Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Upprepade mätningar av andningsmuskelaktivitet och Ventilation i musmodeller av neuromuskulära sjukdomar

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55599
* These authors contributed equally

Summary

Detta papper införs en metod för upprepade mätningar av ventilation och andningsmuskelaktivitet i en fritt beter amyotrofisk lateralskleros (ALS) musmodell under hela sjukdomsprogression med hela kroppen pletysmografi och elektromyografi via en implanterad telemetri-enhet.

Abstract

Tillbehör andningsmuskulaturen bidra till att upprätthålla ventilation när funktionen membran är nedsatt. Följande protokoll beskriver en metod för upprepade mätningar över veckor eller månader av tillbehöret respiratorisk muskelaktivitet samtidigt mäter ventilation i ett icke-sövda, fritt beter mus. Tekniken innefattar kirurgisk implantation av en radiosändare och insättning av elektroden leder in i scalene och trapeziusmusklerna att mäta elektromyogrammet aktiviteten hos dessa inspiratoriska muskler. Ventilation mäts genom hela kroppen pletysmografi, och djurförflyttningar bedöms av video och är synkroniserad med elektromyogram aktivitet. Mätningar av muskelaktivitet och ventilation i en musmodell av amyotrofisk lateralskleros presenteras för att visa hur detta verktyg kan användas för att undersöka hur andningsmuskelaktivitet förändras över tiden och att bedöma effekten av muskelaktivitet på ventilation. De beskrivna metoderna kan easily anpassas för att mäta aktiviteten hos andra muskler eller att bedöma tillbehör andningsmuskelaktivitet i ytterligare musmodeller av sjukdom eller skada.

Introduction

Tillbehör andningsmuskulaturen (vapen) öka ventilationen under tider av hög efterfrågan (t.ex. motion) och bidra till att upprätthålla ventilation när funktionen membran äventyras efter skada eller sjukdom 1, 2. Även om förändringar i funktion membranet har väl beskrivits i amyotrofisk lateral skleros (ALS) patienter och musmodeller 3, 4, 5, 6, mycket mindre är känt om aktiviteten eller funktionen av vapen i ALS. Men föreslog en studie som ALS-patienter som rekryterar vapen har en bättre prognos än de med liknande membran dysfunktion som inte gör det 7. Vidare är ARM aktivitet som är tillräcklig för andning i fall av membran förlamning 8. Dessa studier tyder på att strategier för att utökar ARM-funktionen kan förbättra breathing hos patienter som lider neuromuskulär sjukdom, ryggmärgsskada eller andra tillstånd där funktions membran är nedsatt. Men mekanismerna som styr ARM rekrytering andningen är i stort sett okända. Metoder för att mäta lungfunktion och förändringar i ARM aktivitet över tiden i djurmodeller av sjukdom eller skada krävs för att studera hur armarna rekryteras, samt att utvärdera behandlingar för att förbättra ARM rekrytering och ventilation. Dessutom kan den ökade aktiviteten av vapen som sammanfaller med den progressiva förlusten av funktion membran vara en användbar biomarkör för sjukdomsprogression i neuromuskulära sjukdomar som ALS 7, 9, 10.

Detta protokoll beskriver en metod för att icke-invasivt (efter den första operationen) och upprepade gånger mäta aktiviteten av andningsmuskulaturen och ventilation i vaket, beter möss. Synkroniserade inspelningar av elektromyografeny (EMG), hela kroppen pletysmografi (WBP), och video tillåter utredaren att bedöma hur förändringar i ARM aktivitet ventilation effekt och att bestämma när motivet är i vila eller rörelse. En stor fördel med denna metod är att den kan utföras i vaket, beter möss, medan några alternativa metoder för att mäta EMG kräver anestesi och / eller är terminala förfaranden 11, 12, 13. Inspelningen av EMG-aktivitet i vaken möss över tid kan också åstadkommas genom den kroniska implantation av EMG leder, där musen är tjudrad med trådar till förvärvssystemet 14, 15. Eftersom tjudra en mus kan störa normal rörelse eller beteende och kanske inte är kompatibla med ett standard pletysmografi kammare, använder den beskrivna metoden telemetrianordningar att trådlöst överföra EMG-signalen till inhämtningssystemet. Sändaren kanslås på eller av med en magnet för att spara på batteriet och gör upprepade mätningar av EMG-aktivitet under flera månader. Detta protokoll kan lätt anpassas för att mäta aktiviteten av ytterligare respiratoriska eller icke-andningsmuskler genom insättning av EMG leder in olika muskler. Alternativt kan en av de två ledningarna kan användas för att mäta EEG-aktivitet för att bedöma sömntillstånd eller för att identifiera anfallsaktivitet 16. Denna teknik har framgångsrikt använts för att mäta förändringar i ARM-aktivitet i vila under hela sjukdomsprogression i en musmodell av ALS och att identifiera viktiga neuroner drivarm aktivitet i friska möss 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimentella förfaranden godkändes av Cincinnati Barnsjukhus Medical Center Institutional Animal Care och användning kommittén och genomförs i enlighet med NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur.

1. Förberedelse för Telemetry Device implantat kirurgi

  1. Sätt på personlig skyddsutrustning (dvs scrubs, skoskydd, klänning, hårnät, mask och operationshandskar).
    OBS: Denna operation kräver ett sterilt område.
  2. Slå på inkubatorn (servostyrda befuktare / spädbarn inkubator inställd till 29 ° C) och linje den med torra, vita handdukar för att medge korrekt uppvärmningen för återvinning.
  3. Före operation, sterilisera alla kirurgiska instrument med etylenoxid och sterilisera sändaren med en enzymatisk detergent och kemiskt steriliserande (eller som anges av tillverkaren) före användning.
    OBS: Kirurgiska instrument bör innehålla # 2 laminektomi pincett (standard tips / rakt / 12 cm) (x4), smalmönster pincett (sågtandade / krökt / 12 cm), vävnadsavskiljande sax (rak / trubbig-trubbig / 11,5 cm), och en skalpell hållare och bladet. Det rekommenderas att ha en separat uppsättning steriliserade instrument (två # 2 pincett och sax) endast är avsedda för hantering av trådarna i sändaren för att hålla kirurgiska verktyg i gott skick.
  4. Sterilisera alla ytor inom operationsområdet med en acceptabel desinfektionsmedel. Positionera en stereo dissektionsmikroskop, isofluran anestesiapparaten, kirurgiska verktyg, och hårklippnings i det kirurgiska området (se tabell of Materials).
  5. Att upprätthålla musen kroppstemperaturen under anestesi, placera en värmedyna eller vatten filt under den sterila handduken framför den stereo dissektion mikroskop.
  6. Säkerställa att sändaren är fullt funktionell före användning.
    OBS: En liten magnet placeras inom 2 från sändaren blir enheten på och av. När sändaren är på och hålls nära en raDIO inställd på 500 Hz AM frekvensen, kommer den att avge ett kontinuerligt, högfrekvent surr buller. För att spara på batteriet, stäng av batteriet innan implantera det i djuret.
  7. Förbereda elektrodledningarna före operation genom trimning de distala leder med saxen reserverade för att hantera trådarna så att det finns ungefär 3 cm av bly (tillräckligt för att nå målet muskeln) (Figur 1A). Alternativt linda trådarna proximala till enheten och knyta ihop dem med suturer så att det finns ungefär tre cm av utrullade bly.
    OBS: Spara trimmas-off del av elektroden leder för att förbereda "bly caps" (plastisolerade hölje), som beskrivs i steg 1,9. I steg 3, kommer sändar ledningarna införas genom muskeln, så och den distala, exponerade delen av trådarna måste hållas på plats och isolerade med användning av bly mössor.
  8. Använda en skalpell för att trimma bort 0,5 cm av plasthöljet utan att skära själva tråden. Använd verktygen reserverade for trådhanterings att sträcka ändarna av ledningarna 4 - 5x sin ursprungliga längd, så att de passar lätt i en 25-gauge-nål (Figur 1B-B ''). Trimma den exponerade tråden av ledningarna så att de är 0,5 cm i längd.
  9. Förbereda bly kåpor (plaströr för att täcka trådändarna) före operation. Använda en skalpell för att trimma bort 0,25 cm-långa rör från plasthölje som omger segmenten i elektroden leder sparas från steg 1,7.
    OBS: Fyra ledande lock krävs för varje mus som kommer att genomgå implantation, men det är bäst att förbereda två gånger den nödvändiga mängden kapsyler. Som har ytterligare sterila förberedda bly caps är till hjälp i fallet att säkra en ledande lock misslyckas vid det första försöket.
  10. Anteckna serienumret av det införda sändaren och sparar originalförpackningen med den kalibrerade information. Varje sändare har olika frekvens kalibreringar för EMG inspelning; ange dessa i förvärvs programvara för att erhålla acceptabel EMGinspelningar.

2. Förbered musen för kirurgi

  1. Välja den önskade musen för implantering (dvs SOD1 (G93A) eller kontroll) och väga djuret.
    OBS: Den rekommenderade ålder och vikt för en mus (manlig eller kvinnlig) som genomgår denna operation är P56 - P120 och ≥ 24 g, respektive.
  2. Söva mus under 3,5% isofluran med en 2 L / min syreflödeshastigheten. Utför en tå nypa och en svans nypa för att se till att musen är helt bedövad.
  3. Gång sövda, ta bort musen från rutan släpp och upprätthålla anestesi via en noskon genom att ställa in isofluran nivån till 1,5% och syreflödeshastigheten till 1 l / min. Utför en tå nypa och / eller svans nypa för att se till att bedövningen bibehålls.
  4. Smörj ögon salva för att förhindra att ögonen från att torka ut under operation.
  5. Raka musen för att exponera ett kirurgiskt ställe mellan örat och skuldran (Figur 1C).
  6. Alternate badda operationsområdet, först med desinfektionsmedel och sedan med isopropanol. Upprepa 2 gånger.

3. Implantera telemetrienhet till Record scalene och Trapezius EMG aktivitet

  1. Placera djuret under ett dissektionsmikroskop, på sin sida på toppen av en steril dyna som täcker en värmedyna, och säkra noskonen på plats med tejp. Observera att det är bäst att implantera den högra sidan för att minska EKG-signalen som härrör från hjärtat.
    OBS: Övervaka andning och justera isofluran nivå, om nödvändigt, för att upprätthålla en regelbunden andningsfrekvens och lämplig kirurgisk plan av anestesi.
  2. Dra forelimb mot den ipsilaterala fots längs bålen.
    OBS: Denna position förskjuter skulderblad caudally ger kirurgisk tillgång till scalene och trapezius muskler.
    1. Ta trubbiga böjda pincett, hålla tillbaka framtass ipsilateralt till operationsområdet, och tejpa tassen på plats (Figur 1C). Använd starkt lim kirurgtejp för att säkerställa att tassen är säker under hela proceduren.
  3. Sätt på ett nytt par av kirurgiska handskar. Använda skalpell för att göra en sned incision, ca 2 cm långa, mellan skuldran och örat (röd linje i figur 1C).
  4. Med användning av två # 2 laminektomi pincett, en i varje hand, dra tillbaka fettkudden och sprida isär trapezius och platysma muskler att exponera fascia som täcker sternocleidomastoideus och oliksidig muskler (figur 1D och E).
  5. Använd den bleka sternocleidomastoideus och phrenic nerv som landmärken för att identifiera scalene muskler. Observera att phrenic nerven löper parallellt med scalene muskulaturen, medan sternocleidomastoideus ligger inferior. De scalene muskler löper snett från halskotor till revben under trapeziusmuskeln. Biopotential leder kommer att införas i den främre scalene muskel, som kan identifieras som den muskel som löper intill den nervus phrenicus (Figur 1F och G).
    OBS: Varning. Detta område är mycket vaskulariserad, och man måste vara försiktig för att undvika att skära subclavia artär. Undvika skador på phrenic nerv och brachial plexus.
  6. När väl scalene och trapeziusmusklerna har identifierats (Figur 1G), gör en subkutan ficka för sändaren på baksidan av djuret, mellan skulderbladen.
    1. Använda de vävnads separerande sax, för in de trubbiga spetsar saxen precis under huden och sprida dem tills en ficka öppning som är ca 1,25 gånger bredden hos sändaren är utformad (figur 1H).
      OBS: Sändaren ska sättas in med minimalt motstånd, men pocket bör inte vara så stor att sändaren kan röra sig på egen hand. Om fickan är för liten, kan sändaren skaver mot huden och orsaka irritation som kan uppmana djuret att repa huden och / eller dra leder ut. Om fickan är för stor, kan seromas bilda, eller sändaren kan migrera till en ogynnsam position.
  7. Spola med varm, steril saltlösning och sätt i sändaren med flackare sidan mot muskeln. Placera sändaren så att den ligger platt och trådarna kommer ut från fickan, parallellt med varandra i stället för tvinnad (figur 1I). Curl eventuellt överskott trådlängd under enheten och lägg det platt.
  8. Köra ledningarna från sändaren till scalene och trapeziusmusklerna så att de två uppsättningarna av bipotentiell leads ligga plant och parallellt med varandra.
  9. Använda laminektomi pincett för att separera den främre scalene från de omgivande musklerna och sätt i en 25-gauge nål genom scalene muscle, vinkelrätt mot muskelfibrerna.
    1. Infoga en leder in spetsen av nålen och sedan dra nålen ut ur muskeln, lämnar bakom ledningen införd i muskeln upp till isoleringen av tråden (Figur 1J och K). Record som färgade ledare förs in i vilken muskel.
  10. Placera en liten droppe cyanoakrylatlim på den exponerade änden av tråden, nära muskeln där ledningen är införd, och snabbt glida ledningen locket över tråden så att ingen tråd är exponerad mellan ledningslocket och muskeln (Figur 2A och B).
    OBS: Även om det är en accepterad praxis att säkra EMG leder med cyanoakrylat 17, 18, är en alternativ metod för att säkra sin ledning locket på plats genom att knyta en siden sutur knut runt den.
  11. Trimma överskottstråden distalt till locket och applicera en droppe cyanoakrylatlim till änden av ledningslock / tråd. Ge limmettid för att polymerisera innan du släpper (Figur 2C och D).
  12. Följer samma steg (steg 3.10-3.12) för att infoga den motsatta polariteten bly parallell med den första i samma muskel, 1 - 2 mm bort från den första ledningen.
  13. Upprepa steg 3,10-3,12 infoga leder in trapeziusmuskeln, som ligger strax anterior till scalene muskeln (figur 1L och M).
  14. Se till att kabeltrådarna är fixerade på plats och att det är precis tillräckligt slack i ledningarna för djuret att utföra kroppsrörelser utan att dra på ledningarna. Se till att någon överskottslängd av bly inte trycka mot huden, eftersom det kan orsaka irritation som kan uppmana djuret att repa eller dra leder ut. Flytta ledningarna vid behov, för att förhindra eventuella obehag.
  15. Försiktigt bort tejpen håller ned forelimb. Dra fettkudden tillbaka över muskeln och använda den för att täcka de införda ledningarna. Stänga snittet med cyanoakrylatlim genom retasflikarna huden ihop så att snittlinjerna upp. Nypa en del av flikama hud tillsammans med de böjda pincett och applicera en liten linje av cyanoakrylat-adhesiv längs denna linje.
  16. Injicera 0,1 ml av karprofen subkutant för att lindra postoperativ smärta medan djuret fortfarande är under anestesi.
    OBS: Fortsätt att administrera 0,1 ml karprofen en gång om dagen för 1 - 2 dagar efter operationen och sedan efter behov efter det.
  17. Ta bort djuret från noskonen och placera den i en ren bur i förvärmda inkubator tills djuret är vaken och flytta runt buren frivilligt. Hålla djuret i inkubatorn under minst 15 minuter efteråt, övervakning dess rörelser och vakenhet.

4. Postoperativ vård

  1. Hus djur separat efter operation. Ge helande djur med diet gel och en vattenflaska.
  2. Övervaka djur för första 30 minuter efter operationen. Kontrollera om djuret minst varje timme feller 5 timmar efter kirurgi. Under dagarna efter operation, kontrollera minst två gånger dagligen.
  3. Titta på för nekros, infektion längs snittet och i kroppshålan som innehåller implantatet (dvs värme, svullnad och rodnad) och serom bildning.
    OBS: Dessa tecken förekommer inom den första veckan efter operationen. En frisk läkt djur en månad efter operationen visas i Figur 1 N. Även om EMG inspelningar kan göras omedelbart efter implantation, djuren ges minst en vecka att läka innan inspelning EMG och pletysmografi, som ECG-signaler kan vara hög omedelbart efter implantation.

5. Förvärva Samtidig Elektromyografi och pletysmografi Signaler

  1. Slå på alla förvärv utrustning, inklusive fördomar flöde.
    OBS: Flödeshastigheten för möss är normalt satt till 1,0 l / min.
  2. Kalibrera pletysmografi kammaren (er) med användning av en flödesmätare.
    OBS: Kontrollera regelbundet pletysmografi chambers för att säkerställa att tätningarna inte är spruckna eller brutna. Coat gummitätningarna med ett smörjmedel, såsom vakuum fett en gång i veckan för att bibehålla sin gott skick.
  3. kalibrering Input sändare som anges av tillverkaren.
  4. Placera musen i pletysmografi kammare under minst 1 h för att acklimatisera den före inspelning EMG och pletysmografi. Att använda flera kamrar, är det möjligt att spela in från en mus medan nästa musen acclimating i en andra kammare. Slå inte på sändaren under acklimatisering period för att spara på batteriet (Figur 1O).
  5. Före inspelning (men efter kalibrering), slå på sändaren genom att placera en stark magnet inom en i av den implanterade djuret; en röd lampa på framsidan av mottagaren indikerar när sändaren är påslagen.
  6. Börja förvärv med hjälp av rullgardinsmenyn märkt "Acquisition" och välj "Starta Acquisition." Trots att inspelningstiden kanvarierar genom experiment, en typisk pletysmografi och EMG inspelning varar 1 - 3 h.
    OBS: Sändaren har en gränssamplingshastighet på 240 Hz. En snabbare på 500 Hz ligger i programvaran för att interpolera mellan punkter och för att ge en mjukare vågform. Lågpassfiltret (som tjänar som ett anti-alias filter) och högpassfiltret i implantatet specificera den 1- till 50-Hz bandbredd för denna telemetrianordning. 60-Hz A / C interferens bidrar inte till överskjutande buller i EMG-signalen eftersom implantaten är batteridrivna och djuret skyddar implantatet och leder från elektriska fält. Pletysmografi, EMG, och video synkroniseras automatiskt i realtid via förvärv programvara.
  7. När förvärvet är klar, stäng av sändaren med en magnet och ta djuret från kammaren.
  8. Om du börjar en annan inspelning, rengöra kammaren, anger i de nya sändar kalibreringar från nästa djur, och börja den andra inspelningen. Om finished med förvärvet för dagen, stänga av sändaren, rengör pletysmografi kammare och stänga av alla förvärv utrustning och bias flödet.

figur 2
Figur 1. Implantation av Telemetry anordning för att mäta Respiratory Muscle EMG. (A) Telemetry sändare med två par av biopotential leder för att mäta EMG. Leads kan trimmas till den önskade längden (botten) eller lindad och tucked under sändaren (överst). (B) sändare leder. (B') Leads med trimmas-off plastisolering för att exponera ledningarna och för att göra ledningslock (infälld). (B '') Leads med trådar sträckta 4 - 5x sin ursprungliga längd. Leads bör trimmas så att de är 0,5 cm lång (ej visad). (C) Mus bereddes för kirurgi, med det rakade kirurgiska platsen och korrektplacerad framtassen. Den röda streckade linjen visar snittet platsen. (D) Ytliga muskler belägna under fettkudden och fascia, sedd efter den initiala snittet. T = trapezius. S = sternocleidomastoideus. P = platysma. Gul pil = nervus phrenicus. (E) tecknad diagram av muskler och nervus phrenicus som visas i (D). Pincett bör användas för att föra isär de trapezius och platysma muskler för att nå djupare scalene muskeln, visas i (F) och (G). (F) Landmärken används för att identifiera platsen för scalene och trapezius. Denna bild visar den subclavia (vit pil), nervus phrenicus / plexus brachialis (svart pil), och den blek sternocleidomastoideus (gul pil). (G) tecknad som visar placeringen av de djupare muskler (dvs, mellan scalene, anterior scalene, och SCM), subclavia, och nervus phrenicus. Den bakre scalene syns inte. Dessa kan endast nås när superficial muskler (i D och E) är spridda isär. (H) Att göra en ficka för sändaren med användning av de trubbig spets sax. (I) Insatt sändare i den subkutana fickan, med de parallellt placerade ledningar som kommer ut från fickan. (J) Insättning av den 25-gauge nål i scalene, vinkelrätt mot muskelfibrerna, för att göra en tunnel för tråden bly. (K) Båda ledningar införda i scalene muskel. Bly lock placeras på slutet och limmas på plats. (L) Insättning av den 25-gauge nål i trapezius, vinkelrätt mot muskelfibrerna, för att göra en tunnel för tråden bly. (M) Alla fyra ledningar införda i trapezius och oliksidig muskler och ligger plant före stängningen av snittet. (N) utvinnes Helt mus, med sändaren placerad subkutant på ryggen. (O) samtidigt inspelning pletysmografi, muskel-EMG aktivitet, ennd video med en pletysmografi kammare (gul pil), telemetri mottagande dyna (röd pil), och kamera (svart pil), respektive. En multifunktions förspänning flöde är anslutet till pletysmografi kammaren via ett plaströr (blå pil) för att tillföra syre till musen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Säkra Lead Caps med Cyanoakrylatlim. (A) Applicera en liten droppe cyanoakrylat (lila cirkel) till den exponerade tråden i elektrodledningen (E) tråd proximalt till muskeln. (B) Snabbt glida den förberedda bly locket (LC) på den exponerade tråden över cyanoakrylatlim så att ledningen locket är placerat i direkt anslutning till muskeln. (C) Klipp bort en liten del av den distala änden av ledningslocket och tråd så att det inte finns någon exponerad elektrod present som inte är isolerad med plast. (D) Applicera en liten droppe cyanoakrylat-adhesiv till änden av ledningslock. Ta den trimmade-off distala änden av ledningen locket från djuret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Analys av ARM EMG och pletysmografi

  1. Öppna analysprogram och granska filen av intresse (gå till "File" och välj "Öppna recension file"). Filtrera de EMG-signaler med användning av en 30-Hz högpassfilter genom att högerklicka på EMG spår, välja "Analysera attribut," synliggöra "Advanced Attributes en" flik, och ändra högpassfilter till 30 Hz.
    OBS: Detta filtreringssteg avlägsnar icke-diskriminera, lågfrekvent information. Lokalisera områden från mus inaktivitet genom visuell inspektion baserad på brist på rörelse i den synkroniserade videofilen och avsaknaden av stora, oregelbundna tryckförändringar på grund av rörelse i pletysmografi trace (röd ruta i figur 3A); inaktivitet inträffar när musen sover eller vaken men ändå.
  2. Identifiera EMG skjutningarna oberoende för varje muskel.
    1. Rätta till och integrera den filtrerade EMG signal över 30 ms (figur 4).
      OBS: Eftersom möss andas med en hastighet av 3 Hz, är varje andetag som representeras av cirka 11 integrerade värdena.
    2. Bestämma baslinjen EMG amplituden genom medelvärdesbildning de likriktade och integrerade värden förknippade med EMG-signalen under en tid av 3 s när musen är inaktiv och pletysmografi trace visar eupnea (normal andning) (Figur 4).
    3. Identifiera "anfall" av aktivitet som definieras av minst 3 på varandra följande likriktas och integreras värden som är åtminstone en 50% ökning över baslinjen EMG-signalen (bestämd i steg 6.3.2).
      OBS: Tre på varandra följande värden representerar en 90 ms fönster, men vissa skjutningarna kommer att innehålla mer än 3 värden över tröskeln och kommer att pågå längre än 90 ms.
    4. Använda den synkroniserade video- och pletysmografi trace att utesluta anfall som sker under suckar (figur 3B); sniffning (fig 3C); eller vilje musrörelser, såsom head roterande eller trimning.
    5. Upprepa steg 6.3.1 - 6.3.4 för andra muskler.
  3. Beräkna bout frekvens för varje muskel. Post a) den starttid och sluttid för varje inaktiv period och b) den tid varje match inträffat med användning av ovanstående kriterier. Summera den totala inaktiva tiden. Dela upp det totala antalet anfall med den totala min av inaktiv tid under loppet av inspelningen för att beräkna skjutningen frekvensen.
  4. Bestämma om förändringar i ventilationen är associerade med aktiveringen av den inspelade muscles.
    1. Välja de respirationsparametrar som skall mätas (t ex högsta inandningsflöde, tidalvolym, minutvolym, och andetag per minut).
      OBS: Alla möjliga val kan hittas i P3 Setup rullgardinsmenyn under "Härledda parametrar."
    2. Identifiera de andetag som uppstår under EMG bout aktivitet och de andetag som uppstår under EMG baslinjeaktivitet (Figur 4).
    3. Skapa parser segment spänner pletysmografi andetag som är förknippade med EMG bout aktivitet och skapa oberoende parser segment som är förknippade med baslinjen EMG-aktivitet. Se till att ställa in vilken typ av analys "Parser Seg."
      OBS: Detta val finns i P3 Setup rullgardinsmenyn under "Data Reduction Setup".
    4. Markerar början av varje parser segment med en händelse genom att högerklicka på pletysmografi spår. Ange en bout innehåller parser segment som "Händelse 1" i rullgardinsmenyn och specify baslinjen parser segmenten som "Händelse 2" för att skilja de två klasserna av segment.
    5. Under menyn "Functions", spara "Marks Avsnitt" och "Marks härledda data." Under Data Parser menyn, spara "Analyserad Review File" och "Analyserad härledda data."
      OBS: De valda andningsparametrarna för varje enskild andetag finns i Marks härledda Datablad på fliken märkt "härledningar."
    6. Jämföra de respiratoriska parametrar för andetag som inträffar under ARM Bouts (markerade som Händelse 1) jämfört med andetag som inträffar under baslinjen aktivitet (markerad som Händelse 2) för att bestämma om muskelaktivitet är förknippad med förändringar i ventilation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den beskrivna protokollet användes för att implantera en telemetrienhet och för att registrera oliksidig och trapezius EMG, WBP, och video av en SOD-1 (G93A) ALS musmodell. Perioder då djuret är inaktiv (t ex inte rör sig) identifierades med användning av videoinspelning och bekräftades av avsaknaden av rörelser relaterad aktivitet i WBP trace (figur 3A). Inaktiva perioder inkluderar tid tillbringad i REM eller icke-REM-sömn, såväl som tid vaken men fortfarande (figur 3A). EMG-aktivitet under denna inaktiva tid bedömdes som en skjutningen när minst 3 på varandra följande likriktas och integreras (över 30 ms) värden hade amplituder med åtminstone en 50% ökning över baslinjen EMG-nivåer (figur 4). Anfall av aktivitet som inträffade under suckande eller sniffning (bestämd genom pletysmografi) eller vilje rörelser (bedöms av video) exkluderades från analys (Figur 3B-C). SOD1 (G93A) möss vid early- till mitten-symptomatisk stadier (tabell 1) uppvisar anfall av ökad ARM aktivitet i vila som varar i en till flera andetag (Figur 4). Anfall av ARM-aktivitet är sällsynta i pre-symptomatic SOD1 (G93A) (figur 3A) eller vildtyp möss 10.

</ Tr>
Skede stat Stage Onset bakdelen Presentation
0 Pre-symptomatic <P100 Inga anmärkningsvärda skillnader jämfört med wildtypes.
1 sjukdomsutbrott ~ P100 Bakbens kollaps när musen är upphängd från svansen.
2 Pares ~ P120 Fullständig eller partiell bakbens kollaps med uppkomsten av tremor.
3 förlamning debut ~ P140 Svårigheter att gå, toe curling och / eller fot dra.
4 advanced förlamning ~ P150 Minimal gemensam rörelse, bakben inte används för rörelse framåt.
5 slutsteget ~ P160 Mus oförmögen att räta upp sig från sida inom 30 sekunder.

Tabell 1. Neurologiska Poängsättning av ALS-liknande sjukdomsprogression i SOD1 (G93A) Möss.

figur 3
Figur 3. Representant WBP och EMG Traces. (A - C) WBP och EMG av oliksidig och trapeziusmusklerna från en pre-symptomatic SOD1 (G93A) mus (ålder P98). (A) Perioder när t han djur är i vila (röd ruta) används för analys. Spår utanför den röda rutan visar stora och oregelbundna toppar i pletysmografi spår och muskelaktivitet i EMG spår, typiskt när ett djur är i rörelse, som bestäms med synkroniserade videoinspelningar (ej visad). Den röda rutan visar EMG spår saknar EMG anfall, karakteristisk för en pre-symptomatic mus. (B) Bouts av EMG-aktivitet ofta uppträder direkt föregår en suck (såsom visas i pletysmografi spår). Suckar kännetecknas av hög amplitud inspiration följt av dramatisk utandning. De svarta pilspets pekar på en karakteristisk EKG-signal. (C) Bouts av EMG-aktivitet uppstår ofta vid musen sniffning. Sniffande återspeglas i pletysmografi spår av en långvarig ökning i både frekvens och amplitud över flera andetag (co förekommande med utbrott av EMG-aktivitet).color = "# 0066CC"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Scoring Bouts av EMG aktivitet. (A och B) Två exempel på WBP, filtrerades trapezius EMG spår, och likriktas och integrerade trapezius EMG-signaler från en symptomatisk SOD1 (G93A) mus (okänd P126). Blå prickade linjer indikerar baslinje EMG-nivå, bestämd genom medelvärdes likriktade och integrerade signaler över en tidsperiod av 3 s. Röda streckade linjerna indikerar en ökning 50% i amplitud över baslinjen EMG-aktivitet. En bout av aktiviteten registreras när minst 3 på varandra följande likriktas och integreras värdena överskrider baslinjen tröskeln 50%. Klicka här för att se alArger version av denna siffra.

PIF (ml / s) TV (ml) MV (ml / min) Andnings Frekvens (andetag / min)
Naiv (n = 5) 4,4 ± 0,7 0,27 ± 0,04 58 ± 13 223 ± 41
Implanteras (n = 4) 4,1 ± 0,2 0,27 ± 0,11 56 ± 29 201 ± 32
P-värde 0,439 1,000 0,893 0,410
Värden som visas återspeglar medelvärde ± SD. P-värden beräknades med en t-test.

Tabell 2. Jämförelse av respiration Mellan Naive (ej implanterad) och implanteras Stage 4 SOD1 (G93A) Möss. Inga signifikanta skillnader hittades i högsta inandningsflöde (PIF), tidalvolym (TV), minutvolym (MV), eller andetag per minut mellan de två grupperna. De värden som visas återspeglar medelvärde ± SD. P-värden beräknades med en t-test.

Upprepade mätningar av EMG och / eller WBP kan göras i samma mus över flera månader, med mycket liten förändring i EMG-signalen eller baslinjen efter en 1- till 2-veckors återhämtningsperiod efter operationen. Tidsförloppet typiskt begränsad av batteriets livslängd och således kommer att bestämmas av frekvensen och varaktigheten av de individuella inspelningar. Forskare bör vara medveten om att biverkningarna på grund av den implanterade enheten ibland kan förekomma. Musen kan dra ut ledningarna från den implanterade muskel- eller repa / tugga på huden om ledningarna eller överförater är felaktigt placerad. I de flesta fall, etiska överväganden diktera att dessa djur offras. Sändaren kan avlägsnas, steriliseras och åter implanteras i en annan mus.

För att verifiera att enheten implantation påverkar inte andas, var pletysmografi avstånd mellan naiva SOD1 (G93A) möss (ej implanteras) vid ALS stadium 4 och implanteras SOD1 (G93A) möss vid ALS stadium 4 jämförs. Inga signifikanta skillnader hittades i högsta inandningsflöde (PIF), tidalvolym (TV), minutvolym (MV), eller andetag per minut mellan de två grupperna (Tabell 2). Den oliksidig och trapezius är intill varandra och är direkt i kontakt med varandra. Även om samtidiga EMG bouts observeras ibland i båda musklerna, är starka EMG skjutningarna detekterades också i trapezius när EMG skjutningarna är frånvarande i scalene (och vice versa), vilket visar att det är minimal överhörning mellan elektroder implanteras in varje muskel. Oberoende anfall av EMG-aktivitet observeras också när ledningarna är placerade i trapezius och sternocleidomastoideus muskler (data ej visade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Proceduren visas här möjliggör icke-invasiv (efter initial kirurgisk implantation av sändaren) mätning av andningsmuskelaktivitet och ventilation under många månader i samma djur. Denna teknik har flera fördelar jämfört med vanliga EMG tekniker i sövda möss: 1) experimenten kräver färre möss och ger möjlighet att spela in data från samma plats i ett enda mus över sjukdomsstadier (i stället för att använda flera möss vid olika sjukdomsstadier); 2) analys av data kan utföras med mer kraftfulla statistiska tester (dvs., med användning av upprepade mätningar i stället för att jämföra separata experimentella grupper); 3) samtidig inspelning av EMG och WBP möjliggör direkt bedömning av effekterna av ARM aktivitet på ventilation; och 4) de experiment kan utföras på möss i olika tillstånd av sömn / vakenhet. Dessutom, eftersom friska möss har en mycket låg frekvens av ARM bouts i vila, är denna teknik capable att detektera även små ändringar i frekvensen av ARM-aktivitet i ALS modell möss vid tidiga symptomatiska sjukdomsstadier 10. Emellertid, eftersom denna teknik mäter aktiviteten av ett stort men okänt antal muskelfibrer under naturlig beteende, snarare än att följa nervstimulering vid experimentellt styrda intensiteter, är den inte lämplig för att uppskatta motorenhet storlek eller antal. En annan begränsning är att telemetri baserade sändare som är lämpliga för implantering i möss är för närvarande begränsade till två uppsättningar av biopotential ledningar; således kan endast två platser spelas in från samma mus. För experiment som kräver samtidig inspelning av mer än två muskler i samma mus, kan flera EMG ledningar implanteras och ansluten till ett inhämtningssystemet med hjälp av en tråd tjuder, som tidigare beskrivits 14, 15. Emellertid, skulle modifieringar av pletysmografi kammare eller tätningar erfordras för att tillåtaför samtidig inspelning av muskelaktivitet och ventilation om en mus är tjudrad.

Vid tillämpningen av denna teknik, måste vissa steg i protokollet utföras med omsorg. Biopotential leads måste placeras så att de inte hindrar rörelse eller irritera den överliggande huden. Dessutom måste sändaren placeras så att det inte påverkar den normala rörelse eller hållning av musen. Det rekommenderas att den korrekta placeringen av ledningar (dvs fullständigt inbäddade i rätt muskel och inte i kontakt intilliggande muskler) och bristen på muskelskada eller infektion verifieras genom obduktion efter experimentet har avslutats. Vidare är det viktigt att sändaren är avstängd efter varje inspelningssession för att spara på batteriet.

En oundviklig konsekvens av att mäta EMG från muskler i bröstet och halsområdet är den höga sannolikheten för inspelning elektrokardiogram (EKG) -signaler, som visas som regular spikar inom EMG trace (Figur 3B, pilspets). EKG-signaler kan minimeras genom noggrann placering av ledningarna så att all metall inbäddade fullständigt i muskeln och genom att undvika placering nära stora blodkärl. Implantera leads till musklerna på den högra sidan av kroppen snarare än den vänstra, som ligger närmare till hjärtat, kan också minska EKG-signaler. Även om EKG-signalen kan filtreras ut ur EMG spår med hjälp av beräkningsalgoritmer eller genom att subtrahera en självständigt inspelade EKG-signalen 19, 20, 21, är det inte typiskt nödvändigt. EKG-signalen kan lätt särskiljas från EMG-signalen genom dess regelbunden form, frekvens och amplitud.

Den beskrivna tekniken har använts för att mäta förändringar i ARM-aktivitet i vila i SOD1 (G93A) musmodell för ALS 10. Tillbehör andningsmuskulaturen också rekryteras othennes neuromuskulära sjukdomar (t.ex., muskeldystrofi, spinal muskelatrofi, perifera neuropatier, etc.) och efter nerv eller ryggmärgsskador. ARM aktivitet kan därför fungera som en proxy för att mäta funktionsnedsättning av membranet och mäta sjukdomens svårighetsgrad, övervaka återhämtning från skada, eller bedöma potentiella fördelar behandling för att förbättra andningen i en mängd olika djur sjukdom eller skada modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Stöd för detta arbete från en Cincinnati Barnsjukhus Medical Center förvaltaren Award till SAC och en NIH utbildningsbidrag (T32NS007453) till VNJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J Jackson Laboratory 4435
Plethysmography Chamber Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International 601-1425-001
Telemetry Receivers (Model RPC-1) Data Sciences International 272-6001-001
Bias Flow Pump (Model BFL0500) Data Sciences International 601-2201-001
ACQ-7000 USB Data Sciences International PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix Data Sciences International 271-0117-001
New Ponemah Analysis System Data Sciences International PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20 Data Sciences International PNM-P3P-520
Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20 Data Sciences International PNM-URP100W
Configured Ponemah Software System Data Sciences International PNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP) Data Sciences International PNM-URP100W
Universal Amplifier Data Sciences International 13-7715-59
Sync Board Data Sciences International 271-0401-001
Sync Cable Data Sciences International 274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco Data Sciences International 600-1114-001
Flow Meter Data Sciences International 600-1260-001
Magnet and Radio included in F20-EET Starter Kit Data Sciences International 276-0400-001
Axis P1363 Video Camera   Data Sciences International 275-0201-001
Terg-A-Zyme Fisher Scientific 50-821-785 Enzyme Detergent
Actril Minntech Corporation 78337-000 Chemical Sterilant
Stereo Dissecting Microscope (Model MEB126) Leica 10-450-508
Servo-Controlled Humidifier/Infant Incubator OHMEDA Ohio Care Plus 6600-0506-803
TL11M2-F20-EET Transmitters Data Sciences International 270-0124-001
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2)  Fine Scientific Instruments 11223-20 For handling wires
Dumont #2 Laminectomy Forceps - Standard Tips/Straight/12 cm (x2) Fine Scientific Instruments 11223-20 For surgery
Narrow Pattern Forceps- Serrated/Curved/12 cm Fine Scientific Instruments 17003-12
Spring Scissors - Tough Cut/Straight/Sharp/12.5 cm/6 mm Cutting Edge Fine Scientific Instruments 15124-12
Tissue Separating Scissors - Straight/Blunt-Blunt/11.5 cm Fine Scientific Instruments 14072-10
Fine Scissors - Tough Cut/Curved/Sharp-Sharp/9 cm  Fine Scientific Instruments 14058-11 For cutting wires and clipping nails
Scalpel Handle #3 World Precision Instruments 500236
Scalpel Blade Fine Scientific Instruments 10010-00 For preparing lead caps
Polysorb Braided Absorbable suture Coviden D4G1532X For coiling transmitter leads
Gluture  Zoetis Inc. 6606-65-1 Cyanoacrylate adhesive
3 mL Syring Slip Tip - Soft Vitality Medical 118030055
25 G Needle (x2) Becton Dickinson and Co. 305-145
Cotton Tipped Applicators Henry Schein Animal Health 100-9175
Andis Easy Cut Hair Clipper Set Andis 049-06-0271 Electrical Razor sold at Target
Isoflurane Henry Schein Animal Health 29404 Anesthetic 
Isopropyl Alcohol 70% Priority Care 1 MS070PC
Dermachlor 2% Medical Scrub (chlorohexidine 2%) Butler Schein 55482
Artificial Tears Henry Schein Animal Health 48272 Lubricant Opthalmic Ointment
Vacuum grease Dow Corning Corporation 1597418
Water Blanket JorVet JOR784BN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
  2. Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
  3. Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
  4. Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
  5. Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
  6. Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
  7. Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
  8. Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
  9. Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
  10. Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
  11. Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
  12. Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411 (2013).
  13. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
  15. Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
  16. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
  17. Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
  18. Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
  19. Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
  20. Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
  21. Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).

Tags

Medicin elektromyografi EMG pletysmografi telemetri andning ventilation respiratorisk muskel ersättning respiratorisk amyotrofisk lateral skleros ALS ryggmärgsskada fysiologi
Upprepade mätningar av andningsmuskelaktivitet och Ventilation i musmodeller av neuromuskulära sjukdomar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, V. N., Romer, S. H., Turner, More

Jensen, V. N., Romer, S. H., Turner, S. M., Crone, S. A. Repeated Measurement of Respiratory Muscle Activity and Ventilation in Mouse Models of Neuromuscular Disease. J. Vis. Exp. (122), e55599, doi:10.3791/55599 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter