Summary
Papiret introducerer en fremgangsmåde til gentagne målinger af ventilation og respiratorisk muskelaktivitet i en frit opfører amyotrofisk lateral sklerose (ALS) musemodel hele sygdomsprogression med hel-legemsplethysmografi og elektromyografi via en implanteret telemetrienheden.
Abstract
Tilbehør respirationsmusklerne bidrage til at bevare ventilation, når membranen er svækket. Den følgende protokol beskriver en fremgangsmåde til gentagne målinger over uger eller måneder efter tilbehør respiratorisk muskelaktivitet samtidig måler ventilation i en ikke-bedøvet, frit opfører mus. Teknikken omfatter kirurgisk implantation af en radiosender og indsættelse af elektroden fører ind i scalene og trapezius muskler til at måle elektromyogram aktivitet af disse inspiratoriske muskler. Ventilation måles ved hel-legemsplethysmografi, og dyrs bevægelser vurderes ved video og er synkroniseret med electromyogram aktivitet. Målinger af muskelaktivitet og ventilation i en musemodel for amyotrofisk lateral sklerose præsenteres for at vise, hvordan dette værktøj kan anvendes til at undersøge, hvordan respiratorisk muskelaktivitet ændringer over tid og at vurdere virkningen af muskelaktivitet på ventilation. De beskrevne metoder kan easily tilpasses til at måle aktiviteten af andre muskler eller vurdere tilbehør respiratorisk muskel aktivitet i yderligere musemodeller af sygdom eller tilskadekomst.
Introduction
Tilbehør respiratoriske muskler (ARM'er) øge ventilationen i perioder med høj efterspørgsel (fx motion) og hjælpe med at bevare ventilation, når membranen funktion er kompromitteret efter skade eller sygdom 1, 2. Selvom ændringer i membran funktion er blevet godt beskrevet i amyotrofisk lateral sklerose (ALS) patienter og musemodeller 3, 4, 5, 6, meget mindre om aktiviteten eller funktionen af rentetilpasningslånene i ALS. , En undersøgelse foreslog imidlertid, at ALS-patienter, der rekrutterer våben har en bedre prognose end dem med lignende membran dysfunktion, der ikke gør 7. Endvidere ARM aktivitet er tilstrækkelig til respiration i tilfælde af mellemgulvet lammelse 8. Disse undersøgelser viser, at strategier at forøge ARM-funktionen kan forbedre breathing i patienter, der lider neuromuskulær sygdom, rygmarvsskade, eller andre tilstande, hvor membranen funktion er nedsat. Men de mekanismer, der styrer ARM rekruttering til at trække vejret er stort set ukendt. Metoder til måling af åndedrætsfunktionen og ændringer i ARM aktivitet over tid i dyremodeller af sygdom eller skade er nødvendige for at undersøge, hvordan rentetilpasningslån rekrutteres, samt at evaluere behandlingsformer for at forbedre ARM rekruttering og ventilation. Endvidere kan øget aktivitet af våben falder sammen med det progressive tab af membranen funktion være et nyttigt biomarkør for sygdomsprogression i neuromuskulære sygdomme, såsom ALS 7, 9, 10.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til ikke-invasiv (efter den første kirurgi) og gentagne gange måle aktiviteten af respiratoriske muskler og ventilation i vågne, opfører mus. Synkroniserede optagelser af elektromyografy (EMG), hel-legemsplethysmografi (WBP), og video tillader undersøgeren for at vurdere, hvordan ændringer i ARM aktivitet indvirkning ventilation og til at bestemme, når motivet er i hvile eller bevæger sig. En stor fordel ved denne fremgangsmåde er, at den kan udføres i vågne, opfører mus, mens nogle alternative metoder til måling af EMG kræver anæstesi og / eller er terminalprocedurer 11, 12, 13. Registrering af EMG-aktivitet i vågen mus over tid kan også opnås gennem den kroniske implantation af EMG fører, hvor musen er tøjret med ledninger til erhvervelse systemet 14, 15. Fordi tøjring en mus kan forstyrre normal bevægelse eller adfærd og kan ikke være foreneligt med en standard plethysmografi kammer, den beskrevne metode benyttes telemetri enheder til trådløst at overføre EMG-signalet til erhvervelse system. Senderen kantændes eller slukkes med en magnet for at spare på batteriet og giver gentagne målinger af EMG aktivitet over flere måneder. Denne protokol kan let tilpasses til at måle aktiviteten af yderligere respiratoriske eller ikke-respiratoriske muskler ved at indsætte EMG fører ind forskellige muskler. Alternativt kan en af de to ledninger anvendes til at måle EEG aktivitet at vurdere søvntilstand eller til at identificere anfaldsaktivitet 16. Denne teknik har med succes været anvendt til at måle ændringer i ARM aktivitet i hvile i hele sygdomsprogression i en musemodel af ALS og at identificere de vigtigste neuroner kørsel ARM aktivitet i raske mus 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle procedurer blev godkendt af Cincinnati Children 's Hospital Medical Center Institutional Animal Care og brug Udvalg og gennemføres i overensstemmelse med NIH Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Forberedelse til telemetri Device implantat kirurgi
- Sæt på personlige værnemidler (dvs. scrubs, skoovertræk, kjole, hår netto, maske, og kirurgiske handsker).
BEMÆRK: Denne operation kræver et sterilt område. - Tænd inkubator (servostyret luftfugter / spædbarn inkubator indstillet til 29 ° C) og linje det med tørre, hvide håndklæder at tillade korrekt opvarmning til nyttiggørelse.
- Før kirurgi, sterilisere alle kirurgiske instrumenter med ethylenoxid og sterilisere sender med et enzymatisk rengøringsmiddel og kemisk steriliseringsmiddel (eller som angivet af fabrikanten) før anvendelse.
BEMÆRK: Kirurgiske instrumenter bør omfatte # 2 laminektomistederne pincet (standard tip / straight / 12 cm) (x4), smalpattern pincet (savtakket / buet / 12 cm), vævs-separering saks (straight / stump-stump / 11,5 cm) og en skalpel holder og klinge. Det anbefales at have et separat sæt steriliserede instrumenter (to # 2 pincet og saks) udelukkende er forbeholdt håndtering ledningerne på senderen til at holde de kirurgiske redskaber i god stand. - Sterilisere alle overflader inden det kirurgiske felt med et acceptabelt desinfektionsmiddel. Placer en stereo dissektion mikroskop, isofluran bedøvelse maskine, kirurgiske værktøjer og neglesaks på det kirurgiske område (se tabel of Materials).
- At opretholde muse kropstemperatur mens under anæstesi, placere en varmepude eller vand tæppe under steril serviet foran stereo dissektion mikroskop.
- Sikre, at senderen er fuldt funktionsdygtig før anvendelse.
BEMÆRK: En lille magnet placeret inden 2 i fra senderen tændes enheden til og fra. Når senderen er tændt og holdt tæt på en raDIO fastsat til 500 Hz AM frekvens, vil den afgive en konstant, skingre summende støj. For at spare på batteriet, vend batteriet ud, før implanterer det i dyret. - Forberede elektroden fører før kirurgi ved at trimme de distale ledninger med saksen forbeholdt håndtering tråde, således at der er ca. 3 cm af bly (nok til at nå målet muskel) (figur 1A). Alternativt coil ledningerne proximalt til enheden og binde dem sammen med suturer, så der er ca. 3 cm af uopspolede bly.
BEMÆRK: Gem trimmede-off del af elektroden fører for at forberede "lead caps" (plastisoleret casing), som beskrevet i trin 1.9. I trin 3 vil sender- leads indsættes gennem musklen, så og den distale, udsatte del af trådene skal holdes på plads og isoleret under anvendelse af bly hætter. - Brug en skalpel til at trimme 0,5 cm af plast dækker uden at skære selve tråden. Brug værktøjerne forbeholdt for wire håndtering at strække enderne af lederne 4 - 5x deres oprindelige længde, således at de passer let inden i en 25-gauge nål (figur 1B-B ''). Trimme den blotlagte tråd af lederne, så de er 0,5 cm i længden.
- Forberede bly hætter (plastrør til dækning trådenderne) forud for kirurgi. Brug en skalpel til at trimme 0,25 cm-lange rør fra plasthus omkring segmenterne af elektrode fører reddet fra trin 1.7.
BEMÆRK: Fire bly hætter er påkrævet for hver mus, der vil gennemgå implantation, men det er bedst at forberede det dobbelte af den nødvendige mængde af hætter. Under yderligere sterile forberedt bly caps er nyttigt i tilfælde sikre en blyplade mislykkes i første forsøg. - Notér serienummeret på den indsatte sender og gem den originale emballage med den kalibrerede oplysninger. Hver sender har forskellige frekvenser kalibreringer for EMG optagelse; indtaste disse i købet software til at opnå acceptabel EMGoptagelser.
2. Klargøring af mus til Kirurgi
- Vælge den ønskede musen til implantation (dvs. SOD1 (G93A) eller kontrol) og vejes dyret.
BEMÆRK: Anbefalet alder og vægt for en mus (mand eller kvinde) undergår denne operation er P56 - P120 og ≥ 24 g. - Bedøver musen under 3,5% isofluran med en 2 L / min oxygen strømningshastighed. Udfør en tå knivspids og en hale knivspids for at sikre, at musen er fuldt bedøvet.
- Når bedøvet, fjernes musen fra dueslaget og opretholde anæstesi via en næsekegle ved at sætte isofluran niveau til 1,5% og oxygenstrømningshastigheden til 1 l / min. Udfør en tå knivspids og / eller hale knivspids for at sikre, at bedøvelsen opretholdes.
- Påfør smøremiddel oftalmisk salve for at forhindre øjnene tørrer ud under operationen.
- Barbere musen til at eksponere et kirurgisk sted mellem øret og skulderen (figur 1C).
- Suppleant pensling operationsstedet, først med et desinfektionsmiddel og derefter med isopropanol. Gentag 2 gange mere.
3. Implantation telemetrienheden til Optag scalenii og Trapezius EMG aktivitet
- Sende dyret under en dissektion mikroskop, på sin side på toppen af en steril pude dækker en varmepude, og fastgør næsekeglen på plads med tape. Bemærk, at det er bedst at implantere i højre side for at reducere EKG-signal stammer fra hjertet.
BEMÆRK: Overvåg vejrtrækning og justere isofluran niveauer, hvis det er nødvendigt, for at opretholde en regelmæssig respiration sats og passende kirurgisk plan anæstesi. - Træk forben mod den ipsilaterale fods langs torsoen.
BEMÆRK: Denne position forskyder skulderbladet kaudalt, giver kirurgisk adgang til scalene og trapezius muskler.- Tage de stumpe buede pincet, hæmmer forpote ipsilateralt til operationsstedet, og tape pote på plads (figur 1C). Brug stærk lim kirurgisk tape for at sikre, at poten er sikkert for varigheden af proceduren.
- Tag for friske kirurgiske handsker. Bruge skalpel til at foretage en skrå snit, ca. 2 cm lange, mellem skulderen og øret (rød linie i figur 1C).
- Ved anvendelse af to # 2 laminektomistederne pincet, en i hver hånd trækkes tilbage fedtpuden og spredt fra hinanden trapezius og platysma muskler at blotlægge fascia dækker sternocleidomastoideus og scalene muskler (figur 1D og E).
- Brug den blege musculus sternocleidomastoideus og phrenic nerve som vartegn for at identificere de scalene muskler. Bemærk, at phrenic nerve løber parallelt med de scalene muskler, mens sternocleidomastoideus ligger inferior. De scalene muskler løber skråt fra halshvirvlerne til ribbenene under trapezius musklen. Biopotential ledninger vil blive indsat i den forreste uligesidet muskel, som kan identificeres som den muskel, løber ved siden phrenic nerve (figur 1F og G).
BEMÆRK: Forsigtig. Dette område er særdeles vaskulariseret, og skal være omhyggelig med at undgå at skære subclavia arterie. Undgå at beskadige phrenic nerve og plexus brachialis. - Når scalene og trapezius muskler er blevet identificeret (figur 1G), foretage en subkutan lomme til senderen på bagsiden af dyret, mellem skulderbladene.
- Brug vævs-adskillelse saks, indsætte de stumpe spidser af saksen lige under huden og sprede dem, indtil en lomme åbning, der er ca. 1,25 x bredden af senderen er dannet (figur 1 H).
BEMÆRK: Transmitteren skal indsættes med minimal modstand, men det Pocket bør ikke være så stor, at senderen kan bevæge sig på egen hånd. Hvis lommen er for lille, kunne senderen gnide mod huden og forårsage irritation, som kan tilskynde dyret til at ridse huden og / eller trække ledningerne ud. Hvis lommen er for stor, kunne seromas dannelse, eller senderen kunne migrere til en ugunstig position.
- Brug vævs-adskillelse saks, indsætte de stumpe spidser af saksen lige under huden og sprede dem, indtil en lomme åbning, der er ca. 1,25 x bredden af senderen er dannet (figur 1 H).
- Skylle med varmt, sterilt saltvand og indsæt Senderen med fladere side mod musklen. Placer senderen, således at den ligger fladt og ledningerne komme ud af lommen, parallelt med hinanden i stedet snoet (Figur 1I). Krølle enhver overskydende længde af tråd under enheden og lægge det fladt.
- Køre ledningerne fra senderen til scalene og trapezius muskler, så de to sæt bipotentiel leads ligge fladt og parallelt med hinanden.
- Brug laminektomistederne pincet til at adskille den forreste scalenii fra de omkringliggende muskler og indsætte en 25-gauge nål gennem uligesidet muscle, vinkelret på muskelfibrene.
- Indsætte en føring ind i spidsen af nålen og træk nålen ud af musklen, efterlod føringen indsat i musklen op til isoleringen af tråden (fig 1J og K). Optag der farvede ledninger er indsat i hvilken muskel.
- Placere en lille dråbe cyanoacrylatklæbestof på den blottede ende af wiren, tæt på musklen hvor bliver sat ind, og hurtigt skub den ledende hætte over tråden så ingen ledning er blotlagt mellem den ledende hætte og musklen (figur 2A og B).
BEMÆRK: Selv om det er en accepteret praksis at sikre EMG fører med cyanoacrylat 17, 18, en alternativ metode er at sikre føringen hætte på plads ved at binde en silke sutur knude omkring det. - Trimme det overskydende ledning distalt til hætten og anvende en dråbe cyanoacrylatklæbestof til enden af den ledende kappe / ledning. Giv den limtid til at polymerisere før frigivelsen (figur 2C og D).
- Følge de samme trin (trin 3,10-3,12) for at indsætte den modsatte polaritet bly parallelt med den første i samme muskel, 1 - 2 mm, væk fra den første ledning.
- Gentage trin 3,10-3,12 at indsætte fører ind trapezius musklen, der ligger lige foran den uligesidet musklen (figur 1L og M).
- Sørg for, at ledninger, fikseres på plads, og at der er lige nok slæk i ledningerne for dyret at udføre kropsbevægelser uden at trække på ledningerne. Sørg for, at eventuelle overskydende længde af bly ikke skubbe mod huden, da dette kan forårsage irritation, som kan tilskynde dyret til bunden eller trække ledningerne ud. Flyt ledningerne, hvis det er nødvendigt, for at forhindre enhver potentiel ubehag.
- Fjern forsigtigt tapen holde forben. Træk fedtpude tilbage over musklen og bruge den til at dække de indsatte kundeemner. Lukke snittet med cyanoacrylatklæbestof ved drilleriklapperne huden sammen igen, således at indsnitslinjerne op. Klemmes en del af hudlapper sammen med de buede pincet og anvende en lille serie af cyanoacrylatklæbestof langs denne linje.
- Injicere 0,1 ml af carprofen subkutant at lindre post-operative smerter, medens dyret stadig er under anæstesi.
BEMÆRK: Fortsat administrere 0,1 ml carprofen gang om dagen i 1 - 2 dage efter kirurgi, og derefter efter behov efter at. - Fjern dyret fra næsekegle og placere den i en ren bur i forvarmet inkubator indtil dyret er vågen og bevæger sig rundt i buret frivilligt. Hold dyret i inkubatoren i mindst 15 minutter bagefter, overvågning sine bevægelser og årvågenhed.
4. Postoperative Care
- Hus dyr separat efter operationen. Give healing dyr med kost gel og en vandflaske.
- Overvåg dyret for første 30 minutter efter operationen. Tjek på dyret mindst hver time feller 5 timer efter kirurgi. I dagene efter operationen, kontrollere mindst to gange dagligt.
- Se for nekrose, infektion langs snittet og i kropskaviteten indeholdende implantatet (dvs. varme, hævelse og rødme), og serodannelse.
BEMÆRK: Disse tegn opstår inden for den første uge efter operationen. En sund helbredte dyr en måned efter operationen er vist i fig 1N. Selvom EMG optagelser foretages umiddelbart efter implantation, er dyrene gives mindst en uge til at helbrede før optagelse EMG og plethysmografi, som EKG-signaler kan være høj umiddelbart efter implantation.
5. Erhvervelse Samtidig Elektromyografi og pletysmografi Signaler
- Tænd alt erhvervelse udstyr, herunder skævhed flow.
BEMÆRK: Strømningshastigheden for mus typisk sat til 1,0 l / min. - Kalibrere plethysmografi kammer (er) under anvendelse af et flowmeter.
BEMÆRK: Periodisk kontrollere pletysmografi chambers for at sikre, at sælerne ikke er revnet eller knækket. Coate gummipakninger med et smøremiddel, såsom vakuum fedt en gang om ugen for at opretholde deres god stand. - Input transmitterkalibreringsarket som specificeret af fabrikanten.
- Placer musen i plethysmografi kammer i mindst 1 time at akklimatisere det før optagelse EMG og plethysmografi. Brug af flere kamre, er det muligt at optage fra en mus, mens den næste musen acclimating i et andet kammer. Tænd ikke senderen under akklimatisering periode for at spare på batteriet (Figur 1O).
- Før optagelse (men efter kalibrering), tænde for senderen ved at placere en stærk magnet inden 1 i den implanterede dyr; et rødt lys på forsiden af modtageren viser, når transmitteren er tændt.
- Begynd erhvervelse ved hjælp af rullemenuen mærket "Acquisition" og vælg "Start Acquisition." Selv optagelsens varighed kanvarierer fra eksperiment blev en typisk plethysmografi og EMG optagelse varer 1 - 3 ud h.
BEMÆRK: Transmitteren har en indre samplinghastighed på 240 Hz. En hurtigere hastighed på 500 Hz er indstillet i softwaren for at interpolere mellem punkter og til at give en mere jævn kurve. Lavpasfiltret (der fungerer som et anti-alias filter) og højpasfiltret i implantatet specificere 1- til 50-Hz båndbredde for denne telemetrienheden. 60-Hz A / C interferens ikke bidrager til overskydende støj i EMG signal, fordi implantaterne er batteridrevne og dyret afskærmer implantatet og fører fra elektriske felter. Pletysmografi, EMG, og video synkroniseres automatisk i realtid via erhvervelse software. - Når erhvervelsen er færdig, slukkes senderen med en magnet og fjerne dyret fra kammeret.
- Hvis man starter en anden optagelse, rengøre kammeret, indtaste i de nye senderen kalibreringer fra næste dyr, og begynde den anden optagelse. Hvis finneished med erhvervelsen for dagen, slukke senderen, rengøre plethysmografi kammeret, og sluk alt erhvervelse udstyr og bias flow.
Figur 1. Implantation af telemetri til at måle Respiratory Muscle EMG. (A) Telemetri-sendere med to par biopotentiale fører til måle EMG. Leads kan trimmes til den ønskede længde (nederst) eller oprullet og gemt under senderen (øverst). (B) Transmitter fører. (B') Leads med trimmet-off plastisolation at blotlægge trådene og for at gøre bly hætter (indsat). (B '') Afledning med ledninger strakt 4 - 5x deres oprindelige længde. Leads skal trimmes, så de er 0,5 cm lang (ikke vist). (C) Mouse klar til kirurgi, med den barberede kirurgiske sted og korrektpositioneret forpote. Den røde stiplede linje angiver webstedet indsnit. (D) Overfladiske muskler placeret nedenunder fedtpuden og fascia, set efter den indledende indsnit. T = trapezius. S = sternocleidomastoideus. P = platysma. Gule pil = phrenic nerve. (E) Cartoon diagram af muskler og phrenic nerve er vist i (D). Pincet bør anvendes til at adskille trapezius og platysma muskler til at nå dybere uligesidet muskel, der er vist i (F) og (G). (F) Seværdigheder anvendes til at identificere placeringen af scalenii og trapezius. Dette billede viser den subclavia arterie (hvid pil), phrenic nerve / plexus brachialis (sort pil), og den blege musculus sternocleidomastoideus (gul pil). (G) Cartoon viser placeringen af de dybere muskler (dvs. midt scalenii, forreste scalenii, og SCM), subclavia arterie, og phrenic nerve. Den bageste scalenii er ikke synlig. Disse kan tilgås, når superficial muskler (i D og E) spredes fra hinanden. (H) Making en lomme til senderen ved hjælp af de stump-spids saks. (I) Indsat senderen i den subkutane lomme, med de parallelt positioneret ledninger udgår fra lommen. (J) Indsættelse af 25-gauge kanyle i scalenii, vinkelret på muskelfibrene, at lave en tunnel til wiren bly. (K) Begge ledninger indsat i uligesidet muskel. Bly hætter er anbragt på enden og limes på plads. (L) Insertion af 25-gauge kanyle i trapezius, vinkelret på muskelfibrene, at lave en tunnel til wiren bly. (M) Alle fire ledninger indsat i trapezius og scalene muskler og liggende fladt forud for lukning af snittet. (N) Fuldt genvundet mus, med senderen placeret subkutant på ryggen. (O) Samtidig optagelse plethysmografi, muskel EMG-aktivitet, ennd video under anvendelse af en plethysmografi kammer (gul pil), telemetri modtager pude (rød pil) og kamera (sort pil), hhv. En multifunktions forspænding flow er forbundet til plethysmografi kammeret via et plastrør (blå pil) til at levere ilt til musen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sikring Bly Caps med Cyanoacrylat klæbestof. (A) Påfør en lille dråbe cyanoacrylat (lilla cirkel) til den eksponerede tråd af elektroden bly (E) ledning proximalt til musklen. (B) Hurtigt skubbe den forberedte hovedendehætten (LC) på den blottede tråd over cyanoacrylatklæbestof så det indledende hætten er placeret direkte tilstødende til musklen. (C) Skær en lille del af den distale ende af den ledende hætte og tråd, således at der ikke er synligt elektrode til stede, der er ikke isoleret med plast. (D) Påfør en lille dråbe cyanoacrylatklæbestof til enden af den ledende hætte. Fjern det trimmede-off distale ende af den ledende hætte fra dyret. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Analyse af ARM EMG og pletysmografi
- Åbn analysesoftware og se filen af interesse (gå til "File" og vælg "Åbn gennemgang fil"). Filter EMG-signaler ved hjælp af en 30-Hz højpasfilter ved at højreklikke på EMG spor, vælge "Analyser attributter," fremhæver "Avanceret Attributes 1" fanen, og ændre højpasfilter til 30 Hz.
BEMÆRK: Denne filtrering fjerner ikke-diskriminere, lavfrekvente information. Lokalisere områder uden museaktivitet ved visuel inspektion baseret på den manglende bevægelse i den synkroniserede videofil og manglen på store, uregelmæssige trykændringer på grund af bevægelse i plethysmografi trace (rød boks i figur 3A); inaktivitet opstår, når musen er i søvn eller vågen, men stadig. - Identificere EMG anfald uafhængigt for hver muskel.
- Korrigere og integrere det filtrerede EMG signal over 30 ms (figur 4).
BEMÆRK: Da mus ånde med en hastighed på 3 Hz, er hvert åndedrag repræsenteret ved ca. 11 integrerede værdier. - Bestemme basislinie EMG amplitude ved midling af ensrettede og integrerede værdier forbundet med EMG signal for en periode på 3 s når musen er inaktiv, og plethysmografi spor viser eupnea (normal vejrtrækning) (figur 4).
- Identificere "anfald" af aktivitet, der er defineret af mindst 3 på hinanden følgende ensrettede og integrerede værdier, som er mindst 50% stigning over grundlinjen EMG-signalet (bestemt i trin 6.3.2).
BEMÆRK: Tre på hinanden følgende værdier repræsenterer en 90-ms vindue, men nogle anfald vil indeholde mere end 3 værdier over tærsklen og vil vare længere end 90 ms. - Bruge den synkroniserede video- og plethysmografi spor at udelukke anfald, der opstår under suk (figur 3B); sniffing (figur 3C); eller viljesbestemte muse bevægelser, såsom hoved drejning og plejemidler.
- Gentag trin 6.3.1 - 6.3.4 for anden muskel.
- Korrigere og integrere det filtrerede EMG signal over 30 ms (figur 4).
- Beregn kampen frekvens for hver muskel. Optag a) begyndelsen og sluttidspunktet for hver inaktive periode, og b) den tid, hver kamp fandt sted ved hjælp af de ovennævnte kriterier. Sum den totale inaktive tid. Divider det samlede antal anfald med den samlede minutters inaktiv tid i løbet af indspilningen til at beregne Bout frekvens.
- Bestemme, om ændringer i ventilation er forbundet med aktiveringen af indspillede muscles.
- Vælg respirationsfaserne parametre, der skal måles (f.eks peak inspiratorisk flow, respirationsvolumen, minutvolumen, og vejrtrækninger pr min).
BEMÆRK: Alle mulige valg kan findes i rullemenuen P3 Setup under "Afledte parametre." - Identificere de vejrtrækninger, som opstår under EMG Bout aktivitet og vejrtrækninger, som opstår under EMG baseline aktivitet (figur 4).
- Opret parser segmenter spænder plethysmografi vejrtrækninger, der er forbundet med EMG Bout aktivitet og skabe uafhængige parser segmenter, der er forbundet med baseline EMG aktivitet. Sørg for at indstille den type analyse til "Parser Seg."
BEMÆRK: Dette valg er fundet i P3-opsætning rullemenuen under "Data Reduction Setup". - Markere begyndelsen af hvert parser segment med en begivenhed ved at højreklikke på pletysmografi spor. Angiv en kamp indeholdende parser segmenter som "Event 1" i rullemenuen og specify baseline parser segmenter som "Begivenhed 2" for at skelne de to klasser af segmenter.
- Under menuen "Funktioner", gem "Marks Section" og "Marks Afledte data." Under menuen Data Parser, gemme "Parsede anmeldelse File" og "Parsede Afledt data."
BEMÆRK: De valgte åndedræt parametre for hver enkelt åndedrag findes i Marks Afledt Datablad i fanebladet "Derivations." - Sammenligne de respiratoriske parametre for vejrtrækninger, som opstår under ARM anfald (markeret som event 1) versus vejrtrækninger, som opstår under baseline aktivitet (markeret som event 2) at bestemme, om muskel aktivitet er forbundet med ændringer i ventilation.
- Vælg respirationsfaserne parametre, der skal måles (f.eks peak inspiratorisk flow, respirationsvolumen, minutvolumen, og vejrtrækninger pr min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokol blev anvendt til at implantere en telemetrienhed og registrere scalenii og trapezius EMG, WBP, og video af en SOD1 (G93A) ALS model mus. Perioder, hvor dyret er inaktivt (for eksempel bevæger sig ikke) blev identificeret ved anvendelse videooptagelsen og bekræftet ved den manglende bevægelse-relaterede aktiviteter i WBP trace (figur 3A). Inaktive indbefatter tid tilbragt i REM eller ikke-REM søvn, såvel som tid brugt vågen men stadig (figur 3A). EMG-aktivitet under denne inaktive tid blev scoret som en kamp, når mindst 3 på hinanden følgende ensrettede og integrerede (over 30 ms) værdier havde amplituder med mindst en stigning på 50% i forhold til baseline EMG-niveauer (figur 4). Anfald af aktivitet, der opstod under Suk eller sniffing (bestemt ved plethysmografi) eller viljesbestemte bevægelser (vurderet af video) blev udelukket fra analysen (figur 3B-C). SOD-1 (G93A) mus ved early- til midten-symptomatisk faser (tabel 1) udviser anfald af øget ARM aktivitet i hvile, som varer i en til flere indåndinger (figur 4). Anfald af ARM-aktivitet er sjældne i præ-symptomatisk SOD1 (G93A) (figur 3A) eller vildtype-mus 10.
| Scene | Stat | Stage Onset | bagben Præsentation |
| 0 | Præ-symptomatisk | <P100 | Ingen bemærkelsesværdige forskelle i forhold til wildtypes. |
| 1 | sygdom debut | ~ P100 | Bagben sammenbrud når musen er ophængt hale. |
| 2 | parese | ~ P120 | Fuld eller delvis bagben kollaps med fremkomsten af tremor. | </ Tr>
| 3 | lammelse debut | ~ P140 | Gangbesvær, tå curling og / eller mund trække. |
| 4 | Avanceret lammelse | ~ P150 | Minimal fælles bevægelse, bagben ikke anvendes til fremadgående bevægelse. |
| 5 | slutstadie | ~ P160 | Mus ude af stand til at rette sig fra side inden for 30 sekunder. |
Tabel 1. Neurologisk Scoring af ALS-lignende sygdom Progression i SOD-1 (G93A) Mus.
Figur 3. Repræsentative WBP og EMG Traces. (A - C) WBP og EMG af scalene og trapezius muskler fra en præ-symptomatisk SOD1 (G93A) mus (alder P98). (A) perioder, hvor t Han dyr er i hvile (rød boks) anvendes til analyse. Spor uden for røde felt viser store og uregelmæssige toppe i plethysmografi spor og muskelaktivitet i EMG spor, typisk når et dyr bevæger sig, som bestemt ved synkroniserede videooptagelser (ikke vist). Det røde felt viser EMG spor mangler EMG-anfald, karakteristisk for en præ-symptomatisk mus. (B) anfald af EMG-aktivitet ofte forekommer umiddelbart forud en suk (som vist på plethysmografi spor). Suk er kendetegnet ved høj-amplitude inspiration efterfulgt af dramatisk udløb. De sorte pilespids peger på en karakteristisk EKG-signal. (C) anfald af EMG-aktivitet forekommer hyppigt, mens musen er sniffing. Snusen afspejles i plethysmografi spor af et længerevarende stigning i både frekvens og amplitude over flere vejrtrækninger (co forekommende med byger af EMG-aktivitet).color = "# 0066cc"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Scoring anfald af EMG aktivitet. (A og B) To eksempler på WBP, filtreret trapezius EMG spor, og rektificeret og integrerede trapezius EMG signaler fra en symptomatisk SOD1 (G93A) mus (alder P126). Blå stiplede linjer angiver baseline EMG niveau, bestemmes som gennemsnittet ensrettede og integrerede signaler over en tidsperiode på 3 sek. Røde stiplede linjer angiver en 50% forøgelse i amplitude i forhold til baseline EMG-aktivitet. En anfald af aktivitet er scoret når mindst 3 på hinanden følgende ensrettede og integrerede værdier overstiger 50% baseline tærskel. Klik her for at se alArger version af denne figur.
| PIF (ml / s) | TV (ml) | MV (ml / min) | Vejrtrækning Frekvens (vejrtrækninger / min) | |
| Naive (n = 5) | 4,4 ± 0,7 | 0,27 ± 0,04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Implanterede (n = 4) | 4,1 ± 0,2 | 0,27 ± 0,11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P-værdi | 0,439 | 1.000 | 0,893 | 0.410 |
| De viste værdier afspejler betyder ± SD. P-værdier blev beregnet med en t-test. | ||||
Tabel 2. Sammenligning af respiration Mellem Naive (ikke Implanteret) og implanteret Stage 4 SOD1 (G93A) Mus. Ingen signifikante forskelle blev fundet i peak inspiratorisk flow (PIF), respirationsvolumen (TV), minutvolumen (MV), eller vejrtrækninger pr minut mellem de to grupper. De viste værdier afspejler gennemsnit ± SD. P-værdier blev beregnet med en t-test.
Gentagne målinger af EMG og / eller WBP kan fremstilles i samme mus over flere måneder, med meget lille ændring i EMG signal eller baseline efter en 1- til 2-ugers restitutionsperiode efter operation. Tidsforløbet er typisk begrænset af batteriets levetid, og dermed vil blive bestemt af hyppigheden og varigheden af de enkelte optagelser. Forskerne skal være opmærksom på, at bivirkninger som følge af den implanterede enhed lejlighedsvis kan forekomme. Musen kan trække ledningerne fra den implanterede muskel eller ridse / tygge på huden, hvis ledningerne eller overføreter er forkert placeret. I de fleste tilfælde, etiske hensyn dikterer, at disse dyr ofres. Senderen kan fjernes, steriliseres, og re-implanteres i en anden mus.
At kontrollere, at enheden implantation ikke påvirker vejrtrækning blev plethysmografi målinger mellem naiv SOD1 (G93A) mus (ikke implanteret) ved ALS trin 4 og implanteret SOD1 (G93A) mus ved ALS trin 4 sammenlignet. Ingen signifikante forskelle blev fundet i peak inspiratorisk flow (PIF), respirationsvolumen (TV), minutvolumen (MV), eller vejrtrækninger per minut mellem de to grupper (tabel 2). Den scalenii og trapezius støder op til hinanden og er i direkte kontakt med hinanden. Selvom samtidige EMG anfald undertiden observeret i begge muskler, er stærke EMG anfald også påvist i trapezius når EMG anfald er fraværende i scalenii (og omvendt), hvilket viser, at der er minimal krydstale mellem elektroder implanteret in hver muskel. er også observeret Uafhængige anfald af EMG-aktivitet, når ledningerne er placeret i trapezius og sternocleidomastoideus muskler (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proceduren demonstreret her tillader noninvasiv (efter indledende kirurgisk implantation af senderen) måling af respiratorisk muskelaktivitet og ventilation gennem mange måneder i det samme dyr. Denne teknik har adskillige fordele i forhold til standard EMG teknikker i bedøvede mus: 1) forsøgene kræver færre mus og tilvejebringer evnen til at optage data fra det samme sted i en enkelt mus tværs sygdomsstadier (i stedet for at bruge flere mus på forskellige sygdomstilstande stadier); 2) data analyse kan udføres med kraftigere statistiske tests (dvs. under anvendelse af gentagne målinger i stedet for at sammenligne separate forsøgsgrupper); 3) den samtidige registrering af EMG og WBP giver mulighed for direkte vurdering af virkningerne af ARM aktivitet på ventilation; og 4) kan udføres forsøgene på mus i forskellige tilstande af søvn / vågenhed. Desuden fordi sunde mus har en meget lav frekvens af ARM-anfald i hvile, denne teknik er capable detektere selv små ændringer i hyppigheden af ARM aktivitet i ALS model mus ved tidlige symptomatiske stadier af sygdommen 10. Men fordi denne teknik måler aktiviteten af et stort, men ukendt antal muskelfibre under naturlig adfærd, snarere end efter nervestimulation ved eksperimentelt kontrollerede intensiteter, er det ikke egnet til estimering motorenheden størrelsen eller antallet. En anden begrænsning er, at telemetri-baserede sendere egnede til implantation i mus i øjeblikket er begrænset til to sæt biopotential ledninger; således kan kun to steder optages fra samme mus. Til forsøg, der kræver samtidig optagelse af mere end to muskler i samme mus kan flere EMG leads implanteres og forbundet til en erhvervelse system ved hjælp af en wire tøjr, som tidligere beskrevet 14, 15. Imidlertid vil ændringer af plethysmografi kammer eller tætninger skulle tilladetil samtidig registrering af muskelaktivitet og ventilation, hvis en mus er bundet.
Ved anvendelsen af denne teknik, skal visse trin i protokollen udføres med omhu. Biopotential ledninger skal placeres således, at de ikke hindrer bevægelse eller irritere den overliggende hud. Desuden skal senderen placeres, så det ikke påvirker den normale bevægelse eller arbejdsstillinger på musen. Det anbefales, at den korrekte placering af ledninger (dvs. fuldt integreret i den korrekte muskel og ikke berørende tilstødende muskler) og manglen på muskelskader eller infektion er verificerede af obduktion efter forsøget er afsluttet. Endvidere er det bydende nødvendigt, at senderen er slukket efter hver optagelsen session at spare på batteriet.
En uundgåelig konsekvens af at måle EMG fra muskler i brystet og halsområdet er den høje sandsynlighed for optagelse elektrokardiogram (EKG) signaler, der vises som regular spikes i EMG trace (figur 3B, pilespids). EKG-signalerne kan minimeres ved omhyggelig placering af lederne, således at al metal indlejret fuldstændigt i musklen og ved at undgå anbringelse nær større blodkar. Implantering af ledninger i musklerne på højre side af kroppen snarere end den venstre, som er tættere på hjertet, kan også reducere EKG-signaler. Selv EKG signalet kan filtreres ud af EMG er spor anvendelse beregningsmæssige algoritmer eller ved at fratrække en uafhængigt registreret EKG-signal 19, 20, 21, er det ikke typisk nødvendigt. EKG signalet kan let skelnes fra EMG-signalet ved dets regelmæssig form, frekvens og amplitude.
Den beskrevne teknik er blevet anvendt til at måle ændringer i ARM aktivitet i hvile i SOD1 (G93A) musemodel af ALS 10. Tilbehør respiratoriske muskler er også rekrutteret i othendes neuromuskulære sygdomme (fx muskeldystrofi, spinal muskelatrofi, perifere neuropatier, etc.) og efter nerve eller rygmarvsskader. ARM aktivitet kan derfor tjene som en proxy til at måle den funktionelle forringelse af membranen og måle sværhedsgraden af sygdommen, overvåge restitution fra skade, eller vurdere potentielle behandling fordele at forbedre vejrtrækning i en række dyresygdomme eller beskadigelsesmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støtte til dette arbejde blev leveret af en Cincinnati Children 's Hospital Medical Center administrator Award til SAC og en NIH træning tilskud (T32NS007453) til VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
- Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
- Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
- Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
- Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
- Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
- Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
- Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
- Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
- Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
- Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
- Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
- Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
- Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
- Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).
