Kirurgisk ablasjon analyse for å studere Eye Regeneration i Planarians

Summary

Denne protokollen viser hvordan man konsekvent skjære planarian øyne (optiske kopper) uten å forstyrre omkringliggende vev. Ved hjelp av en insulin nål og sprøyte enten ett eller begge øyne kan ablateres for å lette undersøkelser av de mekanismer som regulerer øye regenerering, utviklingen av visuelle regenerering, og den nevrale grunnlaget for lys-indusert adferd.

Abstract

I studiet av voksne stamceller og regenerative mekanismer, planarian flatormer er en stift in vivo-modellsystem. Dette skyldes i stor grad til deres rike pluripotent stamcellepopulasjon og evne til å regenerere alle celle og vevstyper etter skader som ville være katastrofalt for de fleste dyr. Nylig har planarians vunnet popularitet som en modell for øye regenerering. Deres evne til å regenerere hele øyet (bestående av to vevstyper: pigmentceller og fotoreseptorer) gjør det mulig for disseksjon av de mekanismer som regulerer synssystemet regenerering. Eye ablasjon har flere fordeler i forhold til andre teknikker (slik som halshugging eller hullemaskin) for undersøkelse av øye-spesifikke veier og mekanismer, den viktigste av hvilke er at regenerering er i stor grad begrenset til øyevev alene. Hensikten med denne video artikkelen er å vise hvordan man kan fjerne en pålitelig måte den planarian optiske koppen uten å forstyrre hjernen eller omgivende vev.Håndteringen av ormer og vedlikehold av en etablert koloni er også beskrevet. Denne teknikken bruker en 31 g, 5/16-inch insulin nål kirurgisk å øse ut den optiske kopp planarians immobilisert på en kald plate. Denne metode omfatter både enkelt- og dobbelt øye ablasjon, med øyne regenererende løpet av 1-2 uker, noe som åpner for et bredt spekter av applikasjoner. Spesielt kan denne ablasjon teknikken enkelt kombineres med farmakologiske og genetiske (RNA interferens) skjermer for en bedre forståelse av regenerative mekanismer og deres utvikling, øye stamceller og deres vedlikehold, og phototaxic atferdsmessige reaksjoner og deres nevrologiske basis.

Introduction

Planarians er en kraftig modellorganisme for å studere voksen stamcelle-mediert regenerering. Disse ikke-parasittiske ferskvann flatormer har evnen til å regenerere seg alle manglende vev, inkludert deres sentralnervesystemet og hjerne ^1. Studert så langt tilbake som 1700-tallet ^2, teknologiske fremskritt i planarian felt i løpet av de siste 10-15 årene (for eksempel en sekvens genom, in situ hybridisering, immunhistokjemi, RNA-interferens (RNAi), og transcriptomics) har oppdatert den historiske modellorganisme . Spesielt planarians har nylig vunnet popularitet som en ny modell for øyet forskning ^tre.

Planarians har prototypic grundig med bare to vevstyper, fotoreseptoren nevroner og pigmentceller; Dette har gjort det mulig å karakterisere dens øye stilk-cellepopulasjon og vist at mange av de samme genene som regulerer vertebrate øye degen er konservert i planarians ^{4, 5.} De optiske koppene er lokalisert dorsalt og består av de hvite, pigmenterte dendritter av fotoreseptoren nevroner og de halvmåne svart pigmentceller, og øynene innerverer hjernen via en optisk chiasm. I tillegg til å være en modell for å belyse regenerative prosesser ^6, er det planarian øyet godt egnet for å studere utviklingen av visuelle mekanismer ^7, adferdsmessige responser overfor lys (planarians vise negativ phototaxis) ^8, og den nevrologiske basis av opptreden ^9.

Eye regenerering i planarians stor grad har vært studert i to hoved sammenhenger: som en del av hode-regenerering etter halshugging, ^{4, 10,} og etter fjerning av kun de øyevev ^{11, 12 13, 14,} selv om noen studier har også utført amputasjoner like bak øynene (partiell dekapitasjon) ^15. Imidlertid har alle disse metoder innebærer tap av mange andre faktorer enn bare øyet vev (for eksempel hjerne, tarm, og nephridia), potensielt kompliserer tolkningen av resultatene. Øyet ablasjon Protokollen som presenteres her begrenser eksisjon til øyet vev (spesielt med unntak av hjerne), noe som resulterer i data som er mer spesifikke for øyet. I tillegg, til forskjell fra de halshugde ormer som tar 7-14 dager for å begynne mating, vil øyet ablateres ormer mate innen 24 timer etter ablasjon ^12, slik at RNAi eksperimenter (hvor RNAi blir levert via mat) som skal performed samtidig.

Selv øye ablasjon er teknisk vanskeligere å lykkes utføre enn halshogging, har nåværende studier med eye excision ikke inkludert detaljerte instruksjoner om sine rutiner. Målet med denne videoen artikkelen er å muliggjøre forskere å konsekvent fjerne planarian optiske cup uten å forstyrre de underliggende hjernevev og fjerne så få andre vev som mulig. Denne fremgangsmåten kan brukes for både enkelt- og dobbelt øye ablasjon og er anvendelig for en lang rekke undersøkelser. Som de fleste restitusjon analyser, er øye ablasjon godt egnet for kombinasjon med både farmakologiske og genetiske (RNAi) skjermer, så vel som Adferdsstudier. Her beskriver vi metoder for håndtering av ormer, opprettholde en planarian koloni, og øyet ablasjon teknikk selv.

Protocol

1. Animal Kultur og håndtering

MERK: Denne protokollen bruker Schmidtea mediterranea, en diploid planarian art med en sekvens genom ^{16, 17} som vanligvis brukes for regenerering forskning. Imidlertid er analysen like vellykket med andre arter, for eksempel Girardia tigrina og Girardia dorotocephala (som er kommersielt tilgjengelig).

1. Oppretthold ormer i "orm vann", av 0,5 g / l sjøsalter i ultrarene (eller filtrert deionisert) vann. Bruk sterile polypropylen eller glassbeholdere for å holde ormen vann. Se Utfyllende File 1 for detaljer om ormen vann forberedelse.
   MERK: Bruk aldri såpe for å rengjøre beholdere (eller andre produkter) som såpe er toksisk for ormer; i stedet tørke med 70% etanol og lufttørke. <ol>
2. Bruk hansker når du arbeider med planaria for å beskytte dem mot forurensning.
   MERK: Worms er svært følsomme for miljøgifter og kjemikalier, inkludert såpe, blekemiddel, sjampo, balsam og håndkrem.

Hus koloniene i polypropylen matvarebeholdere, med lokket venstre delvis åpen for luftgjennomgang ved ~ 20 ° C (romtemperatur). Oppbevar eksperimentelle ormer i enten petriskåler (20 ormer pr 100 mm skål), eller ikke-behandlet vev-kulturplater (1 orm per brønn, i 12-brønners plater). For å redusere stress, holde begge kolonier og eksperimenter i mørket.
MERK: Colonies bør ikke ha mer enn 500-1000 ormer per liter ormen vann. For eksperimenter, la lokk helt på plass, siden luftstrømmen er utviklet i disse rettene.

Strøm ikke eksperimentelle ormer gang i uken med most økologisk kjøtt eller kylling leveren ved å slippe puré fra en overførings pipette, å plassere dråper av mat i hele beholderen. Tillat ormer 2 timer for å konsumere mat imørk før rengjøring ut beholderen (se trinn 1.4). Før bruk, lagre puré ved -20 ° C i kort sikt (uker) eller -80 ° C for langvarig (måneder); ikke fryses igjen puré for gjenbruk (som bakterier kan blomstre og skade ormer).
MERK: Lever ikke bør inneholde hormoner eller antibiotika og fortrinnsvis ikke tidligere frosset. Sentrifuger puré før frysing (eller før foring) for å fjerne luft og hindre at maten i å flyte. Mat bør synke til bunnen av beholderen. 1 ml av puré er tilstrekkelig for 500-1,000 ormer.

Utveksling vann en gang per uke med friskt orm vann for både kolonier og eksperimenter. Koloni beholdere bør også tørkes av med en ubleket papirhåndkle (for å fjerne slim rester som felle avfall) en gang i uken for sultne ormer, eller to ganger i uken for å mate ormer (2 timer etter foring, og igjen 2 dager senere). For å beholde biofilmen Tørk ikke mer enn 80% av beholderen.

Flytt ormer mellom beholderne (eller kirurgi SETUp) ved hjelp av en overføring pipette. For å frigjøre ormer klebet til beholderoverflater, spruter vann over / bak ormen for å frigjøre det fra overflaten. Deretter suger opp snekken inn i pipetten, under forsøk på å holde snekken i de nederste tomme (tynnere) delen av pipetten.

1. Motkrefter pipetter med en liten mengde orm vann før suge dem opp.
2. Prøv å flytte vannet rundt ormen, snarere enn ormen seg selv, for å unngå å rive soft-bodied ormer ved å berøre dem med pipetten.
3. Hold eksperimentelle retter dekket med mindre overføre ormer eller skifte vann.

2. Fremstilling

1. Stopp fôring ormer minst en uke før forsøkene.
   1. Velg ormer som ikke har blitt fôret i ≥1 uke og er minst 5-7 mm i lengde. Overfør ormer til en petriskål 2/3 full av orm vann, og bekreft ormen lengden ved å skyve en linjal under fatet. Mål wOrms mens trukket helt ut og bevege seg.
      MERK: Mens mindre (5-7 mm) ormer fungere bedre når det utføres påfølgende immunfluorescens og in situ hybridisering analyser, større ormer (8-10 mm) er lettere å arbeide med - særlig når man lærer å ablate.
   2. Sørg for at ormer er hel, uskadet, og ikke nylig regenererende.
      MERK: Regenerering ormer vil ha vesentlig lettere (eller ingen) pigment i hode- og / eller haleområdet sammenlignet med normale ormer.
   3. Hvis du utfører RNAi eller farmakologisk behandling på ormer, gjør det på dette punktet. Hvis ormer ble matet som en del av behandlingen (som for RNAi), vente i minst 7 dager etter den siste tilførselen før de fortsetter til trinn 2.2.
2. Rengjør arbeidsområdet og dissekere mikroskop base med 70% etanol og la det tørke helt. Sett fatet av utvalgte ormer til venstre for omfanget. Til høyre for rekkevidden, plasserer et par # 5 tang, en 31 G5 / 16-inch insulin nål med en 1ml sprøyte, og en ren overføring pipette.
   1. Sørge for at instrumentene blir holdt fra å berøre benken (som kan innføre forurensninger). Bruke et stivt element (slik som en spisepinne hvile) for å holde den tang, nål, og pipette ren. Alternativt kan plassere instrumenter på toppen av en frisk brun (ubleket) papirhåndkle.
      MERK: Disse og påfølgende instruksjonene er skrevet som de hører til høyrehendte personer. Venstrehendt enkeltpersoner bør reversere høyre / venstre retninger.
3. Ved siden av den arbeidsplass, plassere en boks av ikke-loende vev kluter, en kilde for friskt vann orm, og noen ekstra overføringspipetter (beskyttet mot toppen av benken). Sted orm vann i en plastvaskeflaske for å lette dispensering. Også plassere et merket 12-brønns plate (eller 100 mm Petri skål) på høyre side av rammen for å samle ablasjon dyr.
4. Ved anvendelse av en skreddersydd Peltier-plate for å immobilisere ormer, plasserer Peltier platen inn i fordypningen i than foten av disseksjonsmikroskop og justere utgangen på likestrømskilden til arbeidsflaten av Peltier platen er tilstrekkelig kjølig (typisk ~ 5 V) .Alternatively, foreta en kald plate ved å fylle en 100 mm Petri skål ½ full med vann og fryse i minst 24 timer. Kast lokket og plassere i bunnen av 100 mm skål i bunnen av den dissekere omfang, deretter plassere lokket på en 60 mm Petri skål opp ned direkte på overflaten av isen (figur 1A).
   1. Etter at vannet har frosset på 100 mm skål, kan en "vulkan" av is vises i midten av platen. Hvis dette skjer, bruker et barberblad for å skrape is flate, for å fjerne eventuelle ujevnheter fra overflaten.
      MERK: Under operasjoner isen vil smelte, noe som gjør ablations mye vanskeligere. Forbered flere is retter på forhånd, og erstatte frosne seg for å smelte seg under analysen så snart lokket på 60 mm fatet begynner flytende.
5. Klargjørkirurgi overflaten. Skjær en 5 cm x 10 cm stykke av plastfilm parafin (4 ^cm2 ved bruk av petriskålen kald plate) og plassere den på midten av det immobiliserende enheten. Fold en lofri vev tørke inn i et firkantet omtrent 2 cm ² og plassere den på toppen av filmen. Klipp et stykke hvitt filterpapir 1,5-2 cm ² og legg den på toppen av tørke. Se figur 1B-1E.
   1. Holde den foldede tørke på plass med en behansket finger, og bruk orm vann til lett fuktet den tørke for å sikre at den forblir foldet. Bruk side av en overføring pipette for å rulle tørke flate.
      MERK: Kald temperatur bidrar til å holde ormer fra å flytte. Arbeider "tørr" hjelper også på immobilisering. Vevet tørke virker for å transportere vann gjennom filterpapir, holde ormen fuktig under operasjonen uten å tillate ormer for å tørke helt ut (som er dødelig).

3. Kirurgisk ablasjon

1. Bruk en overføringspipetten å plassere påe orm ryggsiden opp på filterpapir. Slå på lyskilden og lede svanehalser, slik at lyset er fokusert på ormen. Juster dissekere omfang fokus og forstørrelse slik at øynene er godt synlig (hele ormen trenger ikke å være i sikte); 5X forstørrelse er et godt utgangspunkt. Orientere ormen ved å dreie parafinfilm, slik at hodet peker mot forskeren (mot fronten av mikroskop), vinklet 30-40 grader til høyre.
   1. Unngå bruk av sterkt lys for å forhindre at overskytende orm bevegelse. Planarians vise negative phototaxis og vil forsøke å unngå sterkt lys.
   2. Hvis ormen er plassert ventrale side vendt opp (med faryngeale åpning synlig), bruker den matte side av tang til forsiktig reposisjonere orm ryggsiden opp (med øyne synlige). Unngå nærmer dyret med den skarpe spissen av tang for å minimalisere muligheten for riving gjennom mykt vev når reposisjonering dyret.
2. Hold en frisk nål / sprøyten i den høyre hånd som om det var en penn (mellom tommelen og pekefingeren). Avstive venstre tommelfinger mot Peltier platen (eller petriskål kald plate), og bruke venstre tommelfinger som et dreiepunkt på hvilken bunnpartiet av sprøyten vil hvile (figur 2A). Se gjennom mikroskop, og sørge for at skrå av nålen er synlig.
   MERK: Needles er veldig skarpe. Vær forsiktig når du håndterer dem. Iført latex eller nitrilhansker kan tilby noen beskyttelse.
   1. Bruk venstre tommelfinger for å bidra til å holde nålen / sprøyten jevn gjennom hele prosedyren og unngå håndhilser.
   2. Danner en vinkel på omtrent 40 ° med den venstre tommelfinger og venstre pekefinger (med pekefingeren på den kirurgi overflaten) for å bidra til å holde kirurgi overflate stabilt.
3. Medskråkanten av nålen vendt oppover (som en skje), posisjonere kanylen vinkelrett på (figur 2B) i øyet. Bruk tuppen av nålen til forsiktig trenge gjennom tynne lag av vev som ligger over den optiske koppen (hvitt, pigmentert region) i øyet, øste fra høyre til venstre. Veldig forsiktig fjerne pigment vev ligger innenfor syns koppen, tar seg ikke å punktere bunnen eller ødelegge grenser syns cup.
   1. Hvis ormen har vært på filterpapir for> 1-2 minutter ved et hvilket som helst tidspunkt under fremgangsmåten, tilsettes en dråpe av orm vann for å rehydrere ormen.
      MERK: Dehydrering vil øke ormen mottakelighet for ripping skader.
4. Gjenta trinn 3.3 inntil alle de svarte pigmenterte vev (pigment-celler), så vel som alle de hvite vev av den optiske koppen (dendrittene fotoreseptorcellene), blir fjernet. Fjern utskårede vev fast til enden av nålen ved forsiktig å tørke med en vev tørke. Hvis dobbel eye ablasjon er ønsket, ablate det andre øyet på dette punktet.
   NB: For å unngå skade, kan nåler renses ved å gripe nålen med en ren klut tørk holdt med tommelen og pekefingeren, og deretter ved å bruke den andre hånden for å trekke nålen gjennom tørke bort fra tommelen og pekefingeren. Alternativt kan nålen bli tørket på overflaten av en våt vev tørke og undersøkt med hensyn til renhet.
5. Når er ferdig, bruker en overførings pipette for å flytte ormen til en merket skål inneholdende friskt orm vann. Ved analyse av gruppedata, plassere opptil 20 ormer i en enkel 100 mm petriskål. Ved sporing regenerasjon under de samme individer over tid, å plassere en orm i hver brønn av en 12-brønners plate. Når alle ormer er overført, skyll ormer ved å fjerne all orm vann fra retter / brønner og erstatte med mer frisk orm vann.
   1. For å fjerne ormer fra filteret, returlast i pipetten sammen med en liten mengde av orm vann og slipper vann inn på ormen. Dette bør løfte than orm av filterpapiret, skal umiddelbart sugd inn i pipetten for overføring.
6. Inkuber eksperimenter ved ~ 20 ° C (romtemperatur) beskyttet fra lys og følge den regenerative prosessen.
   MERK: Worms kan lagres i et temperaturregulert inkubator for å opprettholde en konstant temperatur, men dette er ikke strengt tatt nødvendig. De fleste romtemperaturer varierer bare med 5 ° C, noe som ikke vil påvirke ormen evne til å regenerere.
7. Dersom det er ønskelig, fikse ormer for immunohistokjemi (se figurene 3-4) og / eller in situ hybridisering analyse av genekspresjon. Ulik fiksering finnes for planarian immunhistokjemi ^{18, 19, 20} og in situ hybridisering ^{21, 22, 23} protokoller.
8. Når eksperimentene er avsluttet, sacrifice levende ormer ved å fjerne orm vann fra skålen og erstatte med 70% etanol. Inkuber ormer i 3-5 min, sjekker for ormer for lyse og slå gråaktig.
9. Plasser ikke-behandlede ormer i normal avfall gang ofret. Unngå å innføre levende ormer i miljøet, spesielt ikke-stedegne arter.

Representative Results

For det første 1-2 timer etter kirurgi, kan dyrene oppviser nedsatt bevegelse sammenlignet med intakte ormer (men de vil fortsatt bevege seg). Om ønskelig vil mark eter i løpet av 24 timer etter operasjonen (for eksempel, for RNAi mating). Når du følger øye regenerering i de samme individene over tid, sørg for å ta et bilde av hver ormen både før operasjonen (intakt) og en time etter ablasjon (HPA). Av 4 dager etter ablasjon (DPA) regenerering pigmentceller skal være synlig, og ved 14 dpa hele øyet vil ha fullstendig regenerert (figur 3A-B). Dette inkluderer fotoreseptoren neuroner og deres innervasjon til hjernen (figur 3C), i tillegg til funksjonell restitusjon av det visuelle systemet (Figur 4A-C). Vellykket ablations vil ikke forstyrre de underliggende vev i hjernen (figur 4D-E), og heller ikke innføre andre skader på dyret (figur 5A). mislykkede ablationsomfatte dyr med: en altfor stor utskjæring som forbinder de to øyne (figur 5B), rives til den laterale kant av dyr (figur 5C), og / eller viklede områder som erter gjennom den ventrale epidermis (figur 5D). Videre mislykkede ablations omfatte ufullstendig fjernelse av hele den optiske kopp, som består av både de hvite pigmenterte vev og de svarte pigment cellene (figur 5E-F).

Figur 1: kirurgi forberedelse. (A) Diagram av kald platekonstruksjon, ved hjelp av bunnen av en 100 mm Petri skål (fylt med is) og lokket på en 60 mm Petri skål (plassert opp ned på isen). (B) Diagram av operasjonen overflate, laget av en stabel av (topp til bunn) hvitt filterpapir, et fuktig foldet vev tørke, og et stykke av parafin film.(C) Operasjonen satt opp (for høyrehendte). A: dissekere omfang, B: svanehals belysning, C: kirurgi overflate, D: Peltier plate, E: skål av 5-7 mm ormer klar for ablasjon, F: Øyevaskflaske orm vann, G: spisepinne resten holding ren overføring pipette H: spisepinne resten holding nål / sprøyte, i: spisepinne hvile holding tang, J: beholder av ekstra overføringspipetter. (D) Custom Peltier-plate konfigurasjonen. (E) petriskål kald plate konfigurasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Plassering av hender og nål / sprøyte i løpet av ablasjon. (A) Plassering av hender (for høyrehendte). Legg merke til at den venstre tommelfinger brukes til å støtte sprøyten (holdti den høyre hånd) for å minimere bevegelse. (B) plassering av nålen i forhold til ormen øye. Merk at den skrå flaten av nålen peker oppover. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: ablated planarian øyne regenerere. Morfologi Schmidtea mediterranea planarians etterveksten øyne følgende (A) dobbelt øye ablasjon og (B) ett øye ablasjon. (C) Immunhistokjemi viser regenerering av fotoreseptoren nevroner (anti-arrestin) ifølge ett øye ablasjon. Intakte ormer er vist før kirurgi, og regenererer er vist på dagene 4 og 14 etter ablasjon. For ett øye ablations, var det venstre øyet etblated og høyre øye tjener som en intern (uskadet) kontroll. Røde pilspisser: ablasjon øyne. Skala Stolper = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Funksjonell utvinning av det visuelle systemet etter ablasjon. (A - C) Funksjonell analyse for å teste planarian fotofobi. (A) Intakte ormer unngå å reise gjennom områder av lys, for eksempel en base for en grønn laserpeker. (B) 24 timer etter ablasjon, "blind" dobbelt øye ablasjon ormer reise gjennom lyse flekker. (C) 7 døgn etter ablasjon, har doble øye ablateres ormer regenerert deres visuelle system tilstrekkelig til å gjenopprette lys unngåelse. Gul pilspiss: avvikende atferdal respons. (D - E) Eye ablasjon er begrenset til vev av den optiske koppen, og forstyrrer ikke den underliggende hjernevevet. (D) Immunhistokjemi viser hjerne-arkitektur (anti-synapsin) er uforandret fra før ablasjon til en timer etter ablasjon. (E) hematoxylin og eosin (H & E) farging ved en timer etter ablasjon i et tversgående snitt som viser skaden alt vesentlig er begrenset til området av den optiske ablatert koppen. Høyre øye (med svart pigmentceller) tjener som intern kontroll. Røde pilspisser: ablasjon øyne. Skala streker = 1 mm (AC) 1 mm, 100 uM i (DE). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Kjennetegn på vellykkede og mislykkede ablations. (A) Vellykkede enkle og doble øye ablations (ved 5 minutter etter ablasjon) har sår som er omtrent lik i størrelse til den opprinnelige optiske koppen. (B - E) Mislykket ablations: (B) for mye vev er fjernet eller såret forbinder de to øyne, (C) sårstedet tårer på og strekker seg til margin, (D) såret er for dyp, og dytter gjennom fra dorsal (D) til den ventrale (D') side, og (E - F) ikke alle de optiske kopp vev er fjernet, visualisert både morfologisk (E) og ved hjelp av anti-arrestin flekkdannelse på fotoreseptoren nevroner (F). Gule pilspisser: avvik ablations. Gule sirkler: ablasjon språk. Skala Stolper = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette øyet ablasjon teknikk forbedrer på dagens metoder (for eksempel hulle) ved å ekskludere hjernevev og begrense eksisjon i hovedsak til den øyevev. Med praksis, kan denne teknikken utføres av de fleste individer, fra teknikere opplevde i microsurgeries til uerfarne men pliktoppfyllende studentene. Det anbefales at denne teknikken bli praktisert mange ganger før anvendelse ablations i eksperimenter, inklusive (hvis mulig) bekreftelse på fullstendig fjerning av alle øyevev ved immunhistokjemi eller in situ hybridisering for øye markør (er) ^{4, 5, 13.} Den mest kritiske trinn i denne protokollen er den øste ut av vev. Det er viktig å ikke fjerne enten for mye eller for lite vev. Dette kan unngås ved å ikke øste for dypt med nålen, for å unngå å trenge gjennom til den ventrale side av snekken. Tuppen av needle skal kun settes inn ca 0,4 mm dyp, og den skrå delen av nålen bør aldri gå hele veien gjennom øyet. Spesiell forsiktighet bør tas for å ikke skade den skjøre vev mellom de to øyne (den mediale kanten av sort farge regionen i hvert øye representerer grensene til hvert øye). Skader mellom øyet og distal margin av ormen bør også unngås. Mindre ormer er mer sannsynlig å rive eller utilsiktet skadet, så bruk av større ormer (spesielt for praksis) anbefales. De viktigste begrensninger ved denne teknikken er at det er forholdsvis tidskrevende (og ikke egnet for high-throughput skjermer), og det krever en innledende investering i å praktisere for å sikre nøyaktigheten av resultatene. Men med praksis 10 øyne kan ablated i ~ 15 min.

Et viktig område for feilsøking er i tråd planarians fortsatt under prosedyren. De to hovedgrunner ormer ikke er immobilisert i tilstrekkelig grad til å utføre ablationser (a) for mye vann og (b) tap av kald temperatur. (A) overskytende vann som planarian bassenger på operasjonen overflaten ved overføring av ormer vil tillate ormer for å bevege og komplisere operasjonen. Operasjonen overflate (lofritt vev tørke og filterpapir) skal forbli fuktig bare. Hvis på noe tidspunkt under prosedyren på tørkeren blir mettet med orm vann, bør det enten erstattes eller en overføring pipette kan brukes til å forsiktig fjerne overflødig væske fra vevet tørk (alltid trekke fra tørke og ikke filterpapir). Tissue kluter kan også brukes for å fjerne overskuddsvann pooling på operasjonen overflaten. Denne prosessen må kanskje gjentas mange ganger, avhengig av antall ormer som ablated. (B) Hvis du bruker petriskålen kald plate satt opp, må du huske å erstatte den kalde plate så snart isen begynner å smelte og 60 mm Petri skål lokket begynner å flyte. Dette vil sikre både en stabil operasjon overflate og en passende kald overflate. Alternativt, hvis ved hjelp av Peltier platensatt opp, være oppmerksom på at etter 45 minutter til 1 time bruk, vil varmen i de ytre ringene overvinne den kalde platen i midten og alle kjølingen går tapt. Hvis dette skjer, slår du av Peltier plate for 5-10 min å tillate det å komme til romtemperatur før du gjenopptar ablations.

Et annet område av feilsøking er under ormen overføring mellom parabolen og kirurgi overflaten og tilbake igjen. Hvis ablasjon ormer er vanskelig å fjerne fra filterpapiret, plassere en dråpe orm vann på ormen før den flytende basseng på toppen av filterpapiret. Ormer kan da bli sugd inn i overføringspipetten som vanlig. Hvis problemene vedvarer, kan du prøve å bla orm på sin ventral side først (ved hjelp kjedelig side av tang). Hvis en orm blir sittende fast inne i overføringspipetten, er dette vanligvis et tegn på at for mye vann har blitt tatt opp (ormer bør trekkes inn i overføringspipetten ikke lenger enn ca en tomme). For å fjerne en orm fast i en overførings pipette, utarbeide 1-2 ml orm water inn i pipetten, slik at ormen er dekket med vann. Fast flick den side av pipetten inntil snekken løsner fra veggen av pipetten og er flytende.

Hvis nålen blir sløv, erstatte med en ny nål / sprøyte. Vurder å bytte nålen etter bruk for å ablate ≥30 øyne. Overdreven fjerning av avkuttede vev ved å tørke med en vev tørke kan også kjedelig nålen, noe som gjør ablations vanskeligere. Det er greit hvis resected vev holde seg innenfor den skrå delen av nålen gjennom hele prosedyren (selv på tvers av flere dyr). Bruk alltid en ny kanyle / sprøyte ved skifting mellom ormer av forskjellige tilstander (f.eks villtype sammenlignet med RNAi ormer), så vel som når begynnelsen nye ablasjon sesjoner (dvs. på forskjellige dager).

Denne kirurgiske øye ablasjon teknikk er et kraftig middel for å undersøke lys-indusert oppførsel (og deres genetiske og nevrologiske basis) i planarians, særlignår kombinert med medikamentell behandling eller RNA-interferens. Eye ablasjon er også en god metode til å belyse de mekanismer som regulerer endogene planarian øye regenerering (og øye stamcelle vedlikehold og differensiering) in vivo. Som de fleste virveldyr har svært begrensede evner til å regenerere øyet vev, forstå hvordan planarians er i stand til å regenerere deres øyne vil være viktig for å identifisere mulige mekanismer for oversettelse til fremtidige behandlinger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional