Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55605
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Dietetics and Nutrition, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Nutrition, Food and Exercise Sciences, Florida State University, 3Center for Advancing Exercise and Nutrition Research on Aging (CAENRA), Florida State University

Summary

עבודה זו מפרטת שיטה שלב אחר שלב להכנת תמציות פוליפנול עשיר מאבקת יער מיובש בהקפאה. בנוסף, הוא מספק תיאור יסודי של איך להשתמש אלה poliphenol עשיר תמציות בתרבית תאים בנוכחות של הפפטיד הורמון אנגיוטנסין II (Ang II) באמצעות כלי דם וסקולרים חלקות (VSMCs).

Abstract

מחקרים אפידמיולוגיים מצביעים על עלייה בצריכת פלבנואידים עם ירידה בתמותה כתוצאה ממחלות לב וכלי דם (CVD) בארה"ב (ארה"ב) ובאירופה. פירות יער נצרכים באופן נרחב בארה"ב ויש להם תוכן פוליפנולי גבוה. פוליפנולים הראו אינטראקציה עם מטרות מולקולריות רבות כדי להפעיל פונקציות ביולוגיות חיוביות רבות, כולל נוגדי חמצון, אנטי דלקתיות, ואפקטים cardioprotective. פוליפנולים המבודדים מאוכמניות (BL), פטל (RB) ופטל שחור (BRB) מפחיתים את הלחץ החמצוני ואת הזיהום הסלולרי בתגובה לאנגיוטנסין II (Ang II). עבודה זו מספקת תיאור מפורט של הפרוטוקול המשמש להכנת תמציות פוליפנול מ גרגרים יבשים להקפיא. תמציות פוליפנול מ אבקת ברי יבשים להקפיא בוצעו באמצעות אתנול מימית 80% ושיטת מיצוי קולי. התמצית הגולמית היתה מטוהרת ומנותקת באמצעות כלורופורם ואתיל אצטט,בהתאמה. ההשפעות של תמציות גס ו מטוהרים נבדקו על כלי הדם חלקות תאים (VSMCs) בתרבות.

Introduction

פוליפנולים הם תרכובות המכילות לפחות טבעת פנולית אחת במבנה שלהם נמצאים בשפע בממלכת הצמח 1 . בני אדם כבר לצרוך צמחים אלפי שנים למטרות רפואיות מבלי להיות מודע לקיומם של תרכובות כאלה 2 . פירות וירקות רבים יש כמה תרכובות פוליפנוליות משותפות, אם כי עם כמויות שונות, כולל פלבנואידים, stilbenes, וחומצות פנוליות 3 . למרות polyphenols קשורות לעיתים קרובות עם פירות וירקות צבעוניים, זה לא נכון לחלוטין. לדוגמה, zeaxanthin ו xanthine נמצאים בירקות שאינם צבעוניים מאוד, כגון בצל ושום, אשר ממשפחת scallions והם קשורים עם יתרונות בריאותיים רבים 4 . מלבד היותו קשור למספר יתרונות בריאותיים 5 , polyphenols גם לשרת צמחים על ידי הגנה עליהם מפני חרקיםקרינה אולטרה סגולה. פוליפנולים נמצאים בדרך כלל בתזונה האנושית ונחשבים לחומרים נוגדי חמצון רבי עוצמה, שכן הם יכולים לסקור את מימן החמצן (ROS) 6 , 7 , 8 . יש להם גם אנטי דלקתיות 9 , מיקרוביאלית 10 , נגד יתר לחץ דם 11 , ו אנטי מסרטנים 12 , 13 נכסים.

מחקרים אפידמיולוגיים מראים קשר הפוך בין צריכת הפלבנואידים לבין מחלות לב וכלי דם (CVD) , 16 , 17 ותמותה 14 , 15 . פירות יער הם נצרך נרחב בארה"ב יש כמויות גבוהות של פוליפנולים, כולל פלבנואידים. לדוגמה, צריכת מיץ (BL) מיץ (300) מ"ל / ד) במשך שמונה שבועות ירדה באופן משמעותי לחץ דם סיסטולי בחולים דיסליפידים 18 . Jeong et al. 19 דיווחו כי גברים ונשים לפני יתר לחץ דם, שצרכו 2.5 גרם של תמצית פטל שחור (BRB) ביום, היו בעלי לחץ דם נמוך יותר 24 שעות ולילה בהשוואה לאלו שצרכו פלסבו. פטל (RB) הוריד את לחץ הדם תוך הגברת הביטוי של superoxide dissutase (SOD) בעכברי יתר לחץ דם באופן ספונטני 20 . זה הוכח לאחרונה כי BL, RB, ו BRB להפחית את רמות ROS ו ההזדקנות המושרה על ידי אנגיוטנסין II (אנג II) ב וסקולרים חלקות תאי שריר (VSMCs) 21 . בנוסף, חלק האנתוציאנינים מתמצית BL הפחית את הביטוי של סינתזה חנקתית חנקתית (iNOS) ועכב את פעילותו של גורם גרעיני kappa B (NF-κB) ו- Kinase של תאית (ERK) תאית (ERK) ב- Lipopolysaccharide (LPS) J774 תאיםהתחת = "xref"> 22. תמציות BRB הפחיתו את ההפעלה NF-κB ו cyclooxygenase 2 (COX-2) ביטוי במבחנה 23 , שיפור פרופיל השומנים, ומניעת היווצרות טרשת עורקים בעכברים הזנת דיאטה דלת שומן 24 . אנתוציאנינים, אשר נחשבים flavonoids שופע ביותר של פירות יער, לווסת את התגובה דלקתיים LPS- מגורה RAW 264.7 מקרופאגים על ידי הפחתת הגידול פקטור אלפא (TNF-α) הייצור 25 ולהפחית את התפשטות והגירה של VSMCs 26 .

מאז יש כבר עניין הולך וגובר בהבנת התפקיד של polyphenols בבריאות האדם ואת המחלה, חשוב כדי לייעל את שיטת החילוץ. ממיסים ממס הוא בשימוש נרחב למטרה זו, שכן הוא חסכוני לשחזור בקלות. במחקר זה, מיצוי ממס שימש עם אתנול, יחד עם ultioasonic בסיוע extractioN, שהותאמה מקים ולי 27 . הטיהור והתפלגות התמציות הגולמיות (CE) תוך שימוש בכלורופורם ובאתיל אצטט בוצעו כדי להשיג את החלק המופק מטחון (PE) שהותאם מקוויירס ואח ' . כמו כן, הושוו היעילות של תמציות פוליפנול גולמיות לעומת מטוהרים מ- BL בהפחתת הזירחון הבסיסי של ERK1 / 2, ודוגמאות מייצגות של ההשפעה המעכבת של תמצית פוליפנול BL מטוהרת על הפחתת אותות המושרה על ידי Ang II ב- VSMCs סופקו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של ריאגנטים

  1. הכן אתנול 80% (100 מ"ל) על ידי ערבוב 80 מ"ל של אתנול מוחלט (ביולוגיה מולקולרית כיתה) ו 20 מ"ל של תא תרבות כיתה מים סטריליים.
  2. כדי להכין תמצית פוליפנול (10 מ"ג / מ"ל), לשקול 10 מ"ג של CE או PE. הוסף 1 מ"ל של רגיל Dulbecco השתנה בינוני הנשר (DMEM) תחת מכסה המנוע בתרבות התא. וורטקס הפתרון. Aliquot ב 200 חלקים μL ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. הכן חיץ תמוגה.
    1. הוסף 5 מ"ל של פתרון M 1 HEPES המניה (pH 7.4, 50 מ"מ הסופי), 1 מ"ל של 5 מ 'פתרון NaCl המניה (50 מ"מ הסופי), 1 מ"ל של פתרון 0.5 M EDTA המניות (5 מ"מ הסופי), 2 מ"ל של 0.5 M NaF פתרון המניה (10 מ"מ הסופי), 286 μL של 700 מ"מ Na 3 VO 4 פתרון המניה (2 מ"מ הסופי), 5 מ"ל של 200 מ"מ Na 4 P 2 O פתרון 7 המניה (10 מ"מ הסופי), ו 5 מ"ל של 20% Triton-X-100 פתרון המניות מוכן במים (1% הסופי). הוסף מים כדי להגיע נפח של 100 מ"ל. שמור על 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכנת למאגר מדגם Laemmli (4x).
    1. הוסף 31.25 מ"ל של פתרון 2 מ 'טריס המניה (pH 6.8), 100 מ"ל של גליצרול, 50 מ"ל של 20% נתרן Dodecyl Sulfate (SDS) פתרון מוכן במים, 50 מ"ל של β-mercaptoethanol. מוסיפים מים עד 250 מ"ל. שמור על 4 מעלות צלזיוס.
  5. כדי להכין למאגר טריס שנאגרו מלוחים (TBS), לשקול 3 גרם של Tris (25 מ"מ הסופי), 0.18 גרם של KCl (2.5 מ"מ הסופי), ו 8.76 גרם של NaCl (150 מ"מ הסופי). להתאים את ה- pH 7.4 ולהוסיף מים עד 1 L. שמור על RT.
  6. כדי להכין TBS-T, להוסיף 997.5 מ"ל של TBS ו 2.5 מ"ל של פתרון 20% Triton-X-100 מוכן במים. שמור על RT.

2. הכנת תמציות Blackberry

  1. הכנת תמצית גרגרי אבקת ברי מיובשת בהקפאה.
    1. לשקול 10 גרם של אבקת פטל שחור מיובש להקפיא (או 5 גרם של אבקה טרייה). אם פירות קפואים משמש, לחתוך אותו אניN כדי חתיכות קטנות מאוד לפני תחילת החילוץ.
    2. מערבבים את אבקת פירות עם 100 מ"ל של 80% אתנול מימי ב 1 ליטר עגול ארלנמאייר בקבוק.
    3. Sonicate את התערובת במשך 20 דקות ב 42 קילוהרץ, 135 W באמצעות אמבטיה קולי על 25 מעלות צלזיוס, ללא מרווח זמן בין לבין. בצע את sonication עם טיהור חנקן מתמשך באור מאופק. לקבלת פירות קפואים, להגדיל את זמן הדגירה עד 4 שעות.
    4. סינון תערובת באמצעות נייר מסנן # 2 באמצעות משפך Buchner צונן עם יניקה ואקום.
      הערה: בסוף שלב זה, שאריות המדגם מופיעות על נייר הסינון; זה נקרא עוגת סינון.
    5. יש לשטוף את העוגה סינון עם 50 מ"ל של אתנול 100%. שמור את תסנין ולהוסיף את העוגה מסנן ל 1 ליטר בקבוקון תחתית המכיל 100 מ"ל של 80% אתנול מימית.
    6. חזור על תהליך החילוץ עבור שאריות (צעדים 2.1.2 - 2.1.4).
    7. שלב את שני filtrates לתוך בקבוקון בתחתית עם תוספת 50 מ"לשל 80% אתנול מימית.
      הערה: נפח הסופי צריך להיות כ 300 מ"ל.
    8. השתמש מאייד סיבובית ב 62 ° C ו 50 סל"ד להתאדה הממס. המשך תהליך זה עד אתנול אינו מתאדות יותר.
      הערה: תהליך זה אורך כ -45 דקות.
    9. מעבירים את המדגם לצינור חרוטי 50 מ"ל. התאדות אתנול ידי הזרקת גז חנקן בחלק העליון של הצינור במשך 10 דקות.
      הערה: צעד זה נדרש כדי להבטיח את ההתאיידות המלאה של אתנול. נפח המדגם בשלב זה הוא כ 20 מ"ל.
    10. להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות.
      הערה: שלב זה נחוץ כדי לאפשר תהליך יעיל יותר להקפאת הייבוש.
    11. להקפיא לייבש את המדגם ב -50 מעלות צלזיוס למשך כ 8 שעות. חנות דגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: המייבש להקפיא יוצר ואקום חזק ב -50 מעלות צלזיוס בתוך החדר לייבש את הדגימות אבל משמר את רוב התרכובות, כגון פוליפNols.
  2. הכנת תמציות פוליפנול מטוהרות מתמציות נפט גולמיות.
    1. לשקול את דגימות מיובשות בהקפאה.
      הערה: נפח תמצית בשלב זה הוא כ 10 מ"ל.
    2. הוסף שני כרכים (~ 20 מ"ל) של כלורופורם כדי תמצית גולמי לנער את הפתרון במשך 5 דקות בצלחת ומערבבים.
    3. יוצקים את התערובת למשפך המפריד. תנו את תמצית תמצית גס עבור 1 שעה ב RT כדי לקבל את החלק מטוהרים.
      הערה: בשלב זה, תערובת דו פאזי תיווצר.
    4. מחק את השכבה התחתונה (שלב כלורופורם) מן המשפך המפריד ולאסוף את השכבה מימית לתוך כוס נקייה.
    5. מוסיפים שני כרכים של אתיל אצטט לשבר מימי ולהשתמש בסרגל מגנטי ומערבבים לערבב את התערובת במשך 5 דקות ב RT.
    6. סינון תערובת באמצעות מסנן # 2 נייר באמצעות משפך Buchner מקורר עם יניקה ואקום.
    7. לאסוף את המדגם מסונן ולהעביר אותו בקבוקון בתחתית להיות לנואד עם המאייד סיבובית.
    8. הגדר את המאייד סיבוב כדי 62 ° C ו 50 סל"ד להתאדות אתיל אצטט למשך כ 30 דקות.
    9. להקפיא לייבש את המדגם ב -50 מעלות צלזיוס למשך כ 8 שעות. מעבירים את המדגם לצינור 50 מ"ל חרוטי ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.

3. טיפול של VSMCs עם תמציות ברי

  1. תרבות VSMCs.
    1. לבודד VSMCs מן aortas החזה של חולדות Sprague-Dawley על ידי ביצוע עיכול אנזימטי, כפי שתואר לעיל 29 . תרבות VSMCs כמתואר 29 .
    2. הכן בינוני שלם לתרבות של VSMCs באמצעות DMEM המכיל 1 גרם / גלוקוז L ו בתוספת 10% בסרום עוברי בסרום (FBS), 100 פניקסילין U / מ"ל, סטרפטומיצין 100 מ"ג / מ"ל, ו 2 מ"מ L- גלוטמין. אחסן את המדיום המלא ב 4 ° C.
  2. דגירה של VSMCs עם תמציות פוליפנול.
    1. כדי לפצל את VSMCs, להשליך את cultuבינוני מחדש לשטוף את התאים פעמיים עם מלוחים פוספט שנאגרו (PBS). הוסף 4 מ"ל של PBS ו 2 מ"ל של טריפסין EDTA 0.25%. דגירה התאים 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור.
      1. איסוף התאים, לערבב אותם עם 2 מ"ל של המדיום המלא בצינור צנטריפוגות 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 1,100 × גרם במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
      2. זרעים 50,000 VSMCs לכל היטב 6-גם תרבות צלחות לגדל אותם בינוני מלא המכיל 10% FBS עד שהם מגיעים 90% confluency (כ 3 ד). לשמור על VSMCs ב 37 ° C בחממה 5% CO 2 humidified.
    2. הכן את המדיום לטיפול באמצעות מדיום DMEM המכיל 1 גרם / גלוקוז L, 100 U / מ"ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ"ג / מ"ל, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 0.5% FBS. אחסן את המדיום הטיפול ב 4 ° C.
      הערה: תמציות פוליפנול ו- Ang II מתווספות ישירות לתאים המשתמשים ביDium.
    3. הכן פתרון מלאי של 10 מ"ג / מ"ל ​​תמצית גולמי (CE) או טיהור מטוהרים (PE) של פוליפנולים על ידי המסת 10 מ"ג של תמצית ב 1 מ"ל של מדיום רגיל DMEM. שמור את המניות 200 aliquots μL ב -20 מעלות צלזיוס.
    4. דגירה VSMCs עם 2 מ"ל של המדיום טיפול המכיל 0.5% FBS ולהוסיף או CE או תמציות PE להשיג ריכוז של 50 - 500 מיקרוגרם / מ"ל. שנה את המדיום כל 24 שעות על ידי הוספת תמציות פוליפנול טרי. לטפל בתאים במשך 3 ד.
    5. לטיפול עם Ang II או הורמונים אחרים וגורמי גדילה, להרעיב את התאים לפחות 24 שעות על ידי דוגרים את התאים עם המדיום טיפול המכיל 0.5% FBS לפני תוספת של Ang II (100 ננומטר).
      הערה: דגירה עם ובלי CE ו PE ב בינוני 0.5% FBS טיפול לפני תוספת של Ang II מומלץ.
      1. לאחר 24 שעות של רעב, הוסף 100 nm Ang II. החלף את המדיום הטיפול עם לסה"נ טרי, PE, או אנג II כל 24 שעות במשך 3 ד.
  3. הכנת דגימות תאים.
    1. לשטוף את התאים שטופלו פעמיים PBS קר lyse אותם עם 200 μL של חיץ תמוגה על הקרח.
    2. איסוף lysates התא באמצעות מגרדים תא ולהעביר את lysates ל 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. דגירה סך lysates התא 20 דקות על הקרח ו מערבולת כל 5 דקות.
    3. סוניקטה התאים שואבת עם שלוש התפרצויות ב 125 וואט לכל 10 שניות, עם הפסקה של 2 בין לבין. שמור את דגימות על הקרח לאורך sonication.
    4. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות מגיב assay חלבון ב 595 ננומטר.
    5. חנות דגימות ב -20 מעלות צלזיוס לניתוח על ידי כתם המערבי.
  4. כתם המערבי.
    1. מערבבים כמויות שוות של חלבון (כ 50 מיקרוגרם) מ שליטה שאינם מטופלים polyphenol מטופלים או Ang II שטופלו דגימות עם חיץ תמוגה להשיג נפח כולל מקסימלי של 50 μL. הוסף 16 μL של חיץ מדגם 4x Laemmli. מחממים את הדגימות 5 דקות ב 75 ° C.
    2. הפרד את הדוגמהEs ב 10% SDS-PAGE ג'לים ולהעביר אותם קרום PDVF ב 10 V במשך 75 דקות במעבר חצי יבש מערכת ניתוח כתם המערבי עם נוגדנים ספציפיים.
    3. לחסום את הממברנה עם חלב 2% ב TBS 0.05% חיץ Triton-X100 (TBS-T) במשך 20 דקות.
    4. הסר את החלב על ידי שטיפת הממברנה לפחות שלוש פעמים עם TBS (5 דקות כל אחד) ו דגירה עם נוגדנים ראשוניים עבור שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C.
    5. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים, 10 דקות כל אחד, עם TBS-T ו דגירה עם נוגדן משני HRP קשורה במשך 45 דקות.
    6. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים, 10 דקות כל אחד, עם TBS-T ולפתח על ידי chemiluminescence משופר (ECL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הוכח בעבר שתמציות פוליפנול המבודדות מ- BL, RB ו- BRB הפחיתו את ההזדקנות של VSMCs בתגובה ל- Ang II 21 . זה הוכח כי אלה מטוהרים פוליפנול שואבת לווסת את אנג II איתות על ידי הפחתת זרחון של Akt, P38 מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK), ו ERK1 / 2. BL מונע הזיהום על ידי הפחתת הביטוי של NADPH oxidase (NOx) 1, אנזים המייצר אניס סופרוקסיד והוא upregulated חזק על ידי אנג II. לעומת זאת, RB ו- BRB מונעים הזיהום על ידי מנגנון שאינו תלוי בנוקס 1, שכן הם מגבירים את הביטוי של אנזימים נוגדי חמצון SOD1, SOD2 וגלוטתיון peroxidase 1 (GPx-1). BL נכשל להגביר את הביטוי SOD2, בעוד שאף אחד מן תמציות לא להחליש את downregulation של קטליז ידי אנג II 21 . BL התמקדה כדי לקבוע אם חוסר ההשפעה של BL על SOD2 ו ביטוי catalase יכולמוסבר על ידי הפסד של תרכובות פוליפנול במהלך תהליך טיהור או על ידי ריכוז מספיק של תרכובת פוליפנולית מסוימים בתמצית. VSMCs הודגרו עם 50-500 מיקרוגרם / מ"ל ​​לסה"נ ( איור 1 א ) או PE ( איור 1B ) בינוני המכיל 0.5% FBS במשך שלושה ימים. לא לסה"נ ולא PE הגדילו רמות SOD2 או catalase בכל אחד מהריכוזים שנבדקו. כבקרה חיובית, זרחן ERK1 / 2 נמדד, ונמצא כי CE הפחית את זרחון של קינאז זה בריכוזים גבוהים מ 300 מיקרוגרם / מ"ל. לעומת זאת, PE היה יעיל על 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​( איור 1 ב ). רמות זרחון נמוכות נצפו בריכוזים של 200-500 מיקרוגרם / מ"ל. נתונים אלה תומכים תצפית הקודם מראה כי 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​BL PE מספיקה כדי להפחית אנג II איתות 21 . תוצאות אלו מראות כי ריכוזים גבוהים יותר של פוליפנול cOmpounds ב PE, לעומת לסה"נ, יכול להסביר את היעילות הגבוהה יותר של תמצית זו על הפחתת ERK1 / 2 זרחון. כדי לבחון את הרעיון, הושוו קומפוזיציות הפוליפנול של שני התמציות. זיהוי וכימות של תרכובות פוליפנול ב CE בוצעה על ידי HPLC, כפי שתואר לעיל 21 ( טבלה 1 ). חומצה O- caffeoylquinic ו quercetin היו נוכחים ברמות גבוהות יותר ב PE לעומת לסה"נ, בעוד חומצה ferulic ורוטין נמצאו רק לסה"נ. לאחר מכן, VSMCs טופלו 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​BL PE עבור 24 שעות לפני תוספת של 100 ננומטר אנג 2 ( איור 1 ג ). כפי שדווח בעבר 21 , תמצית פוליפנול BL צמצמה זירקה ERK 2 / המושרה ERK1 / 2, אך לא הוכיח כל השפעה על הביטוי catalase ו SOD2.

איור 1
> איור 1: Polyphenols Blackberry להפחית בזלת ו Ang II המושרה ERK1 / 2 זרחון VSMCs. VSMCs מתורבת ב FBS 10% ב confluency 90% הודגרו עם 50 - 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​BL גולמי חלץ (CE) (A), מטוהרים חלץ (PE) ( B ), או 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​PE ( C ) 0.5 בינוני FBS DMEM עבור 3 ד. C ) לאחר 24 שעות של דגירה עם BL PE, Ang II (100 ננומטר) נוספה התאים הודגרו במשך 3 ד. המדיום, עם תמציות טריות ואנג II, השתנה מדי יום. התאים נשטפו ואז lysed, ואת תמציות התא הכולל הופרדו 10% PAGE-SDS ג'לים. כתמים מערביים נבדקו עם נוגדנים ארנבים נגד ERK1 / 2 phosphorylated (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, קטלז, ו SOD2 ו נוגדן העכבר נגד אקטין β. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

In-page = "1" עבור: keep-with-next.within-page = "always">
Analytes (ppm) פ לִספִירַת הַנוֹצרִים
חומצות פנוליות
חומצה גלית 243.5 321.9
חומצה p-coumaric 32.9 46.5
חומצה Ferolic - 236.5
חומצות כלורוגניות
חומצה 3-O-caffeoylquinic 235.3 170.5
4-O-caffeoylquinic חומצה 13 76.9
חומצה 5-O-caffeoylquinic 14.1 49.9
פלבונואידים
פלבונולים
קוורצטין 95 24.5
פלבנונים
רוטין - 37.8

טבלה 1: ניתוח הרכב פוליפנול של אוכמן בחלופות מטוהרות של נפט גולמי ופוליפנול. חומצות פנוליות ו flavonoids ב תמצית גולמי (CE) ו מטוהרים חלץ (PE) נותחו באמצעות ביצועים גבוהים נוזלים כרומטוגרפיה (HPLC). הריכוז של analytes מתבטא כמו ppm. ההרכב של פוליפנולים ב BL PE פורסם לאחרונה 21 והוסיף לשולחן להיות לעומת לסה"נ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פוליפנולים מבודדים מהגרגרים מכילים קומפוזיציות שונות. פרוטוקול החילוץ המבוסס על אתנול המתואר כאן מאפשר זיהוי של רמות שונות של חומצות פנוליות ופלבונואידים המצויים בתמציות פוליפנול גולמיות ומטוהרות של BL ( טבלה 1 ). CE הועשר בחומצה גאלית, חומצה פרולית, חומצה 4-O-caffeoylquinic, וחומצה 5-O-caffeoylquinic. תהליך הטיהור לא שינה משמעותית את רמות החומצה הגאלית וחומצה p-coumaric. עם זאת, היא הגדילה את רמות של חומצה O- caffeoylquinic מ 170.5 - 235.3 ppm ו quercetin מ 24.5 - 95 עמודים לדקה. לעומת זאת, חומצה פרולית ורוטין אבדו במהלך טיהור ה - CE.

הטיפול VSMCs עם 50 - 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​לסה"נ PE הראה כי שני תמציות היו יעילים בהפחתת זרחון הבסיס של ERK1 / 2. עם זאת, PE הראה downregulation חזק בפעילות של קינאז זה בריכוז נמוך יותר: 100 & #181; גרם / מ"ל ​​עבור PE לעומת 400 - 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​לסה"נ. תוצאות אלו עשויות לשקף את הריכוז הגבוה יותר של חומצה O- caffeoylquinic או quercetin שנמצאו ב- PE. השימוש של תרכובות פנוליות בודדים בתאים בתרבות יש צורך לזהות את המתחם הספציפי (ים) אחראי על downreguation של זרחן ERK1 / 2.

הירידה בפעילות של קינאזות איתות, כולל Akt, ERK1 / 2 ו- p38MAPK, הנגרמת על ידי פוליפנולים מטוהרים המבודדים מ- BL, RB ו- BRB 21 וכן ERK1 / 2 הנגרמים על ידי BL CE, המוצגים כאן, תואמים - דוחות קודמים. לדוגמה, תמציות פוליפנול מבודדות מאוכמניות הפחיתו את צמיחת הגידול של תאי סרטן החלב, בין השאר על ידי הקטנת הפעילות של Akt ו- ERK1 / 2 30 . כפי שהוזכר לעיל, קינאזות אלה מעורבים גם באינדוקציה של הזדקנות תאית על ידי אנג II 21 , דבר המצביע על כך polyphenols מ BL, RB, ו BRB shoulד להפחית הזדקנות כלי הדם ואת תפקוד לקוי הקשורים CVD.

כפי שדיווחנו בעבר 21 , ביטוי catalase ו SOD2 לא היו upregulated ידי PE, גם בריכוזים גבוהים כמו 500 מיקרוגרם / מ"ל. מאז CE היה גם לא יעיל בהגדלת הביטוי catalase ו SOD2, נתונים אלה מציעים כי תרכובות פנוליות איבדו במהלך פרוטוקול טיהור אינם מעורבים הרגולציה של אלה אנזימים נוגדי חמצון. נתונים אלה גם מצביעים על כך שפרוטוקול הטיהור המוצג כאן מרוכז באופן יעיל תרכובות פנוליות רלוונטיות לרגולציה של איתות אנגי II, לחץ חמצוני וזניחות תאית. לדוגמה, נציג תוצאות להראות כי PE חזק downregulated אנג II-Induced ERK1 / 2 זרחון. ההערכה של זרחון של קינאז זה רלוונטי משום עיכוב של פעילות ERK1 / 2 מנע אנג-II המושרה ניוון סלולרי 21 .

In tErms של שינויים בפרוטוקולים הקודם, sonication נוספה כאן כדי להגדיל את התשואה מיצוי לסה"נ. בנוסף, לטיהור של פוליפנולים, במקום להשתמש במחסנית C18, כפי שתואר על ידי קים ולי 27 , שיטה מסורתית יותר מ Queires et al . 28 אומצה כאן. צעד סינון, באמצעות נייר סינון כדי להסיר זיהומים, נוספה לטיהור של סעיף polyphenol. במונחים של מגבלות, הצעדים sonication ו אידוי צריך להיות בקפידה בהתאם לסוג המכשיר המשמש, שכן משך הטמפרטורה של sonication והתאיידות, הם צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. השינויים שנוספו לשיטה זו הביאו לתשואה הגבוהה ביותר של פוליפנולים בהשוואה לשיטות קודמות 27 , 28 בשימוש במעבדה שלנו (הנתונים לא מוצגים), ככל הנראה בגלל תוספת של צעד sonication. כמו mentiעל בסעיף פרוטוקול, פרוטוקול זה ניתן להשתמש אבקת להקפיא מיובש של גרגרים שונים, כמו גם עבור פירות קפואים. שיטה זו שימשה בהצלחה לחלץ ולטהר פוליפנולים מפטל ופטל שחור 21 , כמו גם מ אוכמניות ותותים (נתונים לא מוצגים). לכן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחלץ polyphenols מ סוגים אחרים של מזון, כולל ירקות.

לסיכום, עבודה זו מפרטת שיטה מהירה, חסכונית ושונית בקלות לבידוד פוליפנולים מתותים, דבר המאפשר שימור וריכוז של חומרים המגנים מפני לחץ חמצוני ב- VSMCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי איגוד הלב האמריקני (14GRNT20180028) ואת מדינת פלורידה מדינת המועצה על מחקר ויצירתיות (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000		 Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
  2. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
  3. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
  4. Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
  5. Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
  6. Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
  7. Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
  8. Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
  9. Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
  10. Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
  11. Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
  12. Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
  13. Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
  14. Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
  15. Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
  16. Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
  17. Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
  18. Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
  19. Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
  20. Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
  21. Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
  22. Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
  23. Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
  24. Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
  25. Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
  26. Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
  27. Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
  28. Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
  29. Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
  30. Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).

Tags

כימיה גליון 125 פוליפנולים אוכמניות תאי שריר חלקים של כלי הדם אנגיוטנסין II איתות תא הזדקנות
מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים<em&gt; במבחנה</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feresin, R. G., Pourafshar, S.,… More

Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter