hold den nede i 2 - 3 s.
- Frigjør membranen i et mikrocentrifugerør inneholdende 1 ml kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% føtalt bovint serum(FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)) med en skalpell.
- Isoler celler fra membranen til enheten ved kontinuerlig skraping i rundt 1 min med en 10 μl pipettespiss.
MERK: Skrapingen er fullført når membranens overflate blir ujevn. Celle tallene fra hver membran er variabel (100-500 celler / membran). Behandle prøvene innen 2 - 3 timer i samlingen.
2. Immunofenotypiske celler ved hjelp av flytcytometri
- Sentrifuger cellene ved 400 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å fjerne mediet. Resuspender cellepellet med 50 μl flytcytometri-farvingsbuffer (fosfatbuffert saltvann (PBS) + 0,05% bovint serumalbumin (BSA)).
- Fargeceller med et panel av antistoffer ( f.eks . CD3 briljantfiolett (BV) 510 (UCHT1), CD4 allofykocyanin-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7-phycoerytrin (PE) -A, CD45RO PE-cyanin 7 (PE- Cy7) -A, og lev / død cellemerke 7-ADD) ved romtemperatur i 20 - 30 minutter imørk. Bruk antistoffer direkte fra lageret i henhold til produsentens protokoll.
MERK: For antistoffkonsentrasjonen, bruk 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD og 10 μl CCR7-PE. Bruk peronale blodmononukleære celler (PBMCs) for å titrere de forskjellige antistoffkonsentrasjoner. For titrering, ta antistoffkonsentrasjonen nevnt i produsentens protokoll og bruk halv og en fjerdedel av anbefalt konsentrasjon. Bruk den laveste konsentrasjonen av antistoffer for å unngå spillover til andre fluorokromkanaler. Klare signaler ble observert med de nevnte konsentrasjoner av antistoffer. Kompensasjonen ble utført ved å teste PBMCs i utgangspunktet i henhold til protokollen nevnt i Williams et al . 20 For testing ble PBMCer inkubert med det samme settet av antistoffer anvendt her og kompensert ved å sammenligne enkelt- og flertall antistoff flekker. - Etter inkuberingen periOd, tilsett 1 ml farvingsbuffer til røret, bland godt og sentrifuger ved 450 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender celler i 200 μl farvingsbuffer.
- Kjør prøver på en flytcytometri maskin.
- Før kalibreringen av dataene kalibreres strømningscytometerkanalspenningene med cytometeroppsett og sporing (CS & T) perler for å normalisere datainnsamlingen på forskjellige dager som produsentens instruksjoner.
- Åpne datasettingsprogrammet for strømningscytometri, klikk på "Sett opp og QC" -knappen, velg riktig CS & T-perle-nummer, last perlene, og klikk deretter på "Start" -knappen.
- Resuspender cellene ved å forsiktig tappe på røret før du legger prøver til maskinen. Åpne datainnsamlingsprogramvaren og klikk på "Forhåndsvisning". Når terskelhastigheten er stabil, klikker du på "Acquire". Overvåk prøvenivået og klikk "Stopp" når prøver går tom.
MERK: Oppkjøp 10.000 hendelser pr. Prøve. Etter å ha anskaffet 10.000 hendelser, generer du en SSC-A og FSC-A prikkplott i regnearket.- Klikk på "Polygon Gate" -knappen og tegne en gate (dette er P1) over alle hendelser med en FSC-A-verdi> 5 x 10 4 for å ekskludere rusk. Klikk på "Opprett prikkplott" -knappen for å generere en ny prikkplott, høyreklikk dot blot, velg "Properties" for å åpne "Plot Editor" -vinduet, og velg deretter "P1". Klikk FSC-A på x-aksen i P1 punktplot, skift den til CD3-BV510. Tegn en '' Polygon Gate '' for å velge CD3 + befolkningen og navnet den '' P2 ''.
- Klikk på "Opprett prikkplott" -knappen for å generere en ny prikkplott, høyreklikk dot blot, velg "Properties" for å åpne "Plot Editor" -vinduet. Klikk FSC-A på x-aksen i P2 punktplott og endre den til 7-AAD. Tegn en '' Polygon Gate '' for 7-AAD - befolkning og velg '' P3 ''. P3 her er CD3 +Levende celler.
- Klikk på "Opprett prikkplott" -knappen for å generere en ny prikkplott, høyreklikk dot blot, velg "Properties" for å åpne "Plot Editor" -vinduet. Klikk på CD3-BV510 på x-akse og CD4-APCH7 på y-aksen på P3-punktplottet. Tegn rektangelportene på øvre og nedre side av kvadranten og velg henholdsvis '' P4 '' og '' P5 ''. P4 er live CD3 + CD4 + og P5 er live CD3 + CD4 - T-celler.
- Klikk på "Opprett prikkplott" -knappen for å generere en ny prikkplott, høyreklikk dot blot, velg "Properties" for å åpne "Plot Editor" -vinduet. Klikk på CD45RO PE-Cy7 på x-aksen og CCR7-PE på y-aksen til både P4 og P5-plottene. Tegn '' Quad Gate '' på denne punktplottet.
MERK: Øvre venstre side, øvre høyre side, nedre høyre side og nedre venstre kvadranter her er naiv, sentralt minne (T CM ), eFfector memory (T EM ), henholdsvis terminalt differensiert effektorminne (T EMRA ) T-celler.
- Før kalibreringen av dataene kalibreres strømningscytometerkanalspenningene med cytometeroppsett og sporing (CS & T) perler for å normalisere datainnsamlingen på forskjellige dager som produsentens instruksjoner.
Representative Results
IC ved denne kliniske enheten tillot oss å isolere okulære overflateimmunceller mens den okulære overflaten holdes intakt. Figur 1 beskriver hvordan IC ble utført. De forskjellige stedene i øyet hvor prøvene ble samlet, er merket. Figur 2 viser representativt resultat av flytcytometri samlet inn fra 10 sunne kontroller. For gating, bruk SSC og 7-AAD å skille mellom levende og døde celler. 7-AAD - celler identifiseres som levende celler. Disse levende celler kjennetegnes videre av CD3 + og CD4 + markører. Videre ble CD4 + og CD4 - populasjonene ytterligere karakterisert som Naïve, T EM , T CM og T EMRA med CCR7- og CD45RO-markørene. Blant CD3 + T-celler dominerer effektorminne-T-celler i den menneskelige okulære overflate. I tidligere eXperiments, har det også blitt vist at CD8 + minnesceller er de viktigste populasjonene i konjunktivepithelial-T-cellene blant de friske individene 20 . Figur 3 viser at CD4 + og CD8 + effektorminne T-celler (T EM og T EMRA ) er hoveddelmengden i den menneskelige okulære overflate i 10 sunne kontrollerte studier. Hver populasjon nevnt i figuren blir varslet med deres markørfenotype og navn (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Tallene i rødt angir prosentandelen av befolkningen. Dataene i denne figuren er representert som gjennomsnittlig ± SEM
Figur 1: Samling av IC-prøver fra det okulære overflaten av Impression Cytology Device. Prøver ble samlet fra den tidlige pæreAr regionen som vist.
Figur 2: Dotplotgraf ved bruk av flytcytometri. Live 7-AAD - celler ble valgt. CD3 + -cellene ble først gated, og deretter ble denne populasjonen inngått i CD4 + og CD4 - delgrupper. Andelene av naiv (CCR7 + CD45RO - ), sentralminne (CCR7 + CD45RO + ) og effektorminne (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO-) delgrupper ble bestemt ved hjelp av CCR7 og CD45RO markører. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
FIgure 3: Immuncelle-undertyper i CD4 + og CD8 + T-celler med sunn menneskelig okulær overflate. Fordeling av konjunktiv CD4 + og CD8 + naivt, sentralminne (T CM ) og effektorminne (T EM og T EMRA ) undergrupper i sunne menneskelige kontroller; Hvert datapunkt representerer en separat individuell gjennomsnittlig ± SEM vist. Andelen av befolkningen er merket som rød under navnet på hver populasjon. Den totale andelen av befolkningen er 98%, fordi CD4 + T EMRA populasjonen ikke var inkludert i nevnte scatterplot (modifisert fra Bose et al. 21 ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Dette er en enkel, rask og mindre invasiv teknikk som kan brukes i klinikkene for utrolige pasienter for relativt rask immunprofilering i motsetning til konvensjonelle teknikker som skraping, sveising, pipettering eller absorberende filterpapir 1 , 2 . En variant av denne teknikken brukes allerede i forskningsinnstillinger 22 . Fremtidig anvendelse av den foreslåtte metoden er for pasientlagdeling i kliniske studier med okulære sykdommer, spesielt de som krever immunfenotyping.
En stor utfordring med denne teknikken er de relativt få immunceller som hentes etter innsamling og skraping. Totalt antall CD3 + T-celler gjenvunnet fra fire visninger per individ varierte fra ~ 500-1000 celler. De okulære prøver ble vasket før strømningscytometrianalysen i et minimalt antall ganger for å unngå ytterligere tap av celles. Kritiske skritt og utfordringer som forblir innenfor protokollen er effektiv samling av okulære prøver og riktig skraping av membranen for å oppnå høyere celle tall. Likevel er denne begrensningen lite sannsynlig å forstyrre en hvilken som helst spesifikk immunfænotype. Feilsøkingen som ble utført her for å maksimere utbyttet av celler, var å redusere antall vaskestrinn etter og før inkuberingen av antistoffer.
Det er andre begrensninger for bruk av IC. Hos pasienter med alvorlig keratinisert eller fibrosert okular overflate som i Steven Johnsons syndrom, kan det cellulære utbyttet være enda mindre enn det i denne studien. Andelen immunceller kan endres hvis prøvene lagres i stedet for analysert samme dag. Det er vanskelig å forutsi om visse celletyper er mer motstandsdyktige mot lagring enn andre. Tidligere studier har rapportert forhøyede nivåer av HLA-DR-ekspresjon i konjunktivalepitelcellene 23 , så det ville være interEsting å vurdere korrelasjonen mellom HLA-DR og nivåer av bestemte immunceller. Immunceller kan også være forbundet med uttrykksnivået av kjemokiner. Disse problemene bør tas opp i fremtidige studier.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Nandini Nallappan og Sharon Yeo for å hjelpe de tekniske trinnene. Studien ble finansiert av en Start-Up Grant til KGC fra Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University og av en Senior Clinician Scientist Award fra Singapore Ministry of Health National Medical Research Council (NMRC) til LT (NMRC / CSA / 045/2012) og ved et tilskudd fra NMRC og administrert av National Health Innovation Center til KGC og LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
