Summary
Questo documento introduce un metodo per misurazioni ripetute di ventilazione e l'attività muscolare respiratorio in un modello murino amiotrofica liberamente comportarsi sclerosi laterale (ALS) durante la progressione della malattia con pletismografia corpo intero e elettromiografia tramite un dispositivo di telemetria impiantato.
Abstract
muscoli respiratori accessori aiutano a mantenere la ventilazione quando è compromessa la funzione del diaframma. Il seguente protocollo descrive un metodo per misure ripetute più di settimane o mesi di accessorio attività dei muscoli respiratori e contemporaneamente misura di ventilazione in un mouse non anestetizzati, liberamente comportarsi. La tecnica comprende l'impianto chirurgico di un trasmettitore radio e l'inserimento dell'elettrodo conduce nella scaleno e trapezio muscoli per misurare l'attività elettromiogramma di questi muscoli inspiratori. La ventilazione è misurata mediante pletismografia corpo intero, e il movimento animale è valutata video ed è sincronizzato con l'attività elettromiogramma. Le misurazioni di attività muscolare e ventilazione in un modello murino di sclerosi laterale amiotrofica vengono presentati per mostrare come questo strumento può essere utilizzato per studiare come i cambiamenti respiratori attività muscolare nel corso del tempo e per valutare l'impatto delle attività muscolare sulla ventilazione. I metodi descritti possono all'easily essere adattato per misurare l'attività di altri muscoli o per valutare l'attività dei muscoli respiratori accessori in altri modelli murini di malattie o lesioni.
Introduction
Muscoli respiratori accessori (ARM) aumentare la ventilazione durante i periodi di alta richiesta (ad esempio, esercizio) e aiutano a mantenere la ventilazione quando la funzione diaframma è compromessa in seguito a lesione o malattia 1, 2. Sebbene alterazioni della funzionalità membrana sono stati ben descritti nei pazienti sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e modelli murini 3, 4, 5, 6, e tanto meno si conosce l'attività o la funzione di armi nella SLA. Tuttavia, uno studio ha suggerito che i pazienti affetti da SLA che reclutano bracci hanno una prognosi migliore rispetto a quelli con simili disfunzioni diaframma che no 7. Inoltre, l'attività ARM è sufficiente per la respirazione in caso di diaframma paralisi 8. Questi studi indicano che le strategie per aumentare la funzione ARM può migliorare breathing in pazienti affetti da malattia neuromuscolare, lesioni del midollo spinale, o altre condizioni in cui è compromessa la funzione diaframma. Tuttavia, i meccanismi che controllano l'assunzione ARM per la respirazione sono in gran parte sconosciuti. I metodi per misurare la funzione respiratoria e variazioni di attività ARM nel tempo in modelli animali di malattia o di infortunio sono necessari per studiare come le braccia sono reclutati, nonché per valutare le terapie per migliorare il reclutamento ARM e la ventilazione. Inoltre, l'aumento dell'attività di bracci coincidente con la perdita progressiva della funzione diaframma può essere un biomarker utile per la progressione della malattia in malattie neuromuscolari come la SLA 7, 9, 10.
Questo protocollo descrive un metodo per non invasivo (dopo l'intervento iniziale) e ripetutamente misurare l'attività dei muscoli respiratori e ventilazione in sveglio, topi si comportano. registrazioni sincronizzate di elettromiografiay (EMG), pletismografia corporea (WBP), e video consentono al ricercatore di valutare come variazioni di ventilazione impatto dell'attività ARM e per determinare quando il soggetto è a riposo o in movimento. Un importante vantaggio di questo metodo è che può essere eseguita in sveglio, topi comportarsi, mentre alcuni metodi alternativi per misurare EMG necessita di anestesia e / o sono procedure terminali 11, 12, 13. La registrazione dell'attività EMG in topi svegli nel tempo può anche essere realizzato attraverso l'impianto cronica di EMG porta, dove il mouse è legato da fili al sistema di acquisizione 14, 15. Perché legare un mouse potrebbe interferire con il movimento o comportamento normale e può non essere compatibile con una camera pletismografia standard, il metodo descritto utilizza dispositivi di telemetria per trasmettere senza fili il segnale EMG al sistema di acquisizione. Il trasmettitore puòessere acceso o spento con un magnete per risparmiare energia e consente ripetute misurazioni di attività EMG diversi mesi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per misurare l'attività dei muscoli respiratori o non respiratorie aggiuntivi inserendo l'EMG conduce in diversi muscoli. In alternativa, può essere utilizzato uno dei due conduttori per misurare l'attività EEG per valutare lo stato di sonno o per identificare l'attività convulsiva 16. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per misurare i cambiamenti nell'attività ARM a riposo per tutta la progressione della malattia in un modello murino di SLA e per identificare i neuroni chiave che guidano l'attività ARM nei topi sani 10.
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Protocol
procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato di cura e l'uso dei bambini di Cincinnati Hospital Medical Center Istituzionale Animal e condotto in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione per telemetria Chirurgia implantare Dispositivo
- Indossare dispositivi di protezione individuale (cioè, scrub, coperture del pattino, abito, rete di capelli, maschera e guanti chirurgici).
NOTA: Questo intervento richiede un campo sterile. - Accendere l'incubatore (servo-controllati incubatore umidificatore / infantile impostata a 29 ° C) e la linea con secchi, asciugamani bianchi per consentire il riscaldamento adeguato per il recupero.
- Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con ossido di etilene e sterilizzare il trasmettitore con un detergente enzimatico e sterilizzante chimico (o come specificato dal costruttore) prima dell'uso.
NOTA: Gli strumenti chirurgici devono includere # 2 pinze laminectomia (standard di suggerimenti / diritto / 12 cm) (x4), strettapinza modello (seghettato / curva / 12 cm), forbici tessuto di separazione (diritto / blunt-smussata / 11,5 cm), e un supporto bisturi e la lama. Si raccomanda di avere un gruppo separato di strumenti sterilizzati (due # 2 pinze e forbici) riservati esclusivamente per la gestione dei cavi del trasmettitore per mantenere gli strumenti chirurgici in buone condizioni. - Sterilizzare tutte le superfici all'interno del campo chirurgico con un disinfettante accettabile. Posizionare un microscopio dissezione stereo, isoflurano macchina anestetica, strumenti chirurgici, e tagliaunghie nel campo chirurgico (vedere la tabella dei materiali).
- Per mantenere la temperatura corporea del mouse mentre sotto anestesia, inserire una piastra elettrica o una coperta acqua sotto l'asciugamano sterile davanti al microscopio dissezione stereo.
- Assicurarsi che il trasmettitore è completamente funzionale prima dell'uso.
NOTA: Un piccolo magnete collocato all'interno 2 del trasmettitore si accende il dispositivo on e off. Quando il trasmettitore è acceso e tenuto vicino ad un raDIO fissato a 500 Hz frequenza AM, emetterà un continuo rumore acuto ronzio. Per prolungare la durata della batteria, girare la batteria prima di impiantare nel animale. - Preparare l'elettrodo porta prima dell'intervento tagliando i cavi distali con le forbici riservati per la gestione fili in modo che vi sia circa 3 cm di piombo (sufficiente per raggiungere il muscolo bersaglio) (Figura 1A). In alternativa, avvolgere i fili prossimale al dispositivo e legarli insieme con suture in modo che v'è di circa 3 cm di piombo srotolata.
NOTA: salvare la parte ritagliata iniziale del porta elettrodo per preparare "tappi" di piombo (plastica involucro coibentato), come descritto al punto 1.9. Nel passaggio 3, i conduttori trasmettitore verranno inseriti attraverso il muscolo, così e la parte distale esposta dei fili devono essere tenute in posizione e isolate con tappi di piombo. - Utilizzare un bisturi per tagliare 0,5 cm del rivestimento in plastica senza tagliare il filo stesso. Utilizzare gli strumenti riservati fomovimentazione filo r per allungare le estremità dei reofori 4 - 5 volte la lunghezza originale in modo che si inseriscono facilmente all'interno di un ago calibro 25 (Figura 1B-B ''). Tagliare il filo esposto dei cavi in modo che siano 0,5 cm di lunghezza.
- Preparare tappi piombo (tubi di plastica per coprire le estremità dei conduttori) prima dell'intervento. Utilizzare un bisturi per tagliare tubi 0,25 cm lunghi dall'involucro plastico circonda i segmenti di elettrodo conduce salvato dal punto 1.7.
NOTA: Quattro protezioni di piombo sono necessari per ogni mouse che saranno sottoposti a impianto, ma è meglio per preparare il doppio della quantità di tappi. Avendo tappi di piombo preparato sterili supplementari è utile nel caso in cui garantire un tappo di piombo è successo al primo tentativo. - Annotare il numero di serie del trasmettitore inserito e salvare la confezione originale con le informazioni calibrato. Ogni trasmettitore possiede diverse tarature di frequenza per la registrazione EMG; inserirle nel software di acquisizione di ottenere accettabile EMGregistrazioni.
2. Preparazione del mouse per la chirurgia
- Scegliere il mouse desiderato per l'impianto (cioè, SOD1 (G93A) o controllo) e pesare l'animale.
NOTA: L'età consigliata e il peso di un mouse (maschio o femmina) sottoposti a questo intervento è P56 - P120 e ≥ 24 g, rispettivamente. - Anestetizzare il mouse 3,5% isoflurano con un / flusso dell'ossigeno min 2 L. Eseguire un pizzico punta e un pizzico coda per fare in modo che il mouse è completamente anestetizzato.
- Una volta anestetizzato, rimuovere il mouse dalla scatola di rinvio e mantenere l'anestesia mediante un'ogiva impostando il livello isoflurano al 1,5% e la portata di ossigeno a 1 L / min. Eseguire una presa punta e / o di coda pinch per assicurarsi che l'anestesia viene mantenuta.
- Applicare il lubrificante pomata oftalmica per evitare che gli occhi si secchi durante l'intervento chirurgico.
- Radere il mouse per esporre un sito chirurgico tra l'orecchio e la spalla (Figura 1C).
- Alternate tampone il sito chirurgico, prima con disinfettante e poi con isopropanolo. Ripetere altre 2 volte.
3. Impianto del dispositivo di telemetria per registrare Scalene e trapezio EMG attività
- Posto l'animale sotto un microscopio di dissezione, sul suo lato su di un tampone sterile che copre una piastra elettrica, e fissare il cono in posizione con nastro. Si noti che è meglio per impiantare il lato destro per ridurre segnale ECG proveniente dal cuore.
NOTA: Controllare la respirazione e regolare i livelli di isoflurano, se necessario, per mantenere un tasso di respirazione regolare e appropriato piano chirurgica di anestesia. - Tirare la zampa anteriore verso il piede ipsilaterale lungo il busto.
NOTA: Questa posizione sposta la scapola caudale, che fornisce l'accesso chirurgico al sCalene e trapezio muscoli.- Prendere le pinze curve smussate, trattenere la zampa ipsilaterale fronte al sito chirurgico, e il nastro la zampa in posizione (Figura 1C). Utilizzare forte nastro chirurgico adesivo per assicurarsi che la zampa è sicuro per la durata della procedura.
- Mettere su un nuovo paio di guanti chirurgici. Utilizzare il bisturi per fare un'incisione obliqua, a circa 2 cm di lunghezza, tra la spalla e l'orecchio (linea rossa nella Figura 1C).
- Utilizzando due # 2 pinze laminectomia, uno in ogni mano, tirare indietro il cuscinetto adiposo e divaricati trapezi e platisma per esporre la fascia che copre i muscoli sternocleidomastoideo e scaleno (Figura 1D ed E).
- Utilizzare il muscolo sternocleidomastoideo pallido e nervo frenico come punti di riferimento per identificare i muscoli scaleni. Si noti che il nervo frenico corre parallela ai muscoli scaleni, mentre lo sternocleidomastoideo trova inferior. I muscoli scaleni corrono obliquamente dal vertebre cervicali alle costole sotto il muscolo trapezio. Lead biopotenziale saranno inseriti nel muscolo scaleno anteriore, che può essere identificato come il muscolo che corre adiacente al nervo frenico (Figura 1F e G).
NOTA: Attenzione. Questa zona è altamente vascolarizzata, e bisogna fare attenzione per evitare di tagliare l'arteria succlavia. Evitare di danneggiare il frenico dei nervi e del plesso brachiale. - Una volta che i scaleno e trapezio sono stati identificati (figura 1G), effettuare una tasca sottocutanea per il trasmettitore sul dorso dell'animale, fra le scapole.
- Utilizzare le forbici tessuto separatore, inserire le punte smussate delle forbici appena sotto la pelle e diffonderli fino aprendo una tasca che è circa 1,25x la larghezza del trasmettitore è formata (Figura 1 H).
NOTA: Il trasmettitore deve essere inserito con resistenza minima, ma il pocket non dovrebbe essere così grande che il trasmettitore può muoversi da solo. Se la tasca è troppo piccolo, il trasmettitore potrebbe sfregare contro la pelle, causando irritazione che possono indurre l'animale a graffiare la pelle e / o tirare i cavi fuori. Se la tasca è troppo grande, sieromi potrebbero formano, o il trasmettitore possono migrare in una posizione sfavorevole.
- Utilizzare le forbici tessuto separatore, inserire le punte smussate delle forbici appena sotto la pelle e diffonderli fino aprendo una tasca che è circa 1,25x la larghezza del trasmettitore è formata (Figura 1 H).
- Lavare con acqua calda, soluzione salina sterile e inserire il trasmettitore con il lato piatto contro il muscolo. Posizionare il trasmettitore in modo che si trovi ei fili emergono dalla tasca, parallele tra loro anziché ritorto (Figura 1I). Arricciare qualsiasi lunghezza in eccesso del filo sotto il dispositivo e adagiarlo orizzontalmente.
- Eseguire i conduttori provenienti dal trasmettitore al scaleni e trapezio muscoli in modo che le due serie di conduttori bipotente giacciono piane e parallele tra loro.
- Utilizzare le pinze laminectomia per separare la scaleno anteriore dai muscoli circostanti e inserire un ago 25-gauge attraverso la mus scalenocle, perpendicolare alle fibre muscolari.
- Inserire un conduttore nella punta dell'ago e quindi tirare l'ago dal muscolo, lasciando il cavo inserito nel muscolo fino all'isolamento del filo (Figura 1J e K). Record che fili colorati vengono inseriti in cui il muscolo.
- Una piccola goccia di adesivo cianoacrilato sull'estremità esposta del filo, in prossimità del muscolo in cui viene inserito il cavo, e far scorrere rapidamente il cappuccio vantaggio sul filo in modo che nessun filo è esposto tra il cappuccio dell'elettrocatetere e il muscolo (Figura 2A e B).
NOTA: Anche se è una pratica accettata per garantire EMG porta con cianoacrilato 17, 18, un metodo alternativo è quello di garantire il tappo di piombo in posizione da un nodo di seta di sutura intorno ad esso. - Tagliare il filo distale eccesso al tappo ed applicare una goccia di adesivo cianoacrilato alla estremità del cappuccio / cavo. Dare la collatempo di polimerizzare prima di rilasciare (Figura 2C e D).
- Seguire la stessa procedura (passi 3,10-3,12) per inserire il contrario piombo polarità parallelo al primo nello stesso muscolo, 1 - allontanamento dal primo conduttore 2 mm.
- Ripetere i passaggi 3,10-3,12 per inserire i cavi nel muscolo trapezio, che si trova appena anteriormente al muscolo scaleno (Figura 1L e M).
- Assicurarsi che i fili conduttori sono fissate in posizione e che non v'è abbastanza gioco nei conduttori per l'animale di eseguire movimenti corporei senza tirare i cavi. Assicurarsi che qualsiasi lunghezza in eccesso di piombo non spinge contro la pelle, poiché ciò potrebbe provocare irritazioni che possono indurre l'animale graffiare o tirare i cavi fuori. Riposizionare i cavi, se necessario, per evitare qualsiasi potenziale disagio.
- Rimuovere delicatamente il nastro tenendo premuto l'arti anteriori. Tirare il cuscinetto di grasso posteriore sopra il muscolo e usarlo per coprire i conduttori inseriti. Chiudere l'incisione con adesivo cianoacrilato da presa in giroi lembi cutanei indietro insieme in modo che le linee di incisione su. Pizzicare una porzione dei lembi cutanei insieme con le pinze curve e applicare una piccola linea di adesivo cianoacrilato lungo questa linea.
- Iniettare 0,1 mL di sottocutanea carprofen per alleviare il dolore post-operatorio, mentre l'animale è ancora sotto anestesia.
NOTA: continuare ad amministrare 0,1 ml di carprofen una volta al giorno per 1 - 2 giorni dopo l'intervento chirurgico, e poi, se necessario dopo. - Rimuovere l'animale dalla nosecone e metterlo in una gabbia pulita nell'incubatrice preriscaldato fino a quando l'animale è sveglio e si muove intorno alla gabbia volontariamente. Mantenere l'animale nell'incubatrice per almeno 15 minuti dopo, il monitoraggio dei suoi movimenti e la vigilanza.
4. Cura postoperatoria
- animali Casa separatamente dopo l'intervento. Fornire guarigione gli animali con il gel dieta e una bottiglia d'acqua.
- Monitorare l'animale per i primi 30 minuti dopo l'intervento chirurgico. Controllare l'animale almeno ogni ora fo 5 ore dopo l'intervento chirurgico. Nei giorni dopo l'intervento, controllare almeno due volte al giorno.
- Guardare per necrosi, infezione lungo l'incisione e all'interno della cavità corporea contenente l'impianto (cioè, calore, gonfiore e arrossamento), e la formazione sieroma.
NOTA: Questi segni si verificano entro la prima settimana dopo l'intervento chirurgico. Una sana guarito animale un mese dopo l'intervento chirurgico è illustrato nella figura 1N. Sebbene registrazioni EMG possono essere effettuate immediatamente dopo l'impianto, gli animali sono date almeno una settimana per guarire prima della registrazione EMG e pletismografia, come segnali ECG può essere alto immediatamente dopo l'impianto.
5. Acquisizione Segnali simultanea elettromiografia e la pletismografia
- Accendere tutte le apparecchiature di acquisizione, incluso il flusso bias.
NOTA: La portata per i topi è in genere fissato a 1,0 L / min. - Calibrare la camera pletismografia (s) utilizzando un misuratore di flusso.
NOTA: Controllare periodicamente il Chambe pletismografiars per garantire che le guarnizioni non sono incrinate o rotte. Rivestire le guarnizioni di gomma con un lubrificante come grasso per vuoto una volta alla settimana per mantenere la loro buona condizione. - taratura del trasmettitore di ingresso, come specificato dal produttore.
- Posizionare il mouse nella camera pletismografia per almeno 1 h per acclimatarsi esso prima della registrazione EMG e pletismografia. Utilizzando camere multiple, è possibile registrare da un mouse mentre il successivo mouse acclimatando in una seconda camera. Non accendere il trasmettitore durante il periodo di acclimatazione per conservare la carica della batteria (Figura 1O).
- Prima della registrazione (ma dopo la calibrazione), attivare il trasmettitore posizionando un forte magnete entro 1 dell'animale impiantato; una luce rossa sulla parte anteriore del ricevitore indica quando il trasmettitore è acceso.
- Iniziare l'acquisizione utilizzando il menu a tendina con l'etichetta "Acquisizione" e scegliere "Start Acquisition". Anche se la durata della registrazione puòvariare da esperimento, una pletismografia tipico e registrazione EMG dura 1 - 3 h.
NOTA: Il trasmettitore ha una frequenza di campionamento di 240 Hz intrinseca. Una maggiore velocità di 500 Hz viene impostata nel software di interpolare tra i punti e per fornire una forma d'onda più liscia. Il filtro passa basso (che serve come un filtro anti-alias) e il filtro passa alto nell'impianto specificano la larghezza di banda da 1 a 50 Hz per questo dispositivo di telemetria. 60 Hz A / C interferenza non contribuisce al rumore eccessivo nel segnale EMG perché gli impianti sono alimentati a batteria e l'animale scudi l'impianto e conduce dai campi elettrici. Pletismografia, EMG, e il video sono sincronizzati automaticamente in tempo reale tramite software di acquisizione. - Quando l'acquisizione è terminata, spegnere il trasmettitore con un magnete e rimuovere l'animale dalla camera.
- Se a partire un'altra registrazione, pulizia della camera, inserire nelle nuove calibrazioni trasmettitore dal prossimo animale, e iniziare la seconda registrazione. Se finmentata con acquisizione per il giorno, spegnere il trasmettitore, pulire la camera pletismografia, e spegnere tutte le unità di acquisizione e il flusso di polarizzazione.
Figura 1. L'impianto di telemetria Dispositivo misurare respiratorio EMG muscolare. Trasmettitori (A) telemetrico con due coppie di biopotenziale porta a misurare EMG. Cavi possono essere tagliati alla lunghezza desiderata (basso) o arrotolati e nascosto sotto il trasmettitore (in alto). (B) Trasmettitore porta. (B') porta con isolamento plastica rifilati per esporre i fili e per fare tappi piombo (riquadro). (B '') porta con fili allungato 4 - 5 volte la loro lunghezza originale. Conduttori devono essere tagliate in modo che essi sono lunghi 0,5 cm (non mostrato). (C) del mouse preparato per un intervento chirurgico, con il sito chirurgico rasata e correttamenteforepaw posizionato. La linea tratteggiata rossa indica il sito di incisione. (D) i muscoli superficiali situati sotto il cuscinetto di grasso e la fascia, visto dopo l'incisione iniziale. T = trapezio. S = sternocleidomastoideo. P = platisma. freccia gialla = nervo frenico. Diagramma (E) fumetto dei muscoli e nervo frenico mostrati in (D). Pinze dovrebbero essere utilizzati per diffondere a parte i muscoli del trapezio e platisma per raggiungere il muscolo più profondo scalene, mostrato in (F) e (G). (F) Luoghi di interesse utilizzato per identificare la posizione del scalene e il trapezio. Questa immagine mostra l'arteria succlavia (freccia bianca), il frenico plesso nervoso / brachiale (freccia nera), e il muscolo sternocleidomastoideo pallido (freccia gialla). (G) fumetto raffigurante la località dei muscoli profondi (cioè, scaleno medio, scaleno anteriore, e SCM), arteria succlavia e nervo frenico. Scaleno posteriore non è visibile. Questi possono essere accessibili solo quando il SuperficiAl muscoli (in D ed E) sono divaricate. (H) Effettuare una tasca per il trasmettitore con le forbici smussata punta. (I) Inserito trasmettitore nella tasca sottocutanea, con i conduttori paralleli in posizione emergenti dalla tasca. (J) Inserimento del ago calibro 25 nella scaleno, perpendicolare alle fibre muscolari, per fare un tunnel per il conduttore. (K) Entrambi i cavi inseriti nel muscolo scaleno. tappi piombo sono posizionati sul estremità e incollate in posizione. (L) Inserimento del ago calibro 25 nella trapezio, perpendicolare alle fibre muscolari, per fare un tunnel per il conduttore. (M) Tutti i quattro conduttori inseriti nei trapezio scaleno e muscoli e disteso prima della chiusura della ferita. (N) completamente recuperato topo, con il trasmettitore posizionato per via sottocutanea sul dorso. (O) Contemporaneamente registrazione pletismografia, attività EMG dei muscoli, unVideo nd utilizzando una camera pletismografia (freccia gialla), telemetria ricezione pad (freccia rossa), e la macchina fotografica (freccia nera), rispettivamente. Un flusso di polarizzazione multifunzione è collegata alla camera pletismografia tramite un tubo di plastica (freccia blu) per fornire ossigeno al mouse. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Fissaggio Caps Piombo con cianoacrilato. (A) Applicare una piccola goccia di cianoacrilato (cerchio viola) al filo esposta del filo conduttore di elettrodo prossimale (E) al muscolo. (B) rapidamente scorrere il cappuccio dell'elettrocatetere preparata (LC) sul filo esposto sopra l'adesivo cianoacrilato in modo che il tappo di piombo è posizionato direttamente adiacente al muscolo. (C) Tagliare una piccola porzione dell'estremità distale del tappo piombo e filo in modo che non ci sono elettrodi presente esposto che non è isolato con plastica. (D) Applicare una piccola goccia di cianoacrilato alla estremità del cappuccio piombo. Rimuovere l'estremità distale rifilati del cappuccio dell'elettrocatetere dall'animale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
6. Analisi di ARM EMG e Pletismografia
- Aprire il software di analisi e rivedere il file di interesse (andare su "File" e scegliere "Apri file riesame"). Filtrare i segnali EMG utilizzando un filtro passa alto da 30 Hz facendo clic destro sulla traccia EMG, scegliendo "Analizza Attributi," mettendo in evidenza "Attributi avanzati 1" sulla scheda, e la sostituzione del filtro passa-alto a 30 Hz.
NOTA: Questo passaggio filtrante rimuove non discriminare, informazioni a bassa frequenza. Individuare aree di inattività topo mediante ispezione visiva relativo alla mancanza di movimento nel file video sincronizzato e la mancanza di grandi variazioni di pressione irregolari dovuti al movimento nella traccia pletismografia (riquadro rosso in figura 3A); inattività si verifica quando il mouse è sveglio o addormentato, ma ancora. - Identificare attacchi EMG in modo indipendente per ogni muscolo.
- Rettificare e integrare il segnale EMG filtrata su 30 ms (Figura 4).
NOTA: Poiché topi respirare ad una velocità di 3 Hz, ogni respiro è rappresentato da circa 11 valori integrati. - Determinare l'ampiezza di base EMG mediando i valori rettificati e integrati associati con il segnale EMG per un periodo di 3 s quando il mouse è inattivo e la traccia pletismografia mostra eupnea (respirazione normale) (Figura 4).
- Identificare "attacchi" di attività definiti da almeno 3 valori rettificati e integrati consecutivi che sono almeno 5aumento 0% al di sopra della linea di base del segnale EMG (determinato nella fase 6.3.2).
NOTA: Tre valori consecutivi rappresentano una finestra di 90 ms, ma alcuni attacchi deve contenere più di 3 valori superiori alla soglia e durerà più a lungo di 90 ms. - Utilizzare il video e pletismografia tracce sincronizzato escludere attacchi che si verificano durante sospiri (Figura 3B); annusando (Figura 3C); o movimenti del mouse volizionali, come rotazione della testa o grooming.
- Ripetere i punti 6.3.1 - 6.3.4 per la seconda muscolare.
- Rettificare e integrare il segnale EMG filtrata su 30 ms (Figura 4).
- Calcolare la frequenza di attacco per ogni muscolo. Record a) il tempo e la fine tempo di inizio di ciascun periodo inattivo e b) quando si è verificato ogni incontro con i criteri di cui sopra. Sommare il tempo di inattività totale. Dividere il numero totale di attacchi da parte del min totale di tempo di inattività nel corso della sessione di registrazione per calcolare la frequenza di incontro.
- Determinare se i cambiamenti nella ventilazione sono associati con l'attivazione della m registratauscles.
- Selezionare i parametri di respirazione da misurare (ad esempio, picco di flusso inspiratorio, volume corrente, il volume minuto, e respiri al minuto).
NOTA: Tutte le selezioni possibili possono essere trovate nel menu a tendina Setup P3 in "parametri derivati." - Identificare i respiri che si verificano durante l'attività EMG attacco ei respiri che si verificano durante l'attività basale EMG (Figura 4).
- Crea segmenti di parser che abbracciano respiri pletismografia che sono associati con l'attività EMG attacco e creare segmenti parser indipendenti che sono associati con l'attività di base EMG. Assicurarsi di impostare il tipo di analisi a "Parser Seg."
NOTA: Questa selezione si trova nel menu a tendina Setup P3 sotto "Setup riduzione dei dati." - Segnare l'inizio di ogni segmento parser con un evento facendo clic destro sulla traccia pletismografia. Specificare un attacco contenente segmenti parser come "Evento 1" nel menu a discesa e specify segmenti parser di base come "evento 2" per distinguere le due classi di segmenti.
- Sotto il menu "Funzioni", salvare la "Sezione Marchi" e "marchi derivati dei dati." Sotto il menu Dati Parser, salvare il "file analizzato Review" e "Parsed Derived Data."
NOTA: I parametri di respirazione selezionati per ogni singolo respiro si trovano nella scheda di dati derivati Marks nella scheda "Derivazioni". - Confrontare i parametri respiratori di respiri che si verificano durante i periodi ARM (contrassegnate come Evento 1) contro respiri che si verificano durante l'attività di base (contrassegnato come evento 2) per determinare se l'attività muscolare è associata a cambiamenti nella ventilazione.
- Selezionare i parametri di respirazione da misurare (ad esempio, picco di flusso inspiratorio, volume corrente, il volume minuto, e respiri al minuto).
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Representative Results
Il protocollo descritto è stato usato per impiantare un dispositivo di telemetria e per registrare e scaleno trapezio EMG, WBP, e video di una SOD1 (G93A) modello ALS topo. Periodi in cui l'animale è inattivo (ad esempio, non si muove) sono stati identificati utilizzando la registrazione video e confermati dalla mancanza di attività movimento-correlata nella traccia WBP (Figura 3A). I periodi inattivi includono il tempo trascorso in REM o sonno non-REM, così come il tempo trascorso sveglio ma ancora (Figura 3A). Attività EMG durante questo tempo inattivo è stato ottenuto come un incontro quando almeno 3 consecutivi rettificati e integrati (oltre 30 ms) valori hanno ampiezze con almeno un aumento del 50% rispetto ai livelli basali EMG (Figura 4). Periodi di attività che si sono verificati durante sospirando o annusando (determinato mediante pletismografia), o movimenti volitivi (valutati in video) sono stati esclusi dall'analisi (Figura 3B-C). SOD1 (G93A) topi a EArly- alle fasi mid-sintomatica (Tabella 1) mostrano periodi di maggiore attività ARM a riposo che durano per uno a più respiri (Figura 4). Periodi di attività ARM sono rari in SOD1 pre-sintomatica (G93A) (figura 3A) o topi di tipo selvatico 10.
| Palcoscenico | Stato | Fase Onset | hindlimb Presentazione |
| 0 | Pre-sintomatica | <P100 | Non ci sono differenze notevoli rispetto al wildtypes. |
| 1 | insorgenza della malattia | ~ P100 | collasso degli arti posteriori quando il mouse è sospeso dalla coda. |
| 2 | Paresi | ~ P120 | crollo totale o parziale degli arti posteriori con l'apparenza del tremore. | </ Tr>
| 3 | paralisi insorgenza | ~ P140 | Difficoltà a camminare, curling punta e / o di trascinamento del piede. |
| 4 | paralisi avanzato | ~ P150 | movimento articolare Minimal, non arti posteriori utilizzata per il movimento in avanti. |
| 5 | Stadio terminale | ~ P160 | Mouse incapace di raddrizzarsi da lato entro 30 secondi. |
Tabella 1. neurologico punteggio di ALS-come progressione della malattia in SOD1 (G93A) Topi.
Figura 3. Rappresentante WBP e EMG Tracce. (A - C) WBP e EMG di scaleno e trapezio muscoli da un SOD1 pre-sintomatica (G93A) topo (P98 età). Periodi (A) quando t egli animale è a riposo (scatola rossa) vengono utilizzati per l'analisi. Tracce di fuori della scatola rossa mostrano picchi grandi e irregolari dell'attività tracce pletismografia e muscolare nel EMG tracce, tipicamente quando un animale è in movimento, come determinato da registrazioni video sincronizzate (non mostrati). La casella rossa mostra EMG ripercorre carente attacchi EMG, caratteristica di un topo pre-sintomatica. (B) Bouts di attività EMG spesso si verificano immediatamente precedente un sospiro (come mostrato nella traccia pletismografia). Sospiri sono caratterizzati da ispirazione ampiezza elevata seguita da espirazione drammatico. I punti di punta di freccia in bianco ad un segnale ECG caratteristico. (C) Bouts di attività EMG verificano frequentemente mentre il mouse viene annusando. Sniffing si riflette nella traccia pletismografia da un aumento prolungato sia nella frequenza e ampiezza su più respiri (co-occorrenti con esplosioni di attività EMG).color = "# 0066CC"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Punteggio Bouts di EMG attività. (A e B) Due esempi di WBP, filtrati tracce trapezio EMG, e rettificati e segnali trapezio EMG integrati da un SOD1 sintomatica (G93A) topo (P126 età). Tratteggiata blu indicano il livello EMG basale, determinata calcolando la media segnali raddrizzati e integrati in un periodo di tempo di 3 s. Rosse linee tratteggiate indicano un aumento del 50% dell'ampiezza sull'attività basale EMG. Un attacco di attività viene ottenuto quando almeno 3 valori rettificati e integrati consecutivi superano la soglia di base 50%. Clicca qui per visualizzare alVersione Arger di questa figura.
| PIF (mL / s) | TV (ml) | MV (ml / min) | Frequenza respiratoria (atti / min) | |
| Naive (n = 5) | 4.4 ± 0.7 | 0.27 ± 0.04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Impiantato (n = 4) | 4.1 ± 0.2 | 0.27 ± 0.11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P-value | 0,439 | 1.000 | 0,893 | 0.410 |
| I valori mostrati riflettono media ± SD. P-valori sono stati calcolati con i test t di Student. | ||||
Tabella 2. Confronto della respirazione Tra Naive (non impiantato) e impiantati Fase 4 SOD1 (G93A) Mouse. Non sono state riscontrate differenze significative nel picco di flusso inspiratorio (PIF), volume corrente (TV), il volume minuto (MV), o respiri al minuto tra i due gruppi. I valori riportati rispecchiano la media ± SD. P-valori sono stati calcolati con i test t di Student.
misurazioni ripetute di EMG e / o WBP possono essere realizzati nello stesso mouse su diversi mesi, con poche variazioni nel segnale EMG o al basale dopo un periodo di recupero da 1 a 2 settimane dopo l'intervento. L'andamento nel tempo è tipicamente limitata dalla durata della batteria e così sarà determinata dalla frequenza e la durata delle singole registrazioni. I ricercatori devono essere consapevoli che possono verificarsi occasionalmente eventi avversi a causa del dispositivo impiantato. Il mouse può estrarre i fili dal muscolo impiantato o graffio / masticazione alla pelle se i cavi o trasmettereter impropriamente collocato. Nella maggior parte dei casi, le considerazioni etiche impongono che questi animali essere sacrificati. Il trasmettitore può essere rimosso, sterilizzato, e ri-impiantato in un altro mouse.
Per verificare che Dispositivo di impianto non influenzare la respirazione, sono state confrontate le misurazioni pletismografia tra SOD1 naive (G93A) topi (non impiantato) in ALS stadio 4 e topi impiantati SOD1 (G93A) in ALS fase 4. Non sono state riscontrate differenze significative nel picco di flusso inspiratorio (PIF), volume corrente (TV), il volume minuto (MV), o respiri al minuto tra i due gruppi (Tabella 2). Scaleno e trapezio sono adiacenti l'uno all'altro e sono direttamente in contatto tra loro. Sebbene simultanei attacchi EMG sono talvolta osservate in entrambi i muscoli, forti attacchi EMG vengono rilevate nel trapezio quando attacchi EMG sono assenti nel scalene (e viceversa), dimostrando che è minimo cross-talk tra gli elettrodi impiantati in ogni muscolo. si osservano anche attacchi indipendenti di attività EMG, quando i cavi sono messi in trapezio e dei muscoli sternocleidomastoideo (dati non riportati).
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Discussion
La procedura consente dimostrato qui per la misurazione non invasiva (dopo l'impianto chirurgico iniziale del trasmettitore) di attività dei muscoli respiratori e ventilazione per molti mesi, nello stesso animale. Questa tecnica ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche standard di EMG nei topi anestetizzati: 1) gli esperimenti richiedono un minor numero di topi e di fornire la possibilità di registrare i dati provenienti dallo stesso sito in un unico mouse attraverso stadi della malattia (invece di utilizzare molteplici topi a diversi stadi della malattia); 2) l'analisi dei dati può essere eseguita con test statistici più potenti (ad esempio, utilizzando misure ripetute anziché confrontare gruppi sperimentali separate); 3) la registrazione simultanea di EMG e WBP consente la valutazione diretta degli effetti dell'attività ARM sulla ventilazione; e 4) gli esperimenti possono essere eseguiti su topi in diversi stati di sonno / veglia. Inoltre, a causa topi sani hanno una frequenza molto bassa di attacchi ARM a riposo, questa tecnica è capable di rilevare anche piccole variazioni della frequenza dell'attività ARM nei topi modello ALS nelle fasi precoce sintomatiche della malattia 10. Tuttavia, poiché questa tecnica misura l'attività di un gran ma sconosciuto numero di fibre muscolari durante comportamento naturale, piuttosto che in seguito a stimolazione nervosa ad intensità sperimentalmente controllati, non è adatto per la stima della dimensione o numero gruppo motore. Un'altra limitazione è che trasmettitori telemetrici basati adatti per l'impianto in topi sono attualmente limitati a due serie di conduttori biopotential; quindi, solo due siti possono essere registrati dallo stesso animale. Per gli esperimenti che richiedono la registrazione simultanea di più di due muscoli del mouse stesso, più derivazioni EMG possono essere impiantati e collegati ad un sistema di acquisizione utilizzando un tether filo, come descritto in precedenza 14, 15. Tuttavia, le modifiche alla camera pletismografia o sigilli sarebbero necessarie per consentireper la registrazione simultanea di attività muscolare e la ventilazione se un mouse è legato.
Quando si applica questa tecnica, alcune fasi del protocollo devono essere effettuate con cura. conduttori biopotenziale devono essere posizionati in modo da non ostacolare il movimento o irritare la pelle sovrastante. Inoltre, il trasmettitore deve essere posizionato in modo che non influenza il movimento normale o postura del mouse. Si raccomanda che il corretto posizionamento dei cavi (vale a dire, pienamente integrati nel muscolo corretta e non a contatto muscoli adiacenti) e la mancanza di danni muscolari o infezione sono verificati dal autopsia dopo l'esperimento è stata terminata. Inoltre, è imperativo che il trasmettitore sia spento dopo ogni sessione di registrazione per prolungare la durata della batteria.
Una conseguenza inevitabile di misurare EMG dai muscoli nella zona del torace e del collo è l'elevata probabilità di (ECG) segnali registrazione elettrocardiogramma, che appaiono come rigular picchi all'interno della traccia EMG (Figura 3B, freccia). segnali ECG possono essere minimizzati posizionamento accurato dei cavi in modo tale che tutto il metallo è incorporato pienamente nel muscolo ed evitando il posizionamento nei pressi di importanti vasi sanguigni. Impiantare conduce in muscoli sul lato destro del corpo, piuttosto che a sinistra, che è più vicino al cuore, può anche ridurre segnali ECG. Anche se il segnale ECG può essere filtrata su EMG tracce utilizzando algoritmi di calcolo o sottraendo un segnale registrato indipendentemente ECG 19, 20, 21, non è in genere necessario. Il segnale ECG può essere facilmente distinto dal segnale EMG dal normale forma, frequenza e ampiezza.
La tecnica descritta è stato utilizzato per misurare le variazioni nell'attività ARM a riposo nel SOD1 (G93A) modello murino di SLA 10. muscoli respiratori accessori vengono anche reclutati in otle malattie neuromuscolari (es, distrofia muscolare, atrofia muscolare spinale, neuropatie periferiche, ecc) e seguenti nervose o lesioni del midollo spinale. attività di ARM può quindi servire come indicatore per misurare compromissione funzionale del diaframma e valutare la gravità della malattia, monitorare il recupero da un infortunio, o valutare i potenziali benefici del trattamento per migliorare la respirazione in una varietà di modelli di malattia animale o lesioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal Premio Trustee Hospital Medical Center di Cincinnati a bambini SAC ed una borsa di formazione NIH (T32NS007453) per VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
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