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Immunology and Infection

신생 전염병 병원체 제거를위한 손씻기의 효능을 시험하는 방법

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55604

Summary

감염성 질병 전파를 예방하기 위해 손씻기가 널리 권장됩니다. 그러나 어떤 손씻기 방법이 전염병 병원균을 제거하는데 가장 효과적인지에 대한 증거는 거의 없다. 우리는 미생물 제거시 손씻기 방법의 효능을 평가하는 방법을 개발했습니다.

Abstract

감염성 질병 전파를 예방하기 위해 손씻기가 널리 권장됩니다. 그러나 일반적으로 손씻기 방법의 효능에 대한 비교 가능한 증거는 거의 없다. 또한 손씻기 방법을 비교하여 감염성 병원체를 제거하는데 가장 효과적인 방법을 결정하는 증거는 거의 없다. 전염병 발생시 사용할 수있는 손씻기에 대한 다양한 접근법에 대한 증거를 제공하기위한 연구가 필요합니다. 여기에는 손에서 미생물을 제거 할 때의 손씻기 방법의 효과와 헹굼 수의 지속성을 평가하는 실험실 방법이 설명되어 있습니다. 자원 봉사자의 손에 시험 생물을 먼저 넣고 손으로 씻는 방법으로 씻어 낸다. 일반적으로 대리 미생물은 질병으로부터 사람 피험자를 보호하기 위해 사용됩니다. 세척 후 자원 봉사자의 손에 남아있는 생물의 수는 변형 된 "장갑 주스"방법을 사용하여 시험합니다 : 손은 elu미생물을 부유시키고 멤브레인 여과 (박테리아) 또는 플라크 분석 (바이러스 / 박테리오파지)에 의한 분석에 사용할 수 있도록 스크러빙됩니다. 손씻기에서 생성 된 헹굼 수는 분석을 위해 직접 수집됩니다. 손씻기의 효능은 손씻기 후에 채취 한 시료와 손씻기가없는 시료의 대수 감소 값을 비교하여 계량화합니다. 헹굼 물 지속성은 다양한 손 씻기 방법에서 씻어 낸 물 시료를 물로 손씻기 후에 수집 한 시료와 비교하여 계량화됩니다. 이 방법은 인간 자원 봉사자의 안전을 지키기 위해 대리 조직을 사용할 필요가 있기 때문에 제한적이지만 체외 연구에서 복제하기 어려운 손씻기의 양상을 파악하고 손씻기 효과 및 헹굼에서 감염 생물의 지속성에 대한 연구 틈을 메운다 물.

Introduction

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손씻기는 설사 및 호흡기 질환을 포함하여 대변 또는 구강 경로로 전염되는 질병의 확산을 막기 위해 널리 권장됩니다 1 . 놀랍게도 비누와 물 (HWWS)로 손을 닦기, 알코올 기반 손 소독제 (ABHS)로 손에서 생물을 제거하는 것과 같은 손씻기 방법의 효능에 대한 비교 가능한 증거는 거의 없다. 초기 연구에 따르면 손씻기 방법과 달리 손씻기의 기계적 작용이 대부분의 유기물 제거에 영향을 줄 수 있습니다. 또한 손씻기 방법이 가장 효과적인 비교 증거는 거의 없습니다. 비공식 문헌 검토에서 비누와 손 소독제의 효능을 유기체 제거에 비교 한 14 개의 연구가 확인되었다. 이 연구들 중 5 명은 ABHS가 더 효과적이라는 것을 발견했습니다 4 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 로 더 효과적이라는 것을 발견하였고 2 명은 방법 16 17 사이에 유의 한 차이가 없음을 발견했다. 이러한 발견은 일관성이없고 손씻기 후 헹굼물에 잔류하는 유기체의 질병으로 인한 지속적인 위험을 언급하지 않습니다. 전반적으로, 감염성 질병을 유발하는 병원균 제거를위한 손씻기 방법의 비교 효능에 대한 증거는 제한적이다.

이러한 제한된 증거로 인해 어떤 방법이 질병 발생 상황에 가장 적합한 지에 대한 불확실성이 제기되었습니다. 예를 들어2013 년부터 2016 년까지 서 아프리카의 에볼라 바이러스 질병 (EVD) 발병 기간 동안 몇몇 대규모 국제 대응자가 HWWS, ABHS 또는 0.05 % 염소 솔루션에 대한 모순 된 권장 사항을 제시했습니다. 세계 보건기구 (WHO)가 HWWS 또는 ABHS (손이 눈에 보이지 않는 경우)를 권장하는 반면, Médecins Sans Frontières (MSF)는 0.05 % 염소 용액을 사용하여 손씻기를 권장합니다. WHO는 염소 요구량이 피부 18 , 19 , 20 , 21 , 22 로 인해 다른 방법보다 덜 효과적이므로 다른 옵션을 사용할 수 없다면 염소를 사용해서는 안된다는 것을 밝히고있다. 또한, 염소 용액은 일반적으로 하이 테아 차아 염소산염 (HTH), 국부적으로 생성되고 안정화 된 차아 염소산 나트륨 (NaOCl) 및 염소산 나트륨(NaDCC)이다. 서 아프리카에서의 EVD 발생에 대한 응답으로 WHO가 의뢰 한 체계적인 검토는 최근 염소로 손씻기의 비교 효능을 조사한 4 개의 연구만을 발견했다. 이 연구들은 또한 상반되는 결과를 가져 왔으며,이 연구들 중 어느 것도 에볼라 바이러스 10 , 24 , 25 , 26 , 27 과 유사한 손씻기 또는 조사 미생물에 대해 0.05 %의 권장 염소 농도를 사용하지 않았습니다. 따라서 권장 사항은 증거에 기반한 것으로 밝혀지지 않았고 어떤 권장 사항이 가장 효과적 이었는지 분명하지 않았습니다.

손씻기 중재는 전염병 전파를 예방하는 중요한 도구이기 때문에 감염 병원체의 확산을 막기위한 손씻기 접근법을 비교하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 이 h세탁 권고는 증거에 근거해야합니다. 따라서 대리모 또는 비 감염성 병원체를 사용하여 실시한 손씻기 효능 및 헹굼 물 지속성을 테스트하는 방법이 개발되었습니다 2 , 28 , 29 . 에볼라 바이러스의 대리인으로 Phi6을 사용하고 일반적인 지시 생물로 대장균 을 사용하는 샘플 결과가 여기에 제시됩니다. 이 프로토콜에서는 손씻기 효능 및 헹굼 수 지속 테스트가 제공됩니다.

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Protocol

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윤리 성명서 : 여기에 기술 된 연구 (에볼라의 대용 물로서 Phi6와 E. coli )는 터프 스 메디컬 센터 (Tufts Medical Center)와 터프 츠 대학교 보건 과학 캠퍼스 (Tufts University Health Sciences Campus)의 기관 검토위원회 (# 12018)의 승인을 받았습니다. 하버드 대학교 (Harvard University)는 Tufts Institutional Review Board (Tufts 기관 검토위원회)에 검토를 양도했습니다.

참고 :이 프로토콜을 시작하기 전에 두 단계를 완료해야합니다. 첫째, 인간 대상에서 안전하게 사용할 수있는 연구 대상 병원체의 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1) 대리인 또는 비 감염성 버전을 확인하고 선정해야합니다 30 . 생물체가 인간 지원자의 맨손에 접종하는 데 사용되므로 BSL-1 대리 병원균 또는 비 감염 병원체가이 프로토콜에 필요합니다. 둘째, 지원자를 모집하거나 실험을 시작하기 전에 지역 인권위원회의 승인을 얻어야한다. 이 프로토콜의 많은 측면은 th를 충족하도록 조정될 수 있습니다.관심있는 연구 질문의 구체적인 요구.

1. 적격 인물을 모집합니다.

  1. 공고문에 전단지를 게시하고 참여에 관심이있는 회원들과 함께 그룹에 이메일을 보내 자원 봉사자를 모집하십시오. 이러한 발표에는 연구 목적, 연락처 정보 및 자격 기준이 포함되어야합니다.
  2. 자격을 평가하기 위해 자원 봉사자들과 만나십시오. 자원 봉사자가 현재 임신 ​​중이거나 항생제를 복용하지 않고 18 세 이상 65 세 사이의 건강한 사람인지 확인하고 피부 손상 / 장애, 손씻기 약 알레르기 알레르기, 위생 관련 정신 건강 문제 기록이 있는지 확인하십시오.
  3. 자격있는 자원 봉사자에게 동의서를 읽으십시오. 그들이 제기 한 질문에 대답하고 자원자와 조사관이 양식 2 부에 서명하도록하십시오. 하나의 양식을 보관하고 자원 봉사자에게 제공하십시오.
  4. 인구 통계 학적 정보, 사람에 관한 질문을 포함하는 기준 조사 실시피부 상태에 관한 최근의 역사, 최근의 손씻기 행동에 관한 정보. 피부염, 피부 손상 또는 기저 피부 이상 징후가 있는지 손 검사 31 .
  5. 관심있는 각각의 유기체에 대해 2 회의 시험 세션을 자원 봉사자에게 계획하십시오 (하나는 토양 부하 시험을, 다른 하나는 시험하지 않음). 자원 봉사자들에게 개인 제품 사용으로 인한 혼란을 피하기 위해 테스트하기 전에 7 일간의 세척 기간 동안 항균 제품을 피하도록 지시하십시오.
    1. 자원 봉사자들에게 항균 제품 (샴푸, 컨디셔너, 비누)을 제공하여 평소 사용하는 제품 대신 사용하십시오. 튼튼한 비닐 장갑을 착용하고 집 청소 제품과 같은 제품을 사용할 때 피사체에 입을 것을 지시하십시오.

2. 응급 처치 (Soap, ABHS, 0.05 % HTH, NaDCC 및 NaOCl 솔루션)에 일반적으로 사용되는 손씻기 솔루션 준비

참고 : 염소 용액은 준비가 가능합니다. 실험 12 시간 전에 저장되지만 12 시간 이상 저장하면 성능이 저하됩니다.

  1. 테스트가 수행되는 상황과 관련된 비누를 선택하여 구입하십시오.
    참고 : 대부분의 경우, 개발 도상국에서의 전염병 응급 상황의 경우 비누가됩니다.
  2. 테스트가 수행되는 상황과 관련된 ABHS 솔루션을 선택하여 구입하십시오.
    참고 : 효능을 보장하기 위해서는 선택한 ABHS의 에틸 알콜 컨텍스트가 70 % 이상이어야합니다.
  3. 초순수에 과립 Ca (ClO) 2 분말을 첨가하여 0.05 % 칼슘 하이포 클로 라이트 (Ca (ClO) 2 ) 용액을 준비합니다. 테스트 할 과목 수에 따라 필요한 솔루션의 양을 결정하십시오.
    1. 다음 방정식을 사용하여 주어진 비율의 가용 염소를 사용하여 주어진 물의 부피에서 원하는 양의 용액을 준비하는 데 필요한 분말의 양을 결정하십시오.
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      참고 : Ca (ClO) 2 분말은 일반적으로 60-80 %의 사용 가능한 염소를 가지고 있습니다.
  4. 초순수에 과립 NaDCC 분말을 첨가하여 0.05 % sodium dichloroisocyanurate (NaDCC) 용액을 준비한다.
    1. 다음 방정식을 사용하여 주어진 비율의 가용 염소를 사용하여 주어진 물의 부피에서 원하는 양의 용액을 준비하는 데 필요한 분말의 양을 결정하십시오.
      방정식
      참고 : NaDCC 분말에는 일반적으로 약 50 %의 가용 염소가 있습니다.
  5. 초순수에 차아 염소산 나트륨 용액을 첨가하여 안정화 된 0.05 % NaOCl 용액을 준비한다.
    1. 제조자의 지시에 따라 적정 시험 법을 사용하여 NaOCl 저장 용액의 농도를 확인한다 ( 예 : 요오드 적정 적정; su의 재료 목록 참조)ggested 키트).
    2. 시험 방법의 결과를 사용하여 다음 방정식을 사용하여 물에 첨가 할 용액의 양을 계산하십시오 :
      방정식
  6. electrochlorinator, 초순수 및 실험실 등급의 염화나트륨 (NaCl)을 사용하여 생산 된 차아 염소산 나트륨 용액을 초순수에 첨가하여 안정화 된 0.05 % NaOCl 용액을 준비한다.
    1. 제조사의 지침에 따라 전기 염소기를 사용하여 초순수와 NaCl로 1 % 염소 용액을 준비합니다.
    2. 적정 시험 방법 ( 예 : 요오드 적정)을 사용하여 NaOCl 저장 용액의 농도를 확인한다.
    3. 시험 결과를 사용하여 다음 방정식을 사용하여 물에 첨가 할 용액의 양을 계산하십시오.
      방정식
  7. C를 확인하십시오.(iodometric titration)을 사용하여 염소 손씻기 용액의 농도를 측정하고 목표 농도 (0.045-0.055 %)의 10 % 오차 이내가 될 때까지 물 또는 염소 소스 분말 / 용액을 첨가하여 용액을 조정합니다.

3. 유기체 및 토양 부하를 준비하고 접종을 생산하기 위해 결합하십시오.

참고 : 다음 하위 섹션에서 대장균 과 Phi6는 방법 설명을위한 샘플 박테리아 및 바이러스 유기체로 사용됩니다.

  1. 박테리아의 경우 10 x 10 8 CFU / mL보다 높고 바이러스의 경우 10 x 10 7 PFU / mL보다 큰 농도로 시험용 생물체를 준비하십시오.
    1. 대장균 을 준비하려면 Luria-Bertani (LB) 한천 플레이트에 대장균 의 비병원성 균주를 줄 지어 단일 배양체를 얻기 위해 24 시간 동안 37 ° C에서 배양하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오.
      참고 :이 작업은 끊을 수 있습니다.실험하기 며칠 전.
      1. 실험 시작하기 하루 전에 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 살균 루프를 사용하여 LB 브로 쓰 10mL를 접종하십시오. 흔들어서 37 ° C에서 밤새 품어 둡니다.
      2. 실험 아침에 신선한 LB 배지 20 mL에 밤새 배양 1 mL를 넣어 신선한 배양액을 시작하십시오. 약 2.5 시간 동안 품어 10 8 CFU / mL 이상의 세포 밀도를 얻으십시오.
      3. 분광 광도계를 사용하여 배양 물의 농도를 측정하십시오.
        참고 : 사용 된 E. coli 균주의 표준 곡선에서 이전에 확립 된 변환 계수를 사용하여 10 8 CFU / mL보다 큰 농도를 확보하십시오 33 . 세포 밀도가 충분히 높지 않으면 인큐베이터로 배양하고 준비가 될 때까지 다시 시험하십시오.
    2. 막 여과를 사용하여 농도를 확인하십시오 34 .
      참고 : 연속 희석을 수행하십시오.인산염 완충 식염수 (PBS)에서 배양하여 여과 된 용액이 플레이트 상에 셀 수의 집계를 산출하도록한다 (정확한 수는 사용 된 배지에 따라 달라진다).
      1. 멸균 여과 깔대기와 진공 연결 장치로 화염과 여과 매니 폴드를 설치하십시오. 에탄올로 그들을 화염에 의해 집게를 소독하십시오. 이들을 사용하여 0.45μm 필터를 그리드가 위를 향하게하여 여과 매니 폴드에 놓습니다. 소량의 멸균 PBS로 필터를 적셔주십시오.
      2. 깔때기를 받침 위에 놓고 피펫 팅 또는 필터에 직접 붓는 방법으로 시료 용액을 첨가하십시오. 전체 시료가 멤브레인을 통과 할 때까지 진공을 유지하십시오. 깔때기의 측면을 멸균 PBS로 헹구고 진공을 다시 맞 춥니 다.
        참고 : 시료는 100 μL 이상 100 mL 이하 여야합니다. 샘플이 10 mL 미만인 경우, 여과하기 전에 여과 깔때기에 약 20 mL의 PBS를 첨가하여 샘플을 균일하게 여과하십시오르.
      3. 깔때기를 제거하고 집게를 불꽃에 살균 한 다음 바닥에서 필터를 들어 올립니다. 필터가 표면과 평평하게 놓여 있는지 확인하기 위해 그리드가 위로 향하도록 배양 접시에 LB 한천에 필터를 부드럽게 놓습니다. 플레이트를 뒤집고 37 ° C에서 24 시간 동안 품어 라.
      4. 24 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 대장균 식민지를 계산합니다. 이 데이터와 알려진 희석 배수 및 용액의 부피를 사용하여 여과 된 용액의 농도를 CFU / mL로 계산하십시오.
    3. 이중 한천 오버레이 방법 35을 사용하여 Pseudomonas syringae 호스트 Phi6을 전파 하십시오.
      1. 100 μL의 Phi6 주식 현탁액과 100 μl의 P. syringae 밤새 배양액을 Nutrient Broth Yeast (NBY) 연한 한천 (0.3 %) 6 mL에 직접 첨가하십시오. NBY 경화 한천 (1.5 %)으로 플레이트 위에 붓고 26 ° C에서 밤새 배양하십시오. 실험을위한 충분한 inoculum을 생산하는 충분한 플레이트를 준비약 4 mL의 플레이트 당 바이러스 현탁액의 수율을 평가 하였다.
      2. 다음날, 부드러운 한천 레이어 위에 PBS 5 ML을 추가합니다. 실온에서 4 시간 동안 방치 한 후 피펫으로 꺼내고 0.45μm 필터로 여과하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오.
        참고 :이 솔루션은 바이러스 접종 역할을합니다.
    4. 플라크 분석을 사용하여 농도가 10 7 PFU / mL 35 이상인지 확인하십시오. PBS에서 바이러스 성 현탁액의 순차 희석을 수행하여 100 μL가 플레이트 상에 셀 수를 세어 나간다.
      1. 적절한 희석 된 시료 100 μL와 밤새 숙주 배양 100 μL를 NBY 소프트 한천 6 mL가 들어있는 튜브에 직접 넣으십시오. NBY 한천에 부드러운 한천을 부어 26 시간 동안 24 시간 배양하십시오.
      2. 다음날 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 당 플라크의 수를 세십시오. 이 데이터와 알려진 희석 배수를 사용하십시오ctor 및 용액의 부피를 측정하여 여과 된 용액의 농도를 PFU / mL 단위로 계산한다.
  2. 인간의 혈청을 모방하기위한 삼중 토양 부하를 준비하십시오.
    1. 7.80 mg / mL의 소 혈청 알부민, 10.92 mg / mL의 트립 톤 및 2.52 mg / mL의 소 뮤신을 혼합하여 필요한 토양 부하량을 산출하십시오. 토양 부하를 혼합 한 후 0.22μm 필터로 여과하여 살균하십시오. 사용하기 전까지 4 ° C에서 보관하십시오. 단백질이 변질되기 때문에 가열 살균하지 마십시오.
  3. 토양 부하가없는 조건에서 접종 물을 혼합하기위한 0.9 % NaCl 용액을 준비하십시오.
  4. 시험 직전에 68 % 박테리아 또는 바이러스 성 현탁액과 32 % 토양 부하로 구성된 접종 물을 준비하십시오. 예를 들어, 단계 3.1.1.2 또는 3.1.3.2의 박테리아 또는 바이러스 성 현탁액 1.02 mL와 토양 부하 (단계 3.2.1) 또는 0.9 % NaCl 용액 (단계 3.3) 중 0.48 mL를 사용합니다. 소용돌이 치거나 가볍게 섞어서 섞으십시오.
    참고 :이 1.5 ML각 조건 하에서 각 자원자에게 접종 물이 사용되므로 준비한 접종 물의 총 부피가 의도 된 횟수만큼 충분하도록해야합니다.

4. 실험 자원 봉사자 준비

참고 : 해당 날짜에 시험 할 생물체 및 토양 부하 조건을 결정하십시오. 동일한 자원 봉사자가 여러 조건을 테스트하는 데 사용될 수 있지만 각 자원 봉사자는 48 시간 내에 한 번의 테스트를 거쳐야합니다.

  1. 검사를 시작하기 전에 자원 봉사자가 7 일 항균 세정 기간을 지켰 음을 구두로 확인하고 피부에 이상이나 이상이 생기지 않았는지 육안으로 확인하여 자격이 있는지 확인하십시오.
  2. 난수 생성기를 사용하여 각 자원 봉사자에게 테스트의 오늘 샘플링을 위해 오른손 또는 왼손을 사용하도록 지정하십시오. 손씻기 작업을 수행 할 주문을 지정하십시오.
    참고 :예를 들어, ABHS는 # 3으로 지정 될 수 있으며 세 번째로 수행됩니다.
  3. 테스트 시작시 한 번 "세척 세척"을 수행하여 피부의 먼지와 기름을 제거하여 이후의 각 테스트가 동일한 조건에서 수행되도록하십시오.
    1. 세척 세척을 수행하려면 빈 접종 (LB broth 또는 PBS 전용)을 사용하고 손씻기없이 샘플을 채취하여 실험의 각 단계 (아래 5 절)를 실행하십시오.

5. 실험 절차

  1. 각 자원 봉사자의 피부 pH를 테스트하려면 팔뚝 표면 피부와 포인터와 가운데 손가락 사이의 웹 공간에 플랫 팁 (flat-tipped) 피부 pH 프로브를 놓습니다. 전극이 피부와 평평한 지 확인하십시오. pH 값을 기록하십시오.
  2. 손을 스파이크.
    1. 자원 봉사자들에게 양손을 함께 모으게하십시오. 신중하게 각 팜에 750 μL를 pipetting하여 접종의 1.5 ML로 손을 스파이크.
    2. 자원 봉사자들이 손의 모든 표면이 접종 될 때까지 부드럽게 문지르지 말고 가능한 한 적은 마찰을 주도록하십시오.
    3. 자원 봉사자들이 접종을 마칠 수 있도록 추가 30 초 동안 손을 잡고 몸을 멀리 두십시오. 예방 접종은 완전히 건조되지 않을 수 있습니다.
  3. 손을 씻으십시오.
    1. 다음의 모든 세척 단계에서, 큰 샘플 채취 백 안의 손에서 헹굼물을 채취하십시오. 백에 12 % 티오 황산나트륨 용액 4.5 mL를 넣어 접촉시 염소를 중성화시키고 2 시간 이내에 처리한다.
      참고 : 티오 황산나트륨은 유기체에 미칠 수있는 영향을 통제하기 위해 모든 시료 (염소가없는 시료 포함)에 첨가해야합니다.
    2. 접종 후 (5.2 절), 지정된 순서대로 다음 방법으로 손을 씻는다.
      1. 대조군 A의 경우 손씻기 단계를 수행하지 말고 직접 단계로 이동하십시오5.5.
      2. 대조군 B의 경우, 알려진 유속의 깔때기를 통해 실온 (약 21 ° C)의 초순수만을 사용하여 손을 씻으십시오.
        참고 : 여기서 1.5 L / m의 유속과 500 mL의 물이 사용되었습니다.
      3. 비누로 손을 씻으려면 초순수 10 mL로 손을 적 십시오. 자원 봉사자들에게 비누로 손을 발라지게하고 추가 20 초 동안 손을 문지르십시오. 1.5L / m의 유속으로 깔때기를 통해 실온에서 500mL의 초순수를 쏟아서 손을 씻습니다.
      4. 모든 염소 용액 ( 예 : ABHS, HTH, NaDCC 및 NaOCl)의 경우, 200 mL의 염소 용액을 1.5 L / m의 유속으로 깔때기를 통해 붓고 자원 봉사자에게 철저히 문지르십시오.
  4. 수정 된 장갑 주스 프로 시저를 사용하여 손으로 헹굽니다.
    1. 손을 씻은 후, 즉시 각 자원 봉사자의 손을 놓습니다 ( 즉, testi를 위해 선택된 손 (오른쪽 또는 왼쪽)단계 4.2에서)을 손목까지 75 mL의 용리액 ( 예 : PBS)이 들어 있는 샘플 백에 넣으십시오. 손목 주위에 가방의 꼭대기를 단단히 고정시킵니다.
      참고 : 손씻기에 사용되는 염소를 중화시키기 위해 충분한 양의 티오 황산나트륨이 포함 된 샘플링 용 용리액을 사용하십시오. PBS는 많은 유기체에 적합한 일반적으로 사용되는 용리액입니다.
    2. 자원 봉사자가 손가락 사이와 손톱 밑에 손이 닿도록주의하면서 30 초 동안 용액에 부드럽게 문지르십시오. 30 초 동안 가방 외부에서 손을 부드럽게 마사지하여 전체 손을 용리액에서 손목까지 완전히 헹구십시오.
    3. 6 시간 이내에 2 시간 이내에 적절한 분석에 따라 봉지를 봉인하고 처리하십시오.
  5. 오염 제거.
    1. 각각의 손 씻기 방법으로 과정을 반복하기 전에 자원 봉사자들에게 비누와 따뜻한 물로 싱크대에서 손을 씻도록하십시오. 자원 봉사에 스프레이하기rs '손을 70 % 에탄올로 바릅니다. 건조하게하십시오.
    2. 각 손씻기 조건에 대해 섹션 5의 모든 단계를 반복합니다. 단 4.2 단계 ( 그림 1 )에서 무작위로 선택한 손만 사용하십시오.

6. 정량화

  1. 선택한 유기체에 적합한 분석을 수행하십시오 ( 예 : 세균에 대한 막 여과 또는 바이러스에 대한 플라크 분석, 각각 섹션 3.1.2 및 3.1.4에서 위에서 설명).
  2. 플레이트를 계수 한 후, 분석을 위해 각 테스트에 대해 추정 된 CFU / mL 또는 PFU / mL를 기록한다 (3.1.2 및 3.1.4 절).

7. 분석

  1. 단계 6.2의 결과를 사용하여 손에있는 생물체, 각 생물체 및 토양 부하 상태, 각 주제 및 손씻기 방법에 대한 로그 감소 값을 계산합니다.
    1. 손씻기 효능을 위해 각각의 박테리아 / 바이러스 농도를 비교하십시오 A (손씻기 없음)를 제어하기위한 손 씻기 표본. 헹굼 수 지속성을 위해 각 헹굼물 표본을 대조군 B (물 세척 만)와 비교하십시오. 다음 표준 공식을 사용하십시오.
      로그 감소 (손씻기 ) = 방정식방정식
      로그 감소 (헹굼 물 ) = 방정식방정식
      참고 : 로그 감소는 로그 10 (손씻기 없음) - 로그 10 (손씻기 사용)
  2. 유의 한 차이를 쌍으로 측정하기 위해 유의 한 모델에 대한 손씻기 방법과 Tukey의 HSD 테스트 후 계산 된 로그 감소 값의 중요한 차이를 평가하기 위해 일방 반복 측정 분산 분석 (ANOVA)을 사용합니다 (p <0.05)ef "> 36.
    1. ANOVA를 실행하기 전에 각 데이터 세트의 구형 성을 평가하십시오 ( 예 : Bartlett 테스트 사용). 구형성에 위배가 가해 졌음을 시험에서 나타내면 보정 ( 예 : Greenhouse-Geisser 보정)을 적용하십시오.

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여기에서 프로토콜 ( 그림 1 )은 18 명의 자원 봉사자와 함께 완료되었으며 각각은 E.coli 와 Phi6를 사용하여 테스트되었습니다. 토양 부하가 있거나없는 대장균 과 토양 부하가있는 Phi6 ( 그림 2그림 3 )과의 손 세척 결과간에 유의 한 차이가 발견되었습니다. 토양 부하가없는 대장균의 경우, HTH, NaDCC 및 안정화 된 NaOCl을 사용한 손씻기는 모두 물로 손을 씻는 것보다 훨씬 더 큰 로그 감소를 가져왔다 (F (6,102) = 2.72, p = 0.034). 토양 부하로, HTH는 물 만, HWWS 및 ABHS (F (6,102) = 3.94, p <0.001)보다 대장균의 대폭 감소를 가져왔다. 토양 부하가없는 Phi6의 방법 간에는 유의 한 차이가 없었다 (F (6,66) = 2.04, p = 0.073). 그러나 토양 부하가있는 Phi6의 경우 (F (6,102) = 7.01, p <0.001), 물만으로는 greABHS, 안정화 된 NaOCl 및 HWWS에 비해 로그 감소가 ABHS, 안정화 된 NaOCl 및 생성 된 NaOCl보다 큰 로그 감소로 나타났다. HTH는 또한 ABHS 및 안정화 된 NaOCl보다 더 큰 로그 감소를 가지며, NaDCC는 안정화 된 NaOCl 및 ABHS보다 큰 로그 감소를 초래 하였다. HTH는 조건들에 대해 가장 일관되게 잘 수행되었지만, 많은 신뢰 구간이 0.5 log보다 작고 1.5 log 감소보다 많은 경우, 많은 결과가 과다 해석되지 않도록주의해야합니다.

헹굼 수에서 염소는 HWWS보다 헹굼 수에서 지속되는 대장균의 대폭 감소를 가져왔다 (토양 부하가없는 경우, F (4,68) = 331.7, p <0.001, 토양 부하 F (4,68) ) = 162.44, p <0.001) ( 도 4 ). 이 같은 패턴은 토양 부하가없는 Phi6에서 발견되었다 ((F (4,43) = 8.95, P <0.001). 모든 염소 용액은HWWS보다 헹굼 수에서 Phi6가 현저하게 더 많이 감소합니다. Phi6와 토양 부하를 가진 헹굼 수의 지속성에는 유의 한 차이가 없었다 ((F (4,67) = 3.35, p = 0.071) ( 그림 5 ).

그림 1
그림 1 : 실험 개요. 손씻기의 각 라운드마다 수행되는 5 단계는 1) pH 테스트, 2) 손 접종, 3) 손 씻기, 4) 손 씻기, 5) 테스트 된 8 가지 조건 각각에 대한 손 오염 제거 등이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도표 2 : E.coli 손 세척 res ults. 핸드 워싱 방법과 비교하여, 손씻기 방법은 대장균 에서 토양 부하없이 1.94-3.01 및 토양 부하로 2.18-3.34의 평균 로그 감소를 가져왔다. 물로 손을 씻음으로써 두 조건 (1.94 및 2.18 로그)에서 대장균의 감소가 가장 적다는 사실이 입증되었습니다. NaDCC로 손을 씻는 것은 토양 부하 (3.01)없이 가장 큰 감소를 가져 왔고 HTH는 토양 부하 (3.34)로 가장 큰 감소를 가져왔다. 차트에서이 선은 유기체의 퍼센트 감소를 나타내며 오차 막대는 로그 감소의 표준 오류를 나타냅니다. Ctrl B, 컨트롤 B; HWWS, 비누로 손씻기; ABHS, 알코올 기반 손 소독제; HTH, 하이포 아 염소산염 시험; NaDCC, 나트륨 디클로로이 소시 아누 레이트; st NaOCl, 안정화 된 차아 염소산 나트륨; NaOCl 생성, 차아 염소산 나트륨 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ve_content "fo : keep-together.within-page ="1 "> 그림 3
그림 3 : Phi6 손씻기 결과. 수동 세척을하지 않은 것에 비해 손 세정법은 Phi6에서 토양 부하가없는 경우 2.44-3.06, 토양 부하가있는 경우 2.71-3.69의 평균 로그 감소를 가져 왔습니다. 비누로 손을 씻는 것은 토양 부하 (2.44)없이 Phi6가 가장 적게 감소하고, 안정화 된 NaOCl로 손씻는 것은 토양 부하 (2.71)로 최소 감소로 나타납니다. 생성 된 NaOCl로 손을 씻음으로써 토양 부하 (3.06)없이 가장 큰 감소를 가져 왔으며 비누로 손을 씻는 것은 토양 부하 (3.69)로 가장 큰 감소를 가져 왔습니다. 차트에서이 선은 유기체의 퍼센트 감소를 나타내며 오차 막대는 로그 감소의 표준 오류를 나타냅니다. Ctrl B, 컨트롤 B; HWWS, 비누로 손씻기; ABHS, 알코올 기반 손 소독제; HTH, 하이포 아 염소산염 시험; NaDCC, 나트륨 디클로로이 소시 아누 레이트;st NaOCl, 안정화 된 차아 염소산 나트륨; NaOCl 생성, 차아 염소산 나트륨 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 대장균 손 헹굼 결과. 수세만으로 손을 씻을 때와 비교할 때 헹굼 수에 남아있는 대장균 의 평균 대수 감소는 토양 부하가없는 경우 0.28-4.77이었고 토양 부하가있는 경우 0.21-4.49였다. 토양 부하가 있든 없든 모두 비누로 손씻기에서 가장 작은 감소가 발견되었습니다 (0.28 및 0.21). 가장 큰 감소는 토양 부하가없는 안정화되고 생성 된 NaOCl (모두 4.77)과 HTH 및 토양 부하를 갖는 NaOCl 생성으로 관찰되었다. 도표에서, 선은 유기체의 퍼센트 감소를 나타내며, 오차 막대는로그 감소의 표준 오류. HWWS, 비누로 손씻기; ABHS, 알코올 기반 손 소독제; HTH, 하이포 아 염소산염 시험; NaDCC, 나트륨 디클로로이 소시 아누 레이트; st NaOCl, 안정화 된 차아 염소산 나트륨; NaOCl 생성, 차아 염소산 나트륨 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : Phi6 핸드 린스 결과. 수세만으로 손을 씻을 때와 비교할 때 헹굼 수에 남아있는 Phi6의 평균 대수 감소는 토양 부하가없는 경우 1.26-2.02이었고 토양 부하가있는 경우 1.30-2.20이었다. 토양 부하의 경우, 비누로 손을 씻는 데있어 가장 작은 감소가 발견되었습니다 (1.26). 토양 부하가 없으면 HTH는 최소 감소 (2.02)를 나타냈다. 가장 큰 감소는 NaDCC로 토양 부하가 있거나없는 경우 모두 관찰되었다(2.02 및 2.20). 차트에서이 선은 유기체의 퍼센트 감소를 나타내며 오차 막대는 로그 감소의 표준 오류를 나타냅니다. HWWS, 비누로 손씻기; ABHS, 알코올 기반 손 소독제; HTH, 하이포 아 염소산염 시험; NaDCC, 나트륨 디클로로이 소시 아누 레이트; st NaOCl, 안정화 된 차아 염소산 나트륨; NaOCl 생성, 차아 염소산 나트륨 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 작업은 미국 국제 재난 지원 센터 (AID-OFDA-A-15-00026)에 의해 지원되었습니다. 말린 울프 (Marlene Wolfe)는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 후원을 받았습니다 (부여 0966093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

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Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).More

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

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