Summary
Dette papiret introduserer en fremgangsmåte for gjentatte målinger av ventilasjon og luftmuskelaktivitet i et fritt oppfører amyotrofisk lateral sklerose (ALS) musemodell hele sykdomsprogresjon med hel-legeme-plethysmografi og elektrode for via et implantert telemetrianordning.
Abstract
Tilbehørs respirasjonsmuskulaturen bidra til å opprettholde ventilasjon når membranfunksjonen er svekket. Følgende protokoll beskriver en metode for gjentatte målinger over uker eller måneder med tilbehør respiratorisk muskelaktivitet samtidig som måle ventilasjon i et ikke-bedøvet, fritt oppfører mus. Teknikken omfatter kirurgisk implantering av en radiosender og innsetting av elektroder fører inn i scalene og trapezius muskler for å måle elektromyogrammet aktiviteten til disse inspiratoriske muskler. Ventilasjon måles ved hjelp av hel-legeme-plethysmografi, og dyr bevegelse vurderes av video og er synkronisert med electromyogram aktivitet. Målinger av muskelaktivitet og ventilasjon i en musemodell av amyotrofisk lateralsklerose blir presentert for å vise hvordan denne verktøyet kan brukes for å undersøke hvordan luftmuskelaktivitet endringer over tid, og for å vurdere effekten av muskelaktivitet på ventilasjon. De beskrevne fremgangsmåter kan easily være tilpasset for å måle aktiviteten til andre muskler eller for å vurdere tilbehør respiratorisk muskelaktivitet i ytterligere musemodeller av sykdom eller skade.
Introduction
Tilbehørs respirasjonsmuskulaturen (armer) øke ventilasjonen i tider med høy etterspørsel (f.eks mosjon) og hjelpe til å opprettholde ventilasjon når membranfunksjonen er svekket etter skade eller sykdom 1, 2. Selv om forandringer i membranfunksjon er godt beskrevet i amyotrofisk lateral sklerose (ALS) pasienter og musemodeller 3, 4, 5, 6, mye mindre er kjent om aktiviteten eller funksjon av armene i ALS. Men en studie antydet at als pasienter som rekrutterer Armene har en bedre prognose enn tilsvarende membranen dysfunksjon som ikke gjør det 7. Videre er tilstrekkelig for respirasjon i tilfeller av membranen lammelse 8 ARM aktivitet. Disse studiene viser at strategier for å utfylle ARM-funksjonen kan forbedre breathing i pasienter som lider av neuromuskulære sykdommer, ryggmargsskade, eller andre tilstander der membranen er svekket. Imidlertid mekanismene som kontrollerer ARM rekruttering for pusting er stort sett ukjent. Metoder for å måle lungefunksjon og endringer i ARM aktivitet over tid i dyremodeller av sykdom eller skade for å studere hvordan armene blir rekruttert, samt for å evaluere terapi for å forbedre ARM rekruttering og ventilasjon. Videre kan den økte aktiviteten av våpen som faller sammen med den progressive tap av membranfunksjonen være en nyttig biomarkør for sykdomsprogresjon i nevromuskulære sykdommer slik som ALS 7, 9, 10.
Denne protokollen beskriver en metode for ikke-invasiv måte (ved å følge den innledende kirurgi) og gjentatte ganger måle aktiviteten av luftveismuskler og ventilasjon i våken, oppfører mus. Synkroniserte opptak av elektromyografeny (EMG), hel-legeme-plethysmografi (WBP), og video tillate undersøkeren å vurdere hvordan endringer i ARM aktivitet innvirkning ventilasjon og for å bestemme når emnet er i ro eller i bevegelse. En stor fordel med denne metoden er at den kan utføres i våken, oppfører mus, mens noen alternative metoder for å måle EMG kreve anestesi og / eller terminale fremgangsmåter 11, 12, 13. Opptaket av EMG-aktivitet i våkne mus over tid, kan også oppnås via det kronisk implantering av EMG leder, hvor musen er bundet ved hjelp av tråder til innsamlingssystemet 14, 15. Fordi tjoring en mus kan forstyrre normal bevegelse eller oppførsel, og kan ikke være kompatibel med et standard pletysmografi kammer, benytter den beskrevne fremgangsmåten telemetrianordninger til å trådløst sende EMG-signal til innsamlingssystemet. Den kan senderenvære slått på eller av med en magnet for å spare batteristrøm og tillater gjentatte målinger av EMG-aktivitet i løpet av flere måneder. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å måle aktiviteten av ytterligere luft eller ikke-respiratoriske muskler ved å innsette EMG fører inn i forskjellige muskler. Alternativt, kan en av de to ledere brukes til å måle EEG-aktivitet for å vurdere hviletilstand, eller for å identifisere anfallsaktivitet 16. Denne teknikken har med hell blitt brukt til å måle endringer i ARM aktivitet i ro over hele sykdomsutvikling i en musemodell av ALS, og for å identifisere viktige neuroner drivarmen aktivitet i friske mus 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Cincinnati Children Hospital Medical Center Institutional Animal Care og bruk komité og utført i samsvar med Guide NIH for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Forberedelse til Telemetri Device Implant Surgery
- Ta på personlig verneutstyr (dvs. skrubb, skoovertrekk, kjole, hår netto, maske, og kirurgiske hansker).
MERK: Denne operasjonen krever et sterilt felt. - Slå på inkubator (servostyrt luftfukter / spedbarn inkubator innstilt på 29 ° C) og den linje med tørre, hvite håndklær for å oppnå tilstrekkelig oppvarming for utvinning.
- Før kirurgi, sterilisere alle kirurgiske instrumenter med etylenoksyd og sterilisere senderen med en enzymatisk vaskemiddel og kjemisk steriliseringsmiddel (eller som angitt av produsenten) før bruk.
MERK: Kirurgiske instrumenter bør omfatte # 2 laminektomi tang (standard tips / straight / 12 cm) (x4), smalmønster tang (sagtakket / krummet / 12 cm), vevs-separering saks (rett / butt-butt / 11,5 cm), og en skalpell og holder bladet. Det er anbefalt å ha et separat sett av steriliserte instrumenter (to # 2 tenger og sakser) reservert utelukkende for behandling av trådene i senderen for å holde kirurgisk verktøy i god stand. - Sterilisere alle overflater i operasjonsområdet med en akseptabel desinfeksjonsmiddel. Plasser en stereo disseksjon mikroskop, isofluran bedøvelse maskin, kirurgiske verktøy, og clippers i det kirurgiske feltet (se tabell for material).
- For å opprettholde den musekroppstemperaturen mens under bedøvelse, plassere en varmepute eller teppe vann under sterile håndkle foran den stereo diseksjonsmikroskop.
- Sørge for at senderen er fullt ut funksjonell før bruk.
MERK: En liten magnet plassert innenfor 2 i fra senderen vil slå apparatet på og av. Når senderen er på, og holdt nær en raDIO satt til 500 Hz AM frekvens, vil den avgi et kontinuerlig, høyfrekvent summende lyd. For å spare batteriet, slår batteriet av før implantere det i dyret. - Forbered elektroden fører før kirurgi ved trimming kan de fjerne avledningene med saks som er reservert for håndtering av kabler, slik at det er omtrent 3 cm av bly (nok til å nå den aktuelle muskelen) (figur 1A). Alternativt spole ledningene proksimalt innretningen og knytte dem sammen med sting, slik at det er omtrent 3 cm av uncoiled bly.
MERK: Lagre trimmet-off del av elektroden fører for å fremstille "lead caps" (plast isolert foringsrør), som beskrevet i trinn 1.9. I trinn 3, vil senderen ledningene føres inn gjennom muskelen, så og den distale, eksponert del av trådene må holdes på plass og isolert ved hjelp av bly caps. - Bruke en skalpell for å klippe av 0,5 cm av plastbelegget uten å kutte selve wiren. Bruk verktøyene reservert foR-kabelen håndtering for å strekke endene av ledningene 4 - 5 ganger sin opprinnelige lengde, slik at de passer lett i en 25-gauge nål (figur 1 B-B ''). Trimme den eksponerte ledning av ledningene slik at de er 0,5 cm i lengde.
- Forbered bly hetter (plastrørene for å dekke trådendene) før operasjonen. Bruke en skalpell for å klippe av 0,25 cm lange rør fra den plastikkbeholder som omgir de deler av elektrodeledningene er lagret fra trinn 1.7.
MERK: Fire ledehetten er nødvendig for hver mus som vil gjennomgå implantering, men det er best å fremstille to ganger den nødvendige mengde caps. Å ha flere sterile fremstilte bly hetter er nyttig i tilfelle å sikre en fremre hette, hver ikke er vellykket ved første forsøk. - Spill serienummeret til det innsatte senderen og lagre den originale emballasjen med den kalibrerte informasjonen. Hver sender har ulike frekvens kalibreringer for EMG-registrering; angir disse i anskaffelse programvare for å oppnå akseptabel EMGinnspillinger.
2. Klar Mouse for kirurgi
- Velge den ønskede mus for implantering (dvs. SOD1 (G93A) eller kontroll) og veie dyret.
MERK: Anbefalt alder og vekt for en mus (mann eller kvinne) som gjennomgår denne operasjonen er P56 - P120 og ≥ 24 g, henholdsvis. - Bedøve mus enn 3,5% isofluran med et 2 l / min oksygen strømningshastighet. Utfør en tå klype og en hale knipe for å sørge for at musen er fullt bedøvet.
- Når de var bedøvet, fjerner mus fra rulleboksen og opprettholde anestesi via en nesekonus ved å sette isofluran nivå til 1,5% og oksygenstrømningshastigheten til 1 l / min. Utføre en tå klype og / eller hale knipe for å sørge for at anestesi opprettholdes.
- Smør oftalmisk salve for å hindre at øynene tørker ut under operasjonen.
- Barbere mus for å eksponere et operasjonssted mellom øret og skulderen (figur 1C).
- Alternativ swabbing kirurgiske området, først med desinfeksjonsmiddel og deretter med isopropanol. Gjenta 2 ganger.
3. Implantere Telemetri enhet til Record Scalene og Trapezius EMG aktivitet
- Plasser dyret under en diseksjonsmikroskop, på høykant på toppen av en steril pute som dekker en varmepute, og sikre nesekonusen på plass med tape. Merk at det er best å implantere høyre side for å redusere EKG signal som kommer fra hjertet.
MERK: Overvåk pust og justere isofluran nivåer, om nødvendig, for å opprettholde et vanlig respirasjonsfrekvensen og hensiktsmessig kirurgisk plan for anestesi. - Trekk forbena mot ipsilaterale fots langs torso.
MERK: Denne stillingen fortrenger scapula caudally, som gir kirurgisk tilgang til scalene og trapezius muskler.- Ta de butte Buede tenger, holder tilbake den foran labben ipsilaterale til det kirurgiske området, og tape poten på plass (figur 1C). Bruk sterkt lim kirurgisk tape for å være sikker på at labben er sikker for varigheten av prosedyren.
- Sett på et nytt par av kirurgiske hansker. Bruk skalpell for å lage en skrå innsnitt, ca. 2 cm lange, mellom skulderen og øret (rød linje i figur 1C).
- Ved å bruke to # 2 laminektomi tang, en i hver hånd, trekker tilbake til fettstykker og spredt fra hverandre trapezius og platysma muskler for å eksponere båndet dekker sternocleidomastoid og scalene muskler (figur 1D og E).
- Bruk blek sternocleidomastoideus og phrenic nerve som landemerker til å identifisere scalene muskler. Merk at phrenic nerve går parallelt med scalene muskler, mens sternocleidomastoid ligger inferior. Scalene muskler, løper på skrå fra den halsvirvler til ribbene under trapezius. Biopotential leder vil bli satt inn i den fremre scalene muskel, som kan identifiseres som den muskel som går ved siden av phrenic nerven (figur 1F og G).
MERK: Forsiktig. Dette området er svært vaskularisert, og omsorg må tas for å unngå å kutte arteria subclavia. Unngå å skade phrenic nerve og plexus brachialis. - Når scalene og trapezius muskler har blitt identifisert (figur 1G), gjøre en subkutan lomme for senderen på ryggen til dyret, mellom scapulas.
- Bruk vev-separering saks, setter de butte tuppen av saksen like under huden og spre dem til en lomme åpning som er omtrent 1,25x bredden av senderen blir dannet (figur 1 H).
MERK: Transmitteren skal settes inn med minimal motstand, men den pocket bør ikke være så stor at senderen kan flytte på egen hånd. Hvis lommen er for liten, kan senderen gni mot huden og forårsake irritasjon som kan be dyret for å lage riper i huden og / eller trekke ledningene ut. Hvis lommen er for stor, kan seromas danne, eller transmitteren kan migrere til en ugunstig stilling.
- Bruk vev-separering saks, setter de butte tuppen av saksen like under huden og spre dem til en lomme åpning som er omtrent 1,25x bredden av senderen blir dannet (figur 1 H).
- Spyl med varm, steril saltløsning og sette senderen med den flatere side mot muskelen. Plasser den transmitteren slik at den ligger flatt og trådene rager ut fra lommen, er parallelle med hverandre i stedet for å vridd (figur 1I). Krølle en hvilken som helst overskytende lengde av kabelen under det utstyret og legge den flat.
- Kjør fører fra senderen til scalene og trapezius muskler, slik at de to sett av bipotential ledningene ligger flatt og parallelt med hverandre.
- Bruk laminektomi pinsett for å skille det fremre scalene fra de omgivende muskler og sette inn en 25-gauge nål gjennom scalene muscle, vinkelrett på muskelfibrene.
- Sett fører man inn i spissen av nålen, og deretter trekke nålen ut av muskelen, etterlater den settes inn i muskelen opp til isoleringen av tråden (Figur 1J og K) bly. Record som fargede ledninger er ført inn i hvilken muskel.
- En liten dråpe av cyanoakrylat klebemiddel på den eksponerte enden av ledningen, i nærheten av muskelen, hvor ledningen føres inn, og raskt skyver blyproppen over ledningen, slik at ingen ledning blir eksponert mellom den fremre hette og muskelen (figur 2A og B).
MERK: Selv om det er en akseptert praksis for å sikre EMG fører med cyanoakrylat 17, 18, er en alternativ metode for å feste den fremre hette på plass ved å knytte en silkesutur knute rundt den. - Trim overflødig ledning distalt til hetten og anvende en dråpe cyanoakrylatlim til enden av blyproppen / wire. Gi limettid til å polymerisere før den slippes (figur 2C og D).
- Følge den samme fremgangsmåten (trinn 3,10 til 3,12) for å sette den motsatte polaritet fører parallell med den første på samme muskel, 1 - 2 mm bort fra den første leder.
- Gjenta trinn 3,10 til 3,12 for å sette ledningene inn i trapezius, som ligger like anteriore til scalene muskel (figur 1 L og M).
- Sørge for at trådledere er festet på plass og at det er akkurat nok slakk i ledningene for dyret til å utføre bevegelser uten å trekke i ledningene. Sørge for at enhver overskytende lengde av bly ikke presse mot huden, da dette kan føre til irritasjon som kan be dyret for å ripe eller trekke ledningene ut. Flytt ledningene, om nødvendig, for å forhindre en eventuell ubehag.
- Fjern forsiktig tapen holder nede forbena. Trekk fettstykket tilbake over muskelen og bruke den til å dekke de innførte leder. Lukk snittet med cyanoakrylatlim ved ertede hudlapper sammen igjen slik at snittet kommer på linje. Klemme en del av de hudlapper sammen med de buede tang og anvende en liten linje med cyanoakrylatlim langs denne linjen.
- Injisere 0,1 ml av carprofen subkutant for å lindre postoperativ smerte mens dyret fremdeles er under anestesi.
MERK: Fortsett å administrere 0,1 ml av carprofen gang daglig i 1 - 2 dager etter operasjonen, og deretter etter behov etter det. - Fjern dyret fra forstykke-konus og plassere den i et rent bur i den forvarmede inkubatoren inntil dyret er våken og beveger seg rundt i buret frivillig. Holde dyret i inkubatoren i minst 15 minutter etterpå, å overvåke sine bevegelser og årvåkenhet.
4. Postoperativ Care
- Hus dyr separat etter operasjonen. Gi healing dyr med diett gel og en vannflaske.
- Overvåk dyret for første 30 min etter operasjonen. Sjekk på dyret minst hver time feller 5 timer etter operasjonen. I dagene etter operasjonen, sjekk minst to ganger daglig.
- Se for nekrose, infeksjon langs snittet og inne i kroppens hulrom med implantatet (dvs. varme, hevelse og rødhet), og serom dannelse.
MERK: Disse skiltene skje innen den første uken etter operasjonen. En frisk helbredet dyr en måned etter operasjonen er vist i figur 1 N. Selv om EMG-opptak kan gjøres umiddelbart etter implantering, ble dyrene gitt minst en uke for å helbrede før opptak EMG og pletysmografi, som EKG-signaler kan være høy umiddelbart etter implantering.
5. Innhente Samtidig elektromyografi og pletysmografi Signaler
- Slå på alt anskaffelse av utstyr, inkludert skjevhet flyt.
MERK: strømningshastighet for mus er vanligvis satt til 1,0 l / min. - Kalibrer-plethysmografi kammeret (e) ved hjelp av en strømningsmåler.
MERK: Med jevne mellomrom sjekke plethysmography chambers å sikre at selene ikke er sprukket eller ødelagt. Smør gummipakninger med et smøremiddel, slik som vakuumfett en gang i uken for å opprettholde god tilstand. - Inngangs senderen kalibrering som spesifisert av produsenten.
- Plassere musen i plethysmography kammeret i minst 1 time for å akklimatisere det forut for opptak av EMG og pletysmografi. Ved å benytte flere kammere, er det mulig å ta opp fra en mus, mens de neste musen er acclimating i et andre kammer. Ikke slå på senderen under akklimatiseringsperioden for å spare batteristrøm (figur 1O).
- Forut for opptak (men etter kalibrering), slå på senderen ved å plassere en sterk magnet innen 1 i av den implanterte dyr; et rødt lys på forsiden av mottakeren vil indikere når senderen er på.
- Begynn kjøpet ved hjelp av rullegardinmenyen merket "Erverv" og velg "Start Acquisition." Skjønt opptaket kan varighetenvariere fra forsøk, en typisk pletysmografi og EMG-registrering varer i 1 - 3 timer.
MERK: Senderen har en iboende samplingsfrekvens på 240 Hz. En raskere rate på 500 Hz er angitt i programvaren for å interpolere mellom punktene og for å tilveiebringe en jevnere bølgeform. Lavpassfilteret (som fungerer som et anti-alias-filter) og høypassfilteret i implantatet angir 1- til 50-Hz båndbredde for denne telemetrianordning. 60-Hz A / C forstyrrelser bidrar ikke til overskytende støy i EMG-signal fordi implantater er batteridrevet og dyret skjold implantatet og fører fra elektriske felt. Plethysmography, EMG, og video blir automatisk synkronisert i sanntid via oppkjøp programvare. - Når anskaffelse er avsluttet, slår senderen med en magnet og fjerne dyret fra kammeret.
- Dersom starter et opptak, rense kammeret, gå inn i den nye senderen kalibreringene fra det neste dyret, og begynne den andre opptak. Hvis finished med anskaffelse for dagen, slå av senderen, rengjør pletysmografi kammeret, og slå av alle innsamlingsutstyr og forspenningen strømmen.
Figur 1. Implantering av telemetri-enhet for å måle Respiratory muskel EMG. (A) sendere med to par av biopotential fører til måle EMG. Kablene kan trimmes til den ønskede lengde (bunn) eller kveilet og gjemt under senderen (øverst). (B) transmitter fører. (B') fører med trimmet-off plastisolasjon for å eksponere ledningene og for å gjøre bly caps (innfelt). (B '') fører med strenger som strekkes 4 - 5 ganger sin opprinnelige lengde. Ledninger må trimmes slik at de er 0,5 cm lang (ikke vist). (C) Mus forberedt for kirurgi, med barbert kirurgiske området og riktigplassert forpoten. Den røde stiplede linjen viser snittet området. (D) overflatemuskler plassert under fettpute og fascia, sett etter den første innsnitt. T = trapezius. S = sternocleidomastoid. P = platysma. Gul pil = phrenic nerve. (E) tegneserie diagram av muskler og phrenic nerve som er vist i (D). Tang skal brukes til å spre seg fra hverandre trapezius og platysma muskler for å nå de dypere scalene muskel, vist i (F) og (G). (F) Merker anvendt for å identifisere plasseringen av scalene og trapezius. Dette bildet viser subclavia arterie (hvit pil), phrenic nerve / brachial plexus (sort pil), og det blek sternocleidomastoideus (gul pil). (G) tegneserie som viser plasseringen av de dypere muskler (dvs. middel scalene, fremre scalene, og SCM), arteria subclavia, og phrenic nerve. Den bakre scalene er ikke synlig. Disse kan nås bare når superficial muskler (i D og E) er spredd fra hverandre. (H) Lage en lomme for den transmitteren ved hjelp av de butte spiss saks. (I) Innsatt transmitter i subkutan lomme, med de parallelle plassert ledningene som kommer ut fra lommen. (J) Innføring av 25-gauge nål inn i scalene, vinkelrett på muskelfibrene, for å lage en tunnel for tråden bly. (K) Begge ledninger er satt inn i scalene muskelen. Bly caps er plassert på enden og limt på plass. (L) Innføring av 25-gauge nål inn i trapezius-, vinkelrett på muskelfibrene, for å lage en tunnel for tråden bly. (M) Alle de fire ledninger ført inn i trapezius og scalene muskler og ligger flatt før lukking av snittet. (N) Fullstendig gjenvunnet mus, med senderen plassert subkutant på baksiden. (O) samtidig opptak av pletysmografi, muskel EMG-aktivitet, ennd video ved hjelp av en pletysmografi kammer (gul pil), telemetri mottakende pute (rød pil), og kameraet (sort pil), henholdsvis. En multifunksjons usymmetrisk strømning er forbundet med pletysmografi kammeret via et plastrør (blå pil) for å tilføre oksygen til mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sikring Lead Caps med Cyanoakrylat-lim. (A) Påfør en liten dråpe av cyanoakrylat-(lilla sirkel) til den utsatte ledningen av elektrodeledningen (E) ledning proksimalt til muskelen. (B) Raskt skyver fremstilte blyproppen (LC) på den utsatte ledningen over cyanoakrylatlim, slik at den fremre hette er plassert i direkte tilknytning til muskel. (C-) Skjær av en liten del av den distale enden av den fremre hette, og ledningen slik at det ikke er synlig elektrode tilstede som ikke er isolert med plast. (D) anvende en liten dråpe av cyanoakrylatlim til enden av den fremre hette. Fjern trimmet-off distale enden av den fremre hette, fra dyret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Analyse av ARM EMG og Plethysmography
- Åpne analyse programvare og gjennom filen av interesse (gå til "File" og velg "Åpne gjennomgangsfilen"). Filtrere EMG-signaler ved hjelp av en 30 Hz høypass-filter ved å høyreklikke på EMG spor, velger "Analyse attributter," markering "Advanced Attributter 1" tab, og endring av høypassfilteret til 30 Hz.
MERK: Dette filtreringstrinn fjerner ikke-diskriminere, lav-frekvensinformasjon. Isere områder med mus uten aktivitet ved visuell inspeksjon, basert på mangel på bevegelse i den synkroniserte videofilen og mangelen på store, uregelmessige trykkforandringer som følge av bevegelse i pletysmografi spor (rød boks i figur 3A); inaktivitet oppstår når musen er sover eller våken, men likevel. - Identifisere EMG anfall uavhengig for hver muskel.
- Rette opp og integrere det filtrerte EMG-signal i løpet av 30 ms (figur 4).
MERK: Siden mus puste med en hastighet på 3 Hz, er ved hvert åndedrag representert ved ca. 11 integrerte verdier. - Bestemme grunnlinjen EMG amplitude ved å midle de likerettede og integrerte verdier forbundet med EMG-signal i en periode på 3 sek når musen er inaktiv og pletysmografi spor viser eupnea (normal pusting) (figur 4).
- Identifisere "utbrudd" av aktivitet er definert av minst 3 påfølgende likerettede og integrerte verdier som er i det minste en 50% økning over basislinje EMG-signal (bestemt i trinn 6.3.2).
MERK: Tre påfølgende verdier representerer en 90-ms-vinduet, men noen kamper vil inneholde mer enn 3 verdier over terskelen og vil vare lenger enn 90 ms. - Bruk synkronisert video og plethysmography spor å utelukke anfall som oppstår under sukk (Figur 3B); sniffing (figur 3C); eller viljebestemt mus bevegelser, for eksempel hode dreiing eller stell.
- Gjenta trinn 6.3.1 - 6.3.4 for andre muskler.
- Rette opp og integrere det filtrerte EMG-signal i løpet av 30 ms (figur 4).
- Beregn bout frekvens for hver muskel. Record a) begynnelse og sluttid for hver inaktive periode, og b) den tid hver kamp oppstod ved anvendelse av de ovenfor nevnte kriterier. Sum totalt inaktiv tid. Dele den totale antall utbrudd av den totale min av inaktiv tid i løpet av innspillingen til å beregne bout frekvens.
- Bestemme om endringer i ventilasjon er assosiert med aktiveringen av den innspilte muscles.
- Velg respirasjonsdata parametre som skal måles (f.eks peak av innåndingsluft, tidevolum, minuttvolum, og åndedrag pr min).
MERK: Alle mulige valg kan bli funnet i P3 Setup nedtrekksmenyen under "avledede parametrene." - Identifiser åndedrag som oppstår i løpet av EMG-aktivitet anfall og pustebevegelsene som oppstår under EMG baseline-aktivitet (figur 4).
- Lag parser segmenter som strekker seg over pletysmografi åndedrag som er forbundet med EMG-aktivitet anfall og skaper uavhengige parserinnsatte segmenter som er forbundet med basislinje EMG-aktivitet. Sørg for å angi hvilken type analyse for å "parser Seg."
MERK: Dette valget er funnet i P3 Setup rullegardinmenyen under "Data Reduction Setup". - Markere begynnelsen av hvert parser segment med en hendelse ved å høyreklikke på den pletysmografi spor. Angi en bout inneholder parser segmenter som "Event 1" i rullegardinmenyen, og specify grunnlinjen parserinnsatte segmentene som "hendelse 2" for å skille de to klasser av segmenter.
- Under "Funksjoner" -menyen, lagre "Marks Section" og "Marks avledede data." Under data parser menyen, lagre "Analysert omtale Fil" og "Analysert avledede data."
Merk: De valgte respirasjon parametere for hver enkelt åndedrag er funnet i Marks avledede data ark i fanen merket "Derivations". - Sammenlign de respiratoriske parametrene for åndedrag som oppstår under ARM anfall (merket som Hendelse 1) i forhold til åndedrag som oppstår i løpet av linjeaktiviteten (markert som Hendelse 2) for å bestemme om muskelaktivitet er assosiert med endringer i ventilasjon.
- Velg respirasjonsdata parametre som skal måles (f.eks peak av innåndingsluft, tidevolum, minuttvolum, og åndedrag pr min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokoll ble benyttet for å implantere en telemetrianordning og å registrere scalene og trapezius EMG, WBP, og video av en SOD1 (G93A) ALS-modell mus. Perioder hvor dyret er inaktive (f.eks, ikke beveger seg) ble identifisert ved bruk av video-opptak og bekreftet ved mangel på bevegelse relatert aktivitet i WBP spor (figur 3A). Inaktive perioder inkludere tid brukt i REM eller ikke-REM søvn, så vel som tiden som brukes våken, men likevel (figur 3A). EMG-aktivitet i løpet av denne inaktive tiden ble notert som et anfall når minst 3 påfølgende likerettet og integrert (over 30 ms) verdiene hadde amplituder med minst en 50% økning over basislinje EMG-nivåer (figur 4). Anfall av aktivitet som oppstod i løpet av sukker eller sniffing (bestemt ved hjelp av pletysmografi), eller viljebestemte bevegelser (vurdert ved video) ble ekskludert fra analyse (figur 3B-C). SOD1 (G93A) mus ved early- til mid-symptomatisk trinn (tabell 1) oppviser anfall av øket ARM aktivitet i ro og som varer i en til flere innblåsninger (figur 4). Anfall av ARM aktivitet er sjeldne i pre-symptomatisk SOD1 (G93A) (Figur 3A) eller villtype-mus 10.
| Scene | Stat | Stage Onset | bakbenet Presentasjon |
| 0 | Pre-symptomatisk | <P100 | Ingen betydelige forskjeller i forhold til wildtypes. |
| 1 | sykdomsfase | ~ P100 | Bakbenet sammenbrudd når musen er opphengt fra halen. |
| 2 | pareser | ~ P120 | Hel eller delvis i bakbenet kollaps med utseende av tremor. | </ Tr>
| 3 | lammelse utbruddet | ~ P140 | Vanskeligheter med å gå, tå curling og / eller uthaling. |
| 4 | Avansert lammelse | ~ P150 | Minimal felles bevegelse, i bakbenet ikke blir brukt for bevegelse fremover. |
| 5 | terminal | ~ P160 | Mus klarer å rette seg fra side innen 30 sekunder. |
Tabell 1. nevrologisk Skårer for ALS-lignende sykdomsprogresjon i SOD1 (G93A) Mus.
Figur 3. Representant WBP og EMG Traces. (A - C) WBP og EMG av scalene og trapezius muskler fra en pre-symptomatisk SOD1 (G93A) mus (alder P98). (A) perioder hvor t Han dyret er i ro (rød boks) brukes for analyse. Spor utenfor det røde feltet viser store og uregelmessige topper i pletysmografi spor og muskelaktivitet i EMG-spor, typisk når et dyr er i bevegelse, som bestemmes av synkroniserte videosekvenser (ikke vist). Den røde boksen viser EMG spor mangler EMG anfall, karakteristisk for en pre-symptomatisk mus. (B) anfall av EMG-aktivitet forekommer ofte direkte forut et sukk (som vist i pletysmografi spor). Sukker er særpreget ved høy-amplitude inspirasjon, etterfulgt av dramatisk utløp. De sorte Arrowhead peker til en karakteristisk EKG-signal. (C) anfall av EMG-aktivitet forekommer ofte når musen er sniffing. Sniffing er reflektert i den pletysmografi trase ved en langvarig økning i både frekvens og amplitude over flere innblåsninger (samtidige med utbrudd av EMG-aktivitet).color = "# 0066CC"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. poeng anfall av EMG-aktivitet. (A og B) To eksempler på WBP, filtrert trapezius- EMG spor, og likerettet og integrert trapezius- EMG-signaler fra en symptomatisk SOD1 (G93A) mus (alder P126). Blå punkterte linjer angir referanse EMG nivå, bestemt ved å ta gjennomsnitt likerettet og integrert signaler over en periode på 3 sek. Røde stiplede linjer indikerer en 50% økning i amplitude i forhold til utgangspunktet EMG-aktivitet. En anfall av aktivitet er avsluttet når minst 3 påfølgende likerettede og integrerte verdier overskrider den 50% baseline terskel. Klikk her for å se alArger versjon av denne figuren.
| PIF (ml / s) | TV (ml) | MV (ml / min) | Breathing frekvens (åndedrag / min) | |
| Naturlige (n = 5) | 4.4 ± 0.7 | 0,27 ± 0,04 | 58 ± 13 | 223 ± 41 |
| Implantert (n = 4) | 4.1 ± 0.2 | 0,27 ± 0,11 | 56 ± 29 | 201 ± 32 |
| P-verdien | 0.439 | 1,000 | 0,893 | 0.410 |
| Verdier som vises reflektere gjennomsnitt ± SD. P-verdiene ble beregnet med en t-test. | ||||
Tabell 2. Sammenligning av respirasjon Mellom Naturlige (ikke Implantert) og implantert Trinn 4 SOD1 (G93A) Mus. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i topp av innåndingsluft (PIF), tidevolum (TV), minuttvolum (MV), eller åndedrag per min mellom de to gruppene. De angitte verdiene reflekterer middelverdien ± SD. P-verdiene ble beregnet med en t-test.
Gjentatte målinger av EMG og / eller WBP kan gjøres i den samme musen over flere måneder, med svært liten endring i EMG-signal eller grunnlinjen etter en 1- til 2 ukers hvileperiode etter kirurgi. Tidsforløpet er vanligvis begrenset av batteriets levetid og således vil bli bestemt av frekvensen og varigheten av de enkelte opptakene. Forskere bør være oppmerksom på at bivirkninger på grunn av den implanterte enheten kan forekomme. Musen kan trekke ut ledningene fra den implanterte muskelen eller ripe / tygge på huden hvis ledningene eller overføreter er feilaktig plassert. I de fleste tilfeller, etiske hensyn tilsier at disse dyrene bli ofret. Senderen kan fjernes, sterilisert, og re-implantert i en annen mus.
For å bekrefte at enheten implantasjon påvirker ikke puster, ble pletysmografi målinger mellom naiv SOD1 (G93A) mus (ikke implantert) ved ALS stadium 4 og implanteres SOD1 (G93A) mus ved ALS stadium 4 sammenlignet. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i topp av innåndingsluft (PIF), tidevolum (TV), minuttvolum (MV), eller åndedrag per minutt mellom de to gruppene (Tabell 2). Scalene og trapezius er ved siden av hverandre og er direkte i kontakt med hverandre. Selv om samtidige EMG anfall er noen ganger observeres i begge musklene, er sterke EMG anfall også påvist i trapezius- når EMG-anfall er fraværende i scalene (og vice versa), som viser at det er minimal krysstale mellom elektroder implantert in hver muskel. Uavhengige anfall av EMG-aktivitet er også observert når ledningene er plassert i trapezius- og sternocleidomastoidmuskelen (data ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren vist her gjør det mulig for den ikke-invasive (etter innledende kirurgisk implantering av senderen) måling av luftveiene muskelaktivitet og ventilasjon over mange måneder i det samme dyr. Denne teknikk har flere fordeler fremfor vanlige EMG-teknikker i bedøvede mus: 1) eksperimentene krever færre mus og gi muligheten til å registrere data fra det samme sted i et enkelt mus på tvers av sykdomsstadier (i stedet for å bruke flere mus ved forskjellige sykdomsstadier); 2) dataanalyse kan utføres med mer kraftfulle statistiske tester (dvs., ved å bruke gjentatte målinger i stedet for å sammenlikne forskjellige forsøksgrupper); 3) den samtidig registrering av EMG og WBP gjør det mulig for den direkte vurdering av effektene av ARM aktivitet på ventilasjon; og 4) de eksperimenter kan utføres på mus i forskjellige tilstander av søvn / våken tilstand. Dessuten, fordi friske mus har en meget lav frekvens på anfall ARM i ro, er denne teknikken ca.Pable for å påvise selv små endringer i frekvens av ARM aktivitet i ALS-modell mus ved begynnelsen av symptomatiske sykdomsstadier 10. Imidlertid, fordi denne teknikken måler aktiviteten av et stort, men ukjent antall muskelfibre i løpet av naturlig oppførsel, snarere enn etter nervestimulering ved eksperimentelt kontrollerte intensiteter, er det ikke egnet for estimering av motorenheten størrelse eller antall. En annen begrensning er at telemetri-sendere som er egnet for implantering i mus For tiden er det to sett av biopotential ledninger; således kan bare to områder tas opp fra den samme mus. For forsøk som krever samtidig registrering av mer enn to muskler på samme mus, kan flere EMG fører implanteres og forbundet med et innsamlingssystem ved hjelp av en ledning tjor, som tidligere beskrevet 14, 15. Imidlertid vil endringer av pletysmografi kammer eller tetninger være nødvendig for å tillatefor samtidig registrering av muskelaktivitet og ventilasjon hvis en mus blir tjoret.
Ved bruk av denne teknikken, må visse trinn i protokollen utføres med forsiktighet. Biopotential fører må plasseres slik at de ikke hindrer bevegelse eller irritere den overliggende huden. I tillegg må senderen plasseres slik at den ikke påvirker den normale bevegelse eller stilling av musen. Det anbefales at riktig plassering av ledninger (dvs. fullstendig innleiret i riktig muskel og ikke å kontakte tilstøtende muskler) og mangel på muskelskader eller infeksjon er verifisert ved obduksjon etter at forsøket er avsluttet. Videre er det viktig at senderen er slått av etter hver innspilling økt for å spare batteriet.
En uunngåelig konsekvens av å måle EMG fra muskler i brystet og halsen er det høy sannsynlighet for opptak elektrokardiogram (EKG) signaler, som vises som gjengular toppene i EMG spor (figur 3B, pilspiss). EKG-signaler kan minimeres ved forsiktig plassering av ledningene slik at alt metall er innleiret fullstendig i muskel og ved å unngå plassering nær store blodkar. Implantere fører inn i musklene på høyre side av kroppen i stedet for mot venstre, noe som er nærmere kjernen, kan også redusere EKG-signaler. Selv EKG-signalet kan filtreres ut av EMG spor er ved hjelp av beregningsalgoritmer, eller ved å trekke fra en uavhengig EKG-signal 19, 20, 21, er det vanligvis ikke nødvendig. EKG-signalet kan lett skjelnes fra EMG-signal ved sin vanlige form, frekvens og amplitude.
Den beskrevne teknikken har blitt anvendt for å måle endringer i ARM aktivitet i ro i den SOD1 (G93A) musemodell for ALS 10. Tilbehørspustemuskulaturen er også rekruttert i othennes nevromuskulære sykdommer (f.eks, muskeldystrofi, spinal muskulær atrofi, perifere nevropatier, etc.) og etter nerve eller ryggmargskader. ARM aktivitet kan derfor tjene som en proxy for å måle funksjonell svekkelse av membranen og måle alvorlighetsgraden av sykdommen, overvåke gjenvinning fra skade, eller vurdere potensielle behandlingsfordeler for å forbedre pusting i en rekke forskjellige dyremodeller sykdom eller skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Støtte for dette arbeidet ble gitt av en Cincinnati Children Hospital Medical Center Tillitsmannen Award til SAC og en NIH trening stipend (T32NS007453) til VNJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J | Jackson Laboratory | 4435 | |
| Plethysmography Chamber | Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International | 601-1425-001 | |
| Telemetry Receivers (Model RPC-1) | Data Sciences International | 272-6001-001 | |
| Bias Flow Pump (Model BFL0500) | Data Sciences International | 601-2201-001 | |
| ACQ-7000 USB | Data Sciences International | PNM-P3P-7002XS | |
| Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix | Data Sciences International | 271-0117-001 | |
| New Ponemah Analysis System | Data Sciences International | PNM-POST-CFG | |
| Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 | Data Sciences International | PNM-P3P-520 | |
| Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Configured Ponemah Software System | Data Sciences International | PNM-P3P-CFG | |
| Analysis Module (URP) | Data Sciences International | PNM-URP100W | |
| Universal Amplifier | Data Sciences International | 13-7715-59 | |
| Sync Board | Data Sciences International | 271-0401-001 | |
| Sync Cable | Data Sciences International | 274-0030-001 | |
| Transducer-Pressure Buxco | Data Sciences International | 600-1114-001 | |
| Flow Meter | Data Sciences International | 600-1260-001 | |
| Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit | Data Sciences International | 276-0400-001 | |
| Axis P1363 Video Camera | Data Sciences International | 275-0201-001 | |
| Terg-A-Zyme | Fisher Scientific | 50-821-785 | Enzyme Detergent |
| Actril | Minntech Corporation | 78337-000 | Chemical Sterilant |
| Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) | Leica | 10-450-508 | |
| Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator | OHMEDA Ohio Care Plus | 6600-0506-803 | |
| TL11M2-F20-EET Transmitters | Data Sciences International | 270-0124-001 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For handling wires |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) | Fine Scientific Instruments | 11223-20 | For surgery |
| Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm | Fine Scientific Instruments | 17003-12 | |
| Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge | Fine Scientific Instruments | 15124-12 | |
| Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm | Fine Scientific Instruments | 14072-10 | |
| Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm | Fine Scientific Instruments | 14058-11 | For cutting wires and clipping nails |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Scalpel Blade | Fine Scientific Instruments | 10010-00 | For preparing lead caps |
| Polysorb Braided Absorbable suture | Coviden | D4G1532X | For coiling transmitter leads |
| Gluture | Zoetis Inc. | 6606-65-1 | Cyanoacrylate adhesive |
| 3 mL Syring Slip Tip - Soft | Vitality Medical | 118030055 | |
| 25 G Needle (x2) | Becton Dickinson and Co. | 305-145 | |
| Cotton Tipped Applicators | Henry Schein Animal Health | 100-9175 | |
| Andis Easy Cut Hair Clipper Set | Andis | 049-06-0271 | Electrical Razor sold at Target |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | Anesthetic |
| Isopropyl Alcohol 70% | Priority Care 1 | MS070PC | |
| Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) | Butler Schein | 55482 | |
| Artificial Tears | Henry Schein Animal Health | 48272 | Lubricant Opthalmic Ointment |
| Vacuum grease | Dow Corning Corporation | 1597418 | |
| Water Blanket | JorVet | JOR784BN |
References
- Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
- Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
- Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
- Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
- Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
- Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
- Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
- Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
- Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
- Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
- Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
- Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
- Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
- Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
- Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
- Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
- Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).
