Kirurgisk ablation analys för att studera ögon Regeneration i Planarians

Summary

Detta protokoll visar hur man konsekvent excidera planarian ögon (optiska koppar) utan att störa omgivande vävnader. Med användning av en insulin nål och spruta, antingen den ena eller båda ögonen kan ablateras för att underlätta undersökningar av de mekanismer som reglerar ögonregenere, utvecklingen av visuell regenerering, och den neurala grunden för Ijusinducerad beteende.

Abstract

I studien av vuxna stamceller och regenerativa mekanismer, planarian Plattmaskar är en stapel in vivo modellsystem. Detta beror till stor del på deras rikliga pluripotenta stamcellspopulationen och förmåga att regenerera alla cell- och vävnadstyper efter skador som skulle vara katastrofalt för de flesta djur. Nyligen har planarians vunnit popularitet som en modell för ögat förnyelse. Deras förmåga att regenerera hela ögat (bestående av två vävnadstyper: pigmentceller och fotoreceptorer) medger dissektion av de mekanismer som reglerar visuella systemet regenerering. Ögon ablation har flera fördelar jämfört med andra tekniker (såsom halshuggning eller hålstans) för behandlingen av ögonspecifika vägar och mekanismer, den viktigaste av dessa är att regenerering är till stor del begränsad till enbart ögonvävnader. Syftet med den här videon artikel är att visa hur tillförlitligt att ta bort planarian optisk cup utan att störa hjärnan eller omgivande vävnader.Hanteringen av maskar och underhåll av en etablerad koloni beskrivs också. Denna teknik använder en 31 G, 5/16 tum insulin nål för att kirurgiskt ösa ut den optiska kopp planarians immobiliserade på en kall platta. Denna metod omfattar både enkel och dubbel ögon ablation, med ögonen regenere inom 1-2 veckor, vilket möjliggör ett brett spektrum av applikationer. I synnerhet kan denna ablation teknik enkelt kombineras med farmakologiska och genetiska (RNA-interferens) skärmar för en bättre förståelse av regenerativa mekanismer och deras utveckling, ögon stamceller och deras underhåll och phototaxic beteendereaktioner och deras neurologiska basis.

Introduction

Planarians är en kraftfull modellorganism för att studera adulta stamceller medierad förnyelse. Dessa icke-parasitiska sötvattensplattmaskar besitter förmågan att regenerera alla eventuella saknade vävnader, inklusive deras centrala nervsystemet och hjärnan ^en. Studerats så långt tillbaka som 1700-talet ^2, de tekniska framstegen i planarian fältet under de senaste 10-15 åren (såsom ett sekvenserat genom, hybridisering in situ, immunohistokemi, RNA-interferens (RNAi), och transkriptomik) har uppdaterat denna historiska modellorganism . Specifikt har planarians nyligen vunnit popularitet som en framväxande modell för ögonforskning ^3.

Planarians har prototypiska ögon med endast två vävnadstyper, fotoreceptor neuroner och pigmentceller; detta har möjliggjort karakteriseringen av dess ögonstamcellspopulation och visade att många av samma gener som reglerar vertebrat ögon deveckling är konserverade i planarians ^{4, 5.} De optiska koppar är belägna dorsalt och består av de vita, opigmenterade dendriter av fotoreceptor nervceller och de halv månens svart pigmentceller, och ögonen innerverar hjärnan via en optisk chiasm. Förutom att vara en modell för att belysa regenerativa processer ^6, är väl lämpad för att studera utvecklingen av visuella mekanismer ⁷ den planarian ögat, beteendemässiga reaktioner för ljus (planarians uppvisar negativa phototaxis) ^8, och den neurologiska grundval av beteende ^9.

Ögonregenerering i planarians har till stor del undersökts i två huvud sammanhang: som en del av huvudregenerering efter dekapitering ^{4, 10,} och efter excision av bara ögonvävnaderna ^{11, 12 13, 14,} även om vissa studier har också utförts amputationer strax bakom ögonen (partiell halshuggning) ^15. Men alla dessa metoder innebär förlusten av många andra än bara ögat vävnader (t.ex. hjärna, tarmar och nephridia), potentiellt komplicerande tolkning av resultaten. Ögat ablation Protokollet presenteras här begränsar excision till ögonvävnaderna (specifikt exklusive hjärnan), vilket resulterar i data som är mer specifika för ögat. Dessutom, till skillnad dekapiterade maskar som tar 7-14 dagar för att påbörja matning, kommer ögon ablateras maskar foder inom 24 h från ablation ^12, vilket tillåter RNAi-experiment (där RNAi levereras via mat) som skall performed samtidigt.

Även ögon ablation är tekniskt svårare att framgångsrikt utföra än halshuggning, har aktuella studier som involverar ögat excision som inte ingår detaljerade instruktioner om sina rutiner. Målet med den här videon artikel är att göra det möjligt för forskare att konsekvent ta bort planarian optisk cup utan att störa de underliggande hjärnvävnad och ta bort så få andra vävnader som möjligt. Denna metod kan användas för både dubbel och enkel ögon ablation och kan tillämpas på ett brett spektrum av undersökningar. Liksom de flesta regenereringsanalyser är ögon ablation väl lämpad för kombination med både farmakologiska och genetiska (RNAi) skärmar, samt beteendestudier. Här beskriver vi metoder för hantering av maskar, upprätthålla en planarian koloni, och ögat ablation tekniken i sig.

Protocol

1. Animaliska Kultur och Hantering

OBS: Detta protokoll använder Schmidtea mediterranea, en diploid planarian arter med ett sekvenserat genomet ^{16, 17} som ofta används för regenerering forskning. Emellertid är analysen lika framgångsrika med andra arter, såsom Dugesia tigrina och dugesia dorotocephala (som är kommersiellt tillgängliga).

1. Upprätthålla maskar i "masken vatten" tillverkad av 0,5 g / L havet salter i ultrarent (eller filtrerat avjoniserat) vatten. Använd sterila polypropylen eller glasbehållare för att hålla masken vatten. Se Kompletterande fil 1 för detaljer om förberedelse mask vatten.
   OBS: Använd aldrig tvål för att rengöra behållare (eller andra förnödenheter) som tvål är giftigt för maskar; Torka i stället med 70% etanol och låt lufttorka. <ol>
2. Använd handskar när du arbetar med planaria för att skydda dem från föroreningar.
   OBS: Worms är mycket känsliga för miljögifter och kemikalier, inklusive tvål, blekmedel, schampo, balsam och handkräm.

Hus kolonier i polypropen matbehållare, med locket lämnas delvis öppen för luftväxling vid ~ 20 ° C (rumstemperatur). Lagra experimentella maskar i antingen petriskålar (20 maskar per 100 mm skål) eller icke-behandlade vävnadsodlingsplattor (1 mask per brunn, för 12-brunnsplattor). För att minska stress, hålla båda kolonier och experiment i mörker.
OBS: Colonies får inte ha mer än 500-1000 maskar per liter mask vatten. För experiment, lämnar locken helt på plats, eftersom luftflödet är utformad i dessa rätter.

Mata icke-experimentella maskar gång i veckan med mosad ekologiskt nötkött eller kycklinglever genom att släppa puré från en överföringspipett, placera droppar av livsmedel i hela behållaren. Låt maskar 2 h för att konsumera mat imörkt innan rensa behållare (se steg 1,4). Före användning, lagra puré vid -20 ° C för kortsiktiga (veckor) eller -80 ° C för lång sikt (månader); inte frysas puré för återanvändning (bakterier kan blomma och skada maskar).
OBS: Lever bör innehålla några hormoner eller antibiotika och helst inte tidigare fryst. Centrifug puré före frysning (eller före utfodring) för att avlägsna luft och förhindra livsmedel från flytande. Mat ska sjunka till botten av behållaren. 1 ml puré är tillräcklig för 500-1000 maskar.

Exchange vatten en gång per vecka med färskt mask vatten för både kolonier och experiment. Koloni behållare bör också torkas av med en oblekt hushållspapper (för att avlägsna slem rester som fångar avfall) en gång i veckan för att svälta maskar eller två gånger i veckan för att mata maskar (2 timmar efter utfodring och återigen 2 dagar senare). För att behålla biofilmen, inte torka mer än 80% av behållaren.

Flytta maskar mellan behållarna (eller kirurgi setup) med användning av en överföringspipett. Till fria maskar vidhäftade behållarytor, spruta vatten över / bakom masken för att frigöra det från ytan. suger sedan upp masken i pipetten, samtidigt som man försöker hålla masken i botten tum (tunnare) delen av pipetten.

1. Bakladdning pipetter med en liten mängd av masken vatten innan suga upp dem.
2. Försök att flytta vattnet runt masken, snarare än masken själv, för att förhindra att riva mjuka arbetsföra maskar genom att röra dem med pipett.
3. Håll experimentella rätter omfattas inte överföra maskar eller byta vatten.

2. Beredning

1. Sluta mata maskar minst en vecka före experimenten.
   1. Välj maskar som inte har fötts upp för ≥1 vecka och är minst 5-7 mm i längd. Överför maskar till en petriskål 2/3 full av mask vatten och bekräfta mask längd genom att skjuta en linjal under skålen. mäta wOrms medan helt utsträckt och flytta.
      OBS: Även mindre (5-7 mm) maskar fungerar bättre när du utför efterföljande immunofluorescens och in situ hybridisering analyser, större maskar (8-10 mm) är lättare att arbeta med - särskilt när man lär sig att avlägsna.
   2. Se till att maskar är hela, oskadade och inte nyligen regenere.
      OBS: Regenerating maskar kommer att ha mycket lättare (eller ingen) pigment i huvudet och / eller svansregionen jämfört med normala maskar.
   3. Om du utför RNAi eller farmakologisk behandling på maskar, gör det på denna punkt. Om maskar matades som en del av behandlingen (som för RNAi), vänta i minst 7 dagar efter den sista matningen innan den fortsätter till steg 2,2.
2. Rengöra arbetsutrymme och dissektionsmikroskop bas med 70% etanol och låt den torka helt. Placera skålen utvalda maskar till vänster om omfattningen. Till höger om ramen, placera ett par # 5 pincett, en 31 G 5/16 tum insulin nål med en 1ml spruta, och en ren överföringspipett.
   1. Se till att instrumenten hålls vidrör bänken (som skulle kunna införa föroreningar). Använd en styv objekt (till exempel en chopstick vila) för att hålla pincett, nål och pipett ren. Alternativt, placera instrument på toppen av en ny brun (oblekt) pappershandduk.
      OBS: Dessa och efterföljande instruktioner skrivs som de avser högerhänta personer. Vänsterhänta individer bör vända vänster / höger riktningar.
3. Bredvid arbetsutrymme, placera en låda med luddfritt vävnads våtservetter, en källa av färsk mask vatten och några extra överföringspipetter (skyddade från bänk). Placera masken vatten i en plasttvättflaska för att underlätta dispensering. Placera också en märkt 12-brunnsplatta (eller 100 mm Petri skål) till höger om utrymmet för uppsamling ablaterade djur.
4. Om du använder en skräddarsydd Peltier platta för att immobilisera maskar, placera Peltier plattan i fördjupningen i than basen av dissektionsmikroskop och justera utgången på likspänningskällan tills arbetsytan av Peltier-plattan är tillräckligt kall (typiskt ~ 5 V) .Alternatively, gör en kall platta genom att fylla en 100 mm Petri skål ½ fullt med vatten och frysa i minst 24 timmar. Kassera locket och placera botten av 100 mm skål på basen av den dissekera omfattning, sedan placera locket på en 60 mm Petri skål uppochned direkt på ytan av isen (Figur 1A).
   1. Efter att vattnet har frusit i 100 mm skålen, kan en "vulkan" is visas i mitten av plattan. Om detta händer, använda ett rakblad för att skrapa is flat, för att avlägsna eventuella ojämnheter från ytan.
      OBS: Under operationer isen smälter, vilket gör ablationer mycket svårare. Förbered flera is rätter i förväg, och ersätta frysta ettor för att smälta dem under analysen så snart locket på 60 mm skålen börjar flyta.
5. Förberedkirurgi yta. Skära en 5 cm x 10 cm stycke av plast paraffinfilmen (4 cm ² om använder petriskålen kall platta) och placera den på mitten av immobiliseringen anordningen. Vika en luddfri vävnaden torka till en fyrkant ungefär 2 cm ² och placera den på toppen av filmen. Skära en bit av vitt filterpapper 1.5-2 cm ² och placera den ovanpå den torka. Se figur 1B-1E.
   1. Håll vikta torka på plats med en handske finger och använda mask vatten för att lätt dämpa torka för att säkerställa att det förblir vikas. Använd sidan av en överföringspipett att rulla torka plant.
      OBS: Kallt temperaturen hjälper till att hålla maskar från att röra sig. Att arbeta "torr" bidrar också till immobilisering. Vävnaden torka verkar för att suga vatten genom filterpapper, att hålla masken fuktig under operation utan att tillåta maskar för att torka ut helt (vilket är letal).

3. Kirurgisk Ablation

1. Använd en överföringspipett att placera påe snäckryggsidan upp på filterpapperet. Vrid ljuskällan på och rikta Goosenecks så att ljuset fokuseras på masken. Justera dissekera omfattning fokus och förstoring så att ögonen syns tydligt (hela masken behöver inte vara med tanke); 5X förstoring är en bra startpunkt. Orientera masken genom att rotera paraffinfilmen så att huvudet är riktat mot forskare (mot framsidan av mikroskop), vinklade 30-40 grader åt höger.
   1. Undvik att använda ljus för att förhindra överskotts mask rörelse. Planarians uppvisar negativa phototaxis och kommer att försöka undvika starkt ljus.
   2. Om masken är placerad ventrala sidan uppåt (med svalg öppnande synligt), använd matta sidan av tången för att försiktigt flytta masken ryggsidan uppåt (med ögonen synliga). Undvik att närma sig djuret med den vassa spetsen på pincett för att minimera risken för att riva genom mjuka vävnader vid ompositionering djuret.
2. Håll en ny nål / spruta i högra handen som om det vore en penna (mellan tumme och pekfinger). Spänna den vänstra tummen mot Peltier plattan (eller petriskål kall platta), och använda den vänstra tumme som en stödpunkt på vilken bottendelen av sprutan kommer att vila (figur 2A). Titta i mikroskopet, och se till att avfasning av nålen är synlig.
   OBS: Needles är mycket vassa. Var försiktig när du hanterar dem. Bära latex eller nitril kan ge ett visst skydd.
   1. Använd den vänstra tumme för att hålla nålen / sprutan stadigt under hela förfarandet och undvika skakar hand.
   2. Bildar en vinkel av ca 40 ° med den vänstra tummen och vänstra pekfinger (med pekfingret på kirurgi ytan) för att hjälpa till att hålla operationen ytan stabil.
3. Medfasningen på nålen uppåt (som en sked), placera nålen i rät vinkel mot ögat (Figur 2B). Använda nålspetsen för att försiktigt penetrera tunna lager av vävnad som ligger över den optiska koppen (vit, opigmenterad region) i ögat, ösa från höger till vänster. Mycket försiktigt bort någon pigmenterad vävnad som ligger inom den optiska koppen, noga med att inte punktera botten eller förstöra gränser optisk cup.
   1. Om masken har varit på filterpapperet för> 1-2 min vid vilken punkt som helst under förfarandet, tillsätt en droppe av snäck vatten för rehydratisering masken.
      OBS: Uttorkning ökar masken känslighet för rippning skador.
4. Upprepa steg 3,3 tills alla svarta pigmenterade vävnader (pigmentceller), såväl som alla de vita vävnader i optiska kopp (dendriter av fotoreceptorceller), avlägsnas. Ta exciderade vävnader fastnat till slutet av nålen genom att försiktigt torka med en vävnad torka. Om dubbel eye Ablation önskas, avlägsna det andra ögat vid denna punkt.
   OBS: För att undvika skador, kan nålar rengöras genom att ta tag i nålen med en ren vävnad torka hålls med tummen och pekfingret, sedan använda andra handen för att dra nålen genom torka bort från tummen och pekfingret. Alternativt kan nålen torkas på ytan av en våt tissue torka och undersöktes för renlighet.
5. När du är klar, använd en pipett för att flytta masken till en märkt maträtt innehåller färsk mask vatten. Om analysera gruppdata, placera upp till 20 maskar i en enda 100 mm Petri skål. Om spåra förnyelse i samma individer över tid, plats en mask i varje brunn i en 12-brunnar. När alla maskar överförs, skölj maskar genom att ta bort alla masken vatten från rätter / brunnar och ersätta med mer färsk mask vatten.
   1. För att ta bort maskar från filtret, skjuta upp den pipetten med en liten mängd av snäck vatten och frigöra vatten på masken. Detta bör lyfta tHan mask av filterpapper, för att omedelbart sugs in i pipetten för överföring.
6. Inkubera experiment vid ~ 20 ° C (rumstemperatur) skyddat från ljus och följer den regenerativa processen.
   OBS: Worms kan lagras i en temperaturkontrollerad inkubator för att hålla en konstant temperatur, men detta är inte absolut nödvändigt. De flesta rumstemperaturer varierar endast av 5 ° C, vilket inte kommer att påverka maskens förmåga att regenerera.
7. Om så önskas, fixa maskar för immunhistokemi (se figurerna 3-4) och / eller in situ-hybridisering analyser av genuttryck. Olika fixerings metoder finns för planarian immunohistokemi ^{18, 19, 20} och in situ-hybridisering ^{21, 22, 23} protokoll.
8. När experiment ingås, sacrifice levande maskar genom att avlägsna masken vatten från skålen och ersätta med 70% etanol. Inkubera maskar i 3-5 minuter, kontroll av maskar att lysera och vända gråaktig.
9. Placera icke-behandlade maskar i den normala avfallet gång offras. Undvik att införa levande maskar i miljön, särskilt icke-inhemska arter.

Representative Results

För första 1-2 timmar efter operation, kan djuren uppvisar minskad rörelse jämfört med intakta maskar (men de kommer fortfarande att röra sig). Om så önskas, kommer maskar äta inom 24 h av kirurgi (exempelvis för RNAi utfodring). När efter ögon förnyelse i samma individer över tid, se till att ta ett fotografi av varje mask både före operationen (intakt) och vid en timmar efter ablation (HPA). Av 4 dagar efter ablation (dpa) regenererande pigmentceller ska vara synliga, och genom 14 dpa hela ögat kommer att ha fullt regenererad (Figur 3A-B). Detta inkluderar fotoreceptor neuroner och deras innervation till hjärnan (figur 3C), såväl som funktionell återhämtning av det visuella systemet (figur 4A-C). Framgångsrika ablationer kommer inte att störa de underliggande vävnaderna i hjärnan (Figur 4D-E), inte heller introducera andra skador till djuret (figur 5A). miss~~POS=TRUNC ablationerinkluderar djur med: en alltför stor excision som förbinder de två ögonen (Figur 5B), tårar till den laterala kanten av djuret (figur 5C), och / eller sårställen som peta genom de ventrala epidermis (Figur 5D). Dessutom misslyckade ablationer inkluderar ofullständigt avlägsnande av hela optiska kopp, som består av både vita opigmenterade vävnader och de svarta pigmentceller (Figur 5E-F).

Figur 1: Kirurgi beredning. (A) Diagram av kalla plattan konstruktion, med hjälp av botten av en 100 mm Petri skål (fylld med is) och locket på en 60 mm Petri skål (placeras upp och ned på isen yta). (B) Diagram av kirurgi yta, tillverkad av en stapel av (topp till botten) vitt filterpapper, en fuktig vikta servetten torka, och en bit av paraffinfilm.(C) Operationen inrättas (för högerhänt). A: dissekera omfattning, B: gooseneck belysning, C: kirurgi yta, D: Peltier platta, E: maträtt av 5-7 mm maskar redo för ablation, F: tvättflaska av snäck vatten, G: matpinne vila innehar ren överföringspipett, H: matpinne vila hålla nålen / sprutan, i: matpinne vila innehar pincett, J: behållare med extra överföringspipetter. (D) Anpassad Peltier plattkonfiguration. (E) petriskål kall plattkonfiguration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Position för händer och nål / spruta under ablation. (A) Placering av händer (för högerhänt). Observera att den vänstra tummen används för att stödja sprutan (som höllsi den högra) för att minimera rörelse. (B) Placering av nålen i förhållande till snäck öga. Notera att den avfasade ytan på nålen är vänd uppåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Ablationsbehandlad planarian ögon regenerera. Morfologi av Schmidtea mediterranea planarians förnybara ögon följande (A) dubbel ögon ablation och (B) enda öga ablation. (C) Immunhistokemi visar regenerering av fotoreceptor neuroner (anti arrestinpositiva) efter enda öga ablation. Intakta maskar visas före operation, och regenerat visas vid dag 4 och 14 efter ablation. För enda öga ablationer var vänster öga enblated och det högra ögat tjänar som en intern (oskadade) kontroll. Röda pilspetsar: ablaterade ögon. Skalstrecken = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Funktionell återhämtning av det visuella systemet efter ablation. (A - C) Funktionell analys för att testa planarian fotofobi. (A) Intakta maskar undvika att resa genom områden av ljus, såsom en fläck från en grön laserpekare. (B) Vid 24 h efter ablation, "blinda" dubbel ögon ablaterade maskar färdas genom ljusfläckar. (C) Vid 7 dagar efter ablation, har dubbla ögon ablateras maskar regener deras visuella systemet tillräckligt för att återvinna ljus undvikande. Gul pilspets: avvikande beteendeal svar. (D - E) Ögon ablation är begränsad till vävnader i optiska kopp, och inte stör de underliggande hjärnvävnader. (D) Immunohistokemi visar hjärn arkitektur (anti-synapsin) är oförändrad från tiden före abiation till en h efter ablation. (E) Hematoxylin och eosin (H & E) färgning vid en h efter ablation i ett tvärgående snitt som visar skador är till stor del begränsad till platsen för den ablationsbehandlade optiska kopp. Höger öga (med svarta pigmentceller) tjänar som intern kontroll. Röda pilspetsar: ablaterade ögon. Skalstrecken = 1 mm i (AC) 1 mm, 100 | j, m i (DE). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Kännetecken för lyckade och misslyckade ablationer. (A) Framgångsrika enkel- och dubbelögon ablationer (vid 5 min efter ablation) har sår som är ungefär samma storlek som den ursprungliga optiska kopp. (B - E) Misslyckade ablationer: (B) för mycket vävnad tas bort eller såret förbinder de två ögonen, (C) sårstället tårar och sträcker sig till marginalen, (D) såret är för djup och sticker igenom från dorsal (D) till den ventrala (D') sida, och (E - F) inte alla av de optiska kopp vävnader avlägsnas, visualiseras både morfologiskt (E) och av anti-arrestin färgning av fotoreceptor neuroner (F). Gula pilspetsar: avvikande ablationer. Gula cirklar: ablation plats. Skalstrecken = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta öga ablation teknik förbättrar på nuvarande metoder (såsom hålslag) genom exklusive hjärnvävnader och begränsa excision huvudsakligen ögonvävnaderna. Med lite övning kan denna teknik utföras av de flesta individer, från tekniker med erfarenhet av microsurgeries till oerfarna men samvetsgranna studenter. Det rekommenderas att denna teknik praktiseras många gånger före användning ablationer i experiment, inklusive (om möjligt) bekräftelse av fullständigt avlägsnande av alla ögonvävnader genom immunhistokemi eller in situ hybridisering för ögon markör (er) ^{4, 5, 13.} Det mest kritiska steget i detta protokoll är ösa ur vävnader. Det är viktigt att inte ta bort antingen för mycket eller för lite vävnad. Detta kan undvikas genom att inte skopa för djupt med nålen, för att undvika att tränga igenom till den ventrala sidan av masken. Spetsen på needle ska bara sättas in ca 0,4 mm djup och avfasade delen av nålen ska aldrig gå hela vägen genom ögat. Särskild försiktighet bör vidtas för att inte skada den ömtåliga vävnaden mellan de två ögonen (den mediala kanten av den svarta pigmenterade regionen varje öga representerar gränserna för varje öga). Skador mellan ögat och den distala kanten av masken bör också undvikas. Mindre maskar är mer benägna att rippa eller oavsiktligt skadas, så användningen av större maskar (särskilt för praktik) rekommenderas. De huvudsakliga begränsningarna med denna teknik är att det är relativt tidskrävande (och inte lämpligt för hög genomströmning skärmar), och det kräver en initial investering i öva att säkerställa riktigheten av resultaten. Men med praktiken 10 ögon kan ablateras i ~ 15 min.

Ett stort område för felsökning är i linje planarians stilla under proceduren. De två huvudsakliga skäl maskar inte immobiliserade tillräckligt för att utför ablationerär (a) för mycket vatten och (b) förlust av kall temperatur. (A) Överskott planarian vatten som pooler på kirurgi yta medan överföra maskar kommer att tillåta maskar för att flytta och komplicera kirurgi. Operationen yta (luddfri vävnaden torka och filterpapper) bör endast förbli fuktig. Om vid någon tidpunkt under förfarandet torklappen blir mättad med snäck vatten, bör det antingen ersättas eller en överföringspipett kan användas för att försiktigt avlägsna överflödig vätska från vävnaden torka (alltid dra av torka och inte filterpappret). Vävnads våtservetter kan också användas för att avlägsna överskottsvatten pooling på kirurgi ytan. Denna process kan behöva upprepas många gånger, beroende på antalet maskar som avlägsnas. (B) Om användning petriskålen kylplatta inrättat, kom ihåg att ersätta den kalla plattan så snart isen börjar smälta och petriskål locket 60 mm börjar att flyta. Detta kommer att säkerställa både en stabil operation yta och en lämpligt kall yta. Alternativt, om användning av Peltier plattanställa upp, vara medveten om att efter 45 min till 1 h för användning, kommer värmen i de yttre ringarna övervinna den kalla plattan i centrum och all kylning kommer att gå förlorade. Om detta händer, stäng av Peltier plattan i 5-10 min för att låta den komma till rumstemperatur innan du fortsätter ablationer.

Ett annat område av felsökningen är under snäcköverföring mellan skålen och operationen ytan och tillbaka igen. Om ablaterade maskar är svåra att ta bort från filterpapper, placera en droppe mask vatten på masken tills vätskan pooler på toppen av filterpapper. Maskar kan därefter sugas in i överföringspipett som vanligt. Om problemen kvarstår, försök vända masken på dess ventrala sidan först (med användning av matta sidan av tången). Om en mask fastnar inuti överföringspipetten, är detta vanligtvis ett tecken på att för mycket vatten har tagits upp (maskar ska dras in överföringspipetten inte längre än ungefär en tum). För att ta bort en mask fastnat i en överföringspipett upprätta 1-2 ml mask water in i pipetten, så att masken är täckt med vatten. Stadigt flick den sida av pipetten tills masken lossnar från väggen av pipetten och är flytande.

Om nålen blir tråkig, ersätta med en ny nål / spruta. Tänk på nålen ersätter efter att ha använt den för att avlägsna ≥30 ögon. Överdriven avlägsnande av utskurna vävnader genom att torka med en vävnad torka kan också tråkig nålen, vilket gör ablationer svårare. Det är okej om utskurna vävnader stanna inom avfasade delen av nålen under hela förfarandet (även över flera djur). Använd alltid en ny nål / spruta vid byte mellan maskar av olika förhållanden (t.ex. vildtyp kontra RNAi maskar), liksom när du börjar nya ablation sessioner (dvs på olika dagar).

Detta kirurgiska ögon ablation teknik är ett kraftfullt medel för att undersöka Ijusinducerade beteenden (och deras genetiska och neurologiska basis) i planarians, särskiltnär de kombineras med farmakologiska behandlingar eller RNA-interferens. Ögon ablation är också en stor medel för att belysa de mekanismer som reglerar endogena planarian ögonregenerering (och ögonstamcells underhåll och differentiering) in vivo. Eftersom de flesta ryggradsdjur har mycket begränsade möjligheter att förnya ögonvävnader, förstå hur planarians kan regenerera deras ögon kommer att vara viktigt för att identifiera möjliga mekanismer för översättning i framtida terapier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional