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Chemistry

संवहनी चिकना मस्तिष्क कोशिकाओं के उपचार के लिए रुक-सूखे बेरी पाउडर से पॉलीफेनोल के निष्कर्षण और शुद्धि Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55605
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Dietetics and Nutrition, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Nutrition, Food and Exercise Sciences, Florida State University, 3Center for Advancing Exercise and Nutrition Research on Aging (CAENRA), Florida State University

Summary

यह कार्य फ्रीज-सूखे बेर पाउडर से पॉलिफेनोल-अमीर अर्क तैयार करने के लिए चरण-दर-चरण विधि का विवरण देता है। इसके अलावा, यह कोशिका संवर्धन में पेप्टाइड हार्मोन एंजियोटेंसिन II (आंग II) की उपस्थिति में इन पॉलीफेनोल-समृद्ध निष्कर्षों का उपयोग करने का एक संपूर्ण विवरण प्रदान करता है जो वास्कुलर चिकना मांसल कोशिकाओं (वीएसएमसीएस) का उपयोग करते हैं।

Abstract

महामारी विज्ञान के अध्ययन से पता चलता है कि संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) और यूरोप में कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों (सीवीडी) के कारण फ्लैनोइड की मात्रा में वृद्धि हुई है। जामुन अमेरिका में व्यापक रूप से भस्म हो रहे हैं और एक उच्च पॉलीफ़ोनोलिक सामग्री है कई आणविक लक्ष्यों के साथ बातचीत करने और एंटीऑक्सिडेंट, विरोधी भड़काऊ, और कार्डियोप्रोटेक्टिव प्रभाव सहित कई सकारात्मक जैविक कार्यों को लागू करने के लिए Polyphenols दिखाया गया है। ब्लैकबेरी (बीएल), रास्पबेरी (आरबी), और काली रास्पबेरी (बीआरबी) से पृथक पॉलीफेनोल एंजियोटेंसिन II (एंग II) के जवाब में ऑक्सीडेटिव तनाव और सेलुलर सिनसेंस को कम करते हैं। यह काम फ्रीज सूखे बेरीज से पॉलीफेनोल अर्क को तैयार करने के लिए प्रयुक्त प्रोटोकॉल का विस्तृत वर्णन प्रदान करता है। फ्रीज-सूखे बेर पाउडर से पॉलीफेनॉल निष्कर्षण 80% जलीय इथेनॉल और एक अल्ट्रासोनिक-सहायता प्राप्त निष्कर्षण पद्धति का उपयोग किया गया था। क्रूड निकालने को और अधिक शुद्ध और क्लोरोफॉर्म और एथिल एसीटेट का उपयोग करके अलग किया गया था,क्रमशः। संस्कृति में संवहनी चिकना मांसल कोशिकाओं (वीएसएमसी) पर कच्चे और शुद्ध दोनों अर्क के प्रभाव का परीक्षण किया गया था।

Introduction

पॉलीफेनॉल उनके संरचना में कम से कम एक phenolic अंगूठी युक्त यौगिक हैं और पौधे साम्राज्य 1 में प्रचुर मात्रा में मौजूद हैं। ऐसे संयुग्मों के अस्तित्व की जानकारी के बिना मानव सदियों से औषधीय उद्देश्यों के लिए पौधों का उपभोग कर रहे हैं। कई फलों और सब्जियों में कुछ साझा पॉलिफ़ोनिक यौगिक हैं, यद्यपि फ्लैनोनोइड्स, स्टिलबेनेस, और फीनिलिक एसिड 3 सहित विभिन्न मात्राओं के साथ। हालांकि पॉलिफेनोल अक्सर रंगीन फलों और सब्जियों से जुड़े होते हैं, ये कड़ाई से सच नहीं है। उदाहरण के लिए, ज़ेकैक्थिन और ज़ैन्थिन सब्जियों में मौजूद होते हैं जो अत्यधिक रंगीन नहीं होते हैं, जैसे कि प्याज और लहसुन, जो स्कैलियां के परिवार से होते हैं और कई स्वास्थ्य लाभ से जुड़े होते हैं 4 कई स्वास्थ्य लाभों से जुड़ा होने के अलावा 5 , पॉलीफेनोल भी पौधों की रक्षा के द्वारा कीड़ों से बचाते हैंडी पराबैंगनी विकिरण 2 पॉलिफेनॉल आमतौर पर मानव आहार में पाए जाते हैं और शक्तिशाली एंटीऑक्सिडेंट माना जाता है, क्योंकि वे रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) 6 , 7 , 8 को हटा सकते हैं। उनके विरोधी भक्षण 9 , रोगाणुरोधी 10 , एंटी-हाइपरटेसेंस 11 , और एंटी-कैंसरजनक 12 , 13 गुण हैं।

महामारी विज्ञान के अध्ययनों में फ्लेवोनोइड्स और कार्डियोवैस्कुलर रोग (सीवीडी) की घटनाओं 16 , 17 और मृत्यु दर 14 , 15 के बीच व्युत्क्रम सम्बन्ध दर्शाता है। जामुन अमेरिका में व्यापक रूप से भस्म हो रहे हैं और इसमें उच्च मात्रा में पॉलीफेनोल शामिल हैं, जिसमें फ्लेवोनोइड शामिल हैं। उदाहरण के लिए, ब्लैकबेरी (बीएल) रस का खपत (300 एमएल / डी) आठ हफ्तों के लिए डिस्लेपीडिमिक मरीजों में सिस्टल रक्तचाप 18 में काफी कमी आई है। जीओंग एट अल 1 9 ने बताया कि पूर्व-उच्च रक्तचाप वाले पुरुषों और महिलाओं को प्रति दिन 2.5 ग्राम काले रास्पबेरी (बीआरबी) निकालने की खपत 24-एच और रात का रक्तचाप कम होता है जो प्लेसबो के उपभोग करने वालों की तुलना में कम होता है। रसाबरी (आरबी) ने रक्तचाप को कम किया जबकि स्वस्थ रूप से उच्च रक्तचाप वाले चूहों 20 में सुपरऑक्साइड डिसूटासेज़ (एसओडी) की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई। यह हाल ही में दिखाया गया है कि बीएल, आरबी, और बीआरबी आरओएस के स्तर को कम करते हैं और संवेदक चिकना मस्तिष्क कोशिकाओं (वीएसएमसी) 21 में एंजियोटेंसिन द्वितीय (एंग II) द्वारा प्रेरित होने वाले साँसेंस। इसके अलावा, बीएल निकालने से एन्थॉकायनिन अंश ने अप्रभावी नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (आईएनओएस) की अभिव्यक्ति कम कर दी और लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस) में परमाणु फैक्टर कपा बी (एनएफ-κबी) और बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेज (ईआरके) की गतिविधि को रोक दिया। J774 कोशिकाओंAss = "xref"> 22 बीआरबी निष्कर्षों ने एनएफ-ए ए बी बी सक्रियण और साइक्लोक्सीजिनेज 2 (सीओएक्स -2) की अभिव्यक्ति में विट्रो 23 में कमी आई है, लिपिड प्रोफाइल में सुधार किया है, और चूहों में एथेरोस्क्लेरोसिस के घावों के गठन से रोका जा सकता है 24 उच्च वसायुक्त आहार 24 । एंथोकायनिन, जो जामुनों में सबसे अधिक प्रचुर मात्रा में फ्लेवोनोइड माना जाता है, ट्यूमर नेकोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ-α) उत्पादन 25 को कम करके एलपीएस-उत्तेजित रॉ 264.7 मैक्रोफेज में भड़काऊ प्रतिक्रिया तैयार करता है और वीएसएमसीएस 26 के प्रसार और माइग्रेशन को कम करता है।

चूंकि मानव स्वास्थ्य और रोग में पॉलीफेनोल की भूमिका को समझने में रुचि बढ़ रही है, इसलिए निकासी विधि को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। सॉल्वेंट निष्कर्षण व्यापक रूप से उस प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह लागत प्रभावी और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इस अध्ययन में, एक विलायक निष्कर्षण का उपयोग एथेनॉल के साथ किया गया था, साथ ही अल्ट्रासोनिक-सहायता प्राप्त एक्स्ट्रेसिओN विधि, जिसे किम और ली 27 से अनुकूलित किया गया था। क्लोरोफॉर्म और एथिल एसीटेट का उपयोग करके कच्चे तेल के निष्कर्षण (सीई) के शुद्धिकरण और विभाजन को शुद्ध ऐड्रेक्ट (पीई) अंश प्राप्त करने के लिए किया गया जो कि क्वीयर एट अल 28 से अनुकूलित किया गया था। इसके अलावा, ईआरके 1/2 के बेसल फास्फोरायलेशन को कम करने के लिए बीआर से क्रूड बनाम शुद्ध पॉलिफेनोल निष्कर्षों की प्रभावकारी तुलना की गई थी, और वीएसएमसीएस में आंग द्वितीय प्रेरित सिग्नलिंग कटौती पर शुद्ध बीएल पॉलीफेनॉल निकालने के निरोधात्मक प्रभाव के प्रतिनिधि के उदाहरण दिए गए थे।

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 80 एमएल पूर्ण एथेनॉल (आणविक जीव विज्ञान-ग्रेड) और 20 मिलीलीटर सेल संस्कृति-ग्रेड बाँझ पानी को मिलाकर 80% इथेनॉल (100 एमएल) तैयार करें।
  2. पॉलिफेनोल निकालने (10 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करने के लिए, 10 मिलीग्राम सीई या पीई का वजन। सेल संस्कृति हुड के तहत सादे डुल्बेकेडो के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) के 1 एमएल जोड़ें। भंवर समाधान 200-μL भागों में विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
  3. Lysis बफर तैयार करें
    1. 1 एम एचईपीईएस स्टॉक सोल्यूशन (पीएच 7.4; 50 एमएम फाइनल) के 5 एमएल, 5 एम नाओकल स्टॉक समाधान (1 एमएल फाइनल) के 1 एमएल, 0.5 एम ईडीटीए स्टॉक समाधान (5 एमएम फाइनल) के 1 एमएल, 0.5 एमएल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें एम नाएफ़ स्टॉक समाधान (10 मिमी अंतिम), 286 μL 700 एमएम ना 3 वीओ 4 स्टॉक समाधान (2 एमएम फाइनल), 5 एमएल 200 एमएम ना 4 पी 2 ओ 7 स्टॉक समाधान (10 एमएम फाइनल), और 5 एमएल 20% ट्राइटॉन-एक्स -100 स्टॉक समाधान पानी में तैयार (1% अंतिम)। 100 एमएल की मात्रा तक पहुंचने के लिए पानी जोड़ें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
  4. Laemmli नमूना बफर (4x) तैयार करें
    1. पानी में तैयार किए गए 2 एम ट्रिस स्टॉक समाधान (पीएच 6.8), 100 एमएल ग्लिसरॉल, 20 एमएल की सोडियम डोडेक्वाइल सल्फेट (एसडीएस) समाधान के 31.25 एमएल, और β-मेरैक्रोटोथैनॉल के 50 एमएल जोड़ें। पानी को 250 एमएल तक जोड़ें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें
  5. ट्रिस्-बफर्ड खारा (टीबीएस) बफर तैयार करने के लिए, त्रिस के तीन ग्राम (25 मिमी अंतिम), 0.18 ग्राम केएलएल (2.5 मिमी अंतिम), और 8.76 ग्राम NaCl (150 मिमी अंतिम) का वजन। पीएच को 7.4 में समायोजित करें और 1 एल तक पानी जोड़ने के लिए आरटी पर रखें।
  6. टीबीएस-टी तैयार करने के लिए, 997.5 एमएल की टीबीएस और पानी में तैयार 20% ट्राइटन-एक्स-100 समाधान के 2.5 एमएल जोड़ें। आरटी पर रखें

2. ब्लैकरी एक्सट्रैक्ट्स की तैयारी

  1. फ्रीज-सूखे बेर पाउडर से कच्चे तेल निकालने की तैयारी
    1. फ्रीज सूखे ब्लैकबेरी पाउडर (या ताजा पाउडर के 5 ग्राम) के 10 ग्राम वजन। अगर जमे हुए फल का उपयोग किया जाता है, तो इसे काट दोनिष्कर्षण शुरू करने से पहले बहुत छोटे टुकड़े nto।
    2. 100 मिलीलीटर के 80% जलीय इथेनॉल के साथ 1 एल राउंड-नीचे एर्लेन्मेयर फ्लास्क में फल पाउडर मिलाएं।
    3. बीच में बीच में किसी भी समय अंतराल के बिना, 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग करते हुए, 42 kHz पर 20 मिनट के लिए 20 मिनट के लिए मिश्रण Sonicate। नरम प्रकाश में लगातार नाइट्रोजन शुद्ध होने के साथ sonication करें। जमे हुए फल के लिए, ऊष्मायन समय 4 घंटे तक बढ़ाएं।
    4. वैक्यूम सक्शन के साथ ठंडा बुचर फ़नल का उपयोग करके # 2 फ़िल्टर पेपर के माध्यम से मिश्रण को फ़िल्टर करें।
      नोट: इस चरण के अंत में, नमूना के अवशिष्ट फिल्टर पेपर पर दिखाई देते हैं; इसे फिल्टर केक कहा जाता है
    5. 50 मिलीलीटर की 100% इथेनॉल के साथ फिल्टर केक को कुल्ला। छानना बचाओ और 100 मिलीलीटर की 80% जलीय इथेनॉल युक्त 1 एल राउंड-नीचे फ्लास्क में फ़िल्टर केक को जोड़ें।
    6. अवशेषों के लिए निष्कर्षण प्रक्रिया को दोहराएं (चरण 2.1.2 - 2.1.4)
    7. एक अतिरिक्त 50 एमएल के साथ एक गोल नीचे फ्लास्क में दो छानने का मिश्रण80% जलीय इथेनॉल का
      नोट: अंतिम मात्रा लगभग 300 एमएल होनी चाहिए।
    8. विलायक को लुप्त होने के लिए 62 डिग्री सेल्सियस और 50 आरपीएम पर रोटरी बाष्पीकरण का प्रयोग करें। इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि इथेनॉल अब और नहीं उगता है।
      नोट: इस प्रक्रिया में लगभग 45 मिनट लगते हैं
    9. एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब नमूना हस्तांतरण 10 मिनट के लिए ट्यूब के शीर्ष पर नाइट्रोजन गैस को इंजेक्शन करके इथेनॉल का लुप्त हो जाना
      नोट: इथेनॉल के पूरा वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए यह चरण आवश्यक है। इस चरण के नमूने की मात्रा लगभग 20 एमएल है।
    10. कम से कम 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज करें
      नोट: यह चरण अधिक कुशल फ्रीज-सुखाने की प्रक्रिया के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है।
    11. लगभग -8 घंटे के लिए -50 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज़ करें नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
      नोट: निस्तारण ड्रायर नमूने को सुखाने के लिए कक्ष के भीतर -50 डिग्री सेल्सियस पर एक शक्तिशाली वैक्यूम बनाता है, लेकिन अधिकांश पॉलीफे के रूप में यौगिकों को संरक्षित करता हैnols।
  2. कच्चे तेल के अर्क से शुद्ध पॉलीफेनोल अर्क तैयार करना।
    1. फ्रीज सूखे निकाले गए नमूनों का वजन।
      नोट: इस कदम पर निकालने की मात्रा लगभग 10 एमएल है
    2. क्रूड निकालने के लिए क्लोरोफॉर्म के दो संस्करणों (~ 20 एमएल) जोड़ें और हलचल-प्लेट में 5 मिनट के लिए हल करें।
    3. एक अलग फ़नल में मिश्रण डालो। शुद्धि अंश प्राप्त करने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए कच्चे तेल निकालने के लिए चलो।
      नोट: इस चरण पर, एक दो चरण का मिश्रण होगा।
    4. अलग-अलग फ़नल से नीचे की परत (क्लोरोफॉर्म चरण) को हटा दें और जलीय परत को साफ बीकर में जमा करें।
    5. जलीय अंश में एथिल एसीटेट के दो संस्करण जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए मिश्रण हल करने के लिए एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करें।
    6. वैक्यूम चूषण के साथ ठंडा बुचर फ़नल का उपयोग करके # 2 फ़िल्टर पेपर के माध्यम से मिश्रण को फ़िल्टर करें।
    7. फ़िल्टर्ड नमूना ले लीजिए और उसे एक गोल नीचे फ्लास्क पर स्थानांतरित करें,रोटरी बाष्पीकरण के साथ एड
    8. रोटरी बाष्पीकरणकर्ता को 62 डिग्री सेल्सियस और 50 आरपीएम पर सेट करें और लगभग 30 मिनट के लिए एथिल एसीटेट को वाष्पीकरण करें।
    9. लगभग -8 घंटे के लिए -50 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज़ करें नमूना को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में ट्रांसफर करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें

3. बेरी एक्सट्रैक्ट्स के साथ वीएसएमसीएस का उपचार

  1. वीएसएमसीसी संस्कृति
    1. पहले से 29 वर्णित एक एंजाइमेटिक पाचन प्रदर्शन करके स्प्रेग-दावली चूहों के थोरैसिक महासागरों से वीएसएमसी को अलग करना संस्कृति के रूप में वर्णित VSMCs 29
    2. डीएमईएम का उपयोग करते हुए वीएसएमसीएस की संस्कृति के लिए पूर्ण माध्यम तैयार करें जिसमें 1 जी / एल ग्लूकोस युक्त होता है और 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक होता है। पूरा माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  2. पॉलीफेनोल अर्क के साथ वीएसएमसीएस के ऊष्मायन
    1. वीएसएमसी को विभाजित करने के लिए, कल्चर को त्यागेंफिर से मध्यम और फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें। 4 एमएल ऑफ़ पीबीएस और 2 एमएल ऑफ़ ट्रिप्सिन ईडीटीए 0.25% जोड़ें। सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
      1. कोशिकाओं को लीजिए, उन्हें 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूर्ण माध्यम के 2 एमएल के साथ मिश्रण करें, और 5 मिनट के लिए 1,100 × जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ सेल गोली resuspend। एक हेमोसिटामीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें
      2. 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से 50,000 वीएसएमसी बीज बीज और 10% एफबीएस युक्त पूर्ण माध्यम में उन्हें बढ़ाना जब तक कि वे 9 0% संगम (लगभग 3 डी) तक नहीं पहुंच पाते। एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर वीएसएमसी को बनाए रखें।
    2. 1 जी / एल ग्लूकोस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 0.5% एफबीएस वाले डीएमईएम मध्यम का उपयोग कर उपचार के लिए मध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर उपचार माध्यम को स्टोर करें
      नोट: पॉलीफेनोल अर्क और आंग II सीधे मुझे इस का उपयोग कर कोशिकाओं को जोड़ रहे हैंdium।
    3. सादे डीएमईएम माध्यम के 1 एमएल में 10 मिलीग्राम निकालने के द्वारा 10 मिलीग्राम / एमएल क्रूड एक्स्ट्रेक्ट (सीई) या पॉलिफेनोल के शुद्ध एक्स्ट्रेक्ट (पीई) के शेयर समाधान तैयार करें। 200 μL अलोकॉट्स -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक रखें
    4. वीएसएसएमसी से 0.5 एमबी युक्त उपचार माध्यम युक्त 0.5% एफबीएस सेते हैं और 50 से 500 ग्राम / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सीई या पीई अर्क जोड़ते हैं। ताजे पॉलीफेनोल अर्क जोड़कर प्रत्येक 24 घंटे मध्यम बदलें। 3 डी के लिए कोशिकाओं का इलाज करें
    5. आंग II या अन्य हार्मोन और ग्रोथ कारकों के साथ उपचार के लिए, आंग II (100 एनएम) के अलावा, 0.5% एफबीएस युक्त उपचार माध्यम युक्त कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं में सेवन करके कम से कम 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को भूखा।
      नोट: आंग II की सिफारिश के अलावा 0.5% एफबीएस उपचार माध्यम के साथ सीई और पीई के बिना ऊष्मायन।
      1. भुखमरी के 24 घंटे के बाद, 100 एनएम आंग द्वितीय जोड़ें। उपचार के माध्यम से ताजे सीई, पीई, या आंग द्वितीय के साथ प्रत्येक 24 घ 3 डी के लिए बदलें।
  3. सेल के नमूनों की तैयारी
    1. इलाज कोशिकाओं को दो बार ठंडे पीबीएस में धो लें और उन्हें बर्फ पर 200 μL लसीस बफर के साथ लें।
    2. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके सेल lysates ले लीजिए और lysates को 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरित करें। कुल सेल lysates बर्फ से 20 मिनट और भंवर हर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. तीन फट के साथ सेल अर्क को 10 सेकंड के लिए 125 डब्ल्यू पर प्रत्येक के साथ दोहराएं, जिसमें 2 एस पॉज़ के बीच होता है पूरे sonication में बर्फ पर नमूने रखें
    4. 595 एनएम पर प्रोटीन परख अभिकर्मक का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता को मापें
    5. पश्चिमी ब्लॉट द्वारा विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  4. पश्चिमी धब्बा।
    1. 50 μL की अधिकतम कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए नियंत्रण के गैर-इलाज और पॉलिफेनोल-इलाज या आंग द्वितीय-उपचार वाले नमूनों से प्रोसेन (लगभग 50 माइक्रोग्राम) को बराबर मात्रा में मिलाएं। एक 4x Laemmli नमूना बफर के 16 μL जोड़ें। नमूने 5 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर गरम करें
    2. नमूना अलग करें10% एसडीएस-पेज जैल में एसएसआई और विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण के लिए अर्द्ध-सूखा ट्रांसफर सिस्टम में 75 वी के लिए 10 वी पर पीडीवीएफ झिल्ली को स्थानांतरित करें।
    3. टीबीएस 0.05% ट्राइटॉन-एक्स 100 बफर (टीबीएस-टी) में 20 मिनट के लिए 2% दूध के साथ झिल्ली को ब्लॉक करें।
    4. झिल्ली को टीबीएस (5 मिनट प्रत्येक) के साथ कम से कम तीन बार धोने और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ आरटी या ओ / एन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेवन करने से दूध निकाल दें।
    5. झिल्ली को तीन बार धोएं, 10 मिनट प्रत्येक, टीबीएस-टी के साथ, और 45 मिनट के लिए एचआरपी से जुड़े माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
    6. झिल्ली को तीन बार धोएं, 10 मिनट प्रत्येक में, टीबीएस-टी के साथ और बढ़ाया कैमिलामिनिसेंस (ईसीएल) द्वारा विकसित करें।

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Representative Results

यह पहले से दिखाया गया है कि बीएल, आरबी, और बीआरबी से पृथक पॉलीफेनॉल निष्कर्षों ने एजी II 21 के जवाब में वीएसएमसीएस के शिखर को कम कर दिया। यह दिखाया गया है कि इन शुद्ध पॉलीफेनोल अक्टक, पी 38 माइटोजेन प्रोटीन किनासे (एमएपीके), और ईआरके 1/2 के फास्फोरायलेशन को कम करने के द्वारा आंग II सिग्नल को नियंत्रित करता है। बीएल एनएडीएपीएच ऑक्सीडेज (नॉक्स) 1, एक एंजाइम है जो सुपरऑक्साइड आयनों का उत्पादन करता है और दृढ़ता से आंग II द्वारा अपग्रेड कर रहा है, की अभिव्यक्ति को कम करने के द्वारा senescence रोकता है। इसके विपरीत, आरबी और बीआरबी, एक Nox1- स्वतंत्र तंत्र द्वारा senescence को रोकने, क्योंकि वे एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों की अभिव्यक्ति एसओडी 1, एसओडी 2, और ग्लूटाथियोन पेरोक्साइड 1 (जीपीएक्स -1) में वृद्धि करते हैं। बीओएल एसओडी 2 अभिव्यक्ति को बढ़ाने में विफल रहता है, जबकि किसी भी अर्क को एट II 21 द्वारा कैटालेज़ के डाउन्र्र्यूलेशन को कम करने में विफल रहता है। बीएल पर ध्यान केंद्रित किया गया था कि क्या एसओडी 2 और कैटालेज अभिव्यक्ति पर बीएल के असर की कमी हैशुद्धि प्रक्रिया के दौरान पॉलीफेनॉल यौगिकों के नुकसान से या अर्क में एक निश्चित पॉलीफेनॉलिक यौगिक के अपर्याप्त एकाग्रता से समझाया जा सकता है। वीएसएमसीएस 50-500 माइक्रोग्राम / एमएल सीई ( चित्रा 1 ए ) या पीई ( चित्रा 1 बी ) से तीन दिनों के लिए 0.5% एफबीएस युक्त मध्यम में लगाए गए थे। न ही सीई और पीई ने सीओडी 2 या कैटालेस के स्तर को किसी भी तरह की मात्रा में बढ़ाया है। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, ईआरके 1/2 फास्फोराइलेशन मापा गया और यह पाया गया कि सीई ने इस किनेज की फॉस्फोरेलेशन को 300 μg / mL से अधिक सांद्रता में कम कर दिया। इसके विपरीत, पीई लगभग 100 μg / mL ( चित्रा 1 बी ) पर प्रभावी था। 200-500 माइक्रोग्राम / एमएल के सांद्रता में कम फास्फोराइलेशन स्तर देखा गया। ये आंकड़े पिछले अवलोकन का समर्थन करते हैं जो दर्शाता है कि 200 μg / ml बीएल पीई आंग II को कम करने के लिए पर्याप्त है I इन परिणामों से पता चलता है कि पॉलीफेनॉल सी की उच्च सांद्रतापीई में ओम्म्मंड्स, सीई के मुकाबले, ईआरके 1/2 फास्फोरायलेशन को कम करने पर इस अर्क की उच्च दक्षता की व्याख्या कर सकता है। इस विचार का परीक्षण करने के लिए, दोनों निष्कर्षों की पॉलीफेनोल रचनाओं की तुलना की गई थी। सीई में पॉलिफेनॉल यौगिकों की पहचान और मात्रा का ठहराव एचपीएलसी द्वारा किया गया था, जैसा कि पहले 21 ( तालिका 1 ) का वर्णन किया गया था। 3- ओ- कैफीफ़्लोक्लिन एसिड और क्वरेटिन सीई की तुलना में पीई में उच्च स्तर पर मौजूद थे, जबकि फेरिलिक एसिड और रटिन केवल सीई में पाए गए थे। इसके बाद, वी.एस.एम.सी. को 200 एनजी / एमएल बीएल पीई के साथ 24 घंटे के साथ इलाज किया गया था, जो 100 एनएम ए II ( चित्रा 1 सी ) के अतिरिक्त था। जैसा कि पहले 21 की सूचना दी, बीएल पॉलीफेनोल ने आंग II-प्रेरित एआरके 1/2 फास्फोराइलेशन को कम किया, लेकिन कैटालेज और एसओडी 2 की अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया।

आकृति 1
बी ), या 200 माइक्रोग्राम / एमएल पीई ( सी ) 0.5 से 3 डी के लिए% FBS DMEM माध्यम सी ) बीएल पीई के साथ ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, आंग II (100 एनएम) जोड़ा गया था और कोशिकाओं 3 डी के लिए incubated थे मध्यम, ताजा निष्कर्षण और अंग द्वितीय के साथ, हर दिन बदल दिया गया था। तब कोशिकाओं को धोया गया था और lysed, और कुल सेल निष्कर्ष 10% पृष्ठ- एसडीएस जैल में अलग हो गए थे। पश्चिमी ब्लोट्स को फॉस्फोरिलेटेड ईआरके 1/2 (थ्र 202 / टायर 204), ईआरके 1/2, कैटालेज़ और एसओडी 2 और माउस एंटीबॉडी के खिलाफ β-actin के खिलाफ खरगोश एंटीबॉडी के साथ परीक्षण किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Analytes (पीपीएम) पीई सीई
Phenolic एसिड
गैलिक अम्ल 243.5 321.9
पी-कैमरारी एसिड 32.9 46.5
फेरुलिक अम्ल - 236.5
क्लोरोजेनिक एसिड
3-ओ-कैफॉयक्लूकिनिक एसिड 235.3 170.5
4-ओ-कैफ़ेलेक्विनिक एसिड 13 76.9
5-ओ-कैफॉयक्लक्विनिक एसिड 14.1 49.9
flavonoids
flavonols
quercetin 95 24.5
Flavanones
rutin - 37.8

तालिका 1: क्रूड और पॉलीफेनॉल-शुद्ध अर्क में ब्लैकबेरी के पॉलीफेनोल संरचना का विश्लेषण। क्रूड एक्स्ट्रेक्ट (सीई) और शुध्द एक्स्ट्रैक्ट (पीई) में phenolic एसिड और फ्लेवोनोइड का विश्लेषण किया गया था जो उच्च निष्पादन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग किया गया था। विश्लेषणाओं की एकाग्रता को पीपीएम के रूप में व्यक्त किया जाता है। बीएल पीई में पॉलीफेनोल की संरचना हाल ही में प्रकाशित की गई थी और सीई की तुलना में तालिका में जोड़ा गया था।

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Discussion

बेरीज से पृथक पॉलीफेनोल अलग रचनाएं शामिल हैं यहाँ वर्णित इथेनॉल आधारित निष्कर्षण प्रोटोकॉल बीएल ( तालिका 1 ) के क्रूड और शुद्ध पॉलीफेनोल अर्क में उपस्थित फीनिलिक एसिड और फ्लैनोनोइड के विभिन्न स्तरों की पहचान के लिए अनुमति दी गई है। सीई गैलिक एसिड, फेरिलिक एसिड, 4-ओ-कैफेलोक्वायिनिक एसिड, और 5-ओ-कैफेएलेक्विनिक एसिड में समृद्ध था। शुद्धिकरण प्रक्रिया ने गैलिस एसिड और पी-कैमरिरिक एसिड के स्तर को महत्वपूर्ण रूप से बदल दिया। हालांकि, इसने 3- ओ- कैफीफ्लोएक्लेक्निक एसिड के स्तर को बढ़ाकर 170.5 - 235.3 पीपीएम और 24.5 - 95 पीपीएम से क्वरेटिन लगा दिया। इसके विपरीत, फेरिलिक एसिड और रटिन सीई के शुद्धि के दौरान खो गए थे।

50 - 500 μg / एमएल सीई और पीई के साथ वीएसएमसी के उपचार से पता चला कि दोनों अर्क ईआरके 1/2 के बेसल फास्फोरेटेशन को कम करने में प्रभावी थे। हालांकि, पीई ने निम्न घनत्व पर इस किनेज की गतिविधि में एक मजबूत रेखांकित किया: 100 & #सीई के लिए 400 - 500 माइक्रोग्राम / एमएल के मुकाबले पीई के लिए 181 जी / एमएल ये परिणाम पीई में पाए गए 3- ओ- कैफफ़ेयक्क्विनीक एसिड या क्वरेटिन की उच्च एकाग्रता को दर्शा सकते हैं। संस्कृति में कोशिकाओं में व्यक्तिगत फिनालिक यौगिकों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है जो कि विशिष्ट संयुग्म (ए) को ईआरके 1/2 फास्फोरायलेशन के डाउनड्यूएशन के लिए जिम्मेदार है।

एटीटी, ईआरके 1/2, और पी 38 एमएपीके सहित सिग्नलिंग कीइंसेस की कमी हुई गतिविधि, बीएल, आरबी, और बीआरबी 21 से पृथक शुद्ध पॉलिफेनोल और बीआर सीई के कारण ईआरके 1/2 की वजह से हुई है, जो यहां दिखाए गए हैं पिछले रिपोर्ट उदाहरण के लिए, ब्लूबेरी से पृथक पॉलीफेनोल निष्कर्षण ने स्तन कैंसर कोशिकाओं के ट्यूमर के विकास में कमी की, आक्ट और ईआरके 1/2 30 की गतिविधि को कम करके। जैसा कि पहले बताया गया है, इन किनेस भी आंग II 21 द्वारा सेलुलर सिनेंस की प्रेरण में शामिल हैं, सुझाव देते हैं कि बीएल, आरबी, और बीआरबी शोल से पॉलीफेनोलडी सीवीडी के साथ जुड़े संवहनी उम्र बढ़ने और डिसफंक्शन को कम करना

जैसा कि हमने पहले 21 की सूचना दी, सीटीएएल और एसओडी 2 की अभिव्यक्ति को पीई द्वारा अपग्रेड नहीं किया गया था, यहां तक ​​कि 500 ​​μg / mL के उच्च के सांद्रता में भी। चूंकि सीटलाज़ और एसओडी 2 की अभिव्यक्ति बढ़ने में सीई भी अप्रभावी थी, ये आंकड़े बताते हैं कि शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के दौरान खोए गए फीनॉलिक यौगिकों को इन एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों के नियमन में शामिल नहीं किया गया है। इन आंकड़ों से यह भी पता चलता है कि शुद्धिकरण प्रोटोकॉल यहां दिखाया गया है कि एंग II सिगनलिंग, ऑक्सीडेटिव तनाव, और सेलुलर सिनेंस के विनियमन से संबंधित फीनोलिक यौगिकों को प्रभावी ढंग से केंद्रित किया गया है। उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं कि पीई दृढ़ता से एंज II प्रेरित ERK1 / 2 फास्फोराइलेशन इस किनेज के फास्फोरायलेशन का आकलन प्रासंगिक है क्योंकि ईआरके 1/2 गतिविधि के अवरोध ने एंग II-प्रेरित सेलुलर senescence 21 को रोका है।

टी मेंपिछले प्रोटोकॉल के संशोधनों के कारण, सीओ के लिए निष्कर्षण उपज बढ़ाने के लिए यहां एक सोनोनिंग जोड़ा गया था। इसके अतिरिक्त, पॉलिफेनोल की शुद्धिकरण के लिए, सी 18 कारतूस का उपयोग करने के बजाय, जैसा कि किम और ली 27 द्वारा वर्णित है, Queires एट अल से एक अधिक पारंपरिक विधि 28 यहाँ अपनाया गया था पॉलिफेनोल अनुभाग की शुद्धि के लिए अशुद्धियों को निकालने के लिए फ़िल्टर पेपर का इस्तेमाल करते हुए एक छानने का कदम रखा गया था। सीमाओं के संदर्भ में, इस्तेमाल किए जाने वाले उपकरण के अनुसार सावधानी और वाष्पीकरण के चरणों का सावधानीपूर्वक निरीक्षण किया जाना चाहिए, क्योंकि sonication और वाष्पीकरण की अवधि और तापमान, इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं। इस पद्धति में जोड़े गए संशोधनों के परिणामस्वरूप हमारी प्रयोगशाला (डेटा नहीं दिखाया गया) में इस्तेमाल किए गए पिछले 27 तरीकों , 27 की तुलना में पॉलिफेनोल की उच्च उपज में हुई, संभवतः एक सोनिकेशन चरण के अतिरिक्त होने के कारण। के रूप में mentiप्रोटोकॉल अनुभाग में लगाया जाता है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न बेरीज से फ्रीज-सूखे पाउडर के लिए और साथ ही जमे हुए फल के लिए भी किया जा सकता है। पॉलिफ़ेनोल को रास्पबेरी और काली रास्पबेरी से 21 निकालने और शुद्ध करने के लिए इस विधि का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, साथ ही साथ ब्लूबेरी और स्ट्रॉबेरी (डेटा नहीं दिखाया गया है)। इस प्रकार, इस पद्धति का उपयोग सब्जी सहित अन्य प्रकार के खाद्य पदार्थों से पॉलिफेनोल निकालने के लिए भी किया जा सकता है।

निष्कर्ष में, यह काम बेरी से पॉलिफेनोल को अलग करने के लिए एक तेज़, लागत प्रभावी, और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का विवरण देता है, जो कि वी.एस.एम.सी. में ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रति सुरक्षात्मक अवयवों के प्रतिधारण और एकाग्रता की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (14GRNT20180028) और फ्लोरिडा स्टेट यूनिवर्सिटी काउंसिल ऑन रिसर्च एंड क्रिएटिविटी (सीओओएफआरएस) ने वित्त पोषित किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000		 Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

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References

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रसायन विज्ञान अंक 125 पॉलीफेनोल ब्लैकबेरी नाड़ी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं एंजियोटेंसिन II सेल सिग्नलिंग senescence
संवहनी चिकना मस्तिष्क कोशिकाओं के उपचार के लिए रुक-सूखे बेरी पाउडर से पॉलीफेनोल के निष्कर्षण और शुद्धि<em&gt; विट्रो में</em
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Feresin, R. G., Pourafshar, S.,… More

Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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