Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En metod för att testa effekten av handtvätt för avlägsnande av nya smittsamma patogener

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55604

Summary

Handtvätt rekommenderas allmänt för att förhindra överföring av smittsamma sjukdomar. Det finns emellertid lite bevis på vilka handtvättningsmetoder som är mest effektiva vid avlägsnande av infektionssjukdomspatogener. Vi utvecklade en metod för att utvärdera effekten av handtvättningsmetoder vid avlägsnande av mikroorganismer.

Abstract

Handtvätt rekommenderas allmänt för att förhindra överföring av smittsamma sjukdomar. Det finns dock lite jämförbart bevis på effekten av handtvättningsmetoder i allmänhet. Dessutom finns det lite bevis att jämföra handtvättningsmetoder för att bestämma vilka som är mest effektiva vid avlägsnande av infektiösa patogener. Forskning behövs för att ge bevis för de olika metoderna för handtvätt som kan användas vid infektionssjukdomar. Här beskrivs en laboratoriemetod för att utvärdera effekten av handtvättningsmetoder vid avlägsnande av mikroorganismer från händer och deras persistens i sköljvatten. Volontärernas händer spikas först med testorganismen och tvättas sedan med varje handtvättningsmetod av intresse. Vanligen används surrogatmikroorganismer för att skydda människor från sjukdomar. Antalet organismer som kvarstår på frivilliga händer efter tvättning testas med hjälp av en modifierad handskensjuice metod: händerna placeras i handskar med eluOch skruvas för att suspendera mikroorganismerna och göra dem tillgängliga för analys genom membranfiltrering (bakterier) eller plackanalys (virus / bakteriofager). Sköljvatten som produceras från handtvättet samlas in direkt för analys. Handtvättens effektivitet kvantifieras genom att man jämför loggreduktionsvärdet mellan prov som tas efter handtvätt till prov utan handtvätt. Sköljvattenperistansen kvantifieras genom att jämföra sköljvattenprover från olika handtvättningsmetoder till prov som samlats in efter handtvätt med bara vatten. Medan denna metod begränsas av behovet av att använda surrogatorganismer för att bevara säkerheten hos humana volontärer, fångar det aspekter av handtvätt som är svåra att replikera i en in vitro- studie och fyller forskningsgap på handtvättningseffekt och persistens av smittsamma organismer i sköljning vatten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Handtvätt rekommenderas i stor utsträckning för att förhindra spridning av sjukdomar, särskilt de som överförs av fekal-oralt eller luftburet rutt, inklusive diarré- och respiratoriska sjukdomar 1 . Överraskande finns det lite jämförbara bevis på effekten av handtvättningsmetoder, såsom handtvätt med tvål och vatten (HWWS) och med alkoholbaserad handavfettningsmedel (ABHS), på borttagning av organismer från händerna. Initial forskning har funnit att den mekaniska verkan av handtvätt, i motsats till handtvättmetoden, kan ta hänsyn till det flesta avlägsnandet av organism 2 , 3 . Dessutom finns det lite jämförande bevis på vilken handtvättningsmetod som är mest effektiv. I en informell litteraturgranskning identifierades 14 studier som jämförde effektiviteten av tvål och handreningsmedel vid avlägsnande av organismer. Av dessa studier hittade fem ABHS att vara mer effektiva 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 7 fann HWWS att vara mer effektiva 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 och två fann ingen signifikant skillnad mellan metoderna 16 , 17 . Dessa resultat är inkonsekventa och behandlar inte den pågående risken för sjukdom från persistens av organismer i sköljvattnet efter handtvätt. Sammantaget är bevisen på den jämförande effekten av handtvättningsmetoder för avlägsnande av infektionssjukdomar som orsakar patogener begränsad.

Detta begränsade bevis har lett till osäkerhet om vilka metoder som är mest lämpliga vid utbrott. Till exempel, Under utbrottet Ebola Virus Disease (EVD) i Västafrika 2013-2016, gav flera stora internationella respondenter motsägelsefulla rekommendationer för HWWS, ABHS eller 0,05% klorlösningar. Médecins Sans Frontières (MSF) rekommenderar användning av 0,05% klorlösning för handtvätt, medan Världshälsoorganisationen (WHO) rekommenderar HWWS eller ABHS (om händerna inte syns synligt). WHO går så långt som att ange att klor inte ska användas om inget annat alternativ är tillgängligt, eftersom det är mindre effektivt än andra metoder på grund av klorförfrågan som utövas av huden 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Dessutom produceras klorlösningarna vanligen från fyra olika klorföreningar, inklusive högt testhypoklorit (HTH), lokalt genererad och stabiliserad natriumhypoklorit (NaOCl) och sodaIumdiklorisocyanurat (NaDCC). En systematisk granskning av WHO som svar på EVD-utbrottet i Västafrika hittade nyligen endast fyra studier som undersökte den jämförande effekten av handtvätt med klor 23 . Dessa studier gav också motstridiga resultat och ingen av dessa studier använde den rekommenderade klorkoncentrationen på 0,05% för handtvätt eller undersökta mikroorganismer som liknar Ebola-viruset 10 , 24 , 25 , 26 , 27 . Rekommendationerna visade sig således inte vara bevisbaserade, och det var oklart vilka rekommendationer som var mest effektiva.

Ytterligare forskning behövs för att jämföra handtvättmetoder för att förhindra spridning av infektiösa patogener, eftersom handtvättinterventioner är ett viktigt verktyg för att förebygga epidemisk sjukdomsöverföring. Dessa hAndwashing rekommendationer måste baseras på bevis. Således utvecklades en metod för att testa handtvättseffektivitet och sköljvattenspänning, utförd med surrogat eller icke-infektiösa patogener, 2 , 28 , 29 . Provresultat, som använder Phi6 som en surrogat för Ebolaviruset och använder Escherichia coli som en vanlig indikatororganisme, presenteras här. I detta protokoll presenteras handtvättning och effektivitet och sköljning av vattenhållfasthetstest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etikutlåtande: Studien som beskrivs här (på Phi6 och E. coli som surrogater för Ebola) godkändes av Institutional Review Board vid Tufts Medical Center och Tufts University Health Sciences Campus (# 12018); Harvard University ceded granskning till Tufts Institutionella granskningsstyrelsen.

OBS! Innan du börjar detta protokoll måste två steg vara klar. Först identifieras och väljs en biosäkerhetsnivå 1 (BSL-1) surrogat eller icke-infektiös version av den patogen som ska studeras som är säker att använda på människor. En BSL-1-surrogat eller icke-infektiös patogen är nödvändig för detta protokoll, eftersom organismen kommer att användas för att ympa de nakna händerna hos humana volontärer. För det andra måste godkännande från den lokala institutionella granskningsnämnden för att genomföra forskning med mänskliga ämnen erhållas innan man rekryterar volontärer eller påbörjar experimentet. Många aspekter av detta protokoll kan anpassas för att möta thE specifika behov av forskningsfrågor av intresse.

1. Rekrytera kvalificerade mänskliga ämnen

  1. Rekrytera volontärer genom att lägga pappersblädder på public message boards och skicka e-post till grupper med medlemmar som kan vara intresserade av att delta. Dessa meddelanden bör innehålla studie syfte, kontaktinformation och behörighetskriterier.
  2. Möt med volontärerna för att utvärdera behörigheten. Bekräfta att volontärerna är friska, mellan 18 och 65 år, och för närvarande inte gravida eller som tar antibiotika och att de inte har hudskador / störningar, kända allergier mot handtvättmedel eller historia om psykiska problem i samband med hygien.
  3. Ha behöriga volontärer läsa samtycke formulär. Besvara eventuella frågor som de utgör och få frivillig och undersökare underteckna två kopior av formuläret. Behåll en form och ge en till volontären.
  4. Administrera en granskningsundersökning, inklusive frågor om demografisk information, personAll historia av hudförhållandena och information om nyligen handtvättat beteende. Undersöka händer för tecken på dermatit, hudskador eller abnormiteter i baslinjen 31 .
  5. Planera volontärerna för två test sessioner för varje organism av intresse (en för testning med jordbelastning och en för testning utan). Frigör volontärerna för att undvika antimikrobiella produkter under en sju dagars utspädningsperiod före testning för att undvika förvirring från personlig produktanvändning.
    1. Ge frivilliga med antimikrobiella produkter (schampo, balsam och tvål) att använda i stället för sina vanliga produkter. Ge tunga vinylhandskar och instruera ämnena att bära dem vid användning av produkter som husrengöringsprodukter.

2. Förbered handtvättlösningar som vanligen används vid nödsituation (tvål, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC och NaOCl lösningar)

OBS: Klorlösningar kan vara prep Ared upp till 12 timmar före experimentet men kommer att försämras om det lagras> 12 timmar.

  1. Välj och köp en tvål som är relevant för det sammanhang för vilket testning utförs.
    OBS! I de flesta fall, för nödsituationer i infektionssjukdomar i utvecklingsländerna, kommer detta att vara en tvålsticka.
  2. Välj och köp en ABHS-lösning som är relevant för det sammanhang för vilken testning utförs.
    OBS! Den valda ABHS bör ha ett etylalkohol-kontext som är större än eller lika med 70% för att säkerställa effekt.
  3. Förbered en 0,05% kalciumhypokloritlösning (Ca (ClO) 2 ) genom tillsats av granulärt Ca (ClO) 2- pulver till ultrabart vatten. Bestäm mängden lösning som behövs baserat på antalet ämnen som ska testas.
    1. Med hjälp av följande ekvation bestämmer du den mängd pulver som behövs för att bereda den önskade mängden lösning i en given volym vatten med användning av en given procent av tillgängligt klor:
      /files/ftp_upload/55604/55604eq1.jpg "/>
      OBS: Ca (ClO) 2- pulver har typiskt 60-80% tillgängligt klor.
  4. Förbered en 0,05% natriumdiklorisocyanuratlösning (NaDCC) genom att tillsätta ett granulärt NaDCC-pulver till ultrabart vatten.
    1. Med hjälp av följande ekvation bestämmer du den mängd pulver som behövs för att bereda den önskade mängden lösning i en given volym vatten med användning av en given procent av tillgängligt klor:
      Ekvation
      OBS: NaDCC-pulver har typiskt ca 50% tillgängligt klor.
  5. Förbered stabiliserad 0,05% NaOCl-lösning genom att tillsätta natriumhydroxokloritlösning till ultralätt vatten.
    1. Bekräfta koncentrationen av NaOCl-stamlösningen (sannolikt 5-8%) med hjälp av en titreringsprovningsmetod enligt tillverkarens instruktioner ( t.ex. jodometrisk titrering, se materiallistan för suGgested kit).
    2. Beräkna mängden lösning för att lägga till vatten med hjälp av resultaten av testmetoden med hjälp av följande ekvation:
      Ekvation
  6. Förbered stabiliserad 0,05% NaOCl-lösning genom att tillsätta natriumhypokloritlösning framställd med hjälp av en elektroklorator, ultralätt vatten och natriumklorid av laboratoriegrad (NaCl) till ultralätt vatten.
    1. Förbered en 1% klorlösning med ultralätt vatten och NaCl, med hjälp av en elektroklorator enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Använd en titreringsmetod ( t.ex. jodometrisk titrering) för att bekräfta koncentrationen av NaOCl stamlösning 32 .
    3. Beräkna mängden lösning för att lägga till vatten med hjälp av testresultaten, med hjälp av följande ekvation:
      Ekvation
  7. Bekräfta cKoncentration av varje klorhandspolningslösning med hjälp av en titreringsmetod ( t.ex. jodometrisk titrering) och justera lösningarna genom att tillsätta vatten eller klorkälla pulver / lösning tills de ligger inom ett 10% fel på målkoncentrationen (0,045-0,055%).

3. Förbered organismer och jordbelastning och kombinera för att producera ympningen

OBS: I följande avsnitt används E. coli och Phi6 som provbakteriella och virala organismer för metodbeskrivningen.

  1. Förbered organismen som ska användas för testning i en koncentration som är större än 10 x 10 8 CFU / ml för bakterier och större än 10 x 107 PFU / ml för virus.
    1. För att bereda E. coli sträcker man en icke-patogen stam av E. coli på agarplattor av Luria-Bertani (LB) och inkuberar vid 37 ° C i 24 h för erhållande av enstaka kolonier. Förvara vid 4 ° C.
      OBS: Det här kan göras delatAlla dagar före experimentet.
      1. En dag före experimentets början väljer du en enda koloni från plattan och ympar 10 ml LB-buljong med en steril slinga. Inkubera över natten vid 37 ° C med skakning.
      2. På morgonen av försöket startar du en ny kultur genom att tillsätta 1 ml av över nattkulturen till 20 ml frisk LB-buljong. Inkubera i ca 2,5 h för att uppnå en celltäthet större än 10 8 CFU / ml.
      3. Använd en spektrofotometer för att uppskatta koncentrationen av kulturen.
        ANMÄRKNING: Använd en tidigare etablerad omvandlingsfaktor från en standardkurva för den använda E. coli- stammen, vilket säkerställer en koncentration högre än 10 8 CFU / mL 33 . Om celltätheten inte är tillräckligt hög, returnera kulturen till inkubatorn och test igen tills den är klar.
    2. Bekräfta koncentrationen med membranfiltrering 34 .
      OBS: Utför seriella utspädningar oF kulturen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) så att lösningen filtreras kommer att producera ett talbart antal kolonier på plattan (det exakta antalet kommer att bero på det använda mediet).
      1. Ställ in en flamma och ett filtreringsgrenrör med sterila filtreringståg och vakuumanslutning. Sterilisera tångar genom att flamma dem med etanol. Använd dem för att placera ett 0,45-μm filter på filtreringsgrenröret, med gallret uppåt. Fukta filtret med en liten mängd steril PBS.
      2. Placera tratten på basen och tillsätt provlösningen som ska bearbetas genom pipettering eller hälla direkt på filtret. Koppla in vakuumet tills hela provet har passerat genom membranet. Skölj sidorna av traven med sterilt PBS och koppla in vakuumet igen.
        OBS: Prov ska vara minst 100 μl och upp till 100 ml. Om ett prov är mindre än 10 ml, tillsätt ca 20 ml PBS till filtreringstrattet före filtrering för att säkerställa enhetlig filtrering av sampetle.
      3. Ta bort tratten, flamsterilisera tången och lyft filtret från basen. Placera filtret försiktigt på LB-agar i en Petri-skål, med gallret uppåt och se till att filtret ligger i jämnhet mot ytan. Vänd plattorna och inkubera i 24 timmar vid 37 ° C.
      4. Efter 24 h, ta bort plattorna från inkubatorn och räkna E. coli kolonierna. Använd dessa data och den kända utspädningsfaktorn och volymen av lösningen för att beräkna koncentrationen av den filtrerade lösningen i CFU / ml.
    3. Propagate Phi6 i Pseudomonas syringae värd med användning av dubbel agaröverlagringsmetoden 35 .
      1. Tillsätt 100 μl Phi6-stamcelsuspension och 100 μl P. syringae över nattkultur direkt till 6 ml mjuk agar (0,3%) näringsbuljongjäst (NBY). Häll den på plattor med NBY hård agar (1,5%) och inkubera över natten vid 26 ° C. Förbered tillräckligt med tallrikar för att producera tillräckligt med ymp för expertenUppskattning av ett utbyte av ungefär 4 ml virussuspension per platta.
      2. Nästa dag, tillsätt 5 ml PBS ovanpå det mjuka agarskiktet. Låt det stå vid rumstemperatur i 4 h, hämta det med pipett och filtrera det med ett 0,45-μm filter. Förvara vid 4 ° C.
        OBS: Denna lösning kommer att fungera som viral inokulering.
    4. Använd en plackanalys för att bekräfta att koncentrationen är större än 10 7 PFU / ml 35 . Utför seriella utspädningar av virussuspensionen i PBS så att 100 μl ger ett antal talbara plack på plattan.
      1. Pipettera 100 μl av ett lämpligt utspätt prov och 100 | il av värdkultur över natten direkt i ett rör innehållande 6 ml NBY mjukagar. Häll mjuk agar över NBY hård agar och inkubera vid 26 ° C i 24 timmar.
      2. Nästa dag, ta bort plattorna från inkubatorerna och räkna antalet plackar per platta. Använd dessa data och den kända utspädningsfasenCtor och volym av lösningen för att beräkna koncentrationen av den filtrerade lösningen i PFU / ml.
  2. Förbered trepartsbelastningen, avsedd att efterlikna humant serum.
    1. Kombinera 7,80 mg / ml bovint serumalbumin, 10,92 mg / ml trypton och 2,52 mg / ml bovint mucin för att producera den erforderliga volymen av jordbelastning. Efter att ha blandat jordbelastningen, filtrera den genom ett 0,22 μm filter för att sterilisera. Förvara den vid 4 ° C tills användning. Värm inte sterilisera, eftersom proteinerna kommer att denaturera.
  3. Förbered en 0,9% NaCl-lösning för att blanda inokulatet för förhållanden utan jordbelastning.
  4. Omedelbart före testning, bereda ett inokulum bestående av 68% bakteriell eller virussuspension och 32% jordbelastning. Använd till exempel 1,02 ml bakteriell eller virussuspension från steg 3.1.1.2 eller 3.1.3.2 och 0.48 ml av antingen jordbelastning (steg 3.2.1) eller 0,9% NaCl-lösning (steg 3.3). Virvla eller virvel blanda försiktigt.
    OBS: 1,5 ml av dettaInokulum kommer att användas för varje volontär under varje tillstånd, så se till att den totala volymen av inokulatet som framställts är tillräcklig för det avsedda antalet test.

4. Förbereda volontärer för experimentet

ANMÄRKNING: Bestäm organism och jordförhållanden som ska testas den dagen. Samma volontärer kan användas för att testa flera villkor, men varje volontär bör endast utsättas för en testundersökning inom en 48 h period.

  1. Innan du börjar testa, bekräfta att volontärerna förblir kvalificerade genom att verbalt verifiera att de följde den 7-dagars antimikrobiella utspädningsperioden och visuellt bekräfta att de inte har utvecklat några raster eller abnormiteter på huden.
  2. Använd en slumptalsgenerator, tilldela varje volontär att använda antingen sin högra eller vänstra hand för provtagning på denna testdag. Tilldela en order där handtvättförhållandena kommer att utföras.
    OBS: FörExempel, ABHS kan tilldelas # 3 och kommer att utföras tredje.
  3. Utför en "rengöringsvask" en gång i början av testningen för att avlägsna hudens smuts och oljor, så att varje efterföljande test utförs under likvärdiga förhållanden.
    1. För att göra en rengöringsvätska, löpa igenom varje steg i försöket (avsnitt 5 nedan) med hjälp av en blank inokulat (endast LB-buljong eller PBS) och ta ett prov utan handtvätt.

5. Experimentellt förfarande

  1. För att testa pH i huden hos varje volontär (för att kontrollera variationen), placera en platta tippad pH-sond på palmarytans hud och webbutrymmet mellan pekaren och mellanfingrarna. Kontrollera att elektroden är platt mot huden. Spela in pH-läsningen.
  2. Spika händerna.
    1. Ha frivilliga koppar båda händerna ihop. Spik händerna med 1,5 ml av ympningen genom att försiktigt pipettera 750 μl långsamt i varje palm.
    2. Låt volontärerna gnugga försiktigt sina händer tills alla handytor är belagda med inokulatet, samtidigt som händerna utsätts för så lite friktion som möjligt.
    3. Frivilliga håller sina händer fortfarande och borta från kroppen i ytterligare 30 s för att tillåta ympningen att torka. Inokulatet får inte torka helt.
  3. Tvätta händerna.
    1. För alla följande tvättsteg, fånga sköljvattnet från händerna i en stor provuppsamlingspåse. Tillsätt 4,5 ml av en 12% natriumtiosulfatlösning till påsen för att neutralisera kloret vid kontakt och bearbeta inom 2 timmar.
      OBS: Natriumtiosulfat bör tillsättas till alla prov (även de utan klor) för att kontrollera eventuella effekter som det kan ha på organismen.
    2. Efter inokulering (avsnitt 5.2), tvätta händerna med nästa metod i den angivna ordern.
      1. För kontroll A, utför inte ett handtvättsteg och gå direkt till steg5,5.
      2. För kontroll B, tvätta händerna med endast ultralätt vatten vid rumstemperatur (ungefär 21 ° C) genom en tratt med känd flödeshastighet.
        OBS: Här användes en flödeshastighet av 1,5 L / m och 500 ml vatten.
      3. För handtvätt med tvål, fuktiga händerna med 10 ml ultralätt vatten. Låt volontärerna lada sina händer med tvål och gnugga sedan ihop varandra i ytterligare 20 s. Skölj händerna genom att hälla 500 ml ultrabart vatten vid rumstemperatur genom en tratt med en flödeshastighet på 1,5 l / m.
      4. För alla klorlösningar ( t.ex. ABHS, HTH, NaDCC och NaOCl), häll 200 ml klorlösning genom en tratt med en flödeshastighet på 1,5 l / m och frivilligt gnugga händerna noggrant.
  4. Handskölj med hjälp av en modifierad handskejuice.
    1. Efter handtvätt, placera omedelbart varje volontärs hand ( dvs. handen (höger eller vänster) vald för testiNg i steg 4.2) i en provpåse innehållande 75 ml elueringsmedel ( t.ex. PBS) upp till handleden. Håll toppen av påsen tätt runt handleden.
      OBS! Använd ett elueringsmedel för provtagning som innehåller tillräckligt med natriumtiosulfat för att neutralisera klor som används för handtvätt. PBS är ett vanligt elueringsmedel som är lämpligt för många organismer.
    2. Frivilliga gnuggar försiktigt handen i lösningen i 30 s, var försiktig med att nå mellan fingrarna och under naglarna. Massage handen från utsidan av påsen försiktigt i 30 s för att säkerställa att hela handen sköljs ordentligt i elueringsmedlet, hela vägen upp till handleden.
    3. Försegla påsen och bearbeta den enligt lämplig analys, som beskrivs i avsnitt 6, inom 2 timmar.
  5. Sanering.
    1. Innan du upprepar processen med varje handtvätt, tvätta frivilliga händerna noga i en handfat med tvål och varmt vatten. Spraya volontärenRs 'händer med 70% etanol tills de är belagda på båda sidor. Låt dem torka.
    2. Upprepa alla steg i avsnitt 5 för varje handtvätt, använd endast handen som valts slumpmässigt i steg 4.2 ( Figur 1 ).

6. Kvantifiering

  1. Utför analyser som är lämpliga för den organism som valts ( t.ex. membranfiltrering för bakterier eller plackanalys för virus, beskrivna ovan i avsnitt 3.1.2 respektive 3.1.4).
  2. Efter räkning av plåtarna registrerar du uppskattad CFU / mL eller PFU / mL för varje test för analyserna (avsnitt 3.1.2 och 3.1.4).

7. Analys

  1. Använd resultaten från steg 6.2, beräkna loggreduktionsvärdet av organismer i händerna, för varje organism och jordbelastningsstatus och för varje ämne och handtvättmetod.
    1. För handtvätt, jämför koncentrationen av bakterier / virus i vardera Handtvättprov för kontroll av A (ingen handtvätt). För sköljvattensåterhållighet, jämföra varje sköljvattenprov för att kontrollera B (tvätta endast med vatten). Använd följande standardformel:
      Logreduktion (handtvätt ) = EkvationEkvation
      Logreducering (sköljvatten ) = EkvationEkvation
      OBS: Logreducering kan också uttryckas som logg 10 (utan handtvätt) - logg 10 (med handtvätt)
  2. Använd en envägs upprepad mätningsanalys av varians (ANOVA) för att bedöma de signifikanta skillnaderna i de beräknade logreduktionsvärdena mellan handtvättningsmetoder och ett post-hoc Tukey-HSD-test för signifikanta modeller för att paravisa bedöma signifikanta skillnader (p <0,05)Ef "> 36.
    1. Innan du kör ANOVA, utvärdera varje dataset för sfäricitet ( t.ex. använd Bartlett test). Tillämpa en korrigering ( t.ex. Greenhouse-Geisser-korrigeringen) när testet indikerar att sfäriciteten kränktes 37 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här avslutades protokollet ( Figur 1 ) med 18 volontärer, vilka testades med användning av både E. coli och Phi6. Betydande skillnader hittades mellan handtvättresultat med E. coli både med och utan jordbelastning och Phi6 med jordbelastning ( Figur 2 och Figur 3 ). För E. coli utan jordbelastning resulterade handtvättning med HTH, NaDCC och stabiliserad NaOCl alltigenom i signifikant större logminskningar än handtvätt med endast vatten (F (6,102) = 2,72, p = 0,034). Med jordbelastning resulterade HTH i en signifikant större logreduktion av E. coli än vatten endast, HWWS och ABHS (F (6,102) = 3,94, p <0,001). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan metoder för Phi6 utan jordbelastning (F (6,66) = 2,04, p = 0,073). För Phi6 med jordbelastning (F (6,102) = 7,01, p <0,001) resulterade emellertid vatten ensamt i ett greppAter log reduktion än ABHS eller stabiliserad NaOCl och HWWS i en större log reduktion än ABHS, stabiliserad NaOCl och genererad NaOCl. HTH hade också en större logreduktion än ABHS och stabiliserad NaOCl och NaDCC resulterade i en större logreduktion än stabiliserad NaOCl och ABHS. Medan HTH utförde mest konsekvent bra över förhållandena, skulle vi vara försiktiga mot övertolkning av signifikanta resultat, eftersom många konfidensintervall var stora, allt från mindre än 0,5 logg till mer än 1,5 logreduktion i många fall.

I sköljvatten resulterade klor i en signifikant större logreducering av E. coli som kvarstår i sköljvattnet än HWWS (utan jordbelastning, F (4,68) = 331,7, p <0,001, med jordbelastning, F (4,68) ) = 162,44, p <0,001) ( Figur 4 ). Samma mönster hittades i Phi6 utan jordbelastning ((F (4,43) = 8,95, P <0,001), med alla klorlösningar resulterande somTämligen större reduktion av Phi6 i sköljvatten än HWWS. Det fanns inga signifikanta skillnader i persistens i sköljvatten med Phi6 och jordbelastning ((F (4,67) = 3,35, p = 0,071) ( Figur 5 ).

Figur 1
Figur 1: Experimentöversikt. De fem steg som vidtas för varje handrengöring innefattar: 1) pH-testning, 2) Inokulering av händerna, 3) Handtvätt, 4) Sköljning av händerna och 5) Avfettning av händerna för var och en av de åtta testade betingelserna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: E. coli handtvätt ÜLTS. Jämfört med ingen handtvätt resulterade de testade handtvättningsmetoderna i en genomsnittlig logreduktion i E. coli av 1,94-3,01 utan jordbelastning och 2,18-3,34 med jordbelastning. Handtvätt med vatten visade minst minskning i E. coli under båda förhållandena (1,94 och 2,18 log). Handtvättning med NaDCC resulterade i största minskningen utan jordbelastning (3,01) och HTH resulterade i största minskningen med jordbelastning (3,34). I diagrammen representerar linjen procentuell reduktion av organismer, och felstängerna representerar standardfelet för logreduktion. Ctrl B, kontroll B; HWWS, handtvätt med tvål; ABHS, alkoholbaserad handrensare; HTH, högt testhypoklorit; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat; St NaOCl, stabiliserad natriumhypoklorit; Gen NaOCl, genererad natriumhypoklorit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3: Phi6 handtvättresultat. Jämfört med ingen handtvätt resulterade de testade handtvättningsmetoderna i en genomsnittlig loggreduktion i Phi6 på 2,44-3,06 utan jordbelastning och 2,71-3,69 med jordbelastning. Handtvätt med tvål visade minsta reduktion i Phi6 utan jordbelastning (2,44) och handtvätt med stabiliserad NaOCl resulterade i minsta reduktion med jordbelastning (2,71). Handtvättning med genererad NaOCl resulterade i största minskningen utan jordbelastning (3,06) och handtvätt med tvål resulterade i största minskningen med jordbelastning (3,69). I diagrammen representerar linjen procentuell reduktion av organismer, och felstängerna representerar standardfelet för logreduktion. Ctrl B, kontroll B; HWWS, handtvätt med tvål; ABHS, alkoholbaserad handrensare; HTH, högt testhypoklorit; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat;St NaOCl, stabiliserad natriumhypoklorit; Gen NaOCl, genererad natriumhypoklorit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Handsköljningsresultat från E. coli . Jämfört med handtvätt endast med vatten var den genomsnittliga loggreduktionen av E. coli kvar i sköljvattnet 0,28-4,77 utan jordbelastning och 0,21-4,49 med jordbelastning. Både med och utan jordbelastning hittades den minsta minskningen i handtvätt med tvål (0,28 och 0,21). De största reduktionerna observerades med stabiliserad och genererad NaOCl utan jordbelastning (både 4,77) och med HTH och genererad NaOCl med jordbelastning. I diagrammen representerar linjen procentuell reduktion av organismer, och felstavarna representerar sTandard fel i logreducering. HWWS, handtvätt med tvål; ABHS, alkoholbaserad handrensare; HTH, högt testhypoklorit; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat; St NaOCl, stabiliserad natriumhypoklorit; Gen NaOCl, genererad natriumhypoklorit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5: Phi6 handsköljningsresultat. Jämfört med handtvätt endast med vatten var den genomsnittliga loggreduktionen av Phi6 kvar i sköljvattnet 1,26-2,02 utan jordbelastning och 1,30-2,20 med jordbelastning. Med jordbelastning hittades den minsta minskningen i handtvätt med tvål (1,26). Utan jordbelastning resulterade HTH i den minsta minskningen (2.02). De största minskningarna observerades både med och utan jordbelastning med NaDCC(2,02 och 2,20). I diagrammen representerar linjen procentuell reduktion av organismer, och felstängerna representerar standardfelet för logreduktion. HWWS, handtvätt med tvål; ABHS, alkoholbaserad handrensare; HTH, högt testhypoklorit; NaDCC, natriumdiklorisocyanurat; St NaOCl, stabiliserad natriumhypoklorit; Gen NaOCl, genererad natriumhypoklorit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Förenta staternas Byrå för Internationell Utveckling, Byrån för Utländsk Katastrofhjälp (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe stöddes av National Science Foundation (bidrag 0966093).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soap bar Dove White Beauty Bar soap
Alcohol-based hand sanitizer Purell Advanced Instant Hand Sanitizer with 70% Ethyl Alcohol
HTH Powder Acros Organics 300340010
NaDCC Powder Medentech Klorsept granules
NaOCl Solution Acros Organics 419550010
Electrochlorinator AquaChlor
Iodometric titrator Hach 1690001
Bovine serum albumin MP Biomedicals NC0117242
Tryptone Fisher BP1421-100
Bovine Mucin EMD Milipore 49-964-3500MG
0.22 µm Filter EMD Milipore GVWP04700
NaCl Fisher BP358-1
Skin pH probe Hanna Instruments H199181
Large Whirlpak Sample Bag Nasco B01447WA
Small Whirlpak Sample Bag Nasco B01323WA
Funnel bottle Thermo Scientific 3120850001 You may drill an appropriately sized hole in the lid of a bottle to form a funnel that will dispense water at the appropriate flow rate
Ethanol ThermoScientific 615090010 Mix with water to produce 70% ethanol
Spray bottle Qorpak PLC06934
E. coli ATCC 25922
LB Broth Fisher BioReagents BP1426-2
LB Agar Fisher BioReagents BP1425-500
Sterile loop Globe Scientific 22-170-204
Phi6 HER 102
Nutrient broth BD Difco BD 247110
GeneQuant 100 Spectrophotometer General Electric 28-9182-04
Sodium thiosulfate Fisher Chemical S445-3
Membrane filter (47 mm, 0.45 µm) EMD Millipore HAWP04700
m-ColiBlue24 broth media EMD Millipore M00PMCB24
Petri dish with pad (47 mm) Fisherbrand 09-720-500
Vacuum Manifold Thermo Scientific/Nalgene 09-752-5
Filter funnels Thermo Scientific/Nalgene 09-747
Pseudomonas syringae HER 1102
Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific 10010031 Solution may also be mixed from source compounds according to any basic recipe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17, (4), 863-893 (2004).
  2. Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16, (1), 18 (2013).
  3. Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78, (4), 685-690 (2015).
  4. Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325, (7360), 362 (2002).
  5. Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60, (1), 32-39 (2005).
  6. Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68, (2), 159-163 (2008).
  7. Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126, (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
  8. Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42, (2), 178-181 (2014).
  9. Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196, (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
  10. Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289, (10), 1274-1277 (2003).
  11. Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48, (3), 285-291 (2009).
  12. Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30, (10), 939-944 (2009).
  13. Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76, (2), 394-399 (2010).
  14. Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84, (3), 543-547 (2012).
  15. Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90, (3), 226-234 (2015).
  16. Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82, (4), 277-280 (2012).
  17. de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78, (11), 2024-2032 (2015).
  18. Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
  19. World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
  20. World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
  21. Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23, (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
  22. Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
  23. Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4, (1), 1 (2015).
  24. Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2, (5403), 230-233 (1964).
  25. Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34, (3), 302-305 (2013).
  26. Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
  27. Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72, (11), 1176-1181 (1998).
  28. ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. Available from: https://www.astm.org/ (2013).
  29. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118, (5), 1210-1216 (2015).
  30. Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78, (6), 1969-1977 (2012).
  31. Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152, (2), 302-307 (2005).
  32. Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
  33. GeneQuant 100 User Manual. Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
  34. United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
  35. Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. Interscience Publishers. New York. (1959).
  36. Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144, (1), 158-170 (2008).
  37. Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58, (2), 132-149 (1987).
  38. Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39, (4), 921-923 (1995).
En metod för att testa effekten av handtvätt för avlägsnande av nya smittsamma patogener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).More

Wolfe, M. K., Lantagne, D. S. A Method to Test the Efficacy of Handwashing for the Removal of Emerging Infectious Pathogens. J. Vis. Exp. (124), e55604, doi:10.3791/55604 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter