Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מתח הידוק פלואומטריה ב Published: May 27, 2017 doi: 10.3791/55598
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Montréal, 2Department of Physics, University of Montréal

Summary

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

Abstract

מתח- Clamp Fluorometry (VCF) כבר טכניקה של בחירה כדי לחקור את המבנה ואת הפונקציה של חלבונים ממברנה electrogenic שבו בזמן אמת מדידות של פלואורסצנטי וזרמים בו זמנית לדווח על הסדרים מקומיים ופונקציה גלובלית, בהתאמה 1 . בעוד טכניקות מבניות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים או קריסטלוגרפיה רנטגן לספק תמונות סטטיות של חלבונים המעניינים, VCF מספק נתונים מבניים דינמיים המאפשר לנו לקשר את הסדרים מבניים (פלואורסצנציה) לנתונים פונקציונליים דינמיים (electrophysiology). עד לאחרונה, כימיה reiactive thiol המשמשים תיוג פלואורסצנטי מכוון האתר של חלבונים הגביל את היקף הגישה כי כל ציסטות נגיש, כולל אלה אנדוגניים, יסווגו. זה היה ולכן נדרש לבנות חלבונים ללא ציסטאין אנדוגני. תיוג היה מוגבל גם לאתרים נגישים מן החוץצַד. זה השתנה עם השימוש של חומצות אמינו פלואורסצנט לא טבעי (FUAA) כדי לכלול במיוחד בדיקה פלואורסצנטי קטן בתגובה לעצור דיכוי קודון באמצעות tRNA אורתוגונלית זוג synthetase tRNA 2 . שיפור VCF רק דורש הליך הזרקת שני שלבים של הזרקת דנ"א (זוג tRNA / synthetase) ואחריו RNA / FUAA שיתוף הזרקת. עכשיו, תיוג הן אתרי תאיים ו קבור אפשרי, ואת השימוש VCF התרחב באופן משמעותי. הטכניקה VCF ובכך הופך אטרקטיבי לחקר מגוון רחב של חלבונים - וחשוב יותר - מאפשר לחקור מנגנונים ציטוזוליים רבים.

Introduction

מעל 200 חומצות אמינו לא טבעיות של תכונות כימיות ופיסיקליות שונות שולבו גנטית בחלבונים בתאי E. coli , שמרים ותאי יונקים 3 . חומצת האמינו הלא טבעית משולבת בתגובה לקודון עצירה מסוים באמצעות זוג tRNA אורתוגונלי מהונדס / synthetase. הגישה הגנטית לשינוי חלבונים סיפקה תובנות חשובות על מבנה החלבון ותפקודו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מתח פלמורומטריה (VCF) בשילוב עם UAA פלואורסצנטי.

ב VCF, תצפית בו זמנית של נתונים פונקציונליים סידורים מבניים מקומי סביב בדיקה ניאון (~ 5 Å) מאפשר לנו להשיג מידע דינמי עם רזולוציה millisecond 1 . בדיקות פלואורסצנט לשנות מצב מרווה שלהם על התנועה המקומית של החלבון. תנועה של 1-2 רק מספיק כדי להוביל לשינויים משמעותיים הקרינהאינטנסיביות 4 . לאחר זיהוי של אתר של עניין בחלבון היעד, האתר הוא מוטציה על ידי מוטציה נקודה. באופן קלאסי, שאריות היה מוטציה על ציסטאין ואילו עכשיו, קודון להפסיק ענבר (TAG) הוא הציג עבור fUAA שילוב גנטי. החלבון הוא אז במבחנה transcribed.

בעוד מערכות ביטוי אחרות ( למשל, תאים יונקים) ניתן להשתמש 5 , 6 , 7 , ביציות Xenopus עדיפים על מבנה מבנה מחקרים בגלל גודל גדול שלהם, המוביל מניפולציה קלה יותר עוצמת הקרינה גבוהה יותר (fluorophores) ולכן, רעש. יתר על כן, ביציות Xenopus יש רקע נמוך מן החלבונים אנדוגני 2 , 8 , ואת פיגמנטציה כהה על המגן מוטות חיית נגד רקע הקרינה מהוא cytosol. ביציות Xenopus הם הוסרו כירורגית קידוד דנ"א tRNA אורתוגונליים / זוג tRNA-synthetase ספציפי עבור FUAA מוזרק לגרעין של הביציות. לאחר זמן הדגירה 6-24 שעות, RNA חלבון הוא שיתוף מוזרק עם FUAA לתוך cytosol של ביציות, ואחריו 2-3 ימים הדגירה תקופה. על מנת למנוע כל נזק fUAA (photobleaching), נהלים כולל אנאפ צריך להתבצע תחת אור אדום כדי למנוע עירור fluorophore.

ביציות נלמדים על חיתוך פתוח ביצית מתח ההתקנה, אשר מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, זרם חשמלי ושינויים הקרינה נרשמות בו זמנית 9 , 10 . לחלופין, שני אלקטרודה מתח מהדק 1 או תיקון תצורת מהדק 11 ניתן להשתמש. הקרינה נרגשת לאורכי גל מתאימים עם רעש RMS נמוך פליטה שנרשמה באמצעות photodiode מקושר למגבר עם הגברה גבוהה.

ישנם מספר יתרונות של שימוש פלואורסצנטי חומצות אמינו לא טבעיות (fUAAs) ב-מלחציים פלמפומטריה. האחד הוא גישה לצד cytosolic של חלבונים הממברנה; תהליכים רגולטוריים רבים נמצאים כאן ( למשל, Ca 2 + - או אתרי מחייב נוקליאוטידים, איטום מהיר וסגור המדינה של ערוצי יון מגודרת מתח, פתיחת הנקבוביות, צימוד מודול). כל התהליכים הללו נגישים כעת עבור תיוג פלואורסצנטי.

יתרון נוסף הוא גודל קטן של בדיקה המוביל פחות הפרעה של החלבון. עד כה, שני אורתוגונליים tRNA / tRNA זוגות synthetase עבור fUAAs כבר מהונדסים 12 , 13 , שם 3- (6-acetylnapthalen-2-ylamino) -2-aminopropanoic חומצה (Anap) הוא FUAA רק אשר שימש ביציות Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Anap הוא fluorophore רגיש לסביבה עם משקל מולקולרי של 272.3 גרם / מול והוא רק מעט גדול יותר Tryptophan 12 ( דמויות 1A, 1B ). בשל גודלו הקטן, השפעות סטיות פחות צפויים להיות מיוצגים על ידי fluorophore לעומת fluorophores קונבנציונאלי המצורפת באמצעות מקשר (בדרך כלל יותר מ 500 g / mol). יתר על כן, במקרה של Anap, fluorophore ממוקם קרוב יותר עמוד השדרה חלבון מאשר אלה הקשורים ציסטאין, וכתוצאה מכך, Anap הוא חיטוט סידורים מקומיים יותר. לבסוף, הסרת ציסטאין אנדוגני ב VCF קונבנציונאלי על מנת להבטיח תיוג אתר ספציפי כבר לא דרישה UAA-VCF ולכן (i) משאיר את החלבונים ב (כמעט) המדינה שלהם יליד (ii) מאפשר VCF להיות מיושם כדי ללמוד מגוון רחב יותר של חלבונים בהם פונקציה עשויה להשתנות על ידי החלפת ציסטאין.

איור 1 איור 1 : Anap ו פלואורסצנטי ספקטרה. ( א ) המבנה הכימי של אנאפ. ( ב ) ספקטרום ספיגה מנורמל ספקטרום פליטה עבור 1 ננומטר אנאפ, המדגים את הרגישות של הקרינה אנאפ כדי הידרופובייה ממס. ספקטרום פליטה התקבלו על ידי מרגש ב 350 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

החיסרון של שימוש UAAs פלואורסצנטי הוא אוכלוסייה הטרוגנית של חלבונים עלולה לנבוע מקריאת קודון להפסיק, reinitiation translational, C- מסוף חתכים מקוצצים או crosstalk עם aminoacylation אנדוגני אם כמות tRNAs aminoacylated הוא נדיר. ביטוי דליפה כזה צריך תמיד להיות בדק עבור בהעדר fUAA ו tRNA / tRNA זוג synthetase. התייחסנו לסוגיית הטרנסLational reinitiation וכיצד לעקוף אותו עבור N- מסוף אתרי הכניסה בעבר 14 . עם זאת, כאשר fUAA, tRNA ו tRNA synthetase נמצאים בכמויות רווי, נותרה רק הסתברות נמוכה של ביטוי דליפה.

ההבדל הפרוצדוראלי העיקרי בין FUAA-VCF לבין VCF קונבנציונאלי הוא הזרקת וטיפול ביציות; הזרקת דנ"א קידוד tRNA ו tRNA synthetase (pAnap) ואחריו המבוא של Anap, אשר גם שיתוף מוזרק עם mRNA חלבון או לחלופין הוסיף פתרון הדגירה כמו אסתר acetoxymethyl (AM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מניפולציות של צפרדעים בוצעו בהתאם להנחיות הקנדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה (CDEA, פרוטוקול מס '15-042) של אוניברסיטת מונטריאול.

1. mRNA הכנה עבור FUAA התאגדות

  1. בחר אתר מעניין של חלבון שבו שינויים קונפורמטיביים צפויים להתרחש. בחר חומצת אמינו באזור זה כדי להחליף את fUAA.
    הערה: בחירת המיקום מבוססת על ההסדרים המבניים הצפויים. אם קיים מבנה בעל רזולוציה גבוהה והשערה של התנועות הצפויות, יש להציב את האנאפ כך שהסביבה הכימית תשתנה; זה עשוי להיות שינוי בקבוע דיאלקטרי (הידרופובי לעומת הידרופילי) או, סביר יותר, מרווה על ידי חומצת אמינו אחרת. מיטב quenchers הם tryptophans. אנאפ צריך להיות במגע עם quencher במדינה אחת (חפיפה של רדיד ואן- der-Waals) ו חינם ממנוהאחר. אם אין מבנים ברזולוציה גבוהה או מודלים קיימים, אחד יצטרך לסרוק את האזור של עניין. בכל מקרה, רצוי לבחור מספר מקומות בקרבת מקום כדי להגדיל את ההסתברות לקבל ביטוי אות הקרינה. על מנת למזער את ההשפעות הסטריות במהלך התבגרות החלבון ו / או הפונקציה, ניתן לבחור להחליף חומצות אמינו גדולות וארומטיות (Phe, Trp, Tyr). המחברים, לעומת זאת, חוו כי סריקה אזור עניין עבור הכניסה fUAA ללא קשר חומצה אמינית תחליף, הוא פרודוקטיבי יותר.
  2. הכנס קודון לעצור ענבר (TAG) באתר הנבחר באמצעות mutagenesis מכוונת האתר 15 . ודא כי חלבון של עניין אינו מסתיים על קודון לעצור ענבר (TAG). אם כך, מוטציה אחרת (אוקר או אופל להפסיק קודון). להגביר, לבודד את רצף ה- DNA. להשיג חלבון mRNA עם שעתוק במבחנה 16 ולאחסן את mRNA ב 20 מעלות צלזיוס או 80 מעלות צלזיוס.
    3. </ Ol>

    2. הכנה ביצית הזרקת

    1. כירורגי להשיג ביציות שלב V או VI מ Xenopus laevis צפרדעים defolliculate עם collagenase כפי שתואר לעיל 17 .
      1. להרדים צפרדעים עם הרדמה מתאימה על פי פרוטוקול חיה מאושר (כאן: 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר). כאשר הם נכשלים להגיב קמצוץ עדין על קצה האצבע (אובדן רפלקס נסיגה), אז הם הרדימו כראוי לניתוח.
      2. מיד להסיר את הצפרדעים מן הפתרון הרדמה ולשטוף ביסודיות את העור במים מתוקים. שטיפה זו תמנע את החיה ליפול לרמות עמוקות יותר של הרדמה על ידי הסרת כימית unabsorbed מפני העור.
      3. הסר צמתים השחלה מצד אחד כירורגי בזהירות לפתוח את הצמתים באמצעות שני מלקחיים. דגירה ו לגרות ביציות ב "פתרון ביצית תקן" (SOS) המכיל 1% (w / v) collagenase עבור 20-30 דקותכדי defolliculate. לשטוף שלוש פעמים עם פתרון SOS.
      4. בחר ביציות גדולות ובריאות באופן אישי ו דגירה אותם הפתרון של בארת 'בתוספת אנטיביוטיקה (100 U / מ"ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, 10 מ"ג / 100 מ"ל קנמיצין) ו 5% בסרום בסרום 18 מעלות לפחות 4 שעות לפני ההזרקה .
        הערה: לאחר 2 - 4 ניתוחים עם עיכוב של 4 חודשים בין, Xenopus laevis הם מורדמים על ידי הדגירה ממושכת (> 1 h) עם 3-aminobenzoic חומצה אתיל אסתר.
    2. עבור הזרקה גרעינית של DNA, להכין קצה הזרקת דק ורזה כדי להיות מסוגל להגיע לגרעין כדי למנוע נזק הביצית. ממלאים את קצה הזרקת עם שמן הר אותו על המכשיר nanoinjector.
      1. התקן את ננו מזרק תחת מיקרוסקופ סטריאו להשתמש מלקחיים כדי לשבור את קצה הקצה. הוצא שמן עד שאין בועות אוויר לכודים בתוך קצה הקצה.
    3. מקום 1 μL של 0.1 מיקרוגרם / &# 181; L pAnap במים nuclease ללא המכיל NaOH (1% של 1 N NaOH) על פיסת parafilm תחת stereoscope ולמלא את קצה הזרקת עם ה- DNA.
    4. העברת 40 ביציות לצלחת הזרקת מצופה רשת המכילים פתרון של בארת בתוספת אנטיביוטיקה.
      הערה: כדי להפוך את צלחת הזרקת מצופה רשת, לחתוך חתיכת בגודל מתאים של 800 מיקרומטר רשת ניילון למלא צלחת פטרי קלקר. הוסף כלורופורם למרכז ולאחר מכן למקם את הרשת למעלה. החזק את רשת שטוח עד הפלסטיק מגדיר.
    5. כמו הגרעין הביצית ממוקם בקוטב החיה (כהה), לכוון את קצה ההזרקה במרכז מוט החיה לדלד כך קצה להגיע ליד מרכז של חצי הכדור החיה (או 2-3x את עומק לעומת הזרקת רנ"א ). להזריק 9.2 nL של pAnap לתוך הגרעין של כל ביצית. קצה דק וקצב הזרקה קטן עלול לגרום הזרקת לא סדיר או קצה חסום. מדי פעם לבדוק אם הזרקת עובד על ידי הזרקת לאוויר.
      הערה: אם הדנ"א מזריק כראוי לתוך הגרעין הוא לא ברור. צפו ולכן 10 - 40% ביציות לא להביע את זוג tRNA / synthetase. ראה דיון לפרט נוסף.

    איור 2
    איור 2 : איור של דנ"א ו- RNA הזרקה לתוך ביציות Xenopus עבור התאגדות אנאפ.
    ראשית, pAnap מוזרק לתוך הגרעין של הביצית Xenopus ( 1 ). לאחר 6-24 שעות, Anap ואת ערוץ רנ"א הם coinjected לתוך מוט הצמח ( 2 ). Anap יהיה אורתוגונלית aminoacylated עם tRNA נושאת לעצור ענבר אנטי קודון, על ידי synethtase aminoacyl-tRNA אשר מקודד על ידי pAnap. בדרך זו, amina-tRNAs aminoacylated מזוהים על ידי הריבוזום על קודון לעצור הענבר מוכנס ב התקשרL RNA, וכתוצאה מכך דיכוי של קודון להפסיק והכנסת Anap. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    1. דגירה ביציות בפתרון 2 מ"ל Barth בתוספת אנטיביוטיקה סרום 5% סוס (HS) ב 18 מעלות צלזיוס למשך 6-24 שעות כדי לאפשר ביטוי חזק של tRNAs ספציפיים ANAP ו synthtases tRNA.
      הערה: זמן הדגירה DNA יכול להימשך מספר ימים לפני הזרקת רנ"א, אבל זה לא להגביר את הביטוי.
    2. הכן את מזרק ננו עבור הזרקת רנ"א (כמו צעד 2.2 אבל את הזרקת קצה לא צריך להיות רזה כמו הזרקת דנ"א). עבודה רק תחת אור אדום מנקודה זו כדי למנוע photobleaching של Anap.
    3. מערבבים 1 μL של 1 מ"מ אנאפ עם 1 μL של 1-2 מיקרוגרם / μL mRNA ישירות על פיסת parafilm ולמלא את קצה הזרקת עם הפתרון המעורב. אימפל מתחת לממברנה בצמח(בהיר) מוט ולהזריק 46 nL בכל ביצית מוזרק pAnap.
      הערה: הריכוז הנדרש mRNA תלוי בחלבון של עניין.
    4. דגירה ביציות מוגן מפני אור בתיבה או עטוף בנייר אלומיניום, פתרון של בארת 'בתוספת אנטיביוטיקה 5% בסרום בסרום ב 18 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. שערי עם פתרון של בארת 'טרי כל יום ולהסיר ביציות מתים כדי למנוע זיהום.

    3. הגדרת VCF

    1. התקן את הציוד המתחבר ביצי מתח, כפי שתואר לעיל.
    2. הר את מערכת הקלטה electrophysiology על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף על ידי התקנת תא ההקלטה על המחוון המאפשר להעביר את זה בין stereoscope סטנדרטי עבור הצבת הביצית ואת המיקרוסקופ לבצע מדידות הקרינה ( איור 2 ג ).
      הערה: הגיאומטריה של החדר לחתוך ביציות פתוח אינו מתאים לשימוש tra רגילההדלקת אור להארה במהלך מניפולציה. לכן, מנורת הלוגן "gooseneck" עם מסנן אדום משמש להאיר הצדה מלמעלה. הקבל של המיקרוסקופ ניתן להסיר את החלל כדי להנמיך את הבמה עבור תא electrophysiology.
    3. חיבור מערכת גילוי photodiode ליציאת היציאה C- הר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 2 א ). לחבר את readout פוטו אל ערוץ קלט השני מעבד אותות דיגיטליים (DSP, אנלוגי / דיגיטלי - דיגיטלי / ממיר אנלוגי).
    4. השתמש 100 W, מנורת הלוגן 12 V כמקור אור עבור עירור פלואורסצנטי.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במבערי HG, אך יש להפחית את עוצמתם כדי למנוע צילום מהיר מדי במהלך ההקלטות. תאורת LED מומלצת רק אם נוריות LED בהתאמה להראות עוצמה משמעותית בטווח עירור ( למשל, ~ 350 ננומטר עבור Anap). רוב נוריות LED הלבנות לא מגיעים רחוק לתוך הספקטרום UV.
    5. InsErt תריס מבוקרת חשמלית בין מקור האור עירור מיקרוסקופ ולחבר את השליטה שלה (בדרך כלל TTL- הדופק) כדי פלט דיגיטלי של DSP. זמן הדופק TTL בתוכנת ההקלטה (עיין בתיעוד היצרן), כך שהתריס ייפתח ~ 100 אלפיות השנייה לפני תחילת ההקלטה. בדרך זו, כל הרטט במהלך תהליך הפתיחה אינו מפריע להקלטה. הזמן תלוי במהירות ורטט של התריס. סיים את 5 הדופק לפני סוף ההקלטה, כפי שמוצג באיור 4 . בדרך זו, הערך עבור הקרינה הכולל נרשם גם.
    6. הכנס קוביית מסנן מתאים (מסנן עירור, המראה dichroic ו מסנן פליטה) של הצריח קוביה מסנן. עבור Anap, השתמש Expass: 377/50 nm bandpass, dichroic 409 nm longpass, ו: 470/40 nm bandpass.

    איור 3
    איור 3 / Strong> : הגדרת VCF. ( A ) בצד תצוגת VCF מראה את הנתיב האור בתוך המיקרוסקופ. קוביית המסנן מכילה מסנן עירור, מראה דיכרואי ומסנן פליטה. ( B ) נבחרים מימדים תאיים הביצית הם 3.4 ס"מ עבור רדיוס החדר העליון (1), 5.5 ס"מ אורך החדר התחתונה (2), 1.4 ס"מ עבור רוחב החדר התחתונה (3) ו 1.7 ס"מ עבור רוחב החדר האמצעי (4). ( ג ) תצוגה קדמית של הגדרת VCF. הראשון ocular בצד שמאל הוא הרכבה את הביצית בתא פתוח לחתוך מתח מהדק עבור permeabilization. ואז, החדר הוא החליק מתחת למיקרוסקופ בעין השנייה ימינה. כאן, האלקטרודה V1 מוכנס לתוך הביצית באמצעות המטרה 4X, פלואורסצנטי נרשם באמצעות המטרה 40X מים טבילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Itle "> 4. הקלטה VCF

    1. בצע את השלבים הכנה לחתוך לפתוח ביצית מתח מלחציים כפי שתואר לעיל דמיינו 18 (הכנה גשר אגר, הרכבה ביצית, permeabilization saponin). עם זאת, עבודה תחת אור אדום בכל עת, כדי למנוע הלבנת fluorophore לפני הקלטות. בעת הנחת הביצית, ודא כי מוט החיה פונה כלפי מעלה. פיגמנטציה תחת קרום המוטות מוט בעל חיים נגד autofluorescence שמקורם cytosol ולכן מפחית הקרינה רקע.
    2. החלק את החדר אל המיקרוסקופ ולהתמקד באמצעות המטרה 4X.
    3. למדוד את הביצית עם מתח V1 אלקטרודה חישה (3 M KCl), לעבור למים טבילה 40X (NA 0.8 - 0.9) המטרה. דגש על מוט החיה אשר פונה כלפי מעלה.
    4. כבה את האור האדום. בחר את קוביית המסנן המתאימה על-ידי סיבוב הצריח הקובני של המסנן ויציאת היציאה האופטית המחוברת לפוטודיודה. הפעל את הלוגEn המנורה בעוצמה הגבוהה ביותר ו לעבור את הצמצם פתוח עבור 2-5 s כדי לקרוא את עוצמת הקרינה רקע שמקורה הביצית. עם ההתקנה המתוארת הערך צריך להיות סביב 50-200 הרשות הפלסטינית עבור Anap.
    5. להדליק את מהדק, להעיף את האמבטיה / השומר לעבור פעיל ולהתאים את פוטנציאל הממברנה (V1 - V2) לפוטנציאל הפקודה על ידי סיבוב הכפתור על headstage אני.
    6. בחר להחזיק פוטנציאל, שלב פרוטוקול, מספר ואורך של פולסים וכו 'בתוכנת ההקלטה. שיא מתח תלוי זרמים ועוצמות הקרינה אנאפ.

    5. שני צבעים VCF

    1. כדי לפקח על שני מיקומים באותו חלבון בו זמנית, מוטציה חומצה אמינו תאית ונגישה לתוך ציסטאין, ולהסיר ציסטאין אחרים כדי להבטיח תיוג ספציפי עם כימיה טיול.
    2. בצע את שלב 2.1-2.5.
    3. לפני הקלטות VCF, דגירה ביציות ב 5 מיקרומטר TMR-maleimide ב תיוג פתרון במשך 15 דקות (או צבע אחרעם ספקטרה שאינה חופפת בהשוואה ל- Anap).
    4. שטפו את הביציות עם פתרון תיוג שלוש פעמים כדי להסיר צבע עודף.
    5. בצע את שלב 4.1-4.6.
    6. הכנס קוביית מסנן מתאים TMR (מסנן עירור, המראה dichroic מסנן פליטה) של הצריח קוביית מסנן. החלף את הקובייה TMR מסנן על ידי סיבוב הצריח מסנן.
    7. קרא את הקרינה רקע TMR כמתואר Anap בשלב 4.4.
      הערה: תיוג עם כימיה thiol תוצאות ברקע רקע גבוה עקב תיוג unspecific בקרום. לכן, הקרינה רקע TMR עשוי להרוות את מגבר (> 2,000 pA). במקרה זה, לא להקטין את עוצמת האור, אבל פשוט להפחית את הקרינה רקע על ידי הוספת היסט היסט לפוטודיודה. במערכות הזמינות מסחרית להשתמש "דגימה והחזק" תכונה על מערכת גלאי. הערה ערך הקרינה רקע (באמצעות מסנן צפיפות 10X ניטרלי) במעבדה jOurnal, כמו ערך זה לא יירשמו (הרוויה).
    8. שיא מתח תלוי זרמים ועוצמות הקרינה TMR בו זמנית כמו בשלב 4.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 מציג דוגמה של הקלטות VCF המתקבל ביצית להביע ערוצי שייקר עם איון מהיר הוסר (IR), L382stop-W434F בנוכחות pAnap ו Anap. המוטציה W434F חוסמת את זרמי האשלגן היוניים, המאפשרים למדוד את זרם הטעינה הזעיר (gating currents). הקלטות בו זמנית של זרמים gating (עקבות העליון) ו Anap פלואורסצנטי שינויים בעוצמה (עקבות נמוכים) על קוטביות להדגים את שילוב מוצלח של Anap למצב L382. כאן, Anap ממוקם על החלק התחתון של כל אחד מארבעת S4 טרנסממברני טרנספורן לזוז במהלך ההפעלה (L382) ובכך לדווח על התארגנויות מקומיות תאיים. שינוי הקרינה יכול להיגרם על ידי הרפיה ממס (שינויים קוטביות סביבתיים) ו / או מרווה ידי חומצות אמינו אחרות 4 . שני המנגנונים הם תוצאה של סידורי חלבונים יחסיים. איור 5 מציג ANAP ו- TMR אותות הקרינה באמצעות פרוטוקולים שלב המתקבל ביצית אותו. על ידי הוספת מוטציה A359C לתוך הרקע L382stop-W434F תיוג עם TMR-maleimide, זה אפשרי עם הטכניקה המתוארת כדי לחקור בזמן אמת תנועות באזורים שונים באותו חלבון. במקרה זה, TMR בודק את התנועה של הסליל העליון S4 (A359C) ואילו Anap בודק את התנועה של החלק התחתון של S4 (L382). מ מהלך הזמן של שינוי הקרינה ניתן לאחזר מידע דינמי של המעבר פיקוח על ידי הקרינה על ידי ניתוח קינטיקה ( תרשימים 5A, 5B ). יתר על כן, הקשר פלואורסצנטי מתח (FV) מתקבל על ידי זומם את עוצמת הקרינה מצב יציב נגד מתח ( איור 5 ג ). FV משקף את שיווי המשקל בין התפוסה של מדינות פיקוח אשר במקרה של ערוצי יון יכול לעקוב vתנועת חיישן מתח, או פתיחת הנקבובית המרכזית. באמצעות fUAAs עכשיו ניתן להשיג את FV מבפנים של הערוץ. איור 5C מראה כי החלק העליון של S4 (TMR) יש תלות מתח זהה החלק התחתון של S4 (Anap).

יחס אות לרעש תלוי בעיקר שינוי הקרינה היחסי (dF / F) ואת הקרינה הכוללת. DF / F מגדיר את גודל האות ואילו הרעש נקבע על ידי הקרינה הכולל בגלל הטבע הקוונטי של האור (רעש Poisson). DF / F יהיה תלוי במצב של מרווה במצבים שונים של החלבון, ואת התפוסה של מדינות ( למשל, ההסתברות הפתוחה). הקרינה הכוללת כוללת את הקרינה מן תיוג ספציפי מתוך תיוג רקע unspecific. הקרינה הספציפי הכולל מוגדר על ידי מספר חלבונים לידי ביטוי התשואה הקוונטית של fluorophore. המשטח הגדול של XEביציות nopus הוא יתרון כי זה מגדיל את מספר חלבונים התורמים.

התשואה הקוונטית של אנאפ, כלומר מספר הפוטונים הנפלטים למחזור עירור או "הבהירות" של הפלואורופור, נמוכה יותר, מה שמוביל לעוצמת הקרינה הכוללת נמוכה יותר ובכך להפחית את יחס האות לרעש. במקביל, Anap תיוג מוביל פלואורסצנטי רקע נמוך כך יחס האות ל-רקע (dF / F) גבוה יותר עבור Anap ( תרשימים 5A, 5B ).

ניסוי שליטה חשוב הוא לבדוק את הביטוי בהעדר Anap, על מנת להעריך את ההשפעה של ביטוי דליפה. זה הוכח בעבר כי מתח בודד מתחמי חיישן (iVSDs, 1-382), אשר חסרים את המקשר S4-S5 ואת הנקבוביות מתבטאים תפקודית 19 . לכן, בהעדר Anap, ערוצי L382stop-W434F להביע כמו iVSD כפי שמוצג באיור 6 . ביטוי של ערוצים באורך מלא עם Anap יש מעט או ללא iVSD זרמים, בעוד ערוצי קטום התערוכה iVSD זרמים חזקה בהעדר Anap. נוכחותם של חלבונים מסוג C- מסוף חתוכים זה תלוי במיקום של קודון לעצור מוכנס תמיד צריך לקחת בחשבון בעת ​​עבודה עם חומצות אמינו לא טבעי. ניסויים בקרה ללא אנאפ לאפשר אימות אם האוכלוסייה heterologous קיים בניסויים עם Anap.

איור 4
איור 4 : זרמים Gating בו זמנית ושינויים הקרינה מן השטח חלבון cytosolic שהושג עם VCF. זרמים Gating שהושגו עם פרוטוקול חיסור P / 4 הקלטה בו זמנית של הקרינה על דטרובליזציה. Anap הוא שולב Shaker על מיקום L382, ויוצר את voעצמת הקרינה תלויי ltage מהקצה התוך תאי של סליל ה- S4. עוצמת הקרינה המקסימלית מסומנת "F" ואת שינוי הקרינה מסומן "dF". הכוכב בסוף השינוי הקרינה מסמן את סגירת תריס חשמלי (פתיחת התריס לפני הדופק אינו מוצג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5 : VCF בשני צבעים עם ANAP ו- TMR. ( A ) Anap ( B ) שינויים הקרינה TMR המתקבל שייקר A359C-L382Anap-W434F להביע ביצית שכותרתו עם TMR-maleimide. ( ג ) שינויים הקרינה מ A ו- B הם זממו נגד פוטנציאל הממברנה (FV). הנתונים מוצגים בממוצע7, SD עם n = 5 ביציות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6 : C- מסוף מקוצץ שייקר ערוצי מבוטאים בהעדר Anap. מתחמי חיישנים מתח בודדים (iVSD, 1-382) מתבטאים ב- zH4IR-L382stop-W434F בהיעדר ANAP, וכתוצאה מכך זרמי iVSD בפוטנציאלים היפר-קוטביים 19 . בנוכחות Anap עם זאת, ביטוי באורך מלא שייקר מתחרה הביטוי iVSD, וכתוצאה מכך, כמות iVSD הוא פחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב aminoacylation in vivo של tRNAs אשר מתמשכים ברציפות יחד עם tRNA-synthetase, מאפשר להשיג רמות ביטוי גבוהות מדידות הקרינה. עבור שילוב FUAA יעיל, זה קריטי כי pAnap מוזרק כראוי לתוך הגרעין. בשל חוסר הוודאות של המיקום המדויק של הגרעין, 10-40% מהזרקת ה- DNA צפויים להיכשל, וכתוצאה מכך לא הביעו ביציות (או דליפות-הביעו) ביציות. לכן, חשוב לבדוק את הביטוי בהעדר Anap ו pAnap לזהות פנוטיפים הנוכחי ואת הגדלים במקרה של ערוצי דליפה. בדרך זו, ניתן להבחין ביציות עם זריקות דנ"א תקין (ביטוי גבוה, Anap dF, פנוטיפ הנוכחי באורך מלא) מאלו עם זריקות דנ"א נכשל (לא או ביטוי נמוך, לא DF Anap, פנוטיפ הנוכחי חתוך אם בכלל). במקרה של חוסר ביטוי פתאומי עם אנאפ, להכין aliquot Anap חדש כמו Anap אינו יציב עבור peri יותרOds ב תמיסה מימית (עד 1 שנה).

השימוש fUAAs עם VCF מוגבל על ידי בחירה של fluorophores מאז כל FUAA חדש דורש זוג tRNA אורתוגונלי / tRNA synthetase להיות מהונדסים. עד כה רק Anap קיים כמו FUAA פונקציונלי לדווח על הדינמיקה חלבון ביציות. רמות ביטוי גבוהה נדרשים על מנת לזהות שינויים הקרינה אנאפ ואנו מעריכים צפיפות חלבון מינימלי של 2 - 4000 מיקרומטר - 2 בהתאם הרגישות של האתר. לדוגמה, שינויים הקרינה אנאפ ניתן לראות רק 0.2 mS של זרמים יוניים עבור V234Anap (2.4 x 10 9 ערוצים לכל אזור clamped ב לחתוך מתח פתוח מהדק), בעוד 5 nC של זרמים gating (1 x 10 6 ערוצי ערוצים לכל clamped אזור ב מהדק מתח פתוח לחתוך) נדרשים עבור A391Anap-W434F. כמו שייקר הוא tetramer יש לו ארבע מולקולות אנאפ לכל ערוץ. כתוצאה מכך, dimers או חלבונים monomeric סביר להניח דורשים רמות ביטוי גבוהות יותר. FurtheRmore, הלבנת קינטיקה של אנאפ, אשר תלויים בסביבה כימית, כמו גם עוצמת האור, צריך להיות מאומת על מנת להבטיח מספיק אינטנסיביות נשאר עבור הפרוטוקול כולו. מצאנו כי קינטיקה בטווח זמן 1 השני עדיין יכול להיות מוקלט עם פרוטוקול צעד מתח טיפוסי. הלבנה יכולה להיות ממוזער על ידי הפחתת עוצמת האור (תהליכים איטיים ניתן לסנן יותר) או הוספת quenchers המדינה שלישיה כגון Trolox (ידוע ממחקרים בודדים פלואורסצנציה מולקולה). אם עירור LED משמש, אפשר גם להגדיר פרוטוקול "מדגם" את עוצמת הקרינה כל 100 אלפיות השנייה 5-10 ms, ביעילות הפחתת זמן עירור 10-20X.

מתח הידוק פלואורומטריה כבר טכניקה חזקה ללמוד יחסי מבנה המבנה של חלבונים הממברנה, וזה כבר בשילוב עם מגוון רחב של טכניקות פלואורסצנטי כולל ליגנד שכותרתו 11 , Lanthanide מבוססי ו Förster תהודה אנרגY העברת (LRET / סריג) 20 , 21 ומעבר מתכת מתכת 22 . עם זאת, מגבלות על טכניקות תיוג מעכב את היישום הנרחב. חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים מבחינה גנטית, בעוד שלא יסולא בפז ביישומים רבים אחרים, גדולים מכדי להציע חלופה כללית. הם הועסקו בהצלחה ב- C- מסוף 23 ואת תחום ליגנד מחייב של BK ערוצים 24 24 , אבל לא ניתן להכניס את "נקודות חמות" של החלבון. המבוא של חומצות אמינו לא טבעיות של פלואורסצנט לשדה פתח את הטכניקה בשתי דרכים 2 : (i) חלבונים רבים יותר ניתן ללמוד מאז עוד ציסטאין endogenous יש להסיר; (2) אתרי cytosolic ו קבור יכול להיות מתויג המאפשר מגוון רחב יותר של מנגנונים רגולטוריים להיחקר.

הנדסת העתיד של tRNA אורתוגונליים / synthetזוגות ase עבור fUAAs חדש יגדיל את תחולתה של VCF עוד יותר. כמו כן, שילובים שונים של fUAAs שונים יכול להיות אפשרי באמצעות בסיס ארבעה או בסיס 5 קודון אסטרטגיה 25 , 26 . בשל היעילות הגבוהה בה ביציות Xenopus מסוגלים לשלב UAAs ואת היישום הנפוץ של VCF, אנו מצפים fUAA-VCF להפוך טכניקה מפתח בתחום של מבנה החלבון ואת הפונקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

PAnap היה מתנה אדיבה של ד"ר פיטר שולץ (מכון המחקר Scripps). עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מענקי מחקר MOP-102689 ו MOP-136894 (ל RB) וקרן קנדה למענק חדשנות 950-225005.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Barth's solution
NaCl  Sigma-Aldrich S7653 90 mM
KCl Fisher Scientific BP366-500 3 mM
MgSO4 Sigma-Aldrich M-9397 0.82 mM
CaCl2 Sigma-Aldrich C-7902 0.41 mM
Ca(NO3)2 Sigma-Aldrich C-1396 0.33 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 5 mM
NaOH hydrate BDH BDH7225-4 pH 7.6
Penicilin Invitrogen 15140122 100 U/mL
Streptomycin Invitrogen 15140122 100 µg/mL
Kanamycin Invitrogen 15160054 10 mg/100mL
Horse Serum (HS) Invitrogen 16050122 5%
SOS Standard Oocyte Solution
NaCl  Sigma-Aldrich 746398 102 mM
KCl Sigma-Aldrich 746436 3 mM
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272 1 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 5 mM
External recording solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG) Alfa Aesar L14282 115 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10 mM
Calcium hydroxide Sigma-Aldrich 239232 2 mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
Internal recording solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG) Alfa Aesar L14282 115 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10 mM
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher Scientific E478-500 2 mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
Labeling solution
KOH Fisher Scientific P250-1 115 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10 mM
Calcium hydroxide Sigma-Aldrich 239232 2 mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
TMR stock solution
Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) Molcular Probes by Life Technologies T6027 5 mM in DMSO
Anap stock solution
Anap ABZENA (TCRS) Custom synthesis TCRS-170 1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N
Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipment
pAnap Addgene 48696
High Performance Oocyte Clamp Dagan Corporation CA-1B
Gpatch Acquisition software Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles
Analysis software Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles
Recording Chamber Custom machined
Photo diode detection system Dagan Corporation PhotoMax-200/PIN
Electrical shutter driver UNIBLITZ VCM-D1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  2. Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
  3. Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
  4. Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , CRC Press. 113-133 (2015).
  5. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  6. DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
  7. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  8. Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
  9. Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
  10. Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
  11. Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
  12. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  13. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  14. Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
  15. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
  16. Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
  17. Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
  18. Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  19. Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
  20. Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
  21. Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
  22. Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
  23. Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
  24. Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
  25. Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
  26. Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).

Tags

ביוכימיה גליון 123 חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא טבעיות פלואורומטריה של מתח הידוק מהדק מתח פתוח ביצית Anap דיכוי קודון של ענבר מיקרו-דגימה של דנ"א,
מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalstrup, T., Blunck, R.… More

Kalstrup, T., Blunck, R. Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids. J. Vis. Exp. (123), e55598, doi:10.3791/55598 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter