Summary
Dette arbejde beskriver en trin-for-trin metode til fremstilling af polyphenol-rige ekstrakter fra frysetørret bærpulver. Derudover giver den en grundig beskrivelse af, hvordan man bruger disse polyphenolrige ekstrakter i cellekultur i nærvær af peptidhormon angiotensin II (Ang II) ved hjælp af vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er).
Abstract
Epidemiologiske undersøgelser tyder på, at øget flavonoid indtagelse korrelerer med nedsat dødelighed på grund af hjerte-kar-sygdomme (CVD) i USA og USA. Bær er meget forbrugt i USA og har et højt polyphenolisk indhold. Polyfenoler har vist sig at interagere med mange molekylære mål og udøve adskillige positive biologiske funktioner, herunder antioxidant, antiinflammatoriske og kardioprotektive virkninger. Polyfenoler isoleret fra blackberry (BL), hindbær (RB) og sort hindbær (BRB) reducerer oxidativ stress og cellulær senescence som svar på angiotensin II (Ang II). Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af protokollen, der anvendes til fremstilling af polyphenolekstrakterne fra frysetørrede bær. Polyphenolekstraktioner fra frysetørret bærpulver blev udført under anvendelse af 80% vandig ethanol og en ultralydassisteret ekstraktionsmetode. Det rå ekstrakt blev yderligere oprenset og fraktioneret under anvendelse af chloroform og ethylacetat,henholdsvis. Virkningerne af både rå og oprensede ekstrakter blev testet på vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) i kultur.
Introduction
Polyfenoler er forbindelser indeholdende mindst en phenolisk ring i deres struktur og er rigeligt til stede i planteområdet 1 . Mennesker har brugt planter i årtusinder til medicinske formål uden at være opmærksom på eksistensen af sådanne forbindelser 2 . Mange frugter og grøntsager har nogle delte polyphenoliske forbindelser, om end med forskellige mængder, herunder flavonoider, stilbener og phenol syrer 3 . Selvom polyfenoler ofte er forbundet med farverige frugter og grøntsager, er dette ikke strengt sandt. For eksempel er zeaxanthin og xanthin til stede i grøntsager, der ikke er yderst farverige, såsom løg og hvidløg, der er fra familien af scallions og er forbundet med mange sundhedsmæssige fordele 4 . Bortset fra at være forbundet med flere sundhedsmæssige fordele 5 , tjener polyphenoler også planter ved at beskytte dem mod insekterD ultraviolet stråling 2 . Polyfenoler findes almindeligvis i den menneskelige kost og betragtes som kraftige antioxidanter, da de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) 6 , 7 , 8 . De har også antiinflammatoriske 9 , antimikrobielle 10 , antihypertensive 11 og anti-kræftfremkaldende 12 , 13 egenskaber.
Epidemiologiske undersøgelser viser en invers forbindelse mellem forbruget af flavonoider og kardiovaskulær sygdom (CVD) incidensen 16 , 17 og dødelighed 14 , 15 . Bær er meget forbrugt i USA og har store mængder polyphenoler, herunder flavonoider. For eksempel forbrug af blackberry (BL) juice (300 ML / d) i otte uger signifikant nedsat systolisk blodtryk hos dyslipidemiske patienter 18 . Jeong et al. 19 rapporterede, at prehypertensive mænd og kvinder forbruge 2,5 g sort hindbær (BRB) ekstrakt om dagen havde lavere 24-timers og nattt blodtryk sammenlignet med dem, der indtog en placebo. Hindbær (RB) reducerede blodtrykket, mens ekspression af superoxiddismutase (SOD) blev øget hos spontant hypertensive rotter 20 . Det har for nylig vist sig, at BL, RB og BRB reducerer niveauerne af ROS og senescence induceret af angiotensin II (Ang II) i vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) 21 . Desuden reducerede anthocyaninfraktionen fra BL-ekstrakt ekspressionen af inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) og inhiberede aktiviteten af Nuclear Factor kappa B (NF-KB) og ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) i lipopolysaccharid (LPS) -stimuleret J774 cellerAss = "xref"> 22. BRB-ekstrakter reducerede NF-KB-aktiveringen og cyclooxygenase 2 (COX-2) -expressionen in vitro 23 , forbedrede lipidprofilen og forhindrede atheroscleroselæsionsdannelse hos mus, der fodrede en fedtholdig diæt 24 . Anthocyaniner, der betragtes som de mest omfattende flavonoider i bær, modulerer det inflammatoriske respons i LPS-stimulerede RAW 264.7-makrofager ved at reducere Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produktion 25 og reducere proliferationen og migreringen af VSMC'er 26 .
Da der har været voksende interesse for at forstå polyphenols rolle i menneskers sundhed og sygdom, er det vigtigt at optimere ekstraktionsmetoden. Opløsningsmiddeludvindingen bruges i vid udstrækning til det formål, da det er omkostningseffektivt og let reproducerbart. I denne undersøgelse blev en opløsningsmiddelekstraktion anvendt med ethanol sammen med en ultralydassisteret ekstraktionN-metode, som blev tilpasset fra Kim og Lee 27 . Rensningen og fraktioneringen af råekstrakter (CE) under anvendelse af chloroform og ethylacetat blev udført for at opnå den oprensede ekstrakt (PE) fraktion, som var tilpasset fra Queires et al. 28 . Endvidere blev effektiviteten af rå versus oprensede polyphenolekstrakter fra BL sammenlignet med BL ved reduktion af den basale phosphorylering af ERK1 / 2 sammenlignet, og repræsentative eksempler på den inhibitoriske virkning af oprenset BL-polyphenolekstrakt på Ang II-inducerede signalreduktioner i VSMC'er blev tilvejebragt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af reagenser
- Tilbered 80% ethanol (100 ml) ved at blande 80 ml absolut ethanol (molekylærbiologi-grade) og 20 ml steriliseret cellekulturklasse.
- For at forberede polyphenol ekstrakt (10 mg / ml), veje 10 mg CE eller PE. Tilsæt 1 ml almindeligt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) under en cellekulturhætte. Vortex opløsningen. Aliquot i 200 μl portioner og opbevar ved -20 ° C.
- Forbered lysis buffer.
- Tilsæt 5 ml 1 M HEPES stamopløsning (pH 7,4; 50 mM endelig), 1 ml 5 M NaCl stamopløsning (50 mM endelig), 1 ml 0,5 M EDTA stamopløsning (5 mM endelig), 2 ml 0,5 M NaF stamopløsning (10 mM endelig), 286 μl 700 mM Na3VO4 stamopløsning (2 mM endelig), 5 ml 200 mM Na4P207 stamopløsning (10 mM endelig) og 5 ml 20% Triton-X-100 stamopløsning fremstillet i vand (1% endelig). Tilsæt vand for at nå et volumen på 100 ml. Opbevares ved 4 ° C.
- Forbered Laemmli prøvebuffer (4x).
- Tilsæt 31,25 ml 2 M Tris stamopløsning (pH 6,8), 100 ml glycerol, 50 ml af en 20% natriumdodecylsulfatopløsning (SDS) fremstillet i vand og 50 ml β-mercaptoethanol. Tilsæt vand op til 250 ml. Opbevares ved 4 ° C.
- Til fremstilling af Tris-Buffered Saline (TBS) puffer vejes 3 g Tris (25 mM endelig), 0,18 g KCl (2,5 mM endelig) og 8,76 g NaCl (150 mM endelig). Juster pH til 7,4 og tilsæt vand op til 1 L. Opbevares ved stuetemperatur.
- Til fremstilling af TBS-T tilsættes 997,5 ml TBS og 2,5 ml af en 20% Triton-X-100 opløsning fremstillet i vand. Opbevares ved RT.
2. Fremstilling af blackerereekstrakter
- Fremstilling af rå ekstrakt fra frysetørret bærpulver.
- Væg 10 g frysetørret blackberry pulver (eller 5 g frisk pulver). Hvis der anvendes frusen frugt, skal du klippe den iNto meget små stykker, før udvindingen påbegyndes.
- Bland frugtpulveret med 100 ml 80% vandig ethanol i en 1 L rundbundet Erlenmeyer-kolbe.
- Sonikere blandingen i 20 minutter ved 42 kHz, 135 W ved anvendelse af et ultralydbad ved 25 ° C uden noget tidsinterval imellem. Udfør sonikering med kontinuerlig kvælstofrensning i dæmpet lys. For frosset frugt øges inkubationstiden til 4 timer.
- Filtrer blandingen gennem et filterpapir nr. 2 ved hjælp af en kølet Buchner-tragt med vakuumsugning.
BEMÆRK: I slutningen af dette trin vises rester af prøven på filterpapiret; Dette kaldes filterkage. - Skyl filterkagen med 50 ml 100% ethanol. Gem filtratet og tilsæt filterkagen til en 1 L rundbundet kolbe indeholdende 100 ml 80% vandig ethanol.
- Gentag udvindingsprocessen for resten (trin 2.1.2 - 2.1.4).
- Kombiner de to filtrater i en rundbundet kolbe med yderligere 50 mlAf 80% vandig ethanol.
BEMÆRK: Det endelige volumen skal være ca. 300 ml. - Brug en rotationsinddamper ved 62 ° C og 50 omdr./min for at afdampe opløsningsmidlet. Fortsæt denne proces, indtil ethanol ikke fordamper længere.
BEMÆRK: Denne proces tager cirka 45 min. - Overfør prøven til et 50 ml konisk rør. Inddamp ethanol ved at injicere nitrogengas øverst i røret i 10 minutter.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at sikre fuldstændig fordampning af ethanol. Proevevolumenet ved dette trin er ca. 20 ml. - Frys prøven ved -80 ° C i mindst 24 timer.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at muliggøre en mere effektiv frysetørringsproces. - Frysetør prøven ved -50 ° C i ca. 8 timer. Opbevar prøverne ved -20 ° C.
BEMÆRK: Fryseapparatet skaber et kraftigt vakuum ved -50 ° C inde i kammeret for at tørre prøverne, men bevarer de fleste af forbindelserne, såsom polyphenNols.
- Fremstilling af rensede polyphenolekstrakter fra råekstrakter.
- Væg de frysetørrede ekstraherede prøver.
BEMÆRK: Udvindingsvolumenet ved dette trin er ca. 10 ml. - Tilsæt to volumener (~ 20 ml) chloroform til råekstraktet og ryst opløsningen i 5 minutter i en omrøringsplade.
- Hæld blandingen i en skilletragt. Lad råproduktet dekanteres i 1 time ved stuetemperatur for at opnå den oprensede fraktion.
BEMÆRK: Ved dette trin vil der dannes en tofaset blanding. - Kassér bundlaget (chloroformfasen) fra skilletragten og opsaml det vandige lag i et rent bægerglas.
- Tilsæt to volumener ethylacetat til den vandige fraktion og anvend en magnetisk omrøringsstang for at omrøre blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Filtrer blandingen gennem filterpapir nr. 2 ved hjælp af en kølet Buchner-tragt med vakuumsugning.
- Saml den filtrerede prøve og overfør den til en rundbundet kolbe for at være osEd med rotationsfordamperen.
- Indstil rotationsfordamperen til 62 ° C og 50 omdr./minut og fordamp ethylacetatet i ca. 30 minutter.
- Frysetør prøven ved -50 ° C i ca. 8 timer. Overfør prøven til et 50 ml konisk rør og opbevar det ved -20 ° C.
- Væg de frysetørrede ekstraherede prøver.
3. Behandling af VSMC'er med Berry Extracts
- VSMCs kultur.
- Isoler VSMC'er fra thoracale aorta af Sprague-Dawley rotter ved at udføre en enzymatisk fordøjelse som tidligere beskrevet 29 . Kultur VSMC'erne som beskrevet 29 .
- Forbered komplet medium til dyrkning af VSMC'er ved anvendelse af DMEM indeholdende 1 g / L glucose og suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin og 2 mM L-glutamin. Opbevar det komplette medium ved 4 ° C.
- Inkubation af VSMC'er med polyphenolekstrakter.
- For at opdele VSMC'erne, kassér cultuRe medium og vask cellerne to gange med phosphatbufret saltopløsning (PBS). Tilsæt 4 ml PBS og 2 ml trypsin EDTA 0,25%. Inkuber cellerne i 5 minutter ved 37 ° C i en CO2-inkubator.
- Saml cellerne, bland dem med 2 ml komplet medium i et 15 ml centrifugerør og centrifuger ved 1.100 × g i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspender cellepellet med 1 ml PBS. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
- Sæd 50.000 VSMC'er pr. Brønd i 6-brønds kulturplader og dyrk dem i komplet medium indeholdende 10% FBS indtil de når 90% konfluens (ca. 3 d). Oprethold VSMC'erne ved 37 ° C i en befugtet 5% CO 2 -kuvator.
- Fremstil mediet til behandlingen ved anvendelse af DMEM-medium indeholdende 1 g / l glucose, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 0,5% FBS. Opbevar behandlingsmediet ved 4 ° C.
BEMÆRK: Polyfenolekstrakter og Ang II tilsættes direkte til celler, der bruger denne migdium. - Forbered en stamopløsning af 10 mg / ml råekstrakt (CE) eller renset ekstrakt (PE) af polyphenoler ved at opløse 10 mg ekstrakt i 1 ml almindeligt DMEM-medium. Opbevar bestanddelen i 200 μl alikvoter ved -20 ° C.
- Inkuber VSMC'erne med 2 ml behandlingsmedium indeholdende 0,5% FBS og tilsæt enten CE- eller PE-ekstrakter for at opnå en koncentration på 50-500 μg / ml. Skift medie hver 24. time ved at tilføje friske polyphenolekstrakter. Behandl cellerne i 3 d.
- Til behandling med Ang II eller andre hormoner og vækstfaktorer, sulter cellerne i mindst 24 timer ved at inkubere cellerne med behandlingsmedium indeholdende 0,5% FBS før tilsætning af Ang II (100 nM).
BEMÆRK: Inkubation med og uden CE og PE i 0,5% FBS behandlingsmedium, før tilsætning af Ang II anbefales.- Efter 24 timer med sult, tilsættes 100 nM Ang II. Udskift behandlingsmediet med frisk CE, PE eller Ang II hver 24 time i 3 d.
- For at opdele VSMC'erne, kassér cultuRe medium og vask cellerne to gange med phosphatbufret saltopløsning (PBS). Tilsæt 4 ml PBS og 2 ml trypsin EDTA 0,25%. Inkuber cellerne i 5 minutter ved 37 ° C i en CO2-inkubator.
- Fremstilling af celleprøver.
- Vask de behandlede celler to gange i kold PBS og lys dem med 200 μl lysisbuffer på is.
- Saml cellelysater ved hjælp af celleskrabere og overfør lysaterne til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Inkubér de totale cellelysater i 20 minutter på is og hvirvel hver 5 min.
- Sonikér celleekstrakterne med tre udbrud ved 125 W i 10 s hver med en 2 s pause i mellem. Opbevar prøverne på is gennem sonikering.
- Mål proteinkoncentrationen ved anvendelse af et proteinassayreagens ved 595 nm.
- Opbevar prøverne ved -20 ° C til analyse ved Western blot.
- Western blot.
- Bland lige mængder protein (ca. 50 μg) fra kontrol-ikke-behandlede og polyphenolbehandlede eller Ang II-behandlede prøver med lysisbuffer for at opnå et maksimalt totalvolumen på 50 μl. Tilsæt 16 μl af en 4x Laemmli prøvebuffer. Opvarm prøverne i 5 minutter ved 75 ° C.
- Adskil sampletEs i 10% SDS-PAGE-geler og overfør dem til PDVF-membraner ved 10 V i 75 minutter i et semi-tørt overførselssystem til Western blot-analyse med specifikke antistoffer.
- Bloker membranen med 2% mælk i TBS 0,05% Triton-X100 buffer (TBS-T) i 20 minutter.
- Fjern mælken ved at vaske membranen mindst tre gange med TBS (5 min hver) og inkuber med primære antistoffer i 1 time ved RT eller O / N ved 4 ° C.
- Vask membranen tre gange, 10 minutter hver, med TBS-T og inkuber med et HRP-bundet sekundært antistof i 45 minutter.
- Vask membranen tre gange, 10 minutter hver, med TBS-T og udvikle ved forbedret kemiluminescens (ECL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er tidligere blevet påvist, at polyphenolekstrakter isoleret fra BL, RB og BRB reducerede senescensen af VSMC'er som svar på Ang II 21 . Det har vist sig, at disse oprensede polyphenolekstrakter modulerer Ang II-signalering ved at reducere phosphoryleringen af Akt, p38-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og ERK1 / 2. BL forhindrer senescens ved at reducere ekspressionen af NADPH oxidasen (Nox) 1, et enzym der producerer superoxidanioner og er stærkt opreguleret af Ang II. I modsætning hertil forhindrer RB og BRB senescens ved en Nox1-uafhængig mekanisme, da de øger ekspressionen af antioxidant enzymerne SOD1, SOD2 og glutathionperoxidase 1 (GPx-1). BL undlader at øge SOD2-ekspression, medens ingen af ekstraktene dæmper nedreguleringen af katalase af Ang II 21 . BL var fokuseret på at bestemme, om manglen på effekt af BL på SOD2 og katalaseekspression kunneForklares ved et tab af polyphenolforbindelser under rensningsprocessen eller ved en utilstrækkelig koncentration af en bestemt polyphenolisk forbindelse i ekstraktet. VSMC'er blev inkuberet med 50-500 μg / ml CE ( figur 1A ) eller PE ( figur 1B ) i medium indeholdende 0,5% FBS i tre dage. Hverken CE eller PE øgede SOD2 eller katalasniveauer ved nogen af de testede koncentrationer. Som en positiv kontrol blev ERK1 / 2-phosphorylering målt, og det blev fundet, at CE reducerede phosphoryleringen af denne kinase i koncentrationer højere end 300 μg / ml. I modsætning hertil var PE effektiv ved ca. 100 μg / ml ( figur 1B ). Lavt phosphoryleringsniveauer blev observeret ved koncentrationer på 200-500 μg / ml. Disse data understøtter den tidligere observation, der viser, at 200 μg / mL BL PE er tilstrækkelig til at reducere Ang II signalering 21 . Disse resultater tyder på, at højere koncentrationer af polyphenol cOmpounds i PE sammenlignet med CE, kunne forklare den højere effektivitet af dette ekstrakt ved at reducere ERK1 / 2-phosphorylering. For at teste denne idé blev polyphenolsammensætningerne af begge ekstrakter sammenlignet. Identifikationen og kvantificeringen af polyphenolforbindelser i CE blev udført ved HPLC som tidligere beskrevet 21 ( tabel 1 ). 3- O- caffeoylquininsyre og quercetin var til stede ved højere niveauer i PE sammenlignet med CE, mens ferulsyre og rutin kun blev fundet i CE. Dernæst blev VSMC'er behandlet med 200 μg / ml BL PE i 24 timer før tilsætningen af 100 nM Ang II ( figur 1C ). Som tidligere rapporteret 21 reducerede BL-polyphenolekstraktet Ang II-induceret ERK1 / 2-phosphorylering, men viste ingen virkning på katalase- og SOD2-ekspression.
| Analyser (ppm) | PE | CE |
| Phenol syrer | ||
| Gallinsyre | 243,5 | 321,9 |
| P-coumarsyre | 32.9 | 46,5 |
| Ferulinsyre | - | 236,5 |
| Chlorogene syrer | ||
| 3-0-caffeoylquininsyre | 235,3 | 170,5 |
| 4-0-caffeoylquininsyre | 13 | 76,9 |
| 5-0-caffeoylquininsyre | 14.1 | 49,9 |
| flavonoider | ||
| flavonoler | ||
| Quercetin | 95 | 24.5 |
| flavanoner | ||
| rutin | - | 37,8 |
Tabel 1: Analyse af polyphenolsammensætningen af Blackberry i rå og polyphenol-rensede ekstrakter. Fenoliske syrer og flavonoider i råekstrakt (CE) og oprenset ekstrakt (PE) blev analyseret under anvendelse af højpræcisionsvæskekromatografi (HPLC). Koncentrationen af analyter udtrykkes som ppm. Sammensætningen af polyphenoler i BL PE blev for nylig offentliggjort 21 og tilføjet til tabellen, der skal sammenlignes med CE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyfenoler isoleret fra bær indeholder tydelige præparater. Den her beskrevne ethanolbaserede ekstraktionsprotokol tillader identifikation af forskellige niveauer af phenol syrer og flavonoider, der findes i rå og rensede polyphenolekstrakter af BL ( tabel 1 ). CE blev beriget i gallinsyre, ferulinsyre, 4-0-caffeoylquininsyre og 5-0-caffeoylquininsyre. Renseprocessen ændrede ikke signifikant niveauerne af gallinsyre og p-coumarsyre. Det øgede imidlertid niveauerne af 3- O- caffeoylquininsyre fra 170,5 - 235,3 ppm og quercetin fra 24,5 - 95 ppm. I modsætning hertil tabte ferulinsyre og rutin under rensningen af CE.
Behandlingen af VSMC'er med 50-500 μg / ml CE og PE viste, at begge ekstrakter var effektive til at reducere basal phosphorylering af ERK1 / 2. PE viste imidlertid en stærkere nedregulering i aktiviteten af denne kinase ved en lavere koncentration: 100 & #181; g / ml for PE sammenlignet med 400-500 μg / ml for CE. Disse resultater kan afspejle den højere koncentration af 3- O- caffeoylquininsyre eller quercetin, der findes i PE. Anvendelsen af individuelle phenolforbindelser i celler i kultur er nødvendig for at identificere den specifikke forbindelse (er) der er ansvarlig for nedreguleringen af ERK1 / 2-phosphorylering.
Den reducerede aktivitet af signaleringskinaser, herunder Akt, ERK1 / 2 og p38MAPK, forårsaget af rensede polyphenoler isoleret fra BL, RB og BRB 21 samt af ERK1 / 2 forårsaget af BL CE, som vist her, er i overensstemmelse med Tidligere rapporter. For eksempel faldt polyphenolekstrakter isoleret fra blåbær tumorvæksten af brystcancerceller, dels ved at reducere aktiviteten af Akt og ERK1 / 2 30 . Som tidligere nævnt er disse kinaser også involveret i induktionen af cellulær senescens af Ang II 21 , hvilket tyder på, at polyphenoler fra BL, RB og BRB shoulD reducere vaskulær aldring og dysfunktion i forbindelse med CVD.
Som vi rapporterede tidligere 21 blev katalase- og SOD2-ekspression ikke opreguleret af PE, selv i koncentrationer så højt som 500 μg / ml. Da CE også var ineffektivt ved forøgelse af katalase- og SOD2-ekspression, tyder disse data på, at de phenolforbindelser, der er tabt under rensningsprotokollen, ikke er involveret i reguleringen af disse antioxidante enzymer. Disse data antyder også, at den her viste rensningsprotokol koncentrerede effektivt phenolforbindelser, der er relevante for reguleringen af Ang II-signalering, oxidativ stress og cellulær senescens. For eksempel viser de repræsentative resultater, at PE stærkt nedreguleret Ang II-induceret ERK1 / 2-phosphorylering. Vurderingen af phosphoryleringen af denne kinase er relevant, fordi inhiberingen af ERK1 / 2-aktivitet forhindrede Ang II-induceret cellulær senescens 21 .
I tÆndringer af modifikationer til tidligere protokoller blev der tilføjet en sonikering her for at øge ekstraktionsudbyttet for CE. Yderligere til rensning af polyphenoler, i stedet for at anvende en C18-patron, som beskrevet af Kim og Lee 27 , en mere traditionel metode fra Queires et al . 28 blev vedtaget her. Et filtreringstrin ved anvendelse af filterpapir til fjernelse af urenheder blev tilsat til rensningen af polyphenolsektion. Med hensyn til begrænsninger bør sonikations- og fordampningstrinene overvåges nøje alt efter hvilken type instrument der anvendes, da lydstyrken og temperaturen af sonikering og fordampning er de kritiske trin i denne protokol. Modifikationerne tilføjet til denne metode resulterede i det højeste udbytte af polyphenoler sammenlignet med tidligere metoder 27 , 28 anvendt i vores laboratorium (data ikke vist), sandsynligvis på grund af tilsætningen af et sonikeringstrin. Som mentiDenne protokol kan anvendes til frysetørret pulver fra forskellige bær såvel som til frosne frugter. Denne metode har med succes været anvendt til at ekstrahere og rense polyphenoler fra hindbær og sorte hindbær 21 såvel som fra blåbær og jordbær (data ikke vist). Således kan denne metode også bruges til at ekstrahere polyphenoler fra andre typer fødevarer, herunder grøntsager.
Sammenfattende beskriver dette arbejde en hurtig, omkostningseffektiv og let reproducerbar metode til at isolere polyphenoler fra bær, hvilket muliggør opbevaring og koncentration af forbindelser, som er beskyttende mod oxidativ stress i VSMC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af American Heart Association (14GRNT20180028) og Florida State University Council for Research and Creativity (COFRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
