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Immunology and Infection

Eine Methode, um die Wirksamkeit der Handwäsche für die Entfernung von auftauchenden infektiösen Pathogenen zu testen

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55604

Summary

Handwäsche ist weithin empfohlen, um Infektionskrankheit Übertragung zu verhindern. Allerdings gibt es wenig Hinweise darauf, welche Handwaschmethoden am effektivsten bei der Beseitigung von Infektionskrankheiten sind. Wir haben eine Methode entwickelt, um die Wirksamkeit von Handwaschverfahren bei der Entfernung von Mikroorganismen zu beurteilen.

Abstract

Handwäsche ist weithin empfohlen, um Infektionskrankheit Übertragung zu verhindern. Allerdings gibt es wenig vergleichbare Beweise für die Wirksamkeit von Handwaschverfahren im Allgemeinen. Darüber hinaus gibt es wenig Beweise, die Handwaschmethoden vergleichen, um festzustellen, welche am effektivsten bei der Beseitigung von infektiösen Pathogenen sind. Forschung ist erforderlich, um Beweise für die verschiedenen Ansätze zur Handwäsche, die bei Infektionskrankheiten Ausbrüche eingesetzt werden können, zu liefern. Hier wird eine Labormethode zur Beurteilung der Wirksamkeit von Handwaschverfahren bei der Entfernung von Mikroorganismen aus den Händen und deren Beharrlichkeit in Spülwasser beschrieben. Freiwillige Hände werden zuerst mit dem Testorganismus versetzt und dann mit jeder Handwaschmethode von Interesse gewaschen. Im Allgemeinen werden Surrogat-Mikroorganismen verwendet, um menschliche Probanden vor Krankheiten zu schützen. Die Anzahl der Organismen, die nach dem Waschen auf Freiwilligen Hände bleiben, wird mit einem modifizierten "Handschuhsaft" -Verfahren getestet: Die Hände werden in Handschuhe mit einem Elu gelegtEnt und werden geschrubbt, um die Mikroorganismen zu suspendieren und sie zur Analyse durch Membranfiltration (Bakterien) oder Plaque-Assay (Viren / Bakteriophagen) zur Verfügung zu stellen. Spülwasser aus der Handwäsche wird direkt zur Analyse gesammelt. Die Handwaschwirkung wird durch Vergleich des Log-Reduktionswertes zwischen Proben, die nach der Handwäsche zu den Proben ohne Handwäsche durchgeführt wurden, quantifiziert. Spülen Wasser Persistenz wird durch den Vergleich von Spülwasser Proben aus verschiedenen Handwäsche Methoden zu Proben gesammelt nach Handwäsche mit nur Wasser quantifiziert. Während diese Methode durch die Notwendigkeit begrenzt ist, Surrogat-Organismen zu verwenden, um die Sicherheit von menschlichen Freiwilligen zu bewahren, erfasst sie Aspekte der Handwäsche, die in einer In-vitro- Studie schwer zu replizieren sind und Forschungslücken über die Handwäsche-Wirksamkeit und die Beharrlichkeit von infektiösen Organismen beim Spülen füllt Wasser.

Introduction

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Handwäsche wird weithin empfohlen, um die Ausbreitung von Krankheiten zu verhindern, insbesondere diejenigen, die durch die fäkal-orale oder luftgetragene Route, einschließlich Durchfall und Atemwegserkrankungen übertragen werden 1 . Überraschenderweise gibt es wenig vergleichbare Hinweise auf die Wirksamkeit von Handwaschmethoden wie Handwäsche mit Seife und Wasser (HWWS) und mit alkoholhaltigem Handdesinfizierer (ABHS), bei der Entfernung von Organismen aus den Händen. Erste Untersuchungen haben ergeben, dass die mechanische Wirkung der Handwäsche im Gegensatz zur Handwaschmethode für die meisten Organismusentfernung 2 , 3 verantwortlich ist. Darüber hinaus gibt es wenig vergleichende Beweise, auf denen Handwäsche-Methode am wirksamsten ist. In einer informellen Literaturrecherche wurden 14 Studien identifiziert, die die Wirksamkeit von Seifen- und Handdesinfektionsmittel bei der Entfernung von Organismen verglichen haben. Von diesen Studien, fünf fanden ABHS mehr wirksam 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , sieben fanden HWWS wirksamer 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , und zwei fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen den Methoden 16 , 17 . Diese Ergebnisse sind inkonsistent und behandeln nicht das anhaltende Risiko von Krankheiten aus der Beharrlichkeit von Organismen im Spülwasser nach Handwäsche. Insgesamt ist der Beweis für die vergleichende Wirksamkeit von Handwaschverfahren zur Entfernung von infektiösen krankheitserregenden Pathogenen begrenzt.

Dieser begrenzte Beweis hat zu Ungewissheit geführt, welche Methoden am besten in Ausbruch-Einstellungen geeignet sind. Beispielsweise, Während der Ebola Virus Disease (EVD) Ausbruch in Westafrika von 2013 bis 2016, mehrere große internationale Responder bieten widersprüchliche Empfehlungen für HWWS, ABHS oder 0,05% Chlor-Lösungen. Médecins Sans Frontières (MSF) empfiehlt die Verwendung von 0,05% Chlorlösung für die Handwäsche, während die Weltgesundheitsorganisation (WHO) HWWS oder ABHS empfiehlt (wenn die Hände nicht sichtbar verschmutzt sind). Die WHO geht so weit, zu erklären, dass Chlor nicht verwendet werden sollte, es sei denn, es sind keine anderen Optionen verfügbar, da es weniger wirksam ist als andere Methoden aufgrund der Chloranforderung, die von der Haut 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ausgeübt wird. Zusätzlich werden die Chlorlösungen üblicherweise aus vier verschiedenen Chlorverbindungen hergestellt, einschließlich Hochtest-Hypochlorit (HTH), lokal erzeugtem und stabilisiertem Natriumhypochlorit (NaOCl) und SodIum-Dichlorisocyanurat (NaDCC). Eine systematische Überprüfung, die von der WHO als Reaktion auf den EVD-Ausbruch in Westafrika in Auftrag gegeben wurde, fand vor kurzem nur vier Studien, die die vergleichende Wirksamkeit der Handwäsche mit Chlor 23 untersuchten. Diese Studien führten auch zu widersprüchlichen Ergebnissen, und keine dieser Studien verwendeten die empfohlene Chlorkonzentration von 0,05% für Handwäsche oder untersuchte Mikroorganismen ähnlich dem Ebola-Virus 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . So wurden die Empfehlungen nicht als evidenzbasiert eingestuft, und es war unklar, welche Empfehlungen am wirksamsten waren.

Zusätzliche Forschung ist erforderlich, um Handwäsche-Ansätze zu vergleichen, um die Ausbreitung von infektiösen Pathogenen zu verhindern, da Handwäsche-Interventionen ein wichtiges Instrument zur Verhinderung der Übertragung von Epidemieerkrankungen sind. Diese hUnd waschen Empfehlungen müssen auf Beweisen basieren. So wurde ein Verfahren zum Testen von Handwaschwirksamkeit und Spülwasser-Persistenz, durchgeführt mit Surrogaten oder nicht-infektiösen Pathogenen, entwickelt 2 , 28 , 29 . Beispielergebnisse, unter Verwendung von Phi6 als Surrogat für das Ebola-Virus und unter Verwendung von Escherichia coli als gemeinsamer Indikatororganismus, werden hier vorgestellt. In diesem Protokoll werden Handwaschwirksamkeit und Spülwasser-Persistenztests vorgestellt.

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Protocol

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Ethik-Statement: Die hier beschriebene Studie (auf Phi6 und E. coli als Surrogate für Ebola) wurde vom Institutional Review Board am Tufts Medical Center und dem Tufts University Health Sciences Campus (# 12018) genehmigt; Die Harvard University hat die Tufts Institutional Review Board überprüft.

HINWEIS: Vor dem Beginn dieses Protokolls müssen zwei Schritte abgeschlossen sein. Zuerst muss ein Biosafety Level 1 (BSL-1) Surrogat oder eine nicht-infektiöse Version des zu untersuchenden Erregers, der bei menschlichen Patienten sicher zu verwenden ist, identifiziert und ausgewählt werden. Für dieses Protokoll ist ein BSL-1-Surrogat oder ein nicht-infektiöser Erreger notwendig, da der Organismus dazu verwendet wird, die bloßen Hände menschlicher Freiwilliger zu impfen. Zweitens muss die Genehmigung des örtlichen Institutional Review Board, um Forschung mit menschlichen Fächern durchzuführen, vor der Rekrutierung von Freiwilligen oder Beginn des Experiments erhalten werden. Viele Aspekte dieses Protokolls können angepasst werden, um thSpezifische Bedürfnisse der Forschungsfragen von Interesse.

1. Rekrutierung von förderfähigen menschlichen Fächern

  1. Rekrutieren Sie Freiwillige, indem Sie Papierflieger auf öffentlichen Anschlagtafeln veröffentlichen und E-Mails an Gruppen mit Mitgliedern senden, die an der Teilnahme interessiert sein können. Diese Ankündigungen sollten die Studienzwecke, Kontaktinformationen und Förderkriterien enthalten.
  2. Treffen Sie mit den Freiwilligen, um die Förderfähigkeit zu bewerten. Bestätigen Sie, dass die Freiwilligen gesund sind, im Alter zwischen 18 und 65 Jahren, und derzeit nicht schwanger oder Antibiotika und dass sie keine Hautschäden / Störungen, bekannte Allergien an Handwaschmittel oder Geschichte der psychischen Gesundheit Fragen im Zusammenhang mit Hygiene haben.
  3. Haben förderungswürdige Freiwillige lesen Zustimmungsformulare. Beantworten Sie alle Fragen, die sie stellen und haben die Freiwilligen und Ermittler unterzeichnen zwei Kopien des Formulars. Halten Sie ein Formular und geben Sie dem Freiwilligen einen.
  4. Verwalten Sie eine Baseline-Umfrage, einschließlich Fragen zu demografischen Informationen, PersonAl Geschichte der Hauterkrankungen und Informationen über das aktuelle Handwaschverhalten. Untersuche die Hände für Anzeichen von Dermatitis, Hautverletzungen oder Baseline Hautanomalien 31 .
  5. Planen Sie die Freiwilligen für zwei Test-Sessions für jeden interessanten Organismus (eine für die Prüfung mit Bodenbelastung und eine für die Prüfung ohne). Weisen Sie die Freiwilligen an, antimikrobielle Produkte für eine Sieben-Tage-Auswaschperiode vor dem Testen zu vermeiden, um eine Verwechslung von der persönlichen Produktnutzung zu vermeiden.
    1. Geben Sie Freiwilligen mit antimikrobiellen Produkten (Shampoo, Conditioner und Seife), um anstelle ihrer üblichen Produkte zu verwenden. Geben Sie schwere Vinyl-Handschuhe und beauftragen die Themen, sie zu tragen, wenn sie Produkte wie Hausreinigungsprodukte verwenden.

2. Vorbereitung von Handwaschlösungen, die häufig in Notfallmaßnahmen verwendet werden (Seife, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC und NaOCl Lösungen)

HINWEIS: Chlorlösungen können vorbereitet werden Bis 12 h vor dem Experiment, aber wird abgebaut, wenn gespeichert> 12 h.

  1. Wählen und kaufen Sie eine Seife, die für den Kontext relevant ist, für den die Prüfung durchgeführt wird.
    ANMERKUNG: In den meisten Fällen, für Infektionskrankheiten Notfälle in den Entwicklungsländern, wird dies eine Seife sein.
  2. Wählen und kaufen Sie eine ABHS-Lösung, die für den Kontext relevant ist, für den die Prüfung durchgeführt wird.
    HINWEIS: Der gewählte ABHS sollte einen Ethylalkoholkontext haben, der größer oder gleich 70% ist, um die Wirksamkeit zu gewährleisten.
  3. Eine 0,05% ige Calciumhypochlorit (Ca (ClO) 2 ) -Lösung durch Zugabe von granulärem Ca (ClO) & sub2; -Pulver zu reinem Wasser zubereiten. Bestimmen Sie die benötigte Lösung, basierend auf der Anzahl der zu prüfenden Themen.
    1. Unter Verwendung der folgenden Gleichung wird die Menge an Pulver bestimmt, die erforderlich ist, um die gewünschte Menge an Lösung in einem gegebenen Wasservolumen unter Verwendung eines gegebenen Prozent des verfügbaren Chlors herzustellen:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      HINWEIS: Ca (ClO) 2- Pulver hat typischerweise 60-80% Chlor verfügbar.
  4. Vorbereitung einer 0,05% igen Natriumdichlorisocyanurat (NaDCC) -Lösung durch Zugabe eines körnigen NaDCC-Pulvers zu hochreinem Wasser.
    1. Unter Verwendung der folgenden Gleichung wird die Menge an Pulver bestimmt, die erforderlich ist, um die gewünschte Menge an Lösung in einem gegebenen Wasservolumen unter Verwendung eines gegebenen Prozent des verfügbaren Chlors herzustellen:
      Gleichung
      ANMERKUNG: NaDCC-Pulver hat typischerweise etwa 50% vorhandenes Chlor.
  5. Vorbereiten einer stabilisierten 0,05% NaOCl-Lösung durch Zugabe von Natriumhypochloritlösung zu hochreinem Wasser.
    1. Bestätigen Sie die Konzentration der NaOCl-Stammlösung (voraussichtlich 5-8%) mit einem Titrationstestverfahren gemäß den Anweisungen des Herstellers ( z. B. jodometrische Titration, siehe Materialliste für die suPasst).
    2. Unter Verwendung der Ergebnisse des Testverfahrens wird die Menge an Lösung berechnet, um Wasser unter Verwendung der folgenden Gleichung zuzusetzen:
      Gleichung
  6. Beruhigen Sie stabilisierte 0,05% NaOCl-Lösung durch Zugabe von Natriumhypochloritlösung, die unter Verwendung eines Elektrochlorinators, Reinstwasser und Labor-Natriumchlorid (NaCl) hergestellt wurde, um Reinstwasser zu erhalten.
    1. Eine 1% ige Chlorlösung mit Reinstwasser und NaCl unter Verwendung eines Elektrochlorinators gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereiten.
    2. Verwenden Sie eine Titrationstestmethode ( zB iodometrische Titration), um die Konzentration der NaOCl-Stammlösung 32 zu bestätigen.
    3. Unter Verwendung der Ergebnisse des Tests berechnen Sie die Menge an Lösung, um Wasser unter Verwendung der folgenden Gleichung hinzuzufügen:
      Gleichung
  7. Bestätigen Sie die c(Z. B. jodometrische Titration) und Einstellung der Lösungen durch Zugabe von Wasser oder Chlor-Pulver / -Lösung, bis sie innerhalb eines 10% igen Fehlers der Zielkonzentration (0,045-0.055%) liegen.

3. Bereiten Sie Organismen und Bodenbelastung vor und kombinieren Sie, um das Inokulieren zu produzieren

ANMERKUNG: In den folgenden Unterabschnitten werden E. coli und Phi6 als Probe bakterielle und virale Organismen für die Methodenbeschreibung verwendet.

  1. Bereiten Sie den Organismus vor, der für die Prüfung in einer Konzentration von mehr als 10 x 10 & sup8 ; CFU / ml für Bakterien und mehr als 10 x 10 & sup7; PFU / ml für Viren verwendet wird.
    1. Um E. coli vorzubereiten, einen nichtpathogenen Stamm von E. coli auf Luria-Bertani (LB) -Ararplatten zu streifen und bei 37 ° C für 24 h inkubieren, um einzelne Kolonien zu erhalten. Bei 4 ° C aufbewahren.
      HINWEIS: Dies kann getan werdenAl Tage vor dem Experimentieren.
      1. Einen Tag vor Beginn des Experiments, wähle eine einzelne Kolonie aus der Platte und geimpft 10 ml LB-Brühe mit einer sterilen Schleife. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln.
      2. Am Morgen des Experiments beginnen Sie eine frische Kultur, indem Sie 1 ml der Übernachtkultur zu 20 ml frischer LB-Brühe hinzufügen. Inkubieren für etwa 2,5 h, um eine Zelldichte von mehr als 10 8 CFU / ml zu erreichen.
      3. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Konzentration der Kultur zu schätzen.
        HINWEIS: Verwenden Sie einen zuvor festgelegten Umrechnungsfaktor aus einer Normenkurve für den verwendeten E. coli- Stamm, wobei eine Konzentration von mehr als 10 8 CFU / mL 33 gewährleistet ist. Wenn die Zelldichte nicht hoch genug ist, geben Sie die Kultur in den Inkubator zurück und testen Sie noch einmal, bis sie fertig sind.
    2. Bestimmen Sie die Konzentration mit der Membranfiltration 34 .
      HINWEIS: Serienverdünnungen durchführen oF die Kultur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), so dass die filtrierte Lösung eine abzählbare Anzahl von Kolonien auf der Platte erzeugt (die genaue Anzahl hängt vom verwendeten Medium ab).
      1. Eine Flamme und einen Filtrationsverteiler mit sterilen Filtrationsträgern und einem Vakuumanschluss aufstellen. Sterilisieren Sie die Zange, indem Sie sie mit Ethanol flammen. Verwenden Sie diese, um einen Filter von 0,45 μm auf den Filtrationsverteiler zu legen, wobei das Gitter nach oben zeigt. Nasse den Filter mit einer kleinen Menge steriler PBS.
      2. Den Trichter auf den Sockel stellen und die zu verarbeitende Probenlösung durch Pipettieren oder Gießen direkt auf den Filter geben. Das Vakuum betätigen, bis die gesamte Probe die Membran passiert hat. Spülen Sie die Seiten des Trichters mit sterilem PBS und betätigen Sie das Vakuum wieder.
        HINWEIS: Die Proben sollten mindestens 100 μl und bis zu 100 ml betragen. Wenn eine Probe weniger als 10 ml beträgt, fügen Sie vor dem Filtrieren etwa 20 ml PBS in den Filtrationstrichter hinzu, um eine gleichmäßige Filtration der Probe zu gewährleistenLe.
      3. Den Trichter entfernen, die Pinzette flammsterilisieren und den Filter von der Basis abheben. Setzen Sie den Filter vorsichtig auf den LB-Agar in einer Petrischale, wobei das Gitter nach oben zeigt, um sicherzustellen, dass der Filter bündig an der Oberfläche liegt. Die Platten umkehren und 24 h bei 37 ° C inkubieren.
      4. Nach 24 h, entfernen Sie die Teller aus dem Inkubator und zählen die E. coli Kolonien. Verwenden Sie diese Daten und den bekannten Verdünnungsfaktor und das Volumen der Lösung, um die Konzentration der gefilterten Lösung in CFU / ml zu berechnen.
    3. Propagate Phi6 in Pseudomonas syringae Wirt mit der Doppel-Agar-Overlay-Methode 35 .
      1. Füge 100 μl Phi6-Stammsäure und 100 μl P. syringae über Nacht Kultur direkt zu 6 ml Nährstoffbrühe Hefe (NBY) Weichagar (0,3%) hinzu. Gießen Sie es auf Platten mit NBY-Hartagar (1,5%) und inkubieren Sie über Nacht bei 26 ° C. Bereiten Sie genug Platten vor, um genügend Inokulum für den Versuch zu produzierenImit, Schätzung einer Ausbeute von etwa 4 ml Virus Suspension pro Platte.
      2. Am nächsten Tag füge 5 ml PBS auf die weiche Agarschicht hinzu. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 4 h, holen Sie es mit einer Pipette ab und filtrieren Sie es mit einem 0,45-μm-Filter. Bei 4 ° C aufbewahren.
        HINWEIS: Diese Lösung dient als virales Inokulieren.
    4. Verwenden Sie einen Plaque-Assay, um zu bestätigen, dass die Konzentration größer als 10 7 PFU / mL 35 ist . Führen Sie serielle Verdünnungen der Virus-Suspension in PBS durch, so dass 100 & mgr; l eine abzählbare Anzahl von Plaques auf der Platte erzeugt.
      1. 100 & mgr; l einer geeigneten verdünnten Probe und 100 & mgr; l über Nachtwirtskultur direkt in ein Röhrchen pipettieren, das 6 ml NBY-Weichagar enthält. Gießen Sie weichen Agar über NBY Hartagar und inkubieren bei 26 ° C für 24 h.
      2. Am nächsten Tag, entfernen Sie die Platten aus den Inkubatoren und zählen die Anzahl der Plaques pro Platte. Verwenden Sie diese Daten und die bekannte Verdünnung faCtor und Volumen der Lösung, um die Konzentration der gefilterten Lösung in PFU / ml zu berechnen.
  2. Bereiten Sie die dreiteilige Bodenbelastung vor, um menschliches Serum nachzuahmen.
    1. Kombinieren Sie 7,80 mg / ml Rinderserumalbumin, 10,92 mg / ml Trypton und 2,52 mg / ml Rindermucin, um das erforderliche Volumen an Bodenbelastung zu erzeugen. Nach dem Mischen der Bodenbelastung filtriere sie durch einen 0,22 μm-Filter zum Sterilisieren. Lagern Sie es bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Hitze sterilisieren nicht, da die Proteine ​​denaturieren werden.
  3. Vorbereitung einer 0,9% igen NaCl-Lösung zum Mischen der Impfung für Bedingungen ohne Bodenbelastung
  4. Unmittelbar vor dem Testen wird ein Inokulum aus 68% bakterieller oder viraler Suspension und 32% Bodenbelastung hergestellt. Verwenden Sie zum Beispiel 1,02 ml bakterielle oder virale Suspension aus den Schritten 3.1.1.2 oder 3.1.3.2 und 0.48 ml entweder Bodenbelastung (Schritt 3.2.1) oder 0.9% NaCl-Lösung (Schritt 3.3). Strudeln oder vortexen vorsichtig zu mischen.
    HINWEIS: 1,5 ml davonInokulum wird für jeden Freiwilligen unter jeder Bedingung verwendet werden, so stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen des vorbereiteten Inokulums für die beabsichtigte Anzahl von Tests ausreichend ist.

4. Vorbereitung von Freiwilligen für das Experiment

HINWEIS: Bestimmen Sie den Organismus und den Bodenbelastungszustand, der an diesem Tag getestet werden soll. Die gleichen Freiwilligen können zum Testen mehrerer Bedingungen verwendet werden, aber jeder Freiwillige sollte nur einer Testrunde innerhalb einer 48-Stunden-Periode unterzogen werden.

  1. Bevor Sie mit dem Testen beginnen, bestätigen Sie, dass die Freiwilligen förderungswürdig sind, indem sie mündlich verifizieren, dass sie die 7 Tage antimikrobielle Auswaschperiode einhalten und visuell bestätigen, dass sie keine Pausen oder Anomalien auf ihrer Haut entwickelt haben.
  2. Mit einem zufälligen Zahlengenerator, vergeben Sie jedem Freiwilligen, um entweder ihre rechte oder linke Hand für die Probenahme an diesem Tag der Prüfung zu verwenden. Weisen Sie einen Auftrag zu, in dem die Handwaschbedingungen durchgeführt werden.
    HINWEIS: FürBeispiel, ABHS kann # 3 zugeordnet werden und wird drittens durchgeführt.
  3. Führen Sie eine "Reinigungswäsche" einmal zu Beginn der Prüfung, um die Haut von Schmutz und Öle, so dass jeder nachfolgende Test unter äquivalenten Bedingungen durchgeführt wird.
    1. Um eine Reinigungswäsche durchzuführen, laufen Sie durch jeden Schritt des Experiments (Abschnitt 5, unten), mit einem leeren Inokulat (LB Brühe oder PBS nur) und nehmen eine Probe ohne Handwäsche.

5. Experimentelles Verfahren

  1. Um den pH-Wert der Haut eines jeden Freiwilligen zu kontrollieren (um eine Variation zu kontrollieren), legen Sie eine flache Haut-pH-Sonde auf die palmare Oberflächenhaut und den Bahnraum zwischen dem Zeiger und den mittleren Fingern. Achten Sie darauf, dass die Elektrode flach an der Haut liegt. Notieren Sie den pH-Wert.
  2. Spike die Hände.
    1. Habe die Freiwilligen beide Hände zusammen. Spike die Hände mit 1,5 ml des Impfes durch sorgfältige Pipettierung 750 μL langsam in jede Palme.
    2. Haben die Freiwilligen sanft ihre Hände zusammen, bis alle Oberflächen der Hand mit dem Inokulat beschichtet sind, während die Hände so wenig Reibung wie möglich ausgesetzt werden.
    3. Haben die Freiwilligen halten ihre Hände immer noch weg von ihrem Körper für weitere 30 s, damit die Impfung zu trocknen. Die Inokulation darf nicht vollständig trocknen.
  3. Waschen Sie die Hände.
    1. Für alle folgenden Waschschritte, fangen Sie das Spülwasser aus den Händen in einem großen Probensammelbeutel. Fügen Sie 4,5 ml einer 12% igen Natriumthiosulfatlösung in den Beutel hinzu, um das Chlor bei Kontakt zu neutralisieren und innerhalb von 2 h zu verarbeiten.
      HINWEIS: Natriumthiosulfat sollte zu allen Proben (auch ohne Chlor) zugegeben werden, um für irgendwelche Auswirkungen zu kontrollieren, die es auf den Organismus haben kann.
    2. Nach der Inokulation (Abschnitt 5.2) die Hände mit der nächsten Methode in der angegebenen Reihenfolge waschen.
      1. Für Control A nicht einen Handwaschschritt durchführen und direkt zum Schritt gehen5.5
      2. Bei Kontrolle B die Hände mit nur Reinstwasser bei Raumtemperatur (ca. 21 ° C) durch einen Trichter mit bekannter Durchflussmenge waschen.
        HINWEIS: Hier wurde eine Durchflussmenge von 1,5 l / m und 500 mL Wasser verwendet.
      3. Für die Handwäsche mit Seife, nass die Hände mit 10 ml ultrareines Wasser. Haben die Freiwilligen ihre Hände mit Seife schäumen und dann ihre Hände zusammen für weitere 20 s reiben. Spülen Sie ihre Hände, indem Sie 500 ml ultrareines Wasser bei Raumtemperatur durch einen Trichter mit einer Durchflussrate von 1,5 l / m gießen.
      4. Für alle Chlorlösungen ( zB ABHS, HTH, NaDCC und NaOCl) gießen Sie 200 ml Chlorlösung durch einen Trichter mit einer Durchflussmenge von 1,5 l / m und lassen den Freiwilligen die Hände gründlich reiben.
  4. Handspülen mit einem modifizierten Handschuhsaft Verfahren.
    1. Nach der Handwäsche sofort die Hand des Freiwilligen ( dh die Hand (rechts oder links) für testi auswählenNg in Schritt 4.2) in einen Probenbeutel mit 75 ml Elutionsmittel ( zB PBS) bis zum Handgelenk. Halten Sie die Oberseite des Beutels fest um das Handgelenk.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Eluent zur Probenahme, das ausreichend Natriumthiosulfat enthält, um jegliches Chlor, das für die Handwäsche verwendet wird, zu neutralisieren. PBS ist ein häufig verwendetes Elutionsmittel, das für viele Organismen geeignet ist.
    2. Haben die Freiwilligen sanft ihre Hand in die Lösung für 30 s reiben, wobei darauf achten, zwischen den Fingern und unter den Fingernägeln zu erreichen. Massieren Sie die Hand von außerhalb des Beutels sanft für 30 s, um sicherzustellen, dass die gesamte Hand gründlich im Elutionsmittel gespült wird, bis hin zum Handgelenk.
    3. Den Beutel abdichten und entsprechend dem in Abschnitt 6 beschriebenen geeigneten Assay innerhalb von 2 h verarbeiten.
  5. Dekontamination.
    1. Bevor Sie den Vorgang mit jeder Handwaschmethode wiederholen, lassen Sie die Freiwilligen ihre Hände gründlich in einer Spüle mit Seife und warmem Wasser waschen. Sprühen Sie die FreiwilligenRs 'Hände mit 70% Ethanol, bis sie auf beiden Seiten beschichtet sind. Lassen Sie sie trocknen.
    2. Wiederholen Sie alle Schritte in Abschnitt 5 für jede Handwäsche-Bedingung, nur mit der Hand, die in Schritt 4.2 zufällig ausgewählt wurde (Abbildung 1 ).

6. Quantifizierung

  1. Durchführen von Assays, die für den Organismus der Wahl geeignet sind ( z. B. Membranfiltration für Bakterien oder Plaque-Assay für Viren, wie oben in den Abschnitten 3.1.2 bzw. 3.1.4 beschrieben).
  2. Nach dem Zählen der Platten notieren Sie die geschätzten CFU / mL oder PFU / mL für jeden Test für die Analysen (Abschnitte 3.1.2 und 3.1.4).

7. Analyse

  1. Mit den Ergebnissen aus Schritt 6.2 berechnen Sie den Log-Reduktionswert von Organismen auf den Händen, für jeden Organismus und Bodenbelastungsstatus und für jede Subjekt- und Handwaschmethode.
    1. Für die Handwaschung Wirksamkeit, vergleichen Sie die Konzentration von Bakterien / Virus in jedem Handwaschprobe zur Kontrolle A (keine Handwäsche). Für Spülwasser Persistenz, vergleichen Sie jede Spülwasser Probe zu kontrollieren B (nur mit Wasser waschen). Verwenden Sie die folgende Standardformel:
      Log Reduzierung (Handwäsche ) = GleichungGleichung
      Log Reduktion (Spülwasser ) = GleichungGleichung
      HINWEIS: Die Protokollreduktion kann auch als log 10 ausgedrückt werden (ohne Handwäsche) - log 10 (mit Handwäsche)
  2. Verwenden Sie eine einmalige, wiederholte Messungsanalyse der Varianz (ANOVA), um die signifikanten Unterschiede in den berechneten Log-Reduktionswerten zwischen Handwaschmethoden und einem Post-hoc-Tukey-HSD-Test für signifikante Modelle zu beurteilen, um signifikante Unterschiede (p <0,05)Ef "> 36
    1. Vor dem Ausführen der ANOVA, bewerten Sie jeden Datensatz für Sphärizität ( zB mit Bartlett-Test). Eine Korrektur anwenden ( zB die Greenhouse-Geisser-Korrektur), wenn der Test darauf hinweist, dass Sphärizität verletzt wurde 37 .

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Representative Results

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Hier wurde das Protokoll (Abbildung 1 ) mit 18 Freiwilligen abgeschlossen, die jeweils mit E. coli und Phi6 getestet wurden. Es wurden signifikante Unterschiede zwischen den Handwasch-Ergebnissen mit E. coli sowohl mit als auch ohne Bodenbelastung und Phi6 mit Bodenbelastung gefunden (Abbildung 2 und Abbildung 3 ). Für E. coli ohne Bodenbelastung führte die Handwäsche mit HTH, NaDCC und stabilisiertem NaOCl zu deutlich signifikanten Reduzierungen als die Handwäsche nur mit Wasser (F (6.102) = 2,72, p = 0,034). Bei der Bodenbelastung führte HTH zu einer signifikant größeren Blockreduktion von E. coli als nur Wasser, HWWS und ABHS (F (6,102) = 3,94, p <0,001). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Methoden für Phi6 ohne Bodenbelastung (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). Für Phi6 mit Bodenbelastung (F (6,102) = 7,01, p <0,001) ergab das Wasser allein ein GreAter-Log-Reduktion als ABHS oder stabilisiertes NaOCl und HWWS in einer größeren Log-Reduktion als ABHS, stabilisiertes NaOCl und erzeugtes NaOCl. HTH hatte auch eine größere Log-Reduktion als ABHS und stabilisierte NaOCl, und NaDCC führte zu einer größeren Log-Reduktion als stabilisierte NaOCl und ABHS. Während HTH am weitesten konsequent über die Bedingungen hinweg war, würden wir vor einer Überinterpretation von signifikanten Ergebnissen vorsichtig sein, da viele Konfidenzintervalle groß waren und von weniger als 0,5 log bis mehr als 1,5 Log-Reduktion in vielen Fällen reichen.

In Spülwasser führte Chlor zu einer signifikant größeren Blockreduktion von E. coli , die im Spülwasser anhielt als HWWS (ohne Bodenbelastung, F (4,68) = 331,7, p <0,001, bei Bodenbelastung F (4,68 ) = 162,44, p <0,001) ( Fig. 4 ). Dieses gleiche Muster wurde in Phi6 ohne Bodenbelastung gefunden ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), wobei alle Chlorlösungen alsEine unwesentlich größere Reduktion von Phi6 in Spülwasser als HWWS. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Persistenz in Spülwasser mit Phi6 und Bodenbelastung ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) (Abbildung 5 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Erfahrungsübersicht Die fünf Schritte, die für jede Runde der Handwäsche durchgeführt werden, umfassen: 1) pH-Test, 2) Impfung der Hände, 3) Handwäsche, 4) Spülen der Hände und 5) Dekontaminierung der Hände für jede der acht getesteten Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: E. coli Handwäsche res Ults Im Vergleich zu keiner Handwäsche führten die getesteten Handwaschverfahren zu einer durchschnittlichen Protokollreduktion in E. coli von 1.94-3.01 ohne Bodenbelastung und 2.18-3.34 bei Bodenbelastung. Handwäsche mit Wasser zeigte die geringste Reduktion von E. coli bei beiden Bedingungen (1.94 und 2.18 log). Die Handwäsche mit NaDCC führte zu der größten Reduktion ohne Bodenbelastung (3,01) und HTH führte zu der größten Reduktion mit Bodenbelastung (3.34). In den Diagrammen stellt die Linie die prozentuale Verringerung der Organismen dar, und die Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Protokollreduktion dar. Ctrl B, Steuerung B; HWWS, Handwäsche mit Seife; ABHS, Alkohol-basierte Hand-Desinfektionsmittel; HTH, Hochtest-Hypochlorit; NaDCC, Natriumdichlorisocyanurat; St NaOCl, stabilisiertes Natriumhypochlorit; Gen NaOCl, erzeugtes Natriumhypochlorit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Abbildung 3
Abbildung 3: Phi6 Handwaschergebnisse. Im Vergleich zu keiner Handwäsche führten die getesteten Handwaschverfahren zu einer durchschnittlichen Protokollreduktion in Phi6 von 2,44-3,06 ohne Bodenbelastung und 2,71-3,69 bei Bodenbelastung. Die Handwäsche mit Seife zeigte die geringste Reduktion von Phi6 ohne Bodenbelastung (2.44) und die Handwäsche mit stabilisiertem NaOCl führte zu einer kleinsten Reduktion mit Bodenbelastung (2,71). Handwäsche mit erzeugtem NaOCl führte zu der größten Reduktion ohne Bodenbelastung (3,06), und Handwäsche mit Seife führte zu der größten Reduktion mit Bodenbelastung (3.69). In den Diagrammen stellt die Linie die prozentuale Verringerung der Organismen dar, und die Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Protokollreduktion dar. Ctrl B, Steuerung B; HWWS, Handwäsche mit Seife; ABHS, Alkohol-basierte Hand-Desinfektionsmittel; HTH, Hochtest-Hypochlorit; NaDCC, Natriumdichlorisocyanurat;St NaOCl, stabilisiertes Natriumhypochlorit; Gen NaOCl, erzeugtes Natriumhypochlorit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: E. coli Hand spülen Ergebnisse. Im Vergleich zur Handwäsche nur mit Wasser betrug die durchschnittliche Holzreduktion von E. coli im Spülwasser 0,28-4,77 ohne Bodenbelastung und 0,21-4,49 bei Bodenbelastung. Sowohl mit als auch ohne Bodenbelastung wurde die kleinste Reduktion bei der Handwäsche mit Seife (0,28 und 0,21) gefunden. Die stärksten Reduktionen wurden mit stabilisiertem und erzeugtem NaOCl ohne Bodenbelastung (beide 4.77) und mit HTH und erzeugtem NaOCl mit Bodenbelastung beobachtet. In den Diagrammen stellt die Linie die prozentuale Verringerung der Organismen dar, und die Fehlerbalken repräsentieren die sTandard Fehler der Protokollreduktion HWWS, Handwäsche mit Seife; ABHS, Alkohol-basierte Hand-Desinfektionsmittel; HTH, Hochtest-Hypochlorit; NaDCC, Natriumdichlorisocyanurat; St NaOCl, stabilisiertes Natriumhypochlorit; Gen NaOCl, erzeugtes Natriumhypochlorit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Phi6 Hand spülen Ergebnisse. Im Vergleich zur Handwäsche nur mit Wasser betrug die durchschnittliche Blockreduktion von Phi6 im Spülwasser 1,26-2,02 ohne Bodenbelastung und 1,30-2,20 bei Bodenbelastung. Bei Bodenbelastung wurde die kleinste Reduktion bei der Handwäsche mit Seife gefunden (1.26). Ohne Bodenbelastung führte HTH zu einer kleinsten Reduktion (2,02). Die größten Reduktionen wurden sowohl mit als auch ohne Bodenbelastung mit NaDCC beobachtet(2,02 und 2,20). In den Diagrammen stellt die Linie die prozentuale Verringerung der Organismen dar, und die Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Protokollreduktion dar. HWWS, Handwäsche mit Seife; ABHS, Alkohol-basierte Hand-Desinfektionsmittel; HTH, Hochtest-Hypochlorit; NaDCC, Natriumdichlorisocyanurat; St NaOCl, stabilisiertes Natriumhypochlorit; Gen NaOCl, erzeugtes Natriumhypochlorit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der United States Agency for International Development, Amt für auswärtige Katastrophenhilfe (AID-OFDA-A-15-00026) unterstützt. Marlene Wolfe wurde von der National Science Foundation (Zuschuss 0966093) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

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Eine Methode, um die Wirksamkeit der Handwäsche für die Entfernung von auftauchenden infektiösen Pathogenen zu testen
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Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).More

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

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