Summary
Este relatório descreve um método para induzir o olho seco autoimune experimental crônico em ratos Lewis através da imunização com uma emulsão de extrato da glândula lacrimal de rato, ovalbumina e adjuvante completo de Freund, seguido da injeção de extrato da glândula lacrimal e ovalbumina na subconjunctiva forniceal e glândulas lacrimais Seis semanas depois.
Abstract
A doença dos olhos secos é uma condição muito comum que causa morbidade e carga de saúde e diminui a qualidade de vida. Existe a necessidade de um modelo adequado de animal de olho seco para testar novas terapêuticas para tratar condições de olho seco autoimune. Este protocolo descreve um modelo de rato de olho seco autoimune crônico. Os ratos Lewis foram imunizados com uma emulsão contendo extrato da glândula lacrimal, ovalbumina e adjuvante completo de Freund. Uma segunda imunização com os mesmos antigénios em adjuvante incompleto de Freund foi administrada duas semanas depois. Estas imunizações foram administradas subcutaneamente na base da cauda. Para aumentar a resposta imune na superfície ocular e glândulas lacrimais, extracto de glândula lacrimal e ovalbumina foram injetados na subconjuntiva e nas glândulas lacrimais de fornice 6 semanas após a primeira imunização. Os ratos desenvolveram características de olho seco, incluindo redução da produção de lágrimas, diminuição da estabilidade do rasgo e aumento do dano da córnea. Imune proO arquivamento por citometria de fluxo mostrou uma preponderância de células T de memória efetora CD3 + no globo ocular.
Introduction
A doença dos olhos secos (DED) é uma doença multifatorial das lágrimas e da superfície ocular que resulta em sintomas de desconforto, distúrbios visuais e instabilidade do filme lacrimal, o que pode levar a danos na superfície ocular. É acompanhada por aumento da osmolaridade do filme lacrimal e pela inflamação da superfície ocular 1 . Os sintomas associados ao DED são queimados, picantes, grosseiros, sensação de corpo estranho, rasgamento, fadiga ocular e secura 2 , 3 . As duas principais causas de DED reduzem a produção de lágrimas pela glândula de secreção lacrimal e a evaporação excessiva do filme lacrimal 4 . Em pacientes com doenças auto-imunes, como a síndrome de Sjogren, o lúpus eritematoso sistêmico e o dano imune à artrite reumatóide às glândulas meibomianas, reduz a expressão de lipídios essenciais para a estabilidade do rasgo. Além disso, o dano imune à superfície ocular diminui a produçãoDe mucinas importantes para a humidificação da superfície. Juntos, esses processos causam cumulativamente o olho seco crônico 5 , 6 , 7 .
A substituição de lágrimas e a terapia anti-inflamatória são os principais pilares da terapia. No entanto, as terapias anti-inflamatórias atuais para DED ( ie, corticosteróides e ciclosporina) são amplamente imunossupressoras, levando a efeitos adversos graves 8 , 9 , 10 . Existe a necessidade de um modelo animal adequado para testar novos agentes imunomoduladores para tratar o olho seco autoimune.
Ratos com defeitos genéticos específicos 11 , 12 , 13 , camundongos que não possuem genes específicos 14 , 15 e camundongos transgênicos que sobreexpressam imunoregulatOs genes ory foram utilizados como modelos de olho seco autoimune 16 , 17 . Modelos animais autoimunes induzidos por antigénios também foram relatados em camundongos 18 , coelhos 19 e ratos 20 , 21 . Aqui, descrevemos um modelo induzido por antígeno de olho seco autoimune crônico. Este modelo é uma modificação de dois modelos anteriores; Um usou extratos de glândula lacrimal e o segundo usou um autoantígeno ( ou seja, klk1b22) das glândulas lacrimais 20 , 21 .
A doença foi induzida pela imunização subcutânea de ratos Lewis fêmeas de 6 a 8 semanas com ovalbumina, adjuvante completo de Freund e uma emulsão contendo extratos de glândulas lacrimais de ratos Sprague-Dawley ( Figura 1 ). Uma segunda imunização com o mesmo antigénio em adjuvante incompleto de Freund foiAdministrado duas semanas depois. Para recrutar células imunes específicas do antígeno para a glândula lacrimal e superfície ocular, a mistura de extrato da glândula lacrimal e ovalbumina (1 mg / mL) foi injetada na subconjuntiva do fornice e nas glândulas lacrimais na semana 6 a 7 ( Figura 1 ). Mais de 85% dos ratos desenvolveram características do olho seco 70 dias após a primeira imunização. Essas características incluem redução da produção de lágrimas ( Figura 2 ), aumento da coloração fluorescente da córnea ( Figura 3 ) e diminuição da estabilidade do rasgo ( Figura 4 ). O perfil imune das células T nos globos oculares de ratos normais por citometria de fluxo revela uma preponderância de células T de memória efetora CD3 + ( Figuras 5 e 6 ). Ratos com DED autoimune representam um aumento das células T de memória efetora CD3 + e uma diminuição correspondente nas células T de memória central naïve e central ( Figura 6
Protocol
Os animais foram tratados de acordo com as diretrizes institucionais e a Declaração do ARVO para o Uso de Animais na Pesquisa Oftálmica e Visão. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da SingHealth.
1. Preparação do extracto de glândula lacrimal
NOTA: Os ratos foram anestesiados com injeção intraperitoneal de cetamina (75 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). A anestesia adequada foi confirmada pela compressão dos pés e pelo aperto da cauda. O gel oftálmico foi aplicado aos olhos do rato para prevenir a secura após cada procedimento. Os ratos anestesiados foram colocados sob luzes infravermelhas distantes para manter os animais aquecidos até que eles se recuperassem completamente. Durante os procedimentos e o tempo de recuperação, os animais foram monitorados de perto pelos pesquisadores. Todos os materiais e ferramentas cirúrgicas foram estéreis antes da utilização. No final do experimento, os ratos foram sacrificados pela injeção intraperitoneal de pentobarbital (80 mg / kg).A eutanásia completa foi verificada pela falta de pulso cardíaco e sem reflexo intermitente ao tocar o globo ocular. Os ratos foram alojados em condições padrão: temperatura ambiente, 21-23 ° C; Umidade relativa, 30-70%; Ciclo luz-escuro, alternando 12 h (7 a 7 horas).
- Coloque os ratos Sprague-Dawley fêmeas eutanizados (faixa etária de 8 semanas a 16 semanas), com uma orelha contra a mesa e outra voltada para cima. Faça uma incisão de 10 mm superior - inferiormente sob a orelha exposta com um par de tesoura de mola. Remova a glândula lacrimal dissecando-a do tecido conjuntivo circundante e do duto de drenagem.
- Armazene as glândulas a -80 ° C até ser necessário. Descongelar as glândulas no gelo. Corte tão finamente quanto possível sobre gelo com tesoura. Adicionar 150 μL de PBS com 1x inibidor de protease por glândula lacrimal.
- Sonicate as amostras em gelo durante 5 min a 20 kHz com o sonicador ajustado a 10 s ligado, 10 s apagado a 30% de amplitude. Centrifugar o filhoAmostras geladas durante 20 minutos a 13.000 xg e 4 ° C.
- Pipetar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo. Alíquota o sobrenadante para tubos de 1,5 mL e guarde-os a -80 ° C. Meça a concentração de proteína com um ensaio de ácido bicinconinico 22 , de acordo com as instruções do fabricante.
2. Preparação de toxina de emulsão e tosse perus
- Emulsão
- Adicione 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra morto pelo calor em 10 mL de adjuvante completo de Freund contendo 1 mg / mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra e misture bem.
NOTA: O adjuvante completo completo de Freund contém 5 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. - Pesar a ovalbumina, dissolvê-la em PBS e preparar uma mistura de antigénio contendo 2 mg / mL de ovalbumina e 10 mg / mL de extrato da glândula lacrimal. Com o objetivo de um volume de injeção de 200 μL para cada animal, prepare uma mistura principal bSobre os números dos animais.
- Transfira o adjuvante de Freund incompleto ou o adjuvante de Freund completo para um tubo de 50 mL, garantindo que o volume de adjuvante para a mistura de antigénio esteja na proporção de 1: 1. Adicione a mistura de antígenos gota a gota ao adjuvante enquanto vortexa com a velocidade mais alta que não resulta em derramamento. Continue a agitar durante 5 minutos depois de todo o antígeno ter sido adicionado.
- Transfira a emulsão para uma seringa de 5 mL e ligue-a com outra seringa de 5 mL através de um conector de seringa. Empurre a emulsão de uma seringa para outra para misturá-la.
NOTA: A emulsão está pronta se uma única gota permanece como uma esfera quando colocada em água. Apenas deve ser utilizada emulsão ou emulsão preparada recentemente durante a noite a 4 ° C.
- Adicione 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra morto pelo calor em 10 mL de adjuvante completo de Freund contendo 1 mg / mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra e misture bem.
- Toxina pertussis
- Reconstitua 50 μg de toxina pertussis em 500 μL de água para se obter uma concentração final de 100 ng / μL. Vote no recipiente por 30 s para se certificar de que o tO oxin dissolve-se completamente.
NOTA: Não esterilize por filtração, pois isso irá resultar em perda de material. Não congele. Esta solução permanece ativa durante pelo menos 6 meses a 4 ° C. - Diluir 100 ng / μL de toxina pertussis para 3 ng / μL usando PBS. Transfira 100 μL da toxina de pertussis diluída para uma seringa de injecção Luer-lock de 1 mL com uma agulha de 27 G.
- Reconstitua 50 μg de toxina pertussis em 500 μL de água para se obter uma concentração final de 100 ng / μL. Vote no recipiente por 30 s para se certificar de que o tO oxin dissolve-se completamente.
3. Imunização dos ratos Lewis
- No dia 0, misture a emulsão algumas vezes. Distribua 200 μL da emulsão, que contém 1 mg de extrato da glândula lacrimal e 200 μg de ovalbumina em adjuvante completo de Freund, em seringas Luer-lock de 1 mL com agulhas 27G. Injete a emulsão subcutaneamente na base das caudas de rato sem anestesia.
NOTA: A cauda não precisa ser pré-aquecida antes da injeção. Cada rato é imunizado com 1 mg de extrato de glândula lacrimal e 200 μg de ovalbumina em engodo adjuvante completo de FreundH 500 μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. - No dia 14, injete 200 μL da emulsão, que contém 1 mg de extrato da glândula lacrimal e 200 μg de ovalbumina em adjuvante incompleto de Freund, da mesma forma que no dia 0. Injecte 300 ng de toxina pertussis em 100 μL de PBS por via intraperitoneal Por rato no mesmo dia.
4. Injeção da Mistura de Antigénio na Subconjunctiva Forniceal e Glândula Lacrimal para Recuperar Células Imunitárias específicas de Antigênio e Causar Inflamação Local
- Calcule a quantidade de ovalbumina e extrato da glândula lacrimal com base no número de ratos no experimento. Pesar a quantidade necessária de ovalbumina e combiná-la com o extracto de glândula lacrimal descongelado preparado no passo 1, fazendo solução de antígeno contendo 1 mg / mL de ovalbumina e 1 mg / mL de extrato de glândula lacrimal.
- Anestesiar os ratos com ketamina (75 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) por injeção intraperitoneal. Aperte o paraEs de ratos para garantir que a anestesia adequada tenha sido alcançada ( ou seja, nenhum movimento responsivo é observado após a pitada). Injetar 5 μL de antígeno na subconjuntiva de forniceal do olho. Injetar 20 μL de antígeno na glândula lacrimal.
5. Avaliação de características do olho seco
NOTA: Para as etapas 5.1-5.3, os ratos anestesiados devem ser mantidos suavemente por uma mão enluvada em uma posição vertical sobre uma superfície plana para evitar o movimento.
- Meça o volume da lágrima com rosca vermelha de fenol.
- Use um par de pinças para segurar o fio e outro para puxar a pálpebra inferior do rato. Coloque a rosca no canto proximal do fórnice inferior durante 1 min e depois remova a rosca.
NOTA: As lágrimas tornam a parte molhada da linha de cor vermelha. - Tire uma imagem do comprimento da parte molhada do fio ao lado de uma régua com marcas milimétricas. Meça o comprimento molhado até o décimo oFa milímetro usando um software de imagem ( por exemplo, ImageJ).
- Use um par de pinças para segurar o fio e outro para puxar a pálpebra inferior do rato. Coloque a rosca no canto proximal do fórnice inferior durante 1 min e depois remova a rosca.
- Medir a suavidade da córnea / lágrima.
- Coloque o rato sob um estereomicroscópio equipado com um iluminador de anel e uma câmera. Aplique 5 μL de solução salina na córnea do rato. Pisca passivamente movendo as pálpebras superiores e inferiores com dedos enluvados ~ 5 vezes para espalhar a solução salina.
- Focalize o iluminador do anel no meio da superfície da córnea com uma ampliação de 1,6x. Adquira imagens fotográficas após 10 s.
NOTA: O iluminador de anel projeta duas linhas circulares de imagens de pontos nas córneas do animal. O espaçamento regular dos pontos não distorcidos sugere uma camada lenta de córnea / lágrima.
- Medir o dano da córnea com coloração com fluoresceína.
- Adicione 2 μL de 0,2% de fluoresceína à córnea do rato. Abra e abra as lâminas do rato 3 vezes com um dedo enluvado para espalhar o corante de fluoresceína na superfície do olho.
- Adquira imagens sob o filtro azul de cobalto ( ou seja, ~ 400 nm) de um microscópio de imagem ocular com as luzes de fundo desligadas.
NOTA: As imagens foram posteriormente analisadas por um sistema de classificação modificado de publicações anteriores 23 . As imagens foram então analisadas por classificação subjetiva do número, área e intensidade das manchas verdes de 0 a 2, onde 0 indica a ausência, 1 indica coloração pontual de menos de 50 pontos e 2 indica coloração pontual de mais de 50 pontos.
- Eutanizar os ratos através da injeção intraperitoneal de pentobarbital (80 mg / kg). Remova as pálpebras superiores e inferiores usando uma tesoura. Corrige e prolapso os globos oculares, pressionando os tecidos perioculares com fórceps. Livre o globo cortando tOs músculos extraoculares, o nervo óptico e a conjuntiva forniceal.
- Corrija a posição do globo ocular do rato com fórceps e abra-o com uma incisão circunferencial ao longo do equador. Remova a lente e o vítreo. Coloque os globos oculares dissecados em tubos de 1,5 mL em gelo.
- Coletar as glândulas lacrimais, conforme descrito no passo 1.1. Transfira imediatamente os tecidos dissecados do globo ocular e as glândulas lacrimais para o laboratório para se preparar para análise de citometria de fluxo.
- Isolou as células imunes com métodos de digestão com colagenase e dispase II 24 , 25 . Proceda para usar citometria de fluxo para perfilar a subpopulação das células T nos tecidos do globo ocular 26 .
NOTA: O painel de anticorpos são: anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22), anti -CD62 PE (HRL1), FITC anti-CD44 (OX-50) e corante celular de viabilidade 7-AAD. Entre os CD45 + CD3
Representative Results
A Figura 1 ilustra o desenho da experiência. No dia 48 e no dia 70, as características clínicas dos olhos secos são avaliadas nos ratos imunizados. O volume de lágrima é representado pelo comprimento da parte molhada da linha vermelha de fenol. A Figura 2 mostra imagens representativas de fios de vermelho de fenol a partir de ratos de controle e DED. O comprimento dos fios vermelhos de fenol no grupo DED é menor que o grupo de controle, indicando menos volume de lágrimas.
Fluoresceína liga-se ao epitélio corneano danificado. Assim, o dano corneano é medido pela coloração fluorescente de córnea. As manchas de fluoresceína na superfície da córnea de ratos DED foram classificadas de 0 a 2 e comparadas com ratos de controle. Ratos com DED têm mais coloração com fluoresceína do que ratos controle ( Figura 3 ), sugerindo danos na córnea.
A suavidade da córneaEm DED e ratos de controle foi avaliada pelo iluminador de anel. Se a superfície da córnea é lisa, com alta estabilidade ao rasgo, a imagem do anel iluminador na superfície ocular é redonda e perfeita. A distorção da imagem indica uma suave lisura corneana e uma película lágrima instável. O grau de distorção do anel foi classificado de 0 a 2. Um nível de distorção do anel mais elevado foi observado no grupo DED ( Figura 4 ), indicando menos estabilidade a rasgo.
Os ratos são definidos como tendo olho seco quando pelo menos duas características clínicas do olho seco são anormais. Entre os 24 ratos imunizados, 21 ratos desenvolveram DED no dia 48. Os resultados foram consistentes quando avaliados no dia 70.
A análise de citometria de fluxo mostra que o subconjunto de células T predominante em tecidos normais de globo ocular de ratos são células T de memória efetora ( Figura 5 ). Nos globos oculares de ratos DED, ~ 70% do CD3+ Células T são células T de memória efetora, enquanto em ratos de controle, esse número é ~ 50%. Os globos oculares de ratos DED têm células T de memória efectoras significativamente maiores que as de ratos de controle ( Figura 6 ).
Figura 1: Esquema do Projeto Experimental. LG: glândula lacrimal; DED: doença ocular seca; CFA: completa o adjuvante de Freund; IFA: adjuvante incompleto de Freund. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rosca vermelha de fenol mede o volume de rasgo. O fio vermelho do fenol é colocado na esquina proximal de ambos os olhos do rato durante 1 min e é então removido. RepresentativE imagens do fio vermelho de fenol, juntamente com uma régua, de ambos os grupos controle e DED são mostrados. ImageJ foi usado para medir o comprimento da parte molhada dos fios vermelhos de fenol. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas do dano epitelial corneano medido por coloração com fluoresceína. Cada córnea de rato foi corada com 0,2% de fluoresceína durante 1 min e lavada com pelo menos 1 mL de solução salina. As imagens foram tomadas sob um microscópio de imagem ocular com luz azul de cobalto. A primeira coluna mostra imagens representativas de córneas de controle. A segunda coluna contém imagens representativas da coloração corneana de ratos com características de DED. Os pontos fluorescentes verdes indicam epitélio da córnea Eu dano. Todas as imagens foram produzidas na mesma escala de cores. A quantificação da coloração com fluoresceína foi realizada de acordo com a área e a densidade das manchas verdes. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas da córnea mostrando a reflexão do iluminador do anel. A suavidade da córnea / lágrima do rato foi medida por um iluminador de anel. O grau de distorção do anel nas imagens capturadas é uma medida da estabilidade relativa do lágrima. A coluna da esquerda mostra as imagens representativas em animais de controle, e a coluna da direita mostra imagens representativas após a indução de olho seco. Barra de escala = 1 mm.Ank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Dot Plots Derivados da Análise de Citometria de Fluxo. As células T isoladas dos tecidos do globo ocular foram coradas com um painel de anticorpos. Na população CD45 + CD3 + 7AAD, células CD3 + 7-AAD - T foram fechadas. Entre as células CD3 + 7-AAD - T, foram determinadas as populações de células T de memória nuclear, naïve, central e de memória efetora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Perfil de subpopulação de células T nos globos oculares. CD3 + CD45RCCélulas T + naïves, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - células de memória efector T (T EM ) e CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + células de memória central T (T CM ) são apresentadas como a porcentagem de células T CD3 + . Os resultados são de 3 ratos de controle e 6 ratos DED. Resultados semelhantes foram obtidos a partir da análise de células T de glândulas lacrimais isoladas (dados não mostrados). O teste t de Student não desempenhado foi utilizado para comparação estatística. As barras de erro representam o SD. * P <0,05, ** p <0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Um passo crítico deste protocolo é garantir a homogeneidade da emulsão. Em emulsões bem preparadas, os antígenos são completamente revestidos com óleo, garantindo a liberação lenta do antígeno injetado e estimulação imune contínua. Outra característica crítica deste protocolo é o uso de ratos Lewis. Os ratos Lewis são mais sensíveis ao desenvolvimento de doenças auto-imunes do que outras cepas 27 .
Este protocolo foi modificado a partir de dois protocolos previamente publicados, que usaram apenas extrato da glândula lacrimal ou Klk1b22 recombinante 20 , 21 . No protocolo atual, o extrato da glândula lacrimal de ovalbumina e mais é usado como antígeno e as células imunológicas específicas do antígeno são atraídas para a superfície ocular e a glândula lacrimal, induzindo danos nos tecidos locais. O olho seco se desenvolve lentamente, atingindo ~ 85% ao dia 48 após a imunização inicial. Desafio antigênico para oO olho e a glândula lacrimal no dia 48 exacerbam o olho seco e asseguram a cronicidade até o dia 70.
Comparado com o Klk1b22 recombinante no modelo DED induzido por Klk, o extrato da glândula lacrimal e ovalbumina utilizada no modelo atual são mais baratos e mais fáceis de obter. O extrato da glândula lacrimal também contém outras proteínas, além de Klk, que podem induzir auto-imunidade, então este extracto é teoricamente mais potente do que o método Klk na indução de DED. Também tentamos imunizar ratos com extrato da glândula lacrimal somente; Embora estes ratos imunizados tenham desenvolvido DED, não houve aumento significativo de células T de memória efetora nos tecidos do globo ocular em comparação com os controles.
A limitação desta técnica é que leva 70 dias para alcançar o modelo. As células T da memória Effector são os principais subconjuntos de células T no olho de rato normal. Neste modelo, o DED auto-imune resulta em um aumento das células T de memória efetora CD3 + no globo ocular. Drogas que preferemSuprimindo, de forma erudica, as células T da memória efetora, como inibidores seletivos do canal de potássio Kv1.3, pode, portanto, ter um benefício terapêutico no DED 28 autoimune.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse. A LT recebeu financiamento prévio e / ou presentes da Alcon, Allergan, Santen, Bausch e Lomb, Eyelens e Eyedetec.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Sra. Tin Min Qi e ao Dr. Veluchamy Amutha Barathi e a sua equipe por sua ajuda no manuseio dos animais. Este trabalho foi apoiado pelo NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 e NMRC / CSA / 045/2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
| complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
| ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
| incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
| pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
| fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
| phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
| Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
| Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |
References
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