Summary
Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.
Abstract
Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) is de gewenste techniek om de structuur en functie van elektrogenische membraanproteïnen te onderzoeken, waarbij real-time metingen van fluorescentie en stromingen gelijktijdig rapporteren over lokale omgevingen en globale functie respectievelijk 1 . Terwijl hoge-resolutie structurele technieken zoals cryo-elektronenmicroscopie of röntgenkristallografie statische beelden van de eiwitten van belang bieden, biedt VCF dynamische structurele gegevens die ons in staat stellen de structurele omzettingen (fluorescentie) te koppelen aan dynamische functionele data (elektrofysiologie). Tot voor kort beperkte de thiol-reactieve chemie die wordt gebruikt voor plaatsgerichte fluorescente etikettering van de eiwitten de reikwijdte van de aanpak, omdat alle toegankelijke cysteinen, waaronder endogene, worden gemerkt. Het was derhalve verplicht om eiwitten vrij te maken van endogene cysteinen. Etikettering was ook beperkt tot sites die toegankelijk waren voor de extracellulairekant. Dit veranderde met behulp van Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) om specifiek een kleine fluorescerende sonde in te nemen in reactie op stopcodononderdrukking met behulp van een orthogonale tRNA en tRNA synthetase pair 2 . De VCF-verbetering vereist alleen een tweetraps injectieprocedure van DNA-injectie (tRNA / synthetase-paar) gevolgd door RNA / fUAA co-injectie. Nu is het mogelijk om zowel intracellulaire als begraafde plaatsen te labelen, en het gebruik van VCF is aanzienlijk uitgebreid. De VCF techniek wordt daardoor aantrekkelijk voor het bestuderen van een breed scala van eiwitten en - nog belangrijker - maakt het mogelijk om talloze cytosolische regulerende mechanismen te onderzoeken.
Introduction
Meer dan 200 onnatuurlijke aminozuren van verschillende chemische en fysische eigenschappen zijn genetisch in eiwitten opgenomen in E. coli , gist en zoogdiercellen 3 . Het onnatuurlijke aminozuur is opgenomen in reactie op een specifiek stopcodon via een orthogonaal ontwikkeld tRNA / synthetasepaar. De genetische benadering van het modificeren van eiwitten heeft waardevolle inzichten gegeven in eiwitstructuur en -functie. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) in combinatie met een fluorescerende UAA.
In VCF staat de gelijktijdige observatie van functionele data en structurele omgevingen rond de fluorescerende sonde (~ 5 Å) ons in staat dynamische informatie te verkrijgen met millisecondresolutie 1 . De fluorescerende probes veranderen hun blusstaat op gelokaliseerde beweging van het eiwit. Een beweging van slechts 1-2 Å is voldoende om te leiden tot significante veranderingen in de fluorescentieIntensiteit 4 . Na identificatie van de bezienswaardigheid in het doelproteïne wordt de plaats gemuteerd door puntmutatie. Klassiek was het residu gemuteerd naar een cysteïne, terwijl nu een amber stopcodon (TAG) geïntroduceerd wordt voor genetische fUAA-incorporation. Het eiwit wordt vervolgens in vitro getranscribeerd.
Terwijl andere expressiesystemen (bijvoorbeeld zoogdiercellen) 5 , 6 , 7 kunnen gebruiken, hebben Xenopus- oocyten de voorkeur aan structurele-functiestudies vanwege hun grotere grootte, wat leidt tot eenvoudiger manipulatie en hogere fluorescentie-intensiteit (meer fluorophoren) Ruisverhouding. Bovendien hebben Xenopus- oocyten lage achtergrond van endogene eiwitten 2 , 8 en de donkere pigmentatie op de dierenpoolschilden tegen achtergrondfluorescentie van tHij cytosol. De Xenopus- oocyten worden chirurgisch verwijderd en DNA dat codeert voor het orthogonale tRNA / tRNA-synthetase-paar dat specifiek is voor het fUAA, wordt geïnjecteerd in de kern van de oocyten. Na een incubatietijd van 6-24 uur wordt het eiwit RNA gecojecteerd met het fUAA in het cytosol van de oocyten, gevolgd door een incubatieperiode van 2-3 dagen. Om eventuele schade aan de fUAA te voorkomen (fotobladen) moeten de procedures inclusief Anap onder rood worden uitgevoerd om fluorofore excitatie te vermijden.
Oocyten worden bestudeerd op een open-oocyte spanningsklemopstelling, die op een oprechte fluorescentiemicroscoop is gemonteerd. Elektrische stroom- en fluorescentieveranderingen worden gelijktijdig opgenomen 9 , 10 . Als alternatief kunnen twee-elektrode spanningsklem 1 of patch-klemconfiguraties 11 gebruikt worden. Fluorescentie wordt opgewonden door geschikte golflengten met laag RMS geluid en Emissie opgenomen met behulp van een fotodiode gekoppeld aan een versterker met hoge amplificatie.
Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van fluorescerende onnatuurlijke aminozuren (fUAA's) in spanningsfluurometrie. Eén is toegang tot de cytosolische zijde van de membraanproteïnen; Veel reguleringsprocessen zijn hier gevestigd ( bijv. Ca 2+ - of nucleotidebindingsplaatsen, snelle en gesloten toestand-inactivering van spanningsgated ionkanalen, porieopening, modulekoppeling). Al deze processen zijn nu toegankelijk voor fluorescerende etikettering.
Een ander voordeel is de kleine maat van de sonde, wat leidt tot minder verstoring van het eiwit. Tot nu toe zijn twee orthogonale tRNA / tRNA synthetaseparen voor fUAA's 12 , 13 ontwikkeld, waar 3- (6-acetylnaphthalen-2-ylamino) -2-aminopropaanzuur (Anap) de enige fUAA is die in Xenopus- oocyten is gebruikt 2 ,"Xref"> 8. Anap is een milieuvriendelijke fluorofoor met een molecuulgewicht van 272,3 g / mol en is slechts iets groter dan tryptofaan 12 ( figuren 1A, 1B ). Vanwege zijn kleine grootte worden waarschijnlijk minder sterische effecten geïntroduceerd door de fluorofoor in vergelijking met conventionele fluoroforen die via een linker (meestal meer dan 500 g / mol) zijn verbonden. Bovendien is in het geval van Anap het fluorofoor dichter bij de eiwit backbone dan die gekoppeld aan cysteinen, en bijgevolg probeert Anap meer gelokaliseerde omgevingen. Ten slotte is de verwijdering van endogene cysteinen in conventionele VCF om site-specifieke etikettering te waarborgen niet langer een vereiste in UAA-VCF en derhalve (i) verlaat de eiwitten in (bijna) hun native state en (ii) staat VCF toe Een bredere reeks eiwitten bestuderen, waarin de functie kan worden veranderd door cysteïne substitutie.
Figuur 1 : Anap en Fluorescentie Spectra. ( A ) Chemische structuur van Anap. ( B ) Genormaliseerd absorptiespectrum en emissiespectra voor 1 nM Anap, waarbij de gevoeligheid van Anap fluorescentie aan de oplosmiddel hydrofobiciteit wordt aangetoond. Emissiespectra werden verkregen door spanning bij 350 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een nadeel van het gebruik van fluorescerende UAA's is dat een heterogene eiwitpopulatie kan voortvloeien uit stopcodon-doorbraak, translationele reinitiatie, C-terminale afgeknotte eiwitten of crosstalk met endogene aminoacylering als de hoeveelheid aminoacyleerde tRNA's schaars is. Dergelijke lekuitdrukking moet altijd gecontroleerd worden bij afwezigheid van het fUAA en het tRNA / tRNA synthetasepaar. We hebben het probleem van trans behandeldLational reinitiation en hoe te omzeilen voor N-terminale insertie sites eerder 14 . Wanneer echter het fUAA, tRNA en tRNA synthetase aanwezig zijn in verzadigde hoeveelheden, blijft er slechts een lage kans op lekuitdrukking.
Het belangrijkste procedurele verschil tussen fUAA-VCF en conventionele VCF is de injectie en behandeling van de oocyten; De injectie van DNA dat codeert voor het tRNA en het tRNA synthetase (pAnap) wordt gevolgd door de introductie van Anap, die ook gecojecteerd wordt met het eiwit mRNA of alternatief toegevoegd aan de incubatieoplossing als een acetoxymethyl (AM) ester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kippenmanipulaties werden uitgevoerd volgens de Canadese richtlijnen en zijn goedgekeurd door de ethische commissie (CDEA, protocol # 15-042) van de Universiteit van Montréal.
1. mRNA Voorbereiding voor fUAA Incorporation
- Kies een site van belang in het eiwit waar verwachting van conformiteitsveranderingen zal optreden. Selecteer een aminozuur in deze regio om te vervangen door de fUAA.
OPMERKING: De keuze van de positie is gebaseerd op de structurele aanpassingen die worden verwacht. Als er een hoge resolutie structuur bestaat en een hypothese van de verwachte bewegingen, moet de anap zo geplaatst worden dat de chemische omgeving verandert; Dit kan ofwel een verandering zijn in de diëlektrische constante (hydrofobe versus hydrofiele omgeving) of, waarschijnlijk, blussen door een ander aminozuur. De beste quenchers zijn tryptofanen. Anap zou in één staat in contact moeten staan met de quencher (overlapping van de Van-der-Waals radius) en vrij van deze inde andere. Als er geen hoge resolutie structuren of modellen bestaan, zou men de regio van belang moeten scannen. In beide gevallen is het raadzaam om meerdere nabijgelegen locaties te selecteren om de kans te vergroten om expressie- en fluorescentiesignaal te verkrijgen. Om sterische effecten tijdens eiwitmaturatie en / of -functie te minimaliseren, kan men kiezen voor het vervangen van grote en aromatische aminozuren (Phe, Trp, Tyr). De auteurs hebben echter ervaren dat het scannen van een regio van belang voor fUAA-insertie, ongeacht het gesubstitueerde aminozuur, meer productief is. - Plaats een amber stopcodon (TAG) op de geselecteerde plaats met behulp van site-directed mutagenese 15 . Zorg ervoor dat het eiwit van belang niet eindigt op een amber stopcodon (TAG). Als dat zo is, muteren naar een andere (oker of opaal stopcodon). Versterk, isoleer en sequentieer het DNA. Verkrijg eiwit mRNA met in vitro transcriptie 16 en berg het mRNA bij 20 ° C of 80 ° C. </ Ol>
- Chirurgisch verkrijgen Stage V of VI oocyten van Xenopus laevis kikkers en defolliculate met collagenase zoals eerder beschreven 17 .
- Anesthetiseer kikkers met een passende verdoving volgens het goedgekeurde dierprotocol (hier: 3-aminobenzoëzuurethylester). Wanneer ze niet reageren op een zachte knijp naar een teenpunt (verlies van onttrekkingsreflex), dan worden ze adequaat verdoofd voor een operatie.
- Verwijder de kikkers onmiddellijk uit de verdovingsoplossing en spoel de huid grondig met vers water. Deze spoel voorkomt dat het dier in dieper niveaus komt door onabsorbeerde chemische stoffen uit het huidoppervlak te verwijderen.
- Verwijder ovariumknooppunten van de ene kant chirurgisch en maak de knooppunten zorgvuldig open met behulp van twee pincetjes. Incubeer en roer de oocyten op in "standaard oocytoplossing" (SOS) die 1% (w / v) collagenase bevat gedurende 20-30 minutenTe vervuilen. Was driemaal met SOS-oplossing.
- Selecteer grote en gezonde oocyten individueel en incubeer ze in Barth's oplossing aangevuld met antibiotica (100 μg / ml peniciline, 100 μg / ml streptomycine, 10 mg / 100 ml kanamycine) en 5% paardserum bij 18 ͦC gedurende minstens 4 uur voor injectie .
OPMERKING: Na 2 - 4 operaties met tussen 4 maanden vertraging, worden Xenopus laevis geëuthaniseerd door langdurige (> 1 uur) incubatie met 3-aminobenzoëzuurethylester.
- Voor nucleaire injectie van DNA, berei een lange en dunne injectie tip voor om de kern te bereiken en om de oocyt te beschadigen. Vul de injectiespuit met olie en bevestig het op het nanoinjector-apparaat.
- Installeer de nano-injector onder een stereomicroscoop en gebruik tang om het uiteinde van de punt te breken. Olie uitwerpen tot er geen luchtbellen zijn vastgelopen binnen het uiteinde van de punt.
- Plaats 1 μL 0,1 μg /# 181; L pAnap in nuclease-vrij water met NaOH (1% 1N NaOH) op een stuk parafilm onder een stereoscoop en vul de injectiepunt met het DNA.
- Breng 40 oocyten over op een met mesh beklede injectieschaal die Barth's oplossing bevat, aangevuld met antibiotica.
OPMERKING: Om de mesh-coated injectie schotel te maken, snij een stukje 800 μm nylon mesh uit om een polystyreen Petri schotel te vullen. Voeg chloroform in het midden en plaats het gaas bovenop. Houd het gaas plat tot het plastic zit. - Aangezien de oocytkern zich bevindt in de dierlijke (donkere) pool, doe de injectiepunt in het midden van de dierenpaal en doe zodanig dat het punt dichtbij het middelpunt van het dierhelft komt (of 2-3x de diepte in vergelijking met RNA-injectie ). Spuit 9,2 nL pAnap in de kern van elke oocyt. De dunne punt en het kleine injectievolume kunnen leiden tot onregelmatige injectie of geblokkeerde tip. Controleer af en toe of de injectie werkt door in de lucht te injecteren.
OPMERKING: Of het DNA goed in de kern wordt geïnjecteerd, is onzeker. Verwacht daarom dat 10 tot 40% van de oocyten het tRNA / synthetase paar niet uitdrukken. Zie discussie voor verdere uitwerking. - Incubeer de oocyten in 2 ml Barth's oplossing aangevuld met antibiotica en 5% Paardserum (HS) bij 18 ° C gedurende 6-24 uur om robuuste expressie van Anap-specifieke tRNA's en tRNA-synthetasen mogelijk te maken.
OPMERKING: De incubatietijd van DNA kan enkele dagen voor RNA-injectie duren, maar het verhoogt de expressie niet. - Bereid de nano-injector voor RNA-injectie (hetzelfde als stap 2.2, maar de injectiepunt hoeft niet zo dun te zijn als voor injectie van DNA). Werk alleen onder rood licht vanaf dit punt om te voorkomen dat de anap wordt geactiveerd.
- Meng 1 μl 1 mM Anap met 1 μL 1-2 μg / μL mRNA rechtstreeks op een stuk parafilm en vul de injectiedip met de gemengde oplossing. Impale net onder het membraan in de vegetale(Heldere) pool en injecteer 46 nL in elke pAnap geïnjecteerde oocyt.
OPMERKING: De vereiste mRNA concentratie hangt af van het eiwit van belang. - Incubeer de oocyten die beschermd zijn tegen licht in een doos of verpakt in aluminiumfolie, in Barth's oplossing aangevulde antibiotica en 5% paarsserum bij 18 ° C gedurende 2-3 dagen. Wissel elke dag met verse Barth's oplossing en verwijder dode oocyten om vervuiling te vermijden.
- Installeer de open-oocyte spanningsklem apparatuur zoals eerder beschreven 18 .
- Monteer het elektrofysiologie opnamesysteem op een rechtop fluorescentiemicroscoop door de opnamekamer op een schuif te installeren die het mogelijk maakt om tussen de standaard stereoscoop te verplaatsen om de oocyt en de microscoop te plaatsen om de fluorescentiemetingen te verrichten ( Figuur 2c ).
OPMERKING: De geometrie van de kamer voor gesneden oocyten is niet geschikt om de normale tractie te gebruikenNsmitted licht voor verlichting tijdens manipulatie. Daarom wordt een halogeenlamp met "gooseneck" met rood filter gebruikt om zijwaarts vanaf de bovenkant te verlichten. De condensor van de microscoop kan verwijderd worden, maak ruimte om het podium voor de elektrofysiologie kamer te verlagen. - Sluit een fotodiode detectiesysteem aan op de C-mount uitgangspoort van de fluorescentiemicroscoop ( Figuur 2a ). Sluit de fotocurrent-uitlezing aan op een tweede ingangskanaal in de digitale signaalprocessor (DSP, analoge / digitale - digitale / analoge omzetter).
- Gebruik een 100 W, 12 V halogeenlamp als lichtbron voor de fluorescentie-excitatie.
OPMERKING: Alternatief kunnen Hg-branders gebruikt worden, maar moeten intensief worden verminderd om te snelle fotobak te voorkomen tijdens opnames. LED-verlichting wordt alleen aanbevolen als de respectieve LED's een significante intensiteit tonen in het excitatiebereik ( bijv. ~ 350 nm voor Anap). De meeste witte LED's komen niet ver in het UV-spectrum. - insZijn een elektrisch gecontroleerde sluiter tussen de excitatie lichtbron en de microscoop en sluit de controle (typisch TTL-puls) aan op een digitale uitgang van de DSP. Tijd de TTL-puls in de opnamesoftware (zie fabrikantdocumentatie), zodat de sluiter ~ 100 ms voor het begin van de opname wordt geopend. Op deze manier beïnvloedt elke vibratie tijdens het openingsproces de opname niet. De tijd is afhankelijk van de snelheid en de trillingen van de sluiter. Beëindig de puls 5ms voor het einde van de opname zoals weergegeven in figuur 4 . Op deze manier wordt ook de waarde voor de totale fluorescentie opgenomen.
- Plaats een passende filterkubus (excitatiefilter, dichroïsche spiegel en emissiefilter) in de filterkubusturret. Voor Anap, gebruik Ex: 377/50 nm bandpas, dichroic 409 nm longpass en Em: 470/40 nm bandpass.
- Volg de voorbereidende stappen voor de open-oocyte spanningsclamp zoals eerder beschreven en visualiseert 18 (agarbrug voorbereiding, montage van de oocyt, saponine permeabilisatie). Werk echter altijd onder rood licht om te vermijden dat de fluorofoor voorafgaand aan opnames wordt gebleekt. Zorg ervoor dat de dierenstok naar voren komt wanneer u de oocyt plaatst. De pigmentatie onder het dierpaalmembraan schept tegen autofluorescentie afkomstig van het cytosol en vermindert daarom achtergrondfluorescentie.
- Schuif de kamer over naar de microscoop en focus met behulp van een 4X objectief.
- Verf de oocyt met de spanningswaarnemende V1-elektrode (3 M KCl), schakel over naar de 40X waterdempende (NA 0.8 - 0.9) doelstelling. Focus op de dierenpaal die naar boven gericht is.
- Schakel het rode licht uit. Selecteer de juiste filterkubus door de filterkubus-turret te draaien en de optische uitgangspoort die is aangesloten op de fotodiode. Zet de halogeen aanEen lamp op de hoogste intensiteit en schakel de sluiter kort voor 2-5 s open om de achtergrond fluorescentie intensiteit te lezen die afkomstig is van de oocyt. Met de beschreven instelling dient de waarde ongeveer 50-200 pA voor Anap te zijn.
- Zet de klem aan, draai de bad- / wachtschakelaar naar actief en stel het membraanpotentiaal (V1 - V2) in op het bedieningspotentieel door de knop in de I-hoofdstand te draaien.
- Selecteer vasthoudpotentieel, stapprotocol, nummer en lengte van pulsen, enz. In de opnameprogramma. Noteer spanningsafhankelijke stromingen en Anap fluorescentie-intensiteiten.
- Om twee locaties in hetzelfde eiwit tegelijkertijd te monitoren, mutateer een extracellulaire en toegankelijk aminozuur in cysteïne en verwijder andere cysteinen om specifieke etikettering met thiolchemie te waarborgen.
- Voer stap 2.1-2.5 uit.
- Vóór VCF opnames incuberen oocyten in 5 μM TMR-maleimide in etiketteringsoplossing gedurende 15 minuten (of andere kleurstofMet niet-overlappende spectra vergeleken met Anap).
- Was de oocyten met etiketteringsoplossing drie keer om overtollige kleurstof te verwijderen.
- Voer stap 4.1-4.6 uit.
- Plaats een passende filterkubus voor TMR (excitatiefilter, dichroïsche spiegel en emissiefilter) in de filterkubustoring. Overschakelen naar de TMR filterkubus door de filtertoring te draaien.
- Lees de achtergrond fluorescentie voor TMR zoals beschreven voor Anap in stap 4.4.
OPMERKING: Het labelen met thiolchemie resulteert in hoge achtergrondfluorescentie door onspecifieke etikettering in het membraan. Daarom kan de TMR-achtergrondfluorescentie de versterker verzadigen (> 2000 pA). In dat geval vermindert u de lichtintensiteit niet, maar simuleert u de achtergrondfluorescentie met behulp van een offsetstroom aan de fotodiode. In commercieel beschikbare systemen gebruikt u de "sample-and-hold" -functie op het detector systeem. Let op de achtergrond fluorescentiewaarde (met behulp van een 10X neutrale dichtheidsfilter) in een laboratorium jOnze naam, aangezien deze waarde niet wordt opgenomen (verzadiging). - Record spanningsafhankelijke stromingen en TMR fluorescentie intensiteiten gelijktijdig zoals in stap 4.6.
2. Oocytpreparatie en injectie
Figuur 2 : Illustratie van DNA- en RNA-injectie in Xenopus Oocyten voor Anap Incorporation.
Ten eerste wordt pAnap geïnjecteerd in de kern van de Xenopus oocyt ( 1 ). Na 6-24 uur worden Anap en kanaal RNA in de vegetale pool ( 2 ) gemonteerd. Anap zal orthogonaal aminoacyleerd worden met het tRNA dat een amber stop anti-codon draagt, door het aminoacyl-tRNA synthetase dat door pAnap wordt gecodeerd. Op deze manier worden de aminoacyleerde Anap-tRNAs herkend door het ribosoom bij het ingevoegde amber stopcodon in de channeL RNA, wat resulteert in onderdrukking van de stopcodon en invoeging van Anap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. VCF Setup
Figuur 3 < / Strong> : VCF setup. ( A ) Zijaanzicht van de VCF setup die het lichtpad in de microscoop toont. De filterkubus bevat een excitatiefilter, dichroïsche spiegel en een emissiefilter. ( B ) De geselecteerde oocytkamerafmetingen zijn 3,4 cm voor de bovenste kamerstraal (1), 5,5 cm voor de onderste kamerlengte (2), 1,4 cm voor de onderste kamerbreedte (3) en 1,7 cm voor de middenkamerbreedte (4). ( C ) Vooraanzicht van de VCF setup. De eerste oculaire aan de linkerkant is voor het monteren van de oocyt in de openingsspanningskamer en voor permeabilisatie. Vervolgens glijdt de kamer onder de microscoop bij de tweede oculaire naar rechts. Hier wordt de V1-elektrode in de oocyt ingebracht met behulp van de 4X-doelstelling, en fluorescentie wordt geregistreerd met behulp van de waterdempende 40X-doelstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Tweekleurige VCF
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 4 toont een voorbeeld van VCF-opnamen verkregen uit een oocytenuitdrukkende Shaker kanalen met snelle inactivatie verwijderd (IR), L382stop-W434F in aanwezigheid van pAnap en Anap. De W434F mutatie blokkeert de ionische kaliumstromen, waardoor het mogelijk is om de transiente gatenverplaatsingen (gatenstromen) te meten. De gelijktijdige opnamen van gatingstromen (bovenste trace) en Anap fluorescentie-intensiteitsveranderingen (lager trace) bij depolarisatie tonen de succesvolle opneming van Anap in positie L382 aan. Hier bevindt Anap zich op de bodem van elk van de vier S4-transmembrane helices die tijdens de activatie (L382) bewegen en derhalve rapporteren over intracellulaire lokale omgevingen. Een fluorescentieverandering kan worden veroorzaakt door oplosmiddel ontspanning (veranderingen in het milieu polariteit) en / of blussen door andere aminozuren 4 . Beide mechanismen zijn een gevolg van relatieve eiwitherrangementen. Figuur 5 toont Anap- en TMR-fluorescentiesignalen onder gebruikmaking van stapprotocollen verkregen uit hetzelfde oocyt. Door de A359C mutatie in de L382stop-W434F achtergrond en etikettering met TMR-maleimide toe te voegen, is het mogelijk met de beschreven techniek om real-time bewegingen in verschillende regio's in hetzelfde eiwit te detecteren. In dit geval probeert TMR de beweging van de bovenste S4-helix (A359C) terwijl Anap de beweging van de bodem van S4 (L382) detecteert. Vanuit de tijdsduur van de fluorescentieverandering kan men dynamische informatie van de overgang bewaken die door de fluorescentie wordt gecontroleerd door de kinetiek te analyseren ( Figuren 5A, 5B ). Bovendien wordt de fluorescentie-spanningsverhouding (FV) verkregen door de steady-state fluorescentie-intensiteit tegen spanning te plotten ( Figuur 5C ). De FV weerspiegelt het evenwicht tussen bezettingen van gecontroleerde staten die in het geval van ionenkanalen v zouden kunnen volgenBeweging van oltsensor of opening van de centrale porie. Met behulp van fUAA's is het nu mogelijk om de FV vanaf de binnenkant van het kanaal te verkrijgen. Figuur 5C laat zien dat het bovenste deel van S4 (TMR) dezelfde spanningsafhankelijkheid heeft als het onderste deel van S4 (Anap).
De signaal-ruisverhouding is voornamelijk afhankelijk van de relatieve fluorescentieverandering (dF / F) en de totale fluorescentie. De dF / F definieert de signaalgrootte terwijl het geluid bepaald wordt door de totale fluorescentie vanwege de kwantum aard van licht (Poisson-geluid). De dF / F zal afhangen van de toestand van het blussen in de verschillende toestanden van het eiwit en de bezettingsgraad van de staten (bijvoorbeeld de open kans). De totale fluorescentie omvat de fluorescentie van specifieke etikettering en van onspecifieke achtergrondmerken. De totale specifieke fluorescentie wordt bepaald door het aantal uitgedrukte proteïnen en de kwantumopbrengst van het fluorofoor. Het grote oppervlak van de XeNopus oocyten is voordelig omdat het het aantal bijdragende eiwitten toeneemt.
De kwantumopbrengst van de anap, dat wil zeggen het aantal fotonen dat wordt uitgezonden per excitatiecyclus of de "helderheid" van de fluorofoor, is lager, wat leidt tot een lagere totale fluorescentie-intensiteit en daardoor de signaal-ruisverhouding verlaagt. Tegelijkertijd leidt Anap labeling tot lage achtergrond fluorescentie zodanig dat de signaal-naar-achtergrond ratio (dF / F) hoger is voor Anap ( Figuren 5A, 5B ).
Een belangrijk controle experiment is om expressie te controleren in afwezigheid van Anap, om het effect van lekuitdrukking te beoordelen. Er is eerder aangetoond dat geïsoleerde spannings sensor domeinen (iVSDs, 1-382) die de S4-S5 linker ontbreken en de porie functioneel uitgedrukt zijn 19 . Daarom, in de afwezigheid van Anap, Expressen L382stop-W434F kanalen als iVSDs zoals getoond in Figuur 6 . Uitdrukking van full-length kanalen met Anap heeft weinig of geen iVSD-stromen, terwijl afgeknotte kanalen sterke iVSD-stromen vertoonden in de afwezigheid van Anap. De aanwezigheid van dergelijke C-terminale afgeknotte eiwitten hangt af van de positie van de ingevoegde stopcodon en moet altijd in aanmerking genomen worden bij het werken met onnatuurlijke aminozuren. Controle experimenten zonder Anap laten toe dat er een heterologe populatie aanwezig is in experimenten met Anap.
Figuur 4 : Gelijktijdig Gatingstromen en Fluorescentieveranderingen van een Cytosolische Proteinoppervlak verkregen met VCF. Gaatstromen verkregen met een P / 4-subtractieprotocol en gelijktijdige opname van fluorescentie bij depolarisatie. Anap is opgenomen in Shaker in positie L382, wat aanleiding geeft tot voSpanningafhankelijke fluorescentieintensiteiten uit het intracellulaire einde van de S4-helix. De maximale fluorescentie-intensiteit wordt aangeduid met "F" en de fluorescentieverandering wordt aangeduid als "dF". De ster aan het einde van de fluorescentieverandering geeft de sluiting van de elektrische sluiter aan (de opening van de sluiter voordat de puls wordt getoond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5 : Tweekleurige VCF met Anap en TMR. ( A ) Anap en ( B ) TMR fluorescentie veranderingen verkregen uit een Shaker A359C-L382Anap-W434F expressie-oocyte gemerkt met TMR-maleimide. ( C ) Fluorescentieveranderingen van A en B zijn afgebeeld tegen het membraanpotentiaal (FV). Gegevens tonen betekenen7; SD met n = 5 oocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 : C-terminale afgeknotte shakerkanalen worden uitgedrukt in afwezigheid van anap. Geïsoleerde spanningsensor domeinen (iVSD, 1-382) worden uitgedrukt met zH4IR-L382stop-W434F in afwezigheid van Anap, wat resulteert in iVSD-stromingen bij hyperpolariseerde potentiaal 19 . In aanwezigheid van Anap concurreren de volledige lengte Shaker-expressie met iVSD-expressie, en als gevolg hiervan is de hoeveelheid iVSD minder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in vivo aminoacylatie van tRNA's die continu worden getranscribeerd met het tRNA-synthetase, maakt het mogelijk om hoge expressieniveaus te verkrijgen voor fluorescentiemetingen. Voor efficiënte fUAA-incorporation is het van kritiek belang dat pAnap correct in de kern wordt geïnjecteerd. Vanwege de onzekerheid van de exacte locatie van de kern wordt verwacht dat 10-40% van de DNA-injecties mislukt, wat resulteert in niet-expressieve (of lekkende expressie) oocyten. Daarom is het belangrijk om expressie te controleren in afwezigheid van Anap en pAnap om de huidige fenotypes en magnitudes in geval van lekkagekanalen te identificeren. Zo is het mogelijk om oocyten te onderscheiden met de juiste DNA-injecties (hoge expressie, Anap dF, full length current phenotype) van die met mislukte DNA-injecties (geen of lage expressie, geen Anap dF, truncated current phenotype, indien aanwezig). In geval van plotselinge tekortkoming met Anap, berei een nieuwe Anap-aliquot voor, aangezien Anap niet stabiel is voor langere periOds in waterige oplossing (tot 1 jaar).
Het gebruik van fUAA's met VCF is beperkt door de keuze van fluoroforen, omdat elke nieuwe fUAA vereist dat een orthogonaal tRNA / tRNA synthetase paar wordt ontworpen. Tot nu toe bestaat alleen Anap als een functioneel fUAA om te rapporteren over eiwitdynamiek in oocyten. Hoge expressieniveaus zijn nodig om Anap fluorescentie veranderingen te detecteren en we schatten een minimale eiwitdichtheid van 2 - 4000 μm - 2 afhankelijk van de gevoeligheid van de site. Bijvoorbeeld, anap fluorescentie veranderingen kunnen worden gezien bij slechts 0,2 mS ionische stromingen voor V234Anap (2,4 x 10 9 kanalen per vastgeklemd gebied in de open-open spanningsklem), terwijl 5 nC doorstroomstromen (1 x 10 6 kanalen per klemmen Gebied in snijspanningsklem) zijn vereist voor de A391Anap-W434F. Aangezien Shaker een tetramer is, heeft het vier Anap-moleculen per kanaal. Dientengevolge vereisen dimers of monomeer eiwitten waarschijnlijk hogere expressieniveaus. furtheBovendien, bleekkinetiek van Anap, die afhankelijk is van de chemische omgeving en de lichtintensiteit, moet worden gecontroleerd om te zorgen dat voldoende intensiteit voor het gehele protocol blijft. We vonden dat kinetiek in het 1 seconde bereik nog steeds kan worden opgenomen met een typisch spanningsprotocol. Het bleken kan worden geminimaliseerd door het verminderen van de lichtintensiteit (langzame processen kunnen meer gefiltreerd worden) of het toevoegen van triplet-state quenchers zoals Trolox (bekend uit single molecule fluorescentie studies). Als LED-excitatie wordt gebruikt, kan men ook een protocol instellen om de fluorescentie-intensiteit elke 100 ms gedurende 5-10 ms te 'proeven', waardoor de excitatietijd 10-20X effectief wordt verminderd.
Spanningsklemfluorometrie is een krachtige techniek om structuur-functieverhoudingen van membraanproteïnen te bestuderen en het is gecombineerd met een verscheidenheid aan fluorescentietechnieken waaronder gelabelde liganden 11 , Lanthanide-gebaseerde en Förster Resonance EnergY Transfer (LRET / FRET) 20 , 21 en overgangsmetaal FRET 22 . Beperkingen op de etiketteringstechnieken belemmeren echter de wijdverspreide toepassing. Genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, die onmisbaar zijn in vele andere toepassingen, zijn te groot om een algemeen alternatief te bieden. Ze zijn met succes in de C-terminus 23 en het ligandbindende domein van BK Ca kanalen 24 gebruikt , maar kunnen niet in "hotspots" van het eiwit worden geïntroduceerd. De introductie van fluorescerende onnatuurlijke aminozuren in het veld opent de techniek op twee manieren 2 : (i) veel meer eiwitten kunnen worden bestudeerd aangezien niet langer endogene cysteinen verwijderd moeten worden; (Ii) cytosolische en begraven plaatsen kunnen worden gemerkt waardoor een bredere waaier van regelgevende mechanismen kan worden onderzocht.
Toekomstige techniek van orthogonale tRNA / synthetAsparen voor nieuwe fUAA's zouden de toepasbaarheid van VCF nog verder verbreden. Ook kunnen meerdere incubaties van verschillende fUAA's mogelijk gemaakt worden met behulp van een vierbasis- of vijfbasiscodonstrategie 25 , 26 . Vanwege het hoge rendement waarmee Xenopus oocytes in staat zijn om UAA's te integreren en de wijdverspreide toepassing van VCF, verwachten we dat fUAA-VCF een sleuteltechniek wordt op het gebied van eiwitstructuur en -functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
PAnap was een aardig cadeau van dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Instituten voor Gezondheidsonderzoekstoelaes MOP-102689 en MOP-136894 (naar RB) en de Canadese Stichting Innovatie Grant 950-225005.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90 mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3 mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82 mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41 mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100 U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100 µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10 mg/100mL |
| Horse Serum (HS) | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5 mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 |
References
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , CRC Press. 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
