Summary
В этой работе подробно описан пошаговый способ получения экстрактов, богатых полифенолом, из лиофилизированного порошка ягод. Кроме того, он дает подробное описание того, как использовать эти богатые полифенолом экстракты в культуре клеток в присутствии пептидного гормона ангиотензина II (Ang II) с использованием сосудистых гладких мышечных клеток (VSMCs).
Abstract
Эпидемиологические исследования показывают, что увеличение потребления флавоноидов коррелирует со снижением смертности от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в США (США) и Европе. Ягоды широко потребляются в США и имеют высокий полифенольный состав. Было показано, что полифенолы взаимодействуют со многими молекулярными мишенями и оказывают множество положительных биологических функций, включая антиоксидантные, противовоспалительные и кардиозащитные эффекты. Полифенолы, выделенные из ежевики (BL), малины (RB) и черной малины (BRB), снижают окислительный стресс и клеточное старение в ответ на ангиотензин II (Ang II). В этой работе приводится подробное описание протокола, используемого для получения полифенольных экстрактов из лиофилизированных ягод. Выделение полифенолов из лиофилизированного порошка ягод осуществляли с использованием 80% -ного водного этанола и метода экстракции ультразвуком. Неочищенный экстракт далее очищали и фракционировали с использованием хлороформа и этилацетата,соответственно. Эффекты как сырых, так и очищенных экстрактов были протестированы на сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) в культуре.
Introduction
Полифенолы представляют собой соединения, содержащие по крайней мере одно фенольное кольцо в своей структуре и обильно присутствуют в растительном царстве 1 . Люди потребляют растения в течение тысячелетий в медицинских целях, не зная о существовании таких соединений 2 . Многие фрукты и овощи имеют некоторые общие полифенольные соединения, хотя и с различными количествами, включая флавоноиды, стильбены и фенольные кислоты. 3 . Хотя полифенолы часто ассоциируются с красочными фруктами и овощами, это не совсем верно. Например, зеаксантин и ксантин присутствуют в овощах, которые не очень яркие, такие как лук и чеснок, которые принадлежат к семейству луков и связаны с многочисленными преимуществами для здоровья 4 . Помимо того, что они связаны с несколькими преимуществами для здоровья 5 , полифенолы также служат растениям, защищая их от насекомых,D ультрафиолетовое излучение 2 . Полифенолы обычно встречаются в рационе человека и считаются мощными антиоксидантами, поскольку они могут собирать реактивные виды кислорода (ROS) 6 , 7 , 8 . Они также имеют противовоспалительные 9 , антимикробные 10 , антигипертензивные 11 и антиканцерогенные 12 , 13 свойства.
Эпидемиологические исследования демонстрируют обратную связь между потреблением флавоноидов и сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) 16 , 17 и смертностью 14 , 15 . Ягоды широко потребляются в США и содержат большое количество полифенолов, включая флавоноиды. Например, потребление сока ежевики (BL) (300 Мл / д) в течение восьми недель значительно уменьшалось систолическое артериальное давление у пациентов с дислипидемией 18 . Jeong et al. 19 сообщили, что у мужчин и женщин с гипертензией, потребляющих 2,5 г экстракта черной малины (BRB) в день, было более низкое 24-часовое и ночное кровяное давление по сравнению с теми, кто потреблял плацебо. Малина (RB) уменьшала артериальное давление, увеличивая экспрессию супероксиддисмутазы (SOD) у спонтанно гипертензивных крыс 20 . Недавно было показано, что BL, RB и BRB снижают уровни РОС и старения, вызванные ангиотензином II (Ang II) в сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) 21 . Кроме того, антоцианиновая фракция из экстракта BL уменьшала экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и ингибировала активность ядерного фактора kappa B (NF-κB) и внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK) в липополисахариде (LPS) -стимулированной Ячейки J774Ass = "xref"> 22. Экстракты BRB уменьшали экспрессию NF-κB и циклооксигеназы 2 (COX-2) in vitro 23 , улучшали профиль липидов и предотвращали образование атеросклероза у мышей, которым кормили диету с высоким содержанием жиров 24 . Антоцианины, которые считаются наиболее распространенными флавоноидами в ягодах, модулируют воспалительную реакцию в LPS-стимулированных макрофагах RAW 264.7 путем уменьшения производства альфа-фактора (NFRO-α) фактора роста опухоли 25 и уменьшают пролиферацию и миграцию VSMCs 26 .
Поскольку растет интерес к пониманию роли полифенолов в здоровье и болезни человека, важно оптимизировать метод извлечения. Для этой цели широко используется экстракция растворителем, так как она экономична и легко воспроизводима. В этом исследовании использовали экстракцию растворителем с этанолом наряду с экстрактом ультразвукаN, который был адаптирован из Ким и Ли 27 . Очистку и фракционирование сырых экстрактов (CE) с использованием хлороформа и этилацетата проводили для получения фракции очищенного экстракта (PE), которая была адаптирована из Queires et al. 28 . Кроме того, сравнивали эффективность неочищенных и очищенных полифенольных экстрактов из BL при восстановлении базального фосфорилирования ERK1 / 2 и были представлены типичные примеры ингибирующего действия очищенного экстракта полифенола BL на Ang-индуцированные передачи сигналов в VSMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение реагентов
- Подготовьте 80% этанола (100 мл) путем смешивания 80 мл абсолютного этанола (молекулярная биология) и 20 мл стерильной воды с клеточной культурой.
- Для приготовления экстракта полифенола (10 мг / мл) весят 10 мг СЕ или ПЭ. Добавьте 1 мл простой модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM) под кожух клеточной культуры. Vortex решение. Аликвоту в 200 мкл порциями и хранить при -20 ° C.
- Подготовьте буфер для лизиса.
- Добавляют 5 мл основного раствора 1 М HEPES (pH 7,4, 50 мМ конечного), 1 мл 5 М раствора NaCl (50 мМ конечного), 1 мл 0,5 М исходного раствора EDTA (5 мМ конечного), 2 мл 0,5 M NaF (конечный раствор 10 мМ), 286 мкл 700 мМ исходного раствора Na 3 VO 4 (2 мМ конечного), 5 мл 200 мМ Na 4 P 2 O 7 исходного раствора (10 мМ конечного) и 5 мл 20% исходного раствора Triton-X-100, приготовленного в воде (1% конечного продукта). Добавьте воду, чтобы достичь объема 100 мл. Хранить при температуре 4 ° C.
- Подготовьте буфер образца Laemmli (4 раза).
- Добавляют 31,25 мл 2 М Tris исходного раствора (pH 6,8), 100 мл глицерина, 50 мл 20% раствора додецилсульфата натрия (SDS), приготовленного в воде, и 50 мл β-меркаптоэтанола. Добавить воду до 250 мл. Хранить при температуре 4 ° C.
- Для приготовления буфера Tris-Buffered Saline (TBS) весят 3 г Трис (25 мМ финала), 0,18 г KCl (2,5 мМ конечного) и 8,76 г NaCl (150 мМ финала). Отрегулируйте рН до 7,4 и добавьте воду до 1 л. Хранить при комнатной температуре.
- Для получения TBS-T добавляют 997,5 мл TBS и 2,5 мл 20% раствора Triton-X-100, приготовленного в воде. Хранить при комнатной температуре.
2. Подготовка экстрактов Blackerry
- Получение неочищенного экстракта из лиофилизированного порошка ягод.
- Взвесьте 10 г лиофилизированного порошка ежевики (или 5 г свежего порошка). Если используются замороженные фрукты, разрежьте их iNto очень мелкие кусочки перед началом экстракции.
- Смешайте фруктовый порошок с 100 мл 80% -ного водного этанола в 1 л круглодонную колбу Эрленмейера.
- Сонатируйте смесь в течение 20 минут при 42 кГц, 135 Вт, используя ультразвуковую ванну при 25 ° C, без какого-либо промежутка времени между ними. Выполняйте обработку ультразвуком с непрерывной продувкой азота в приглушенном свете. Для замороженных фруктов увеличьте время инкубации до 4 часов.
- Фильтруйте смесь через фильтровальную бумагу №2 с помощью охлажденной воронки Бюхнера с вакуумным отсосом.
ПРИМЕЧАНИЕ. В конце этого этапа на фильтровальной бумаге появляются остатки образца; Это называется фильтровальной лепешкой. - Промойте фильтровальную лепешку 50 мл 100% этанола. Сохраните фильтрат и добавьте осадок на фильтре в круглодонную колбу емкостью 1 л, содержащую 100 мл 80% -ного водного этанола.
- Повторите процесс экстракции остатка (шаги 2.1.2 - 2.1.4).
- Объедините два фильтрата в круглодонную колбу с дополнительными 50 мл80% -ного водного этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ. Конечный объем должен составлять приблизительно 300 мл. - Для испарения растворителя используйте роторный испаритель при 62 ° C и 50 об / мин. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока этанол не испарится.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот процесс занимает приблизительно 45 минут. - Перенесите образец в коническую трубку объемом 50 мл. Выпаривают этанол, впрыскивая газообразный азот в верхней части трубки в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг необходим для обеспечения полного испарения этанола. Объем образца на этой стадии составляет приблизительно 20 мл. - Заморозьте образец при -80 ° C в течение не менее 24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг необходим, чтобы обеспечить более эффективный процесс сублимационной сушки. - Замораживают образец при -50 ° C в течение приблизительно 8 часов. Храните образцы при температуре -20 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сушилка для замораживания создает мощный вакуум при температуре -50 ° C внутри камеры для сушки образцов, но сохраняет большую часть соединений, таких как полифNoLS.
- Получение очищенных полифенольных экстрактов из сырых экстрактов.
- Взвесьте лиофилизированные экстрагированные образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Объем экстракта на этом этапе составляет приблизительно 10 мл. - Добавить два объема (~ 20 мл) хлороформа в неочищенный экстракт и встряхнуть раствор в течение 5 минут в мешалке.
- Вылейте смесь в разделительную воронку. Пусть сырой экстракт декантируют в течение 1 часа при комнатной температуре с получением очищенной фракции.
ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе образуется двухфазная смесь. - Удалите нижний слой (фазу хлороформа) из разделительной воронки и соберите водный слой в чистый стакан.
- Добавьте два объема этилацетата к водной фракции и используйте магнитную мешалку для перемешивания смеси в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Отфильтруйте смесь через фильтровальную бумагу №2 с помощью охлажденной воронки Бюхнера с вакуумным отсосом.
- Соберите отфильтрованный образец и перенесите его в круглодонную колбу для насС роторным испарителем.
- Установите роторный испаритель на 62 ° C и 50 об / мин и испарите этилацетат в течение примерно 30 минут.
- Замораживают образец при -50 ° C в течение приблизительно 8 часов. Перенесите образец в коническую трубку объемом 50 мл и храните его при -20 ° C.
- Взвесьте лиофилизированные экстрагированные образцы.
3. Лечение VSMC с экстрактами ягод
- Культура VSMC.
- Выделите VSMC из грудных аортов крыс Sprague-Dawley, выполнив ферментативное расщепление, как описано ранее 29 . Культура VSMC, как описано 29 .
- Подготовьте полную среду для культивирования VSMC с использованием DMEM, содержащей глюкозу 1 г / л, и добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед. / Мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Хранить всю среду при температуре 4 ° C.
- Инкубация VSMC с экстрактами полифенолов.
- Чтобы разбить VSMC, отбросьте культуруИ промыть клетки дважды фосфатным буферным раствором (PBS). Добавить 4 мл PBS и 2 мл трипсина EDTA 0,25%. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в инкубаторе CO 2 .
- Соберите клетки, смешайте их с 2 мл полной среды в 15 мл центрифужной пробирке и центрифугируйте при 1100 × g в течение 5 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок с 1 мл PBS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Семя 50 000 VSMC на лунку в 6-луночных планшетах для культивирования и выращивать их в полной среде, содержащей 10% FBS, до тех пор, пока они не достигнут 90% слияния (около 3 г). Поддерживайте VSMC при температуре 37 ° C в увлажненном 5% -ном инкубаторе CO 2 .
- Подготовьте среду для лечения с использованием среды DMEM, содержащей 1 г / л глюкозы, 100 ед. / Мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 0,5% FBS. Храните обрабатывающую среду при температуре 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Полифенольные экстракты и Ang II добавляют непосредственно в клетки, используя это meРадиевом. - Подготовьте исходный раствор 10 мг / мл сырого экстракта (CE) или очищенного экстракта (PE) из полифенолов путем растворения 10 мг экстракта в 1 мл простой среды DMEM. Храните запас в 200 мкл аликвоты при -20 ° C.
- Инкубируйте VSMC с 2 мл обрабатывающей среды, содержащей 0,5% FBS, и добавьте экстракт CE или PE для достижения концентрации 50-500 мкг / мл. Изменяйте среду каждые 24 часа, добавляя свежие экстракты полифенолов. Обработайте клетки в течение 3 дней.
- Для лечения Ang II или других гормонов и факторов роста голодайте клетки в течение по меньшей мере 24 часов путем инкубации клеток с лечебной средой, содержащей 0,5% FBS, перед добавлением Ang II (100 нМ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубация с CE и без CE в 0,5% среде для обработки FBS перед добавлением Ang II рекомендуется.- Через 24 часа голодания добавьте 100 нМ Ang II. Замените среду для обработки свежим CE, PE или Ang II каждые 24 часа на 3 дня.
- Чтобы разбить VSMC, отбросьте культуруИ промыть клетки дважды фосфатным буферным раствором (PBS). Добавить 4 мл PBS и 2 мл трипсина EDTA 0,25%. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С в инкубаторе CO 2 .
- Подготовка образцов клеток.
- Промыть обработанные клетки дважды в холодном PBS и лизировать их 200 мкл буфера для лизиса на льду.
- Собирайте клеточные лизаты с помощью скребков клеток и переносите лизаты в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Инкубируйте полные клеточные лизаты в течение 20 мин на льду и вихрете каждые 5 мин.
- Сонатируйте экстракты клеток тремя вспышками при 125 Вт в течение 10 с каждый с паузой в 2 с между ними. Храните образцы на льду во время обработки ультразвуком.
- Измерьте концентрацию белка, используя реагент для анализа белка при 595 нм.
- Храните образцы при -20 ° C для анализа с помощью Вестерн-блоттинга.
- Вестерн-блот.
- Смешайте равные количества белка (около 50 мкг) из контрольных необработанных и обработанных полифенолом или обработанных Ang II образцов буфером для лизиса, чтобы получить максимальный общий объем 50 мкл. Добавьте 16 мкл 4x буфера для образцов Laemmli. Нагреть образцы в течение 5 мин при 75 ° С.
- Отделите образецВ 10% гелях SDS-PAGE и переносить их на мембраны PDVF при 10 В в течение 75 мин в полусухой системе переноса для Вестерн-блот-анализа с конкретными антителами.
- Заблокируйте мембрану 2% молоком в TBS 0,05% буфера Triton-X100 (TBS-T) в течение 20 мин.
- Удалите молоко, промывая мембрану по меньшей мере три раза TBS (по 5 минут каждый) и инкубируйте с первичными антителами в течение 1 часа при RT или O / N при 4 ° C.
- Промывайте мембрану три раза, по 10 минут каждый, с TBS-T и инкубируйте с HRP-связанным вторичным антителом в течение 45 мин.
- Промывайте мембрану три раза, по 10 минут каждый, с TBS-T и развивайте с помощью улучшенной хемилюминесценции (ECL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее было продемонстрировано, что экстракты полифенолов, выделенные из BL, RB и BRB, уменьшают старение VSMC в ответ на Ang II 21 . Было показано, что эти очищенные полифенольные экстракты модулируют передачу сигналов Ang II путем снижения фосфорилирования Akt, p38 митоген-активированной белковой киназы (MAPK) и ERK1 / 2. BL предотвращает старение, уменьшая экспрессию NADPH-оксидазы (Nox) 1, фермента, который продуцирует супероксидные анионы и сильно активируется Ang II. Напротив, RB и BRB предотвращают старение с помощью Nox1-независимого механизма, поскольку они увеличивают экспрессию антиоксидантных ферментов SOD1, SOD2 и глутатионпероксидазы 1 (GPx-1). BL не увеличивает экспрессию SOD2, в то время как ни один из экстрактов не ослабляет подавление каталазы Ang II 21 . BL был сфокусирован, чтобы определить, может ли отсутствие эффекта BL на SOD2 и экспрессию каталазыОбъясняются потерей полифенольных соединений в процессе очистки или недостаточной концентрацией определенного полифенольного соединения в экстракте. VSMC инкубировали с 50-500 мкг / мл СЕ ( фиг. 1А ) или РЕ ( фиг. 1В ) в среде, содержащей 0,5% FBS в течение трех дней. Ни CE, ни PE не повышали уровни SOD2 или каталазы ни в одной из тестируемых концентраций. В качестве положительного контроля было измерено фосфорилирование ERK1 / 2, и было установлено, что CE снижает фосфорилирование этой киназы при концентрациях выше 300 мкг / мл. Напротив, ПЭ был эффективен при примерно 100 мкг / мл ( фиг. 1В ). Низкие уровни фосфорилирования наблюдались при концентрациях 200-500 мкг / мл. Эти данные подтверждают предыдущее наблюдение, показывающее, что 200 мкг / мл BL PE является достаточным для снижения сигнализации 21 Ang II. Эти результаты показывают, что более высокие концентрации полифенола cOmpounds в PE, по сравнению с CE, может объяснить более высокую эффективность этого экстракта при уменьшении фосфорилирования ERK1 / 2. Чтобы проверить эту идею, сравнивали полифенольные композиции обоих экстрактов. Идентификацию и количественную оценку полифенольных соединений в СЕ проводили с помощью ВЭЖХ, как описано выше 21 ( таблица 1 ). 3- O- каффеоилхиноновая кислота и кверцетин присутствовали на более высоких уровнях в ПЭ по сравнению с СЕ, в то время как феруловая кислота и рутин были обнаружены только в СЕ. Затем VSMC обрабатывали 200 мкг / мл BL PE в течение 24 часов перед добавлением 100 нМ Ang II ( фиг.1C ). Как сообщалось ранее 21 , экстракт полифенола BL уменьшал индуцированное Ang II ERK1 / 2 фосфорилирование, но не оказывал никакого влияния на экспрессию каталазы и SOD2.
| Анализы (ppm) | PE | CE |
| Фенольные кислоты | ||
| Галлия кислота | 243,5 | 321,9 |
| П-кумариновая кислота | 32,9 | 46,5 |
| Феруловая кислота | - | 236,5 |
| Хлорогенные кислоты | ||
| 3-O-каффеоилхинова кислота | 235,3 | 170,5 |
| 4-O-каффеоилхинова кислота | 13 | 76,9 |
| 5-O-каффеоилхинова кислота | 14,1 | 49,9 |
| ФЛАВОНОИДЫ | ||
| Флавонолы | ||
| кверцетин | 95 | +24,5 |
| флаванонами | ||
| Рутин | - | 37,8 |
Таблица 1: Анализ полифенольного состава ежевики в сырых и полифенол-очищенных экстрактах. Фенольные кислоты и флавоноиды в сыром экстракте (CE) и очищенном экстракте (PE) анализировали с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрация аналитов выражается в виде ppm. Недавно была опубликована композиция полифенолов в BL PE и добавлена в таблицу для сравнения с CE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Полифенолы, выделенные из ягод, содержат различные композиции. Протокол извлечения этанола, описанный здесь, позволил идентифицировать различные уровни фенольных кислот и флавоноидов, присутствующих в неочищенных и очищенных полифенольных экстрактах BL ( таблица 1 ). CE был обогащен галловой кислотой, феруловой кислотой, 4-O-каффеоилхиноновой кислотой и 5-O-каффеоилхиноновой кислотой. Процесс очистки существенно не изменял уровни галловой кислоты и р-кумариновой кислоты. Тем не менее, он увеличил уровни 3- O- каффеоилхиновой кислоты с 170,5 до 235,3 м.д. и кверцетина с 24,5 до 95 частей на миллион. Напротив, феруловая кислота и рутин были потеряны во время очистки СЕ.
Обработка VSMC с 50-500 мкг / мл CE и PE показала, что оба экстракта эффективны в снижении базального фосфорилирования ERK1 / 2. Однако ПЭ показал более сильную подавление активности этой киназы при более низкой концентрации: 100 &181 г / мл для ПЭ по сравнению с 400-500 мкг / мл для СЕ. Эти результаты могут отражать более высокую концентрацию 3- O- каффеоилхиновой кислоты или кверцетина, обнаруженного в ПЭ. Использование отдельных фенольных соединений в клетках в культуре необходимо для идентификации конкретного соединения (-ов), ответственного за понижение уровня фосфорилирования ERK1 / 2.
Сниженная активность сигнальных киназ, включая Akt, ERK1 / 2 и p38MAPK, вызванные очищенными полифенолами, выделенными из BL, RB и BRB 21 , а также ERK1 / 2, вызванные BL CE, показанные здесь, согласуется с Предыдущие отчеты. Например, экстракты полифенолов, выделенные из черники, уменьшали рост опухолей клеток рака молочной железы, частично за счет снижения активности Akt и ERK1 / 2 30 . Как упоминалось ранее, эти киназы также участвуют в индукции клеточного старения Ang II 21 , предполагая, что полифенолы из BL, RB и BRB shoulD уменьшают сосудистое старение и дисфункцию, связанную с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Как сообщалось ранее 21 , экспрессия каталазы и SOD2 не регулировалась ПЭ даже при концентрациях до 500 мкг / мл. Поскольку CE также неэффективен при увеличении экспрессии каталазы и SOD2, эти данные свидетельствуют о том, что фенольные соединения, потерянные во время протокола очистки, не участвуют в регуляции этих антиоксидантных ферментов. Эти данные также показывают, что протокол очистки, показанный здесь, эффективно концентрирует фенольные соединения, имеющие отношение к регулированию передачи сигналов Ang II, окислительного стресса и клеточного старения. Например, представительские результаты показывают, что PE сильно ингибирует Ang II-индуцированное фосфорилирование ERK1 / 2. Оценка фосфорилирования этой киназы является актуальной, поскольку ингибирование активности ERK1 / 2 предотвращает индуцированное Ang II клеточное старение 21 .
В тErms модификаций предыдущих протоколов, была добавлена обработка ультразвуком для увеличения выхода извлечения для CE. Кроме того, для очистки полифенолов вместо использования картриджа C18, как описано Ким и Ли 27 , более традиционный метод от Queires et al . 28 был принят здесь. Для очистки участка полифенола добавляли стадию фильтрации с использованием фильтровальной бумаги для удаления примесей. С точки зрения ограничений, процедуры обработки ультразвуком и испарения должны тщательно контролироваться в соответствии с типом используемого инструмента, поскольку продолжительность и температура обработки ультразвуком и испарения являются критическими шагами в этом протоколе. Модификации, добавленные к этому методу, привели к наивысшему выходу полифенолов по сравнению с предыдущими методами 27 , 28, используемыми в нашей лаборатории (данные не показаны), скорее всего, из-за добавления стадии обработки ультразвуком. Как mentiЭтот протокол может использоваться для высушенного вымораживанием порошка из различных ягод, а также для замороженных фруктов. Этот метод был успешно использован для извлечения и очистки полифенолов из малины и черной малины 21 , а также из черники и клубники (данные не показаны). Таким образом, этот метод можно было бы также использовать для извлечения полифенолов из других видов пищевых продуктов, включая овощи.
В заключение, эта работа подробно описывает быстрый, экономически эффективный и легко воспроизводимый метод выделения полифенолов из ягод, что позволяет удерживать и концентрировать соединения, которые защищают от окислительного стресса в VSMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Американской кардиологической ассоциацией (14GRNT20180028) и Советом Университета штата Флорида по исследованиям и творчеству (COFRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
