الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

Summary

يظهر هذا البروتوكول كيفية استئصال باستمرار عيون مستورقة (أكواب البصرية) من دون إزعاج الأنسجة المحيطة بها. باستخدام إبرة الأنسولين والمحاقن، إما احدة أو كلتا العينين يمكن أن يكون ذاب لتسهيل التحقيقات في آليات تنظيم التجديد العين، وتطور تجديد البصري، والأساس العصبي للسلوك الناجم عن الضوء.

Abstract

في دراسة الخلايا الجذعية للبالغين وآليات التجدد، الديدان المفلطحة مستورقة هي من دعائم النظام في نموذج الجسم الحي. ومن المقرر في جزء كبير منه إلى وفرة المحفزة السكان الخلايا الجذعية وقدرتها على تجديد جميع أنواع الخلايا والأنسجة بعد الإصابات التي سيكون كارثيا بالنسبة لمعظم الحيوانات هذا. في الآونة الأخيرة، اكتسبت شعبية مستورقات كنموذج للتجديد العين. قدرتها على التجدد العين بأكملها (تتألف من أنواع الأنسجة هما: الخلايا الصبغية ومبصرات) تسمح للتشريح الآليات التي تنظم تجديد النظام البصري. العين الاجتثاث لديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من التقنيات (مثل قطع الرأس أو ثقب) لدراسة سبل وآليات العين محددة، وأهمها هو أن يقتصر التجديد إلى حد كبير إلى أنسجة العين وحدها. والغرض من هذه المقالة الفيديو هو إظهار كيفية إزالة موثوق الكأس البصرية مستورقة دون إزعاج الدماغ أو الأنسجة المحيطة بها.يوصف أيضا التعامل مع الديدان وصيانة مستعمرة أنشئت. ويستخدم هذا الأسلوب 31 G، 5/16 بوصة الانسولين إبرة لحلج القطن جراحيا من الكأس البصري من مستورقات يجمد على طبق من ذهب الباردة. ويشمل هذا الأسلوب على حد سواء مفردة ومزدوجة الاجتثاث العين، مع عيون تجديد في غضون 1-2 أسابيع، والسماح لمجموعة واسعة من التطبيقات. على وجه الخصوص، هذه التقنية الاجتثاث يمكن الجمع بسهولة مع (التدخل RNA) شاشات الدوائية والجينية لفهم أفضل للآليات التجدد وتطورها، والخلايا الجذعية العين وصيانتها، والاستجابات السلوكية phototaxic وأساسها العصبية.

Introduction

مستورقات هي قوية نموذج حي لدراسة الجذعية البالغة تجديد بوساطة الخلايا. هذه الديدان المفلطحة المياه العذبة غير الطفيلية تمتلك القدرة على التجدد أي وجميع الأنسجة المفقودة، بما في ذلك نظامهم العصبي المركزي والدماغ ^1. درس بقدر ما يعود إلى 1700s في ^2، والتقدم التكنولوجي في مجال مستورقة خلال 10-15 سنة الماضية (مثل تسلسل الجينوم، في الموقع التهجين، المناعية، والتدخل RNA (رني)، وtranscriptomics) قمنا بتحديث هذا نموذج حي تاريخي . على وجه التحديد، اكتسبت مستورقات شعبية في الآونة الأخيرة لتكون نموذجا الناشئة للبحوث العين ^3.

مستورقات لها عيون prototypic مع أنواع الأنسجة اثنين فقط، والخلايا العصبية مستقبلة للضوء والخلايا الصبغية. وقد مكن هذا التوصيف من سكان العين الخلايا الجذعية، وأظهرت أن العديد من نفس الجينات التي تنظم الفقاريات العين دييتم حفظها velopment في مستورقات ^{4 و 5.} تقع الكؤوس البصرية ظهريا وتتكون من البيض، التشعبات unpigmented من الخلايا العصبية مستقبلة للضوء وشبه القمر الخلايا الصبغية الأسود، وعيون عصب الدماغ عن طريق chiasm البصرية. بالإضافة إلى كونه نموذجا لتوضيح عمليات التجدد ^6، والعين مستورقة هي مناسبة تماما لدراسة تطور آليات البصرية ^7، والاستجابات السلوكية للضوء (مستورقات عرض انجذاب ضوئي سلبي) ^8، والأساس العصبي للسلوك ^9.

تجديد العين في مستورقات وقد درست إلى حد كبير في سياقين رئيسيين: كجزء من تجديد رئيس يلي قطع الرأس ^{4، 10،} وفيما يلي استئصال فقط أنسجة العين ^{11 و 12} 13 ^{و 14،} على الرغم من أن بعض الدراسات قد أجريت أيضا عمليات البتر خلف العينين (قطع الرأس الجزئي) ^15. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب تنطوي على فقدان العديد من الأنسجة الأخرى من مجرد العين (مثل الدماغ والأمعاء وnephridia)، ويحتمل أن تعقيد تفسير النتائج. بروتوكول الاجتثاث العين المعروضة هنا يقيد الختان إلى أنسجة العين (باستثناء المخ على وجه التحديد)، مما أدى إلى البيانات التي هي أكثر تحديدا للعين. بالإضافة إلى ذلك، على عكس الديدان مقطوعة الرأس التي تأخذ 7-14 أيام للبدء في التغذية، والعين ذاب الديدان تتغذى خلال 24 ساعة من الاجتثاث ^12، مما يسمح للتجارب رني (حيث يتم تسليم رني عبر الطعام) ليتم performeد متزامن.

وعلى الرغم من الاجتثاث العين هو أصعب من الناحية الفنية لأداء بنجاح من قطع الرأس، لم شملت الدراسات الحالية التي تنطوي على استئصال العين تعليمات مفصلة حول إجراءاتها. والهدف من هذه المقالة الفيديو هو لتمكين الباحثين من إزالة باستمرار الكأس البصرية مستورقة دون إزعاج أنسجة المخ الأساسية وإزالة بعض الأنسجة الأخرى كما ممكن. وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في كل من مفردة ومزدوجة الاجتثاث العين وينطبق على مجموعة واسعة من التحقيقات. مثل معظم فحوصات تجديد، والاجتثاث العين مناسبة تماما للمزيج مع كل من (رني) شاشات الدوائية والوراثية، وكذلك الدراسات السلوكية. نحن هنا وصف الطرق لمعالجة الديدان، والحفاظ على مستعمرة مستورقة، وتقنية الاجتثاث العين نفسها.

Protocol

1. الحيوان الثقافة والمناولة

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول ميدتيرانيا Schmidtea، وهي من الأنواع مستورقة مضاعفا مع تسلسل الجينوم ^{16 و 17} التي يشيع استخدامها للبحث تجديد. ومع ذلك، فإن الاختبار هو ناجح على قدم المساواة مع الأنواع الأخرى، مثل Girardia tigrina وGirardia dorotocephala (والتي هي متوفرة تجاريا).

1. الحفاظ على الديدان في "المياه دودة" مصنوعة من 0.5 غرام أملاح / L البحر في عالى النقاء (أو منزوع الأيونات تصفيتها) المياه. استخدام معقم البولي بروبلين أو العبوات الزجاجية لعقد المياه دودة. رؤية الملف التكميلي 1 للاطلاع على تفاصيل إعداد ماء دافيء.
   ملاحظة: لا تستخدم الصابون لتنظيف حاويات (أو غيرها من اللوازم)، والصابون سامة لالديدان. بدلا من ذلك مسح مع الايثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف. <رأ>
2. ارتداء القفازات أثناء العمل مع المستورقات لحمايتها من التلوث.
   ملاحظة: الديدان هي حساسة جدا للسموم والمواد الكيميائية البيئية، بما في ذلك الصابون ومواد التبييض، والشامبو، وهواء، وغسول اليد.

المستعمرات منزلا في حاويات المواد الغذائية من مادة البولي بروبيلين، مع غطاء تركت مفتوحة جزئيا لتبادل الهواء في ~ 20 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة). الديدان مخزن التجريبية في أي أطباق بتري (20 الديدان في طبق بقطر 100 ملم) أو لوحات غير المعالجة الأنسجة الثقافة (1 دودة لكل بئر، لوحات ال 12 أيضا). للحد من التوتر، والحفاظ على كل من المستعمرات والتجارب في الظلام.
ملاحظة: يجب أن يكون المستعمرات لا يزيد عن 500-1،000 الديدان لكل لتر من الماء دودة. للتجارب، وترك أغطية تماما في المكان، منذ تم تصميم تدفق الهواء إلى هذه الأطباق.

تغذية الديدان غير التجريبية مرة واحدة في الأسبوع مع المهروس لحم البقر العضوي أو كبد الدجاج من خلال إسقاط هريس من ماصة نقل، ووضع قطرات من الأغذية في جميع أنحاء الحاوية. اسمحوا الديدان 2 ساعة في استهلاك المواد الغذائية فيالظلام قبل تنظيف الحاويات (راجع الخطوة 1.4). قبل استخدامها، هريس مخزن في -20 درجة مئوية لمدة قصيرة (أسابيع) أو -80 ° C على المدى الطويل (أشهر)؛ لا اعادة تجميد هريس لإعادة استخدامها (كما البكتيريا قد تزدهر وتضر الديدان).
ملاحظة: الكبد يجب أن لا تحتوي على الهرمونات أو المضادات الحيوية ويفضل أن لا يتم تجميد سابقا. الطرد المركزي هريس قبل التجميد (أو قبل التغذية) لإزالة الهواء ومنع الطعام من العائمة. يجب أن تغرق الغذاء إلى أسفل الحاوية. 1 مل من معجون يكفي ل500-1،000 الديدان.

مياه الصرف مرة واحدة في الأسبوع مع المياه دودة جديدة لكل من المستعمرات والتجارب. وينبغي أيضا أن تمحى حاويات مستعمرة أسفل مع منشفة ورقية غير مقصور (لإزالة بقايا المخاط الذي النفايات فخ) مرة واحدة في الأسبوع لتجويع الديدان، أو مرتين في الأسبوع لمدة الديدان تغذية (2 ساعة بعد الرضاعة ومرة ​​أخرى في وقت لاحق 2 أيام). من أجل الحفاظ على بيوفيلم، لا تمسح أكثر من 80٪ من الحاويات.

نقل الديدان بين حاويات (أو سيتو جراحةع) باستخدام ماصة نقل. الديدان حرة تلتزم الأسطح الحاويات، بخ الماء على / وراء دودة لتحريرها من السطح. ثم تمتص الدودة في ماصة، بينما كان يحاول الحفاظ على دودة داخل الجزء السفلي بوصة (أرق) من ماصة.

1. الماصات Backload مع كمية صغيرة من الماء دودة قبل مص لهم.
2. حاول نقل المياه في جميع أنحاء دودة، بدلا من الدودة نفسها، للمساعدة في منع تمزق الديدان رخوة عن طريق لمس منهم مع ماصة.
3. حافظ على أطباق التجريبية غطت ما لم نقل الديدان أو استبدال المياه.

2. إعداد

1. التوقف عن تغذية الديدان أسبوع واحد على الأقل قبل التجارب.
   1. اختر الديدان التي تم لم يتم تغذيتها لمدة أسبوع ≥1 وهي على الأقل 5-7 ملم في الطول. نقل الديدان على طبق بيتري 2/3 كامل من الماء دودة، وتأكيد طول الدودة عن طريق تحريك مسطرة تحت الطبق. قياس ثorms تمديد حين بالكامل وتتحرك.
      ملاحظة: في حين أن أصغر (5-7 ملم) الديدان تعمل على نحو أفضل عند تنفيذ المناعي لاحق ويحلل الموقع التهجين، والديدان الكبيرة (8-10 ملم) هي أسهل للعمل مع - وخاصة عندما تعلم اجتثاث.
   2. تأكد من أن الديدان هي كلها، لم يلحق بها أذى، وليس تجديد مؤخرا.
      ملاحظة: مجدد الديدان يكون أخف وزنا بكثير (أو لا) الصباغ في الرأس و / أو منطقة الذيل بالمقارنة مع الديدان العادية.
   3. إذا كان أداء رني أو العلاجات الدوائية على الديدان، والقيام بذلك في هذه المرحلة. إذا كانت تتغذى الديدان كجزء من العلاج (كما لرني)، وانتظر بعد 7 أيام على الأقل التغذية مشاركة قبل المتابعة إلى الخطوة 2.2.
2. تنظيف قاعدة المجهر مساحة العمل وتشريح مع الايثانول 70٪ واتركه حتى يجف تماما. وضع طبق من الديدان المحدد إلى الجهة اليسرى من النطاق. إلى اليمين من نطاق، ووضع زوج من رقم 5 ملقط، و31 G 5/16 بوصة الانسولين إبرة مع 1مل حقنة، وماصة نقل نظيفة.
   1. ضمان أن يتم الاحتفاظ الصكوك من لمس مقاعد البدلاء (والذي يمكن أن يعرض الملوثات). استخدام عنصر جامدة (مثل بقية عود) للحفاظ على ملقط، إبرة، وماصة نظيفة. بدلا من ذلك، أدوات مكان على رأس البني (غير مقصور) منشفة ورقية جديدة.
      ملاحظة: تتم كتابة هذه واللاحقة تعليمات من حيث صلتها الأفراد يمنى. يجب أعسر الأفراد عكس اليمين / اليسار الاتجاهات.
3. بجانب مساحة العمل، ووضع علبة من مناديل الأنسجة خالية من الوبر، مصدر للمياه العذبة دودة، وبعض ماصات نقل إضافية (محمية من أعلى مقاعد البدلاء). ماء دافيء مكان في زجاجة غسل البلاستيك لسهولة صرفها. أيضا وضع المسمى لوحة 12-جيدا (أو 100 ملم طبق بيتري) إلى يمين نطاق لجمع الحيوانات ذاب.
4. في حالة استخدام لوحة بلتيير حسب الطلب لشل حركة الديدان، ووضع لوحة بلتيير إلى الاكتئاب في تيانه قاعدة المجهر تشريح وضبط الإخراج على مصدر الطاقة DC حتى سطح العمل من لوحة بلتيير باردا بما فيه الكفاية (عادة ~ 5 V) .Alternatively، وجعل لوحة الباردة عن طريق ملء طبق بيتري ملم 100 ½ بالكامل بالماء وتجميد لمدة 24 ساعة على الأقل. تجاهل الغطاء ووضع الجزء السفلي من طبق 100 ملم على قاعدة نطاق تشريح، ثم وضع غطاء طبق بيتري 60 ملم رأسا على عقب مباشرة على سطح الجليد (الشكل 1A).
   1. بعد الماء جمدت في صحن 100 ملم، يمكن أن تظهر في "بركان" من الجليد في وسط اللوحة. إذا حدث هذا، استخدام شفرة حلاقة لكشط شقة الجليد، لإزالة أي مخالفات من على سطح الأرض.
      ملاحظة: أثناء العمليات الجراحية الجليد سوف تذوب، مما يجعل ablations أكثر صعوبة بكثير. إعداد عدة أطباق الجليد مقدما، وتحل محل المجمدة لذوبان منها خلال فحص في أقرب وقت غطاء صحن 60 ملم يبدأ العائمة.
5. حضرسطح الجراحة. قطع قطعة 5 سم × 10 سم من البلاستيك فيلم البارافين (4 سم ² في حالة استخدام طبق بتري لوحة الباردة) ووضعه في وسط الجهاز الشلل. أضعاف الأنسجة خالية من الوبر مسح في مربع تقريبا 2 سم ² ووضعه على رأس الفيلم. قطع قطعة من مرشح ورقة بيضاء 1.5-2 سم ² ووضعه على رأس القضاء. انظر الشكل 1B-1E.
   1. عقد مطوية مسح في مكان مع إصبع القفاز، واستخدام ماء دافيء لتخفيف بخفة مسح للتأكد من أنها لا تزال مطوية. استخدام الجانب من ماصة نقل للفة مسح المسطح.
      ملاحظة: درجات الحرارة الباردة يساعد على إبقاء الديدان من التحرك. العمل "جافة" يساعد أيضا في تجميد. الأنسجة مسح الأفعال الفتيل المياه من خلال ورقة الترشيح، والحفاظ على دودة رطبة أثناء الجراحة دون السماح الديدان لتجف تماما (وهو قاتلة).

3. تذرية الجراحي

1. استخدام ماصة نقل وضعها علىالجانب ه دودة ظهري حتى على ورقة الترشيح. تحويل مصدر الضوء على وتوجيه goosenecks قابل بحيث يتركز الضوء على دودة. ضبط تشريح التركيز نطاق والتكبير بحيث عيون هي واضحة للعيان (دودة كاملة لا تحتاج إلى أن تكون في رأي)؛ 5X التكبير هو نقطة انطلاق جيدة. توجيه الدودة عن طريق تناوب الفيلم البارافين بحيث يتم أشار يتجه نحو الباحث (نحو الجزء الأمامي من المجهر)، الزاوية 30-40 درجة إلى اليمين.
   1. تجنب استخدام الضوء الساطع لمنع حركة الدودة الزائدة. مستورقات عرض انجذاب ضوئي سلبية، وسوف تسعى للتهرب من الضوء الساطع.
   2. إذا تم وضع دودة الجانب البطني مواجهة (مع البلعوم فتح مرئية)، استخدم الجانب مملة من ملقط لإعادة بلطف الجانب الظهري دودة (بعيون مرئية). تجنب الاقتراب من الحيوانات مع طرف حاد من ملقط لتقليل فرصة على اختراق الأنسجة الرخوة عند اعادة تموضع الحيوان.
2. عقد إبرة جديدة / حقنة في اليد اليمنى كما لو كانت من ركلة جزاء (بين الإبهام والسبابة). يستعدوا الإبهام الأيسر ضد لوحة بلتيير (أو طبق بتري لوحة الباردة)، واستخدام الإبهام الأيسر كنقطة ارتكاز على أي الجزء السفلي من الحقنة ستقع (الشكل 2A). تبدو من خلال المجهر، وتأكد من أن شطبة من الإبرة مرئيا.
   ملاحظة: إبر حادة جدا. كن حذرا عند التعامل معها. ويمكن ارتداء اللاتكس أو قفازات النتريل تقدم بعض الحماية.
   1. استخدام الإبهام الأيسر للمساعدة في اجراء إبرة / المحاقن ثابتة في جميع أنحاء الداخلي وتجنب المصافحة.
   2. جعل زاوية من حوالي 40 درجة مع الإبهام الأيسر والأيسر السبابة (مع السبابة على سطح الجراحة) للمساعدة في اجراء مستقر سطح الجراحة.
3. معشطبة من الإبرة التي تواجه أعلى (مثل ملعقة)، موقف الإبرة بزاوية قائمة على العين (الشكل 2B). استخدام رأس الإبرة لاختراق بلطف طبقة رقيقة من الأنسجة التي تغمر كوب البصري (أبيض والمنطقة unpigmented) من العين، يغرف من اليمين إلى اليسار. جدا إزالة بلطف أي نوع من الأنسجة الصباغية التي تقع داخل الكأس البصرية، مع الحرص على عدم ثقب أسفل أو تدمير حدود الكأس البصرية.
   1. إذا كانت دودة على ورقة الترشيح لل> 1-2 دقيقة في أي وقت أثناء العملية، إضافة قطرة واحدة من الماء لترطيب دودة دودة.
      ملاحظة: سوف الجفاف زيادة قابلية الدودة إلى وقوع إصابات التمزيق.
4. كرر الخطوة 3.3 حتى كل من الأنسجة مصطبغة السوداء (الخلايا الصبغية)، وكذلك كل من الأنسجة البيضاء للكوب الضوئية (التشعبات للخلايا مستقبلة للضوء)، تتم إزالتها. إزالة الأنسجة رفعه تمسك نهاية إبرة عن طريق المسح بعناية بمنديل يمسح. إذا مزدوج عبلة العينهو المطلوب نشوئها، اجتثاث العين الثانية في هذه المرحلة.
   ملاحظة: لتجنب الإصابة، والإبر يمكن تنظيفها عن طريق الامساك الإبرة بمنديل نظيف يمسح عقد مع الإبهام والسبابة، ثم باستخدام اليد الأخرى لسحب الإبرة من خلال مسح بعيدا عن الإبهام والسبابة. بدلا من ذلك، إبرة يمكن أن تمحى على سطح النسيج الرطب مسح وفحص للنظافة.
5. عند الانتهاء، استخدم ماصة نقل لنقل دودة إلى طبق المسمى تحتوي على المياه العذبة دودة. إذا تحليل البيانات المجموعة، وضع ما يصل إلى 20 ديدان في واحد 100 مم طبق بيتري. إذا تتبع تجديد في نفس الأفراد مع مرور الوقت، ضع 1 دودة في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا. مرة واحدة يتم نقل جميع الديدان، وشطف الديدان عن طريق إزالة جميع المياه دودة من أطباق / الآبار واستبدال مع المزيد من المياه العذبة دودة.
   1. لإزالة الديدان من مرشح، backload ماصة مع كمية صغيرة من الماء دودة والافراج عن الماء على دودة. وهذا ينبغي رفع رانه دودة من ورقة الترشيح، إلى أن امتص على الفور في ماصة للنقل.
6. احتضان التجارب في ~ 20 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) محمية من الضوء ومتابعة عملية التجدد.
   ملاحظة: الديدان يمكن تخزينها في حاضنة التحكم في درجة حرارته للحفاظ على درجة حرارة ثابتة، ولكن هذا ليس ضروريا تماما. معظم درجة حرارة الغرفة تختلف فقط من قبل +5 ° C، والتي لن تؤثر على قدرة الدودة على التجدد.
7. إذا رغبت في ذلك، وتحديد الديدان لالمناعية (أنظر الشكلين 3-4) و / أو في الموقع التهجين تحليل التعبير الجيني. توجد طرق تثبيت مختلفة لالمناعية مستورقة ^{18 و 19 و 20} و الموقع التهجين ^{21، 22، 23} البروتوكولات في.
8. عندما تبرم التجارب، sacrifiم تعيش الديدان عن طريق إزالة ماء دافيء من طبق واستبدالها مع 70٪ من الإيثانول. احتضان الديدان لمدة 3-5 دقيقة، والتحقق من الديدان إلى ليز وتحويل رمادي.
9. وضع الديدان غير المعالجة في مجرى النفايات العادية مرة واحدة التضحية. تجنب إدخال الديدان الحية في البيئة، وخاصة الأنواع غير المحلية.

Representative Results

لأول 1-2 ساعة بعد الجراحة، قد يحمل الحيوانات انخفضت حركة بالمقارنة مع الديدان سليمة (ومع ذلك فإنها لا تزال تتحرك). إذا رغبت في ذلك، والديدان تأكل خلال 24 ساعة من الجراحة (على سبيل المثال، لتغذية رني). عند اتباع تجديد العين في نفس الأفراد مع مرور الوقت، تأكد من التقاط صورة لكل دودة على حد سواء قبل الجراحة (سليمة) وفي 1 ساعة بعد الاجتثاث (HPA). قبل 4 أيام آخر الاجتثاث (د ب أ) ينبغي أن يكون تجديد الخلايا الصبغية مرئية، وبنسبة 14 د ب أ العين بالكامل سوف يكون مجدد بالكامل (الشكل 3A-B). ويشمل ذلك الخلايا العصبية مستقبلة للضوء وتعصيب على الدماغ (الشكل 3C)، فضلا عن الانتعاش وظيفية من النظام البصري (الشكل 4A-C). سوف ablations الناجحة لا تزعج الأنسجة الكامنة وراء الدماغ (الشكل 4D-E)، ولا يدخل إصابات أخرى للحيوان (الشكل 5A). ablations فاشلةوتشمل الحيوانات مع: والختان كبير للغاية الذي يربط عيون اثنين (الشكل 5B)، والدموع إلى الهامش الجانبي للحيوان (الشكل 5C)، ومواقع و / أو الجرح الذي كزة من خلال البشرة بطني (الشكل 5D). وعلاوة على ذلك، تشمل ablations فاشلة إزالة غير كاملة من الكأس البصرية بأكمله، ويتألف من كل الأنسجة unpigmented البيضاء والخلايا الصبغية السوداء (الشكل 5E-F).

الشكل 1: إعداد جراحة. (A) رسم تخطيطي لبناء لوحة الباردة، وذلك باستخدام الجزء السفلي من 100 ملم طبق بيتري (مليئة الجليد) وغطاء طبق بيتري 60 ملم (وضعت رأسا على عقب على سطح الجليد). (B) رسم تخطيطي لسطح الجراحة، مصنوعة من كومة من (الأعلى إلى الأسفل) ورقة مرشح البيضاء، الأنسجة مطوية رطبة مسح، وقطعة من فيلم البارافين.(C) وجراحة اقامة (للحصول على حق الوفاض). A: نطاق تشريح، B: إضاءة معقوفة، C: سطح الجراحة، D: لوحة بلتيير، E: طبق من الديدان 5-7 ملم جاهزة للالاجتثاث، F: زجاجة غسل من ماء دافيء، G: عود بقية عقد نظيفة ماصة نقل، H: عود بقية عقد إبرة / المحاقن، I: عود بقية عقد ملقط، J: حاوية من الماصات نقل إضافية. تكوين لوحة (D) مخصص بلتيير. (E) طبق بتري تكوين لوحة الباردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: موقف اليدين وإبرة / المحاقن خلال الاجتثاث. (A) موضع اليدين (للحصول على حق الوفاض). لاحظ أنه يتم استخدام الإبهام الأيسر لدعم حقنة (عقدفي اليد اليمنى) للحد من الحركة. (B) موضع إبرة فيما يتعلق العين الدودة. لاحظ أن سطح مشطوف من الإبرة يواجه صعودا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): ذاب عيون مستورقة تتجدد. مورفولوجية Schmidtea ميدتيرانيا مستورقات إعادة نمو عيون التالية (A) الاجتثاث مزدوجة العين و (B) واحد الاجتثاث العين. (C) المناعية تظهر تجديد الخلايا العصبية مستقبلة للضوء (مكافحة arrestin) بعد استئصال العين واحد. وتظهر الديدان سليمة قبل الجراحة، وأظهرت تجدد في أيام 4 و 14 بعد الاجتثاث. لablations عين واحدة، وكانت العين اليسرى لblated وتخدم العين اليمنى باعتبارها (يصب) الرقابة الداخلية. السهام الحمراء: عيون ذاب. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الانتعاش الوظيفي للنظام البصري بعد الاجتثاث. (A - C) الفحص الوظيفي لاختبار الضياء مستورقة. (A) الديدان سليمة تجنب السفر عبر مناطق الضوء، مثل بقعة من مؤشر ليزر خضراء. (B) في 24 ساعة بعد الاجتثاث "العمياء" مزدوجة العين الديدان ذاب السفر من خلال بقع الضوء. (C) في 7 أيام بعد الاجتثاث، وإعادة إنشاء العين ذاب الديدان ضعف نظامهم البصرية بما فيه الكفاية لاسترداد تجنب الضوء. رأس السهم الأصفر: السلوك المنحرفآل استجابة. (D - E) يقتصر الاجتثاث العين إلى أنسجة الكأس البصرية، ولا تخل أنسجة الدماغ الكامنة. (D) المناعية تظهر بنية الدماغ (مكافحة سينابسينات) لم تتغير من قبل الاجتثاث إلى 1 ساعة بعد الاجتثاث. يقتصر (E) الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ في 1 ساعة بعد الاجتثاث في المقطع العرضي يظهر الضرر إلى حد كبير إلى موقع الكأس البصرية ذاب. العين اليمنى (مع الخلايا الصبغية السوداء) بمثابة الرقابة الداخلية. السهام الحمراء: عيون ذاب. الحانات النطاق = 1 مم في (AC) 1 ملم، و 100 ميكرومتر في (DE). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: بصمات ablations الناجحة وغير الناجحة. (A) الناجحة ablations العين المفردة والمزدوجة (في 5 دقائق بعد الاجتثاث) لديها الجروح التي تتشابه تقريبا في حجم الكأس البصرية الأصلي. (B - E) ablations فاشلة: إزالة (B) الأنسجة الكثير أو الجرح يربط عيون اثنين، (C) الدموع موضع الجرح، وتمتد إلى الهامش، (D) الجرح عميق جدا والوخزات من خلال من الظهرية (D) إلى بطني (D ') الجانب، و (E - F) تتم إزالة ليس كل من الأنسجة كأس البصرية، تصور كلا شكليا (E)، وتلطيخ مكافحة arrestin من الخلايا العصبية مستقبلة للضوء (F). النصال صفراء: ablations الشاذة. الدوائر الصفراء: الموقع الاجتثاث. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تحسن هذه التقنية الاجتثاث العين على الطرق الحالية (مثل ثقب) باستبعاد أنسجة المخ وتقييد الختان أساسا إلى أنسجة العين. مع الممارسة، وهذه التقنية يمكن أن يقوم بها معظم الأفراد، من الفنيين ذوي الخبرة في microsurgeries للطلاب الجامعيين عديم الخبرة ولكن الضميري. فمن المستحسن أن هذه التقنية أن تمارس عدة مرات قبل استخدام ablations في التجارب، بما في ذلك (عند الإمكان) تأكيد الإزالة الكاملة للجميع أنسجة العين عن طريق المناعية أو التهجين الموضعي للعلامة العين (ق) ^{4، 5، 13} في. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو شفط من الأنسجة. ومن المهم أن لا إزالة الأنسجة إما الكثير أو القليل جدا. ويمكن تجنب ذلك من خلال عدم شفط عميقا جدا مع الإبرة، لتجنب اختراق من خلال إلى الجانب البطني من دودة. غيض من نيينبغي أن تدرج DLE فقط حوالي 0.4 ملم عميق، والجزء مشطوف من الإبرة لا ينبغي أبدا أن يذهب كل في طريقه من خلال العين. وينبغي إيلاء عناية خاصة للا تضر الأنسجة الهشة بين العينين (حافة سطي في المنطقة المصطبغة السوداء من كل عين تمثل حدود كل عين). وينبغي أيضا تجنب الضرر بين العين والهامش البعيد للدودة. هي الديدان الصغيرة أكثر عرضة للتمزق أو أن أصيب عن غير قصد، لذلك ينصح باستخدام الديدان أكبر (خاصة لممارسة). القيود الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نسبيا الوقت مكثفة (وليس من المناسب للشاشات عالية الإنتاجية)، وأنها تتطلب استثمارا أوليا في ممارسة لضمان دقة النتائج. ومع ذلك، مع ممارسة 10 العينين يمكن أن يكون ذاب في ~ 15 دقيقة.

منطقة رئيسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها في حفظ مستورقات تزال أثناء العملية. لا يجمد في سببين رئيسيين الديدان بما فيه الكفاية لأداء ablationsهي: (أ) (ب) فقدان الكثير من المياه ودرجات الحرارة الباردة. (A) المياه مستورقة الزائدة التي برك على سطح الجراحة بينما الديدان نقل سيسمح الديدان للتحرك وتعقيد عملية جراحية. سطح الجراحة (الأنسجة خالية من الوبر مسح ورقة فلتر) يجب أن تبقى رطبة فقط. إذا كان في أي وقت أثناء الإجراء مسح يصبح مشبعا بالماء دودة، فإنه ينبغي إما استبدال أو ماصة نقل يمكن استخدامها لإزالة بلطف السوائل الزائدة من أنسجة مسح (رسم دائما من ولا ورقة الترشيح مسح). ويمكن أيضا أن تقضي على الأنسجة استخدامها لإزالة تجميع المياه الزائدة على سطح الجراحة. قد تحتاج هذه العملية لتكرارها عدة مرات، اعتمادا على عدد من الديدان التي ذاب. (B) في حالة استخدام طبق بتري لوحة الباردة إعداد، تذكر لاستبدال لوحة الباردة حالما يبدأ ذوبان الجليد و60 مم طبق بتري غطاء يبدأ تطفو. وهذا يضمن كلا سطح جراحة مستقرة وسطح بارد بشكل مناسب. بدلا من ذلك، في حالة استخدام لوحة بلتييرإعداد، تكون على علم أنه بعد 45 دقيقة إلى 1 ساعة من الاستخدام، والحرارة في حلقات الخارجي سيتغلب على لوحة الباردة في الوسط وسيتم فقدان جميع التبريد. إذا حدث هذا، إيقاف لوحة بلتيير لمدة 5-10 دقائق للسماح له أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل استئناف ablations.

مجال آخر من مجالات استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء نقل دودة بين الطبق وسطح الجراحة والعودة مرة أخرى. إذا الديدان ذاب من الصعب إزالة من ورقة الترشيح، وضع قطرة من ماء دافيء على دودة حتى برك السائلة على رأس ورقة الترشيح. ويمكن بعد ذلك امتص الديدان في ماصة نقل كالمعتاد. إذا استمرت المشاكل، حاول التقليب الدودة على جانبها بطني أولا (باستخدام الجانب مملة من ملقط). إذا كان يحصل عالقا دودة داخل ماصة نقل، وهذا عادة ما يكون علامة على أن الكثير من المياه وقد تم تناولها (ينبغي وضع الديدان في ماصة نقل أبعد من عن شبر واحد). لإزالة دودة عالقة في ماصة نقل، ووضع 2/1 مل من الدودة واتإيه في ماصة، بحيث يتم تغطية الدودة بالماء. نفض الغبار بحزم إلى جانب ماصة حتى يفصل الدودة من جدار ماصة ويتحرك.

إذا أصبحت إبرة مملة، مع استبدال إبرة / حقنة جديدة. التفكير في استبدال الإبر بعد استخدامها لاجتثاث ≥30 العينين. إزالة الزائدة من أنسجة مقطوعة عن طريق المسح بمنديل يمسح يمكن أيضا مملة الإبرة، مما يجعل ablations أكثر صعوبة. انها على ما يرام إذا بقيت الأنسجة مقطوعة داخل جزء مشطوف من الإبرة في جميع أنحاء الداخلي (حتى عبر الحيوانات متعددة). دائما استخدام إبرة جديدة / حقنة عند تغيير بين الديدان من الظروف المختلفة (على سبيل المثال wildtype مقابل الديدان رني)، وكذلك عند بداية جلسات الاجتثاث الجديدة (أي في أيام مختلفة).

هذه التقنية الاجتثاث العين الجراحية هي وسيلة قوية لتحقيق السلوكيات التي يسببها الضوء (والأساس الجيني والعصبية الخاصة بهم) في مستورقات، وخاصةعندما جنبا إلى جنب مع العلاجات الدوائية أو تدخل الحمض النووي الريبي. العين الاجتثاث هو أيضا وسيلة رائعة يمكن من خلالها توضيح الآليات التي تنظم الذاتية مستورقة تجديد العين (وساق العين صيانة الخلايا والتمايز) في الجسم الحي. حيث أن معظم الفقاريات لديها قدرات محدودة جدا لتجديد أنسجة العين، وفهم كيف هي قادرة على تجديد عيونهم ستكون مهمة في تحديد الآليات الممكنة للترجمة إلى العلاجات المستقبلية مستورقات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional