Mesure de l'activité répétée des muscles respiratoires et la ventilation dans les modèles murins de maladies neuromusculaires

Summary

Cet article présente un procédé pour des mesures répétées de la ventilation et de l'activité des muscles respiratoires dans un comportement librement modèle de souris de la sclérose latérale (ALS) amyotrophique tout au long de la progression de la maladie avec la pléthysmographie du corps entier et électromyographie via un dispositif de télémétrie implanté.

Abstract

Accessoires muscles respiratoires aident à maintenir une bonne ventilation lorsque la fonction de la membrane est altérée. Le protocole suivant décrit une méthode pour les mesures répétées pendant des semaines ou des mois d'activité des muscles respiratoires accessoires tout en mesurant la ventilation dans un non-anesthésié, se comportant librement souris. La technique comprend l'implantation chirurgicale d'un émetteur radio et l'insertion de conducteurs d'électrode dans les muscles trapèzes scalènes et à mesurer l'activité électromyographique des muscles inspiratoires. La ventilation est mesurée par pléthysmographie du corps entier, et le déplacement des animaux est évaluée par vidéo et est synchronisé avec l'activité électromyographique. Les mesures de l'activité musculaire et la ventilation dans un modèle de souris de la sclérose latérale amyotrophique sont présentés pour montrer comment cet outil peut être utilisé pour étudier comment les changements respiratoires de l'activité musculaire au fil du temps et d'évaluer l'impact de l'activité musculaire sur la ventilation. Les méthodes décrites peuvent easily être adapté pour mesurer l'activité d'autres muscles ou d'évaluer l'activité des muscles respiratoires accessoires dans les modèles de souris supplémentaires de maladie ou d'une blessure.

Introduction

Accessoires muscles respiratoires (ARMs) augmentent la ventilation pendant les périodes de forte demande (par exemple, exercice) et aident à maintenir une bonne ventilation lorsque la fonction de diaphragme est compromise suite à une blessure ou d'une maladie ^{1, 2.} Bien que les modifications de la fonction de la membrane ont été bien décrites dans les patients de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des modèles de souris ^{3, 4, 5, 6,} on sait beaucoup moins sur l'activité ou la fonction de bras dans la SLA. Cependant, une étude a suggéré que les patients atteints de SLA qui recrutent ARMs ont un meilleur pronostic que ceux qui ont un dysfonctionnement de la membrane similaire qui ne le font pas ^7. En outre, l' activité de bras est suffisante pour la respiration en cas de paralysie du diaphragme ^8. Ces études indiquent que les stratégies pour augmenter la fonction ARM peut améliorer breathing chez les patients souffrant d'une maladie neuro-musculaire, une lésion de la moelle épinière, ou d'autres conditions dans lesquelles la fonction de la membrane est altérée. Cependant, les mécanismes qui régissent le recrutement ARM pour la respiration sont largement inconnus. Les méthodes pour mesurer la fonction respiratoire et des changements dans l'activité ARM au fil du temps dans les modèles animaux de maladie ou d'une blessure sont nécessaires pour étudier la façon dont ARMs sont recrutés, ainsi que pour évaluer les thérapies pour améliorer le recrutement ARM et de ventilation. De plus, l'augmentation de l' activité des bras coïncidant avec la perte progressive de la fonction de la membrane peut être un biomarqueur utile pour la progression de la maladie dans les maladies neuromusculaires comme la SLA ^{7, 9, 10.}

Ce protocole décrit un procédé de non-invasive (après la chirurgie initiale) et mesurer de manière répétée l'activité des muscles respiratoires et la ventilation en éveil, les souris se comportent. enregistrements synchronisés de electromyography (EMG), pléthysmographie corps entier (WBP) et vidéo permettent à l'enquêteur d'évaluer comment les changements dans la ventilation de l'impact de l'activité ARM et de déterminer quand le sujet est au repos ou en mouvement. Un avantage majeur de cette méthode est qu'elle peut être effectuée dans des souris éveillé, se comportant, alors que d'autres méthodes pour mesurer l' EMG nécessite une anesthésie et / ou sont des procédures terminales ^{11, 12, 13.} L'enregistrement de l' activité EMG chez les souris éveillé au fil du temps peut également être réalisée par l'implantation chronique d'EMG conduit, où la souris est attaché par des fils au système d'acquisition ^{14, 15.} Du fait d'attacher une souris pourrait interférer avec le mouvement normal ou le comportement et peut ne pas être compatible avec une chambre standard pléthysmographie, le procédé décrit utilise des dispositifs de télémétrie pour transmettre sans fil le signal EMG au système d'acquisition. L'émetteur peutêtre activée ou désactivée avec un aimant pour économiser l'énergie de la batterie et permet de répéter les mesures de l'activité EMG pendant plusieurs mois. Ce protocole peut être facilement adapté pour mesurer l'activité des muscles respiratoires ou non respiratoires supplémentaires en insérant l'EMG conduit dans les différents muscles. Alternativement, l' un des deux fils peut être utilisé pour mesurer l' activité EEG pour évaluer l' état de sommeil ou d'identifier l' activité de saisie ^16. Cette technique a été utilisée avec succès pour mesurer les changements dans l' activité ARM au repos tout au long de la progression de la maladie dans un modèle de souris de la SLA et d'identifier les neurones clés de conduite activité ARM chez des souris en bonne santé ^10.

Protocol

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Centre médical Hôpital pour enfants de Cincinnati institutionnel de protection des animaux et le Comité d'utilisation et menées en conformité avec le NIH Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation de l'appareil télémétrique chirurgie des implants

1. Revêtir un équipement de protection individuelle (c. -à- gommages, couvre-chaussures, robe, filet de cheveux, masque et gants chirurgicaux).
   NOTE: Cette chirurgie nécessite un champ stérile.
2. Allumer l'incubateur (incubateur humidificateur / bébé asservi réglé à 29 ° C) et l'aligner avec, serviettes blancs secs pour permettre le réchauffement adéquat pour la récupération.
3. Avant la chirurgie, stériliser les instruments chirurgicaux avec de l'oxyde d'éthylène et stériliser l'émetteur avec un détergent enzymatique et chimique stérilisant (ou tel que spécifié par le fabricant) avant utilisation.
   NOTE: Les instruments chirurgicaux doivent inclure # 2 pinces laminectomie (pointes standard / droite / 12 cm) (x4), étroitePince de motif en dents de scie (/ courbe / 12 cm), du tissu de séparation de ciseaux (droite / à extrémités franches extrémités franches / 11,5 cm), et un porte-scalpel et la lame. Il est recommandé d'avoir un ensemble distinct d'instruments stérilisés (deux # 2 pinces et ciseaux) réservés exclusivement pour manipuler les fils de l'émetteur pour maintenir les outils chirurgicaux en bon état.
4. Stériliser toutes les surfaces à l'intérieur du champ opératoire avec un désinfectant acceptable. Placez un microscope de dissection stéréo, appareil d' anesthésie isoflurane, outils chirurgicaux, et coupe dans le domaine chirurgical (voir la table des matières).
5. Pour maintenir la température du corps de la souris sous anesthésie, placer un coussin chauffant ou une couverture d'eau sous la serviette stérile devant le microscope de dissection stéréo.
6. Assurez-vous que le transmetteur est entièrement fonctionnel avant l'utilisation.
   NOTE: Un petit aimant placé dans 2 de l'émetteur se mettre l'appareil sous et hors tension. Lorsque l'émetteur est allumé et maintenu près d'un raDIO fixé à 500 Hz fréquence AM, il émet un ronronnement continu aigu. Pour économiser la batterie, mettez la batterie avant de l'implanter chez l'animal.
7. Préparation de l'électrode conduit avant l'opération de coupe par le conduit distal avec des ciseaux réservés pour la manipulation de fils de sorte qu'il y a environ 3 cm de plomb (suffisant pour atteindre le muscle cible) (Figure 1A). En variante, la bobine les fils proximale du dispositif et de les attacher ensemble avec des sutures pour qu'il y ait environ 3 cm de plomb déroulée.
   REMARQUE: Sauvegarder la partie garnie d'arrêt de l'électrode conduit afin de préparer des « bouchons » (plomb de boîtier isolant en matière plastique), comme décrit à l'étape 1.9. A l'étape 3, l'émetteur fils sont insérés à travers le muscle, de sorte et la partie distale, une partie exposée des fils doivent être maintenus en place et isolés à l'aide bouchons de plomb.
8. Utilisez un scalpel pour couper 0,5 cm de la gaine en matière plastique sans couper le fil lui-même. Utilisez les outils réservés for manipulation de fil pour étirer les extrémités des fils 4 - 5x leur longueur d' origine de sorte qu'ils soient facilement à l' intérieur d' une aiguille de calibre 25 (figure 1B-B « »). Couper le fil exposé des conducteurs de sorte qu'ils sont de 0,5 cm de longueur.
9. Préparer capuchons conducteurs (tubes en matière plastique pour couvrir les extrémités des fils) avant la chirurgie. Utilisez un scalpel pour couper 0,25 cm de long tubes de l'enveloppe en matière plastique entourant les segments de conducteurs d'électrode enregistré à l'étape 1.7.
   NOTE: Quatre capsules de plomb sont nécessaires pour chaque souris qui fera l'objet d'une implantation, mais il est préférable de préparer le double de la quantité requise de bouchons. Avoir capsules stériles de plomb préparé supplémentaires est utile en cas de fixation d'un bouchon de plomb ne réussit pas à la première tentative.
10. Le numéro de série de l'émetteur inséré et enregistrer l'emballage d'origine avec les informations calibrées. Chaque émetteur a des calibrations de fréquence pour l'enregistrement EMG; saisissez-les dans le logiciel d'acquisition pour obtenir EMG acceptableenregistrements.

2. Préparation de la souris pour la chirurgie

1. Choisissez la souris souhaitée pour l' implantation (c. -à- SOD1 (G93A) ou le contrôle) et peser l'animal.
   REMARQUE: L'âge recommandé et le poids d'une souris (mâle ou femelle) subissant cette chirurgie est P56 - P120 et ≥ 24 g, respectivement.
2. Anesthésier la souris de 3,5% d'isoflurane avec un débit de 2 L / min d'oxygène. Effectuer une pincée d'orteil et une pincée de queue pour se assurer que la souris est complètement anesthésié.
3. Une fois anesthésiés, retirer la souris dans la zone de chute et de maintenir l'anesthésie par l'intermédiaire d'un cône de nez en réglant le niveau de l'isoflurane à 1,5% et le débit d'oxygène à 1 L / min. Effectuer une pincée de pied et / ou pincement de la queue pour vous assurer que l'anesthésie est maintenue.
4. Appliquer du lubrifiant pommade ophtalmique pour éviter que les yeux de sécher pendant la chirurgie.
5. Raser la souris pour exposer un site chirurgical entre l'oreille et l' épaule (Figure 1C).
6. Autre badigeonnage du site chirurgical, d'abord avec un désinfectant, puis avec de l'isopropanol. Répétez 2 fois.

3. Implanter l'appareil télémétrique à enregistrement Scalene et Trapèze activité EMG

1. Placer l'animal sous un microscope de dissection, de son côté au-dessus d'un tampon stérile recouvrant un coussin chauffant, et fixer le cône de nez en place avec du ruban adhésif. Notez qu'il est préférable d'implanter le côté droit de réduire le signal ECG provenant du coeur.
   REMARQUE: Contrôler la respiration et régler les niveaux isoflurane, le cas échéant, de maintenir un taux de respiration régulière et le plan chirurgical approprié de l'anesthésie.
2. Tirez la patte avant vers le pied homolatéral le long du torse.
   NOTE: Cette position déplace l'omoplate caudale, l'accès chirurgical aux smuscles Calene et les trapèzes.
   1. Prendre le forceps émoussé courbes, retenir la patte avant ipsilatérale au site chirurgical, et la bande de la patte en place (Figure 1C). Utilisez du ruban adhésif chirurgical fort pour faire en sorte que la patte est en sécurité pendant toute la durée de la procédure.
3. Mettez une nouvelle paire de gants chirurgicaux. Utiliser le scalpel pour faire une incision oblique, à environ 2 cm de longueur, entre l'épaulement et l'oreille (ligne rouge sur la figure 1C).
4. En utilisant deux # 2 pinces de laminectomie, une dans chaque main, tirez le coussin de graisse et écartez les trapèzes et platysmales pour exposer le fascia couvrant les muscles sterno et scalènes (figure 1D et E).
5. Utilisez le muscle sterno pâle et nerf phrénique comme points de repère pour identifier les muscles scalènes. Notez que le nerf phrénique est parallèle aux muscles scalènes, tandis que le sterno est INFErior. Les muscles scalènes courent obliquement à partir des vertèbres cervicales pour des nervures dans le cadre du muscle trapèze. Fils biopotentiel seront insérés dans le muscle antérieur scalène, qui peut être identifié comme étant le muscle qui longe le nerf phrénique (figure 1F et G).
   REMARQUE: Attention. Cette zone est très vascularisé, et il faut veiller à éviter de couper l'artère sous-clavière. Éviter d'endommager le plexus brachial et nerf phrénique.
6. Une fois que les muscles scalènes et trapèzes ont été identifiés (figure 1G), faire une poche sous - cutanée pour l'émetteur sur le dos de l'animal, entre les omoplates.
   1. Utilisez les ciseaux de séparation de tissus, insérer les bouts arrondis des ciseaux juste sous la peau et les répartir jusqu'à une ouverture de poche qui est environ 1,25 fois la largeur de l'émetteur est formé (Figure 1H).
      REMARQUE: L'émetteur doit être inséré avec une résistance minimale, mais le Pocket ne devrait pas être si grand que l'émetteur peut se déplacer lui-même. Si la poche est trop faible, l'émetteur pourrait frotter contre la peau, ce qui provoque une irritation qui peut inciter l'animal à se gratter la peau et / ou tirer les mène. Si la poche est trop grande, séromes pourrait former, ou l'émetteur pourrait migrer vers une position défavorable.
7. Rincer avec une solution saline chaude, stérile et insérer l'émetteur avec le côté plat contre le muscle. Positionner l'émetteur de sorte qu'il repose à plat et les fils sortent de la poche, parallèle à l'autre plutôt que de torsion (figure 1I). Recourber tout excès de longueur de fil sous le dispositif et le poser à plat.
8. Faire passer les fils de l'émetteur vers les muscles trapèzes scalènes et de telle sorte que les deux ensembles de fils bipotentielles reposent à plat et parallèlement les unes aux autres.
9. Utiliser la pince de laminectomie pour séparer le scalène antérieur des muscles environnants et insérer une aiguille de calibre 25 à travers le mus scalènecle, perpendiculaire aux fibres musculaires.
   1. Insérer une sonde dans la pointe de l'aiguille, puis retirer l'aiguille du muscle, en laissant le fil inséré dans le haut du muscle à l'isolation du fil (Figure 1J et K). Enregistrement qui conduit colorés sont insérés dans lequel le muscle.
10. Placer une petite goutte de colle à base de cyanoacrylate sur l'extrémité exposée du fil, à proximité du muscle où le fil est inséré, et le faire glisser rapidement le capuchon d' avance sur le fil de sorte qu'aucun fil est exposée entre le capuchon principal et le muscle (figure 2A et B).
    REMARQUE: Bien qu'il soit une pratique acceptée pour obtenir EMG conduit avec cyanoacrylate ^{17, 18,} une autre méthode consiste à fixer le capuchon de plomb en place en faisant un nœud de suture de soie autour d' elle.
11. Couper l'excédent de fil distal de la capsule et appliquer une goutte de colle cyanoacrylate à l'extrémité de la capsule plomb / fil. Donnez la colletemps pour polymériser avant de libérer (figure 2C et D).
12. Suivre les mêmes étapes (étapes 03.10 à 03.12) pour insérer le fil de polarité opposée parallèlement à la première dans le même muscle, 1 - 2 mm de la première tête.
13. Répétez les étapes 03/10 à 03/12 pour insérer dans le conduit trapèzes, situé juste en avant au muscle scalène (Figure 1 L et M).
14. Assurez-vous que les fils conducteurs sont fixés en place et qu'il ya juste assez de mou dans les fils pour l'animal d'effectuer des mouvements du corps sans tirer sur les fils. Assurez-vous que tout excédent de plomb ne pousse pas contre la peau, car cela pourrait provoquer une irritation qui peut inciter l'animal à se gratter ou tirer les mène. Les fils Repositionner, si nécessaire, pour éviter tout inconfort potentiel.
15. Retirez délicatement la bande en maintenant la patte avant. Tirez le coussinet adipeux en arrière sur le muscle et l'utiliser pour couvrir les fils insérés. Fermer l'incision avec un adhésif cyanoacrylate par taquinles lambeaux de peau de retour ensemble de sorte que les lignes d'incision vers le haut. Pincer une partie des rabats de la peau en même temps que les forceps incurvés et appliquer une petite ligne de colle cyanoacrylate le long de cette ligne.
16. Injecter 0,1 ml de sous-cutanée carprofène pour soulager la douleur post-opératoire alors que l'animal est toujours sous anesthésie.
    REMARQUE: Continuer d'administrer 0,1 ml de carprofène fois par jour pendant 1 - 2 jours après la chirurgie, puis au besoin après.
17. Retirer l'animal de la nosecone et le placer dans une cage propre dans l'incubateur préchauffé jusqu'à ce que l'animal est éveillé et se déplaçant autour de la cage volontairement. Gardez l'animal dans l'incubateur pendant au moins 15 minutes après, suivi de ses mouvements et la vigilance.

4. Soins postopératoires

1. animaux maison suivant la chirurgie séparément. Fournir des animaux de guérison avec un gel de l'alimentation et une bouteille d'eau.
2. Surveiller l'animal pour les 30 premières minutes après la chirurgie. Vérifiez sur l'animal au moins toutes les heures fou 5 h après la chirurgie. Dans les jours qui ont suivi la chirurgie, vérifier au moins deux fois par jour.
3. Lire la nécrose, l' infection le long de l'incision et dans la cavité du corps contenant de l'implant ( par exemple, la chaleur, un gonflement et une rougeur), et la formation de sérome.
   NOTE: Ces signes se produisent dans la première semaine après la chirurgie. Un animal guéri en bonne santé un mois après la chirurgie est montré à la figure 1 N. Bien que les enregistrements EMG peuvent être immédiatement après l'implantation, les animaux sont donnés au moins une semaine pour guérir avant l'enregistrement EMG et pléthysmographie, en tant que signaux ECG peuvent être élevés immédiatement après l'implantation.

5. L'acquisition simultanée électromyographie Pléthysmographie signaux

1. Allumez tous les équipements d'acquisition, y compris le flux de polarisation.
   NOTE: Le débit pour les souris est généralement fixé à 1,0 L / min.
2. Calibrer la chambre de pléthysmographie (s) à l'aide d'un débitmètre.
   REMARQUE: Vérifiez régulièrement la pléthysmographie Chambers pour assurer que les joints ne sont pas fissurés ou cassés. Enduire les joints en caoutchouc avec un lubrifiant tel que la graisse à vide une fois par semaine pour maintenir leur bon état.
3. l'étalonnage de l'émetteur d'entrée tel que spécifié par le fabricant.
4. Placer la souris dans la chambre de pléthysmographie pendant au moins 1 h à acclimater il avant l'enregistrement EMG et pléthysmographie. L'utilisation de plusieurs chambres, il est possible d'enregistrer à partir d'une souris alors que la souris est ensuite acclimatation dans une seconde chambre. Ne mettez pas l'émetteur pendant la période d'acclimatation afin d'économiser l' énergie de la batterie (Figure 1O).
5. Avant d'enregistrement (mais après calibration), activer l'émetteur en plaçant un aimant puissant à moins de 1 dans de l'animal implanté; une lumière rouge à l'avant du récepteur indique lorsque l'émetteur est activé.
6. Commencer l'acquisition en utilisant le menu déroulant intitulé « Acquisition » et choisissez « Démarrer l'acquisition ». Bien que la durée d'enregistrement peutvarier d'expérience, un pléthysmographie typique et l'enregistrement EMG dure de 1 - 3 h.
   NOTE: L'émetteur a un taux d'échantillonnage de 240 Hz intrinsèque. Un taux plus rapide de 500 Hz est réglée dans le logiciel pour interpoler entre les points et pour fournir une forme d'onde plus lisse. Le filtre passe-bas (qui sert de filtre anti-alias) et le filtre passe-haut dans l'implant spécifient le 1- à 50 Hz de bande passante pour ce dispositif de télémétrie. 60 Hz interférence A / C ne contribue pas à l'excès de bruit dans le signal EMG parce que les implants sont alimentés par batterie et l'animal protège l'implant et conduit des champs électriques. Pléthysmographie, EMG et vidéo sont automatiquement synchronisés en temps réel via le logiciel d'acquisition.
7. Quand l'acquisition est terminée, éteindre l'émetteur avec un aimant et enlever l'animal de la chambre.
8. Si le démarrage d'un autre enregistrement, nettoyer la chambre, entrer dans les nouveaux calibrages de l'émetteur de l'animal suivant, et commencer le deuxième enregistrement. Si finished avec acquisition pour la journée, éteindre l'émetteur, nettoyer la chambre de pléthysmographie, et éteindre tous les appareils d'acquisition et le flux de polarisation.

Figure 1. Implantation d' un appareil de télémétrie pour mesurer l' EMG des muscles respiratoires. (A) des émetteurs de télémesure avec deux paires de biopotentiel conduit à mesurer l' EMG. Conducteurs peuvent être coupés à la longueur désirée (en bas) ou enroulé et caché sous l'émetteur (en haut). (B) Transmetteur conduit. (B ») conduit avec une isolation en matière plastique garni d'arrêt pour exposer les fils et à faire capuchons conducteurs (encadré). (B « ») conduit avec des fils tendus 4 - 5 fois leur longueur initiale. Leads devraient être parés de façon qu'ils sont de 0,5 cm de long (non représenté). (C) Souris préparé pour la chirurgie, avec le site chirurgical rasé et correctementpatte positionnée. La ligne en pointillé rouge indique le site d'incision. (D) des muscles superficiels situés en dessous du coussinet adipeux et la bordure, vue suivant l'incision initiale. T = trapèzes. S = sterno. P = peaucier. Flèche jaune = nerf phrénique. (E) de bande dessinée diagramme des muscles et des nerfs phréniques représenté en (D). Forceps devraient être utilisés pour écarter les trapèzes et platysmales pour atteindre le muscle scalène plus profond, montré en (F) et (G). (F) Repères utilisés pour identifier l'emplacement du scalène et les trapèzes. Cette image montre l'artère sous-clavière (flèche blanche), le plexus nerf phrénique / brachial (flèche noire), et le muscle sterno pâle (flèche jaune). (G) Cartoon représentant l'emplacement des muscles profonds (c. -à- milieu scalène, antérieure scalène et SCM), l' artère sous - clavière, et le nerf phrénique. Le scalène postérieur n'est pas visible. Ceux-ci ne sont accessibles que lorsque le SUPERFICImuscles al (en D et E) sont écartés. (H) Faire une poche pour l'émetteur à l' aide des ciseaux à pointe émoussée. (I) inséré émetteur dans la poche sous - cutanée, avec les fils parallèles positionnés sortant de la poche. (J) d' insertion de l'aiguille de calibre 25 dans le scalène, perpendiculaire aux fibres musculaires, de faire un tunnel pour le fil métallique. (K) les deux fils insérés dans le muscle scalène. bouchons de plomb sont positionnés à l'extrémité et collées en place. (L) d' insertion de l'aiguille de calibre 25 dans le trapèze, perpendiculaire aux fibres musculaires, de faire un tunnel pour le fil métallique. (M) Les quatre conducteurs insérés dans les muscles trapèzes scalènes et couché à plat et préalablement à la fermeture de l'incision. (N) complètement récupéré souris, avec l'émetteur placé en sous - cutané sur le dos. (O) enregistrant simultanément la pléthysmographie, l' activité EMG musculaire, unnd vidéo en utilisant une chambre de pléthysmographie (flèche jaune), tampon de réception de télémétrie (flèche rouge) et la caméra (flèche noire), respectivement. Un courant de polarisation multifonction est relié à la chambre de pléthysmographie par l' intermédiaire d' un tube en plastique (flèche bleue) pour fournir de l' oxygène à la souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2. Fixation Caps plomb avec l' adhésif cyanoacrylate. (A) Appliquer une petite goutte de cyanoacrylate (cercle violet) sur le fil nu du fil conducteur d'électrode (E) à proximité du muscle. (B) rapidement coulisser le bouchon de plomb préparé (LC) sur le fil exposé sur l'adhésif de cyanoacrylate de sorte que le capuchon de l' électrode est positionnée directement adjacente au muscle. (C) Couper une petite partie de l'extrémité distale du capuchon de l'électrode et le fil de sorte qu'il n'y a pas actuellement d'électrode à découvert qui ne sont pas isolés avec du plastique. (D) appliquer une petite goutte de colle cyanoacrylate à l'extrémité du capuchon de plomb. Retirez l'extrémité distale parés arrêt du bouchon de plomb de l'animal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

6. Analyse des ARM EMG et Pléthysmographie

1. Ouvrez le logiciel d'analyse et examiner le dossier d'intérêt (allez dans « Fichier » et choisissez « Fichier d'examen ouvert »). Filtrer les signaux EMG en utilisant un filtre passe-haut de 30 Hz par un clic droit sur la trace EMG, en choisissant « Analyser les attributs », soulignant l'onglet « Attributs avancés 1 » et changer le filtre passe-haut à 30 Hz.
   REMARQUE: Cette étape de filtrage élimine non-discriminante, les informations basse fréquence. Localiser les zones d'inactivité de la souris par une inspection visuelle sur la base de l'absence de mouvement dans le fichier de vidéo synchronisée et l'absence de grandes variations irrégulières de pression dues à la circulation dans la trace de pléthysmographie (boîte rouge sur la figure 3A); l'inactivité se produit lorsque la souris est endormi ou éveillé, mais encore.
2. Identifier les épisodes EMG indépendamment pour chaque muscle.
   1. De rectification et intégrer le signal EMG filtré sur 30 ms (figure 4).
      Remarque: En raison des souris respirer à un débit de 3 Hz, chaque respiration est représenté par environ 11 valeurs intégrées.
   2. Déterminer l'amplitude de l' EMG de référence en faisant la moyenne des valeurs redressées et intégrées associées au signal EMG pour une période de 3 s lorsque la souris est inactif et la trace de la pléthysmographie montre eupnea (respiration normale) (Figure 4).
   3. Identifier « bouts » d'activité définie par au moins 3 valeurs consécutives redressée et intégrée qui sont au moins un 50% d'augmentation au-dessus du signal EMG de base (déterminée à l'étape 6.3.2).
      NOTE: Trois valeurs consécutives représentent une fenêtre de 90 ms, mais certains épisodes contiennent plus de 3 valeurs au-dessus du seuil et vont durer plus de 90 ms.
   4. Utiliser la vidéo synchronisée et trace pléthysmographie à exclure des matchs qui se produisent pendant soupirs (figure 3B); sniffing (figure 3C); ou des mouvements de souris volitifs, tels que la tête de tourner ou de toilettage.
   5. Répétez les étapes 6.3.1 - 6.3.4 pour le second muscle.
3. Calculer la fréquence d'accès pour chaque muscle. Record a) l'heure de début et de fin de chaque période d'inactivité et b) le temps que chaque combat a eu lieu en utilisant les critères ci-dessus. Somme le total du temps inactif. Diviser le nombre total de combats par le total min de temps d'inactivité au cours de la session d'enregistrement pour calculer la fréquence de combat.
4. Déterminer si les changements de la ventilation sont associés à l'activation du m enregistréuscles.
   1. Sélectionner les paramètres de respiration à mesurer (par exemple, le pic débit inspiratoire, le volume courant, le volume minute, et respirations par minute).
      REMARQUE: Toutes les sélections possibles se trouvent dans le menu Configuration P3 menu déroulant sous « Paramètres dérivés. »
   2. Identifier les souffles qui se produisent au cours de l' activité de combat EMG et les souffles qui se produisent au cours de l' activité de base EMG (Figure 4).
   3. Créer des segments d'analyseur couvrant souffles pléthysmographie qui sont associés à l'activité de combat EMG et de créer des segments d'analyseur indépendants qui sont associés à l'activité EMG de base. Assurez-vous de définir le type d'analyse à « Parser Seg. »
      NOTE: Cette sélection se trouve dans la configuration P3 menu déroulant sous la rubrique « Réglage de la réduction des données. »
   4. Marquer le début de chaque segment d'analyseur avec un événement par un clic droit sur la trace de pléthysmographie. Spécifier un combat contenant des segments d'analyseur comme « Evénement 1 » dans le menu déroulant et specify les segments de l'analyseur de base comme « événement 2 » pour distinguer les deux classes de segments.
   5. Dans le menu « Fonctions », enregistrez la « section Marques » et « marques dérivées de données. » Dans le menu Parser données, enregistrer le « Analysée Review Fichier » et « données dérivées analysable. »
      REMARQUE: Les paramètres de respiration sélectionnés pour chaque respiration individuels se trouvent dans la fiche de données dérivées marques dans l'onglet « Dérivations. »
   6. Comparer les paramètres respiratoires des respirations qui se produisent au cours des épisodes ARM (marqués comme événement 1) par rapport aux souffles qui se produisent au cours de l'activité de base (marqué comme événement 2) pour déterminer si l'activité musculaire est associée aux changements de la ventilation.

Representative Results

Le protocole décrit a été utilisé pour implanter un dispositif de télémétrie et d'enregistrer scalène et trapèzes EMG, WBP et vidéo d'un SOD1 (G93A) la souris modèle SLA. Les périodes où l'animal est inactif (par exemple, ne se déplace pas) ont été identifiés à l' aide de l'enregistrement vidéo et confirmé par l'absence d'activité liée au mouvement dans la trace WBP (figure 3A). Les périodes inactives comprennent le temps passé dans le sommeil paradoxal ou non-REM, ainsi que le temps passé éveillé , mais encore (figure 3A). Activité EMG pendant cette période inactive a été reçu comme un combat quand au moins 3 valeurs consécutives redressée et intégrée (plus de 30 ms) ont des amplitudes d'au moins une augmentation de 50% par rapport aux niveaux EMG de base (figure 4). Des périodes d'activité qui se sont produits au cours de soupir ou sniffing (déterminée par pléthysmographie), ou mouvements volontaires (évaluée par vidéo) ont été exclus de l' analyse (Figure 3B-C). SOD1 (G93A) chez la souris à early- pour présenter les étapes de milieu symptomatique (tableau 1) périodes d'activité ARM accrue au repos qui dure une à plusieurs respirations (Figure 4). Des périodes d'activité ARM sont rares dans SOD1 pré-symptomatique (G93A) (figure 3A) ou des souris de type sauvage ^10.

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Étape	Etat	Etape Onset	Présentation des membres postérieurs
0	Présymptomatique	<P100	Aucune différence notable par rapport à wildtypes.
1	apparition de la maladie	~ P100	effondrement patte arrière lorsque la souris est suspendue à partir de la queue.
2	Parésie	~ P120	effondrement de la patte arrière totale ou partielle avec apparition de tremblements.
3	apparition paralysie	~ P140	Difficulté à marcher, le curling orteil et / ou traîner les pieds.
4	paralysie avancée	~ P150	Minimal mouvement conjoint, des membres postérieurs ne sont pas utilisés pour le mouvement vers l'avant.
5	Étape finale	~ P160	Souris incapable de se redresser d'un côté dans les 30 secondes.

Tableau 1. Marquer un point neurologique de progression de la maladie ALS-t -il à SOD1 (G93A) Souris.

Figure 3. Représentant WBP et EMG Traces. (A - C) WBP et EMG des muscles trapèzes scalènes et d'une souris SOD1 pré-symptomatique (G93A) (P98 d'âge). (A) des périodes où t il animal est au repos (encadré rouge) sont utilisés pour l'analyse. Des traces en dehors de la zone rouge montrent des pics larges et irréguliers dans l'activité des traces pléthysmographie et dans le muscle EMG traces, typique lorsqu'un animal se déplace, tel que déterminé par des enregistrements vidéo synchronisées (non représentées). La boîte rouge montre des traces EMG manquants des matchs EMG, caractéristique d'une souris pré-symptomatique. (B) des périodes d'activité EMG se produisent fréquemment précédant directement un soupir (comme représenté sur la trace de pléthysmographie). Soupirs se caractérisent par une inspiration de haute amplitude suivie d'une expiration dramatique. Les points noirs à pointe de flèche un signal ECG caractéristique. (C) Bouts d'activité EMG se produisent fréquemment alors que la souris renifle. Sniffing se reflète dans la trace de pléthysmographie par une augmentation prolongée à la fois en fréquence et en amplitude sur plusieurs respirations (co-occurrence avec des éclats de l'activité EMG).color = « # 0066CC »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4. Notation de l' activité EMG Bouts. (A et B) Deux exemples de WBP, filtrées traces EMG du trapèze, et rectifiées et les signaux de l' EMG de trapèze intégrés à partir d' une souris SOD1 symptomatique (G93A) (P126 d'âge). Bleu lignes en pointillés indiquent le niveau EMG de référence, déterminé en calculant la moyenne des signaux redressés et intégrés sur une période de 3 s. des lignes en pointillés rouges indiquent une augmentation de 50% en amplitude sur l'activité EMG de base. A bout de l'activité est marqué quand au moins 3 valeurs consécutives redressée et intégrée dépasse le seuil de référence de 50%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir alla version Arger de ce chiffre.

	PIF (ml / s)	TV (ml)	MV (ml / min)	Fréquence respiratoire (Souffles / min)
Naive (n = 5)	4,4 ± 0,7	0,27 ± 0,04	58 ± 13	223 ± 41
Implantée (n = 4)	4,1 ± 0,2	0,27 ± 0,11	56 ± 29	201 ± 32
P-value	0,439	1.000	0,893	0,410
Les valeurs indiquées reflètent moyenne ± écart type. Les valeurs P ont été calculées avec le test t de Student.

Tableau 2. Comparaison Respiratoires entre Naive (non Implantés) Étape 4 et Implantée SOD1 (G93A) Souris. Aucune différence significative n'a été observée dans le débit de pointe inspiratoire (PIF), le volume courant (TV), le volume minute (MV), ou respirations par minute entre les deux groupes. Les valeurs indiquées reflètent la moyenne ± écart-type. Les valeurs P ont été calculées avec le test t de Student.

Des mesures répétées de l'EMG et / ou WBP peuvent être la même souris sur plusieurs mois, avec très peu de changement dans le signal EMG ou de base après une période de récupération de 1 à 2 semaines après la chirurgie. Le cours du temps est généralement limitée par la durée de vie de la batterie et donc sera déterminée par la fréquence et la durée des enregistrements individuels. Les chercheurs doivent être conscients que les événements indésirables liés à l'appareil implanté peuvent se produire de temps en temps. La souris peut retirer les fils du muscle ou une égratignure implanté / chique à la peau si les fils ou transmettreter sont mal placés. Dans la plupart des cas, les considérations d'ordre éthique exigent que ces animaux soient sacrifiés. L'émetteur peut être éliminé, stérilisé, et ré-implanté dans une autre souris.

Pour vérifier que l'implantation du dispositif ne modifie pas la respiration, les mesures de pléthysmographie entre SOD1 naïf (G93A) chez la souris (non implanté) à l'étape 4 de la SLA et des souris SOD1 (G93A) implanté à l'étape 4 de la SLA ont été comparés. Aucune différence significative n'a été observée dans le débit de pointe inspiratoire (PIF), le volume courant (TV), le volume minute (MV), ou respirations par minute entre les deux groupes (tableau 2). Le scalène et trapèzes sont adjacents les uns aux autres et sont directement en contact avec l'autre. Bien que des épisodes EMG simultanés sont parfois observés dans les deux muscles, forts des épisodes EMG sont également détectés dans les trapèzes lors des épisodes EMG sont absents dans le scalène (et vice versa), ce qui démontre qu'il ya un minimum de diaphonie entre les électrodes implantées in chaque muscle. épisodes indépendants d'activité EMG sont également observés lorsque les fils sont placés dans les muscles trapèzes et sterno (données non présentées).

Discussion

La procédure démontrée ici permet la mesure non invasive (après l'implantation chirurgicale initiale de l'émetteur) de l'activité des muscles respiratoires et la ventilation sur plusieurs mois dans le même animal. Cette technique présente plusieurs avantages par rapport aux techniques classiques EMG chez les souris anesthésiés: 1) les expériences nécessitent moins de souris et offrent la possibilité d'enregistrer des données sur le même site dans une souris unique à travers les étapes de la maladie (au lieu d'utiliser plusieurs souris à différents stades de la maladie); 2) l' analyse des données peut être réalisée avec des tests statistiques plus puissants ( par exemple, en utilisant des mesures répétées au lieu de comparer les groupes expérimentaux séparés); 3) l'enregistrement simultané des EMG et WBP permet l'évaluation directe des effets de l'activité ARM sur la ventilation; et 4) les expériences peuvent être effectuées sur des souris dans différents états de sommeil / éveil. De plus, parce que les souris en bonne santé ont une très faible fréquence des épisodes ARM au repos, cette technique est capable de détecter même de petits changements dans la fréquence de l' activité ARM chez des souris modèles de SLA à des stades précoce symptomatiques de la maladie ^10. Cependant, parce que cette technique mesure l'activité d'un grand nombre inconnu de fibres musculaires pendant un comportement naturel, plutôt que de suivre la stimulation nerveuse à des intensités expérimentales contrôlées, il ne convient pas pour estimer la taille de l'unité de moteur ou le numéro. Une autre limitation est que les émetteurs à base de télémétrie appropriés pour une implantation dans les souris sont actuellement limitées à deux ensembles de fils de biopotentiel; Ainsi, seuls deux sites peuvent être enregistrés à partir de la même souris. Pour les expériences exigeant l'enregistrement simultané de plus de deux muscles de la même souris, fils multiples EMG peuvent être implantés et connectés à un système d'acquisition à l' aide d' une attache en fil, comme décrit précédemment ^{14, 15.} Cependant, des modifications à la chambre de pléthysmographie ou les joints seraient nécessaires pour permettrepour l'enregistrement simultané de l'activité musculaire et la ventilation si une souris est attaché.

Lors de l'application de cette technique, certaines étapes du protocole doivent être effectués avec soin. conduit biopotentielle doivent être placés de telle sorte qu'ils ne gênent pas le mouvement ou irritent la peau sus-jacente. En outre, l'émetteur doit être positionné de telle sorte qu'il ne touche pas le mouvement normal ou la posture de la souris. Il est recommandé que le placement correct des conducteurs (c. -à- entièrement intégrés dans le muscle correct et pas en contact avec les muscles adjacents) et l'absence de lésions musculaires ou d' infection sont vérifiées par autopsie après l'expérience a été terminée. En outre, il est impératif que l'émetteur est éteint après chaque session d'enregistrement pour économiser la batterie.

Une conséquence inévitable de mesurer l'EMG de muscles dans la zone de la poitrine et du cou est la forte probabilité de signaux d'électrocardiogramme d'enregistrement (ECG), qui apparaissent comme regulaire pointes à l'intérieur de la trace EMG (Figure 3B, flèche). les signaux ECG peuvent être réduits au minimum par un placement judicieux des conducteurs de telle sorte que tout le métal est intégré pleinement dans le muscle et en évitant le placement à proximité des principaux vaisseaux sanguins. Dans les muscles conduit l'implantation sur le côté droit du corps plutôt que de la gauche, ce qui est plus proche du cœur, peut aussi réduire les signaux ECG. Bien que le signal ECG peut être filtré de traces EMG en utilisant des algorithmes de calcul ou en soustrayant un signal ECG enregistré indépendamment ^{19, 20, 21,} il est généralement nécessaire. Le signal ECG peut être facilement distingué du signal EMG par sa forme régulière, la fréquence et l'amplitude.

La technique décrite a été utilisée pour mesurer les changements dans l' activité de ARM au repos dans le modèle de souris SOD1 (G93A) de la SLA ^10. muscles respiratoires sont également recrutés otses maladies neuromusculaires (par exemple, la dystrophie musculaire, l' atrophie musculaire spinale, neuropathies périphériques, etc.) et des nerfs suivants ou lésions de la moelle épinière. activité ARM peut donc servir de proxy pour mesurer l'incapacité fonctionnelle du diaphragme et de mesurer la gravité de la maladie, surveiller le rétablissement d'une blessure, ou évaluer les avantages potentiels des traitements pour améliorer la respiration dans une variété de maladies animales ou des modèles blessures.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	Jackson Laboratory	4435
Plethysmography Chamber	Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International	601-1425-001
Telemetry Receivers (Model RPC-1)	Data Sciences International	272-6001-001
Bias Flow Pump (Model BFL0500)	Data Sciences International	601-2201-001
ACQ-7000 USB	Data Sciences International	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix	Data Sciences International	271-0117-001
New Ponemah Analysis System	Data Sciences International	PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20	Data Sciences International	PNM-P3P-520
Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20	Data Sciences International	PNM-URP100W
Configured Ponemah Software System	Data Sciences International	PNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP)	Data Sciences International	PNM-URP100W
Universal Amplifier	Data Sciences International	13-7715-59
Sync Board	Data Sciences International	271-0401-001
Sync Cable	Data Sciences International	274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco	Data Sciences International	600-1114-001
Flow Meter	Data Sciences International	600-1260-001
Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit	Data Sciences International	276-0400-001
Axis P1363 Video Camera	Data Sciences International	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785	Enzyme Detergent
Actril	Minntech Corporation	78337-000	Chemical Sterilant
Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126)	Leica	10-450-508
Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
TL11M2-F20-EET Transmitters	Data Sciences International	270-0124-001
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	For handling wires
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	For surgery
Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm	Fine Scientific Instruments	17003-12
Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge	Fine Scientific Instruments	15124-12
Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm	Fine Scientific Instruments	14072-10
Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm	Fine Scientific Instruments	14058-11	For cutting wires and clipping nails
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Scalpel Blade	Fine Scientific Instruments	10010-00	For preparing lead caps
Polysorb Braided Absorbable suture	Coviden	D4G1532X	For coiling transmitter leads
Gluture	Zoetis Inc.	6606-65-1	Cyanoacrylate adhesive
3 mL Syring Slip Tip - Soft	Vitality Medical	118030055
25 G Needle (x2)	Becton Dickinson and Co.	305-145
Cotton Tipped Applicators	Henry Schein Animal Health	100-9175
Andis Easy Cut Hair Clipper Set	Andis	049-06-0271	Electrical Razor sold at Target
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	29404	Anesthetic
Isopropyl Alcohol 70%	Priority Care 1	MS070PC
Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%)	Butler Schein	55482
Artificial Tears	Henry Schein Animal Health	48272	Lubricant Opthalmic Ointment
Vacuum grease	Dow Corning Corporation	1597418
Water Blanket	JorVet	JOR784BN