Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Summary

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Abstract

La recuperación funcional rara vez ocurre después de la lesión o la degeneración inducida por la enfermedad dentro del sistema nervioso central (SNC) debido al entorno inhibitorio y la capacidad limitada para la neurogénesis. Estamos desarrollando una estrategia para abordar simultáneamente la pérdida de la vía neuronal y axonal dentro del SNC dañado. Este manuscrito presenta el protocolo de fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos (micro-TENNs), construcciones implantables que consisten en neuronas y tramos axonales alineados que abarcan la luz de la matriz extracelular (ECM) de un cilindro de hidrogel preformado de centímetros de micrómetros de diámetro que puede extenderse centímetros en longitud. Los agregados neuronales están delimitados a los extremos del recubrimiento tridimensional y están atravesados ​​por proyecciones axonales. Los micro-TENNs se encuentran en una posición única como estrategia para la reconstrucción del SNC, emulando aspectos de la citoarquitectura del conector cerebral y proporcionando potencialmente medios para el reemplazo de la red. El neuLos agregados ronales pueden sinapsar con el tejido huésped para formar nuevos relés funcionales para restaurar y / o modular circuitos perdidos o dañados. Estas construcciones también pueden actuar como andamios vivos pro-regenerativos capaces de explotar mecanismos de desarrollo para la migración celular y la búsqueda axonal, proporcionando pistas estructurales y solubles sinérgicas basadas en el estado de regeneración. Los micro-TENN se fabrican vertiendo el hidrogel líquido en un molde cilíndrico que contiene una aguja centrada longitudinalmente. Una vez que el hidrogel se ha gelificado, la aguja se retira, dejando una micro-columna hueca. Se añade una solución de ECM a la luz para proporcionar un entorno adecuado para la adhesión neuronal y el crecimiento axonal. Las neuronas disociadas se agregan mecánicamente para una siembra precisa dentro de uno o ambos extremos de la micro-columna. Esta metodología produce confiablemente construcciones miniatura autónomas con tramos axonales de proyección larga que pueden recapitular características de la neuroanatomía cerebral. Synaptic immUnolabeling y los indicadores de calcio genéticamente codificados sugieren que los micro-TENNs poseen amplia distribución sináptica y la actividad eléctrica intrínseca. En consecuencia, los micro-TENNs representan una estrategia prometedora para la reconstrucción neuroquirúrgica dirigida de las vías cerebrales y también pueden aplicarse como modelos biofidelicos para estudiar los fenómenos neurobiológicos in vitro .

Introduction

Una característica común de los trastornos y enfermedades del sistema nervioso central (CNS), como lesión cerebral traumática (TBI), lesión de la médula espinal (SCI), accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson es la desconexión de las vías axonales y células neuronales Pérdida ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Por ejemplo, cuando un accidente cerebrovascular isquémico no se trata, se estima que los axones se pierden a una velocidad de 7 millas de axones por minuto [ ^5] . En el caso de TBI, que aproximadamente 1,7 millones de personas experimentan cada año sólo en los EE.UU., la degeneración axonal puede seguir ocurriendo años después del trauma, ya que la lesión inicial precipita un estado neurodegenerativo a largo plazo [ ^4] . Agravando estos efectos deletéreos, el SNC tiene una capa severamente limitadaCiudad para la regeneración ^{1 , 7 , 8 , 9} . Después de la lesión, se desarrolla un ambiente inhibitorio que se caracteriza por la falta de orientación dirigida a objetivos distantes, la presencia de inhibidores asociados a mielina que impiden el crecimiento de neuritas y la formación de una cicatriz glial por astrocitos reactivos ^{8 , 10 , 11 , 12} . La cicatriz gliales sirve como una barrera bioquímica y física para la regeneración, con moléculas como la condroitina sulfato proteoglicanos que obstruyen la proliferación de axones [ ^{8 , 11]} . Además, aunque se han encontrado células madre neurales en el SNC adulto, la producción de nuevas neuronas es limitada, ya que sólo se ha encontrado evidencia consistente de neurogénesis en el bulbo olfatorio, en el hipocampoLa zona subgranular, el área periventricular y el canal central de la médula espinal ^{13 , 14} . Estos obstáculos impiden la recuperación funcional de las neuronas perdidas y la arquitectura de la sustancia blanca después de una lesión o enfermedad, dando como resultado los efectos a menudo cambiantes y prolongados de estas condiciones.

A pesar de la falta de capacidad regenerativa en el SNC adulto, se ha demostrado que la regeneración axonal es posible si se presentan muestras ambientales adecuadas a las neuronas huésped ^{15 , 16 , 17 , 18} . Los investigadores han intentado administrar y manipular factores de crecimiento ( por ejemplo, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento glial dependiente y factor neurotrófico 3) y otras moléculas de orientación para estimular la plasticidad y la regeneración del axón ^{14 ,}/ Sup> ^{18 , 19} . Aunque estos estudios han confirmado que los axones adultos son capaces de responder a factores de crecimiento, estas estrategias están limitadas por la baja permeabilidad de la barrera hematoencefálica y los gradientes espaciales y temporales específicos necesarios para promover la regeneración ^{14 , 18 , 19} . Otros enfoques se han basado en la hiperactivación de factores de transcripción relacionados con la regeneración en las neuronas del SNC. Por ejemplo, la sobreexpresión del factor de transcripción Stat3 estimuló la regeneración axonal en el nervio óptico ²⁰ . Sin embargo, tanto la entrega de biomoléculas como la sobreexpresión de factores de transcripción no reemplazan a las poblaciones neuronales perdidas. Las estrategias basadas en células se han centrado principalmente en trasplantar células madre neurales (NSC) en el SNC, aprovechando su capacidad para reemplazar las neuronas del SNC, liberar factores tróficos,Y apoyar los intentos de neurogénesis que se producen después de la lesión [ ^17] . A pesar de esto, todavía existen retos apremiantes que impiden este enfoque, incluyendo la dificultad de sobrevivir, integrarse con el huésped y mantenerse espacialmente restringido al área lesionada ^{6 , 14 , 17 , 21} . Además, la administración celular sola es incapaz de restablecer la citoarquitectura de las vías axonales dañadas o perdidas. Un enfoque alternativo que aborda los problemas que enfrentan las estrategias de entrega de células y fármacos / sustancias químicas es la combinación de estos enfoques con el uso de biomateriales ^{14 , 22 , 23} . Los biomateriales tales como hidrogeles son capaces de emular las propiedades bioquímicas y físicas de la matriz extracelular (ECM), ayudando en la liberación celularD retención dentro de la zona lesionada, y la entrega de factores de crecimiento y otras moléculas bioactivas con liberación controlada [ ^22] . Las características atractivas de estas estrategias basadas en el biomaterial han dado como resultado evidencia de regeneración axonal in vivo tras el trasplante de andamios al área lesionada ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30} . Sin embargo, las estrategias de biomateriales acelulares no reemplazan a las neuronas perdidas; Cuando se usan como vehículos de suministro para células precursoras neuronales, gliales o neuronales, los biomateriales son incapaces de reconstituir redes axonales de larga distancia. El desafío de desarrollar un enfoque que aborda tanto la degeneración de la vía axonal como la pérdida neuronal asociada con lesión y enfermedad del SNC sigue siendo <Sup class = "xref"> 31.

Nuestro grupo de investigación informó anteriormente el desarrollo de implantable micro-tejidos ingeniería redes neuronales (micro-TENNs), que son un tipo de "andamiaje" que consiste en cuerpos de células neuronales restringido a uno o ambos extremos de un agarose hidrogel-ECM microc columna , Con tramos axonales alineados que se extienden a lo largo del interior de este encajonamiento tridimensional (3D) ^{1 , 10 , 31 , 32} . Una de las principales diferencias entre esta técnica y los enfoques anteriores es que la citoarquitectura de los micro-TENNs se crea completamente in vitro y se trasplanta después ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,}Sup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . La fabricación in vitro ofrece un amplio control espacial y temporal del fenotipo y orientación celular, propiedades mecánicas / físicas, señales bioquímicas y factores exógenos, lo que beneficia la integración de estos andamios con el huésped después de la implantación ^{41 , 42} . Los micro-TENNs son anatómicamente inspirados porque emulan la neuroanatomía del cerebro, mostrando tramas axonales similares a las que unen distintas regiones funcionales del cerebro ( Figura 1A ) ¹ . Por lo tanto, esta estrategia puede ser capaz de reemplazar físicamente los tractos de la materia blanca perdida y las neuronas después de la implantación en una región lesionada. Esta técnica también está inspirada en mecanismos de desarrollo en los que los "andamios naturales" formados por células gliales radiales y axones pioneros actúan como guías de trayectoria para célulasMigración desde la zona subventricular y el crecimiento axonal, respectivamente ⁴³ . Estos mecanismos se recapitulan en los tramos axonales alineados de micro-TENNs, que puede presentar las vías vivas para la migración de células neuronales y la regeneración axonal por Axon mediada axonal outgrowth ( Figura 1C ] [ ^43] . Además, esta estrategia aprovecha la integración sináptica entre las neuronas micro-TENN y los circuitos nativos, formando nuevos relés que pueden contribuir a la recuperación funcional ( Figura 1B ) [ ^43] . La capacidad de formación de sinapsis también puede conceder a este enfoque la capacidad de modular el SNC y responder al tejido del huésped de acuerdo con la retroalimentación de la red. Por ejemplo, las neuronas optogeneticamente activas en los andamios vivos pueden ser estimuladas para modular las neuronas huésped a través de interacciones sinápticas ( Figura 1D ).

Además, la estructura tubular basada en el biomaterialEl desarrollo de micro-TENNs ofrece un ambiente adecuado para la adhesión celular, el crecimiento, la extensión neurítica y la señalización, mientras que las dimensiones en miniatura de las construcciones permiten potencialmente una implantación mínimamente invasiva y proporcionan un microenvimiento parcialmente secuestrado para la integración gradual en el cerebro. De hecho, publicaciones recientes han demostrado el potencial de micro-TENNs para imitar las vías neurales después de la implantación en el cerebro de rata. Después de la microinyección estereotáxica, hemos informado anteriormente la evidencia de micro-TENN supervivencia neuronal, el mantenimiento de la arquitectura del tracto axonal, y la extensión neurita en la corteza del anfitrión a por lo menos 1 mes in vivo [ ^{10 , 31]} . Además, el etiquetado con sinapsina proporcionó evidencia histológica de integración sináptica con tejido nativo ^{10 , 31} . En general, los micro-TENN pueden ser especialmente adecuados para reconstruir y modular los dañosCNS sustituyendo las neuronas perdidas, integrándose sinápticamente con los circuitos del huésped, restaurando la citoarquitectura axonal perdida y, en ciertos casos, proporcionando axones regeneradores con las señales de detección de trayectos apropiadas.

Figura 1: Principios e inspiración detrás del desarrollo de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos (micro-TENNs). ( A ) Los micro-TENNs imitan la citoarquitectura de la conexión cerebral (púrpura), en la cual regiones funcionalmente distintas están conectadas por largos tramos axonales alineados de una manera unidireccional (rojo, verde) o bidireccional (azul). A modo de ejemplo, los micro-TENNs podrían reconstituir las conexiones perdidas en las vías corticotalámica y nigroestriatal o en la vía perforante desde la corteza entorrinal al hipocampo (adaptado de Struzyna et al. , 2015) ¹ . ( B ) Diagrama de una unidireccionL y micro-TENN bidireccional (rojo y azul, respectivamente) que se integran sinápticamente con el circuito del anfitrión (morado) para servir como un relé funcional entre ambos extremos de una lesión. ( C ) Esquema de los tractos axonales de un micro-TENN unidireccional (verde) que sirve como guía para la regeneración axónica facilitada de los axones del huésped (púrpura) hacia un objetivo con el que interactúa el micro-TENN. ( D ) Diagrama conceptual del uso de micro-TENNS optogeneticamente activos como neuromoduladores, aprovechando la integración sináptica con neuronas excitadoras o inhibidoras (parte inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El manuscrito actual detalla la metodología utilizada para fabricar micro-TENNs usando neuronas corticales cerebrales derivadas de forma embrionaria. Cabe destacar que los micro-TENN podrían fabricarse con otros tipos de células neurales. Por ejemploAmpliamente, los informes iniciales del desarrollo exitoso de micro-TENN incluyeron neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) ³² . Las microcolumnas de hidrogel pueden ser generadas ( Figura 2A ) añadiendo agarosa líquida a un conjunto de canales cilíndrico cortado por láser hecho a medida oa tubos capilares, conteniendo ambos agujas de acupuntura alineadas. La aguja forma el lumen y determina el diámetro interior (ID) de la micro-columna, mientras que el ID del tubo capilar y el diámetro de los cilindros en el dispositivo de corte por láser dictan el diámetro exterior (DO) de las construcciones. La DO y la ID se pueden elegir de acuerdo con la aplicación deseada seleccionando diferentes diámetros para los tubos de dispositivo / capilar y las agujas de acupuntura, respectivamente. La longitud de las micro-columnas también se puede variar; Hasta la fecha, hemos informado de la construcción de micro-TENNs de hasta 20 mm de longitud ¹⁰ y están buscando activamente longitudes aún más largas. Después de los geles de agarosa y la acupuntura nSe retiran las eedles, se añade una solución ECM que consiste generalmente en colágeno tipo I y laminina en el lumen de las construcciones ( Figura 2C ). El núcleo de ECM proporciona un andamio para soportar la adhesión de células neuronales y el crecimiento axonal. Inicialmente, las neuronas corticales de rata primaria se colocaron en las micro-columnas utilizando suspensiones de células disociadas [ ^{10 , 31 , 32]} . Sin embargo, este enfoque no produjo la citoarquitectura objetivo en todos los casos, que se definió como los cuerpos celulares neuronales restringidos a los extremos de las micro-columnas, con la luz central compuesta de puros alineados axonal tracts. Desde entonces, el uso de un método de agregación neuronal forzada (basado en protocolos adaptados de Ungrin et al .) Ha permitido una fabricación más fiable y consistente de micro-TENNs con la estructura ideal ( Figura 2B ] [ ^44] . Además de describir las, Este artículo mostrará contraste de fase representativo y imágenes confocales de micro-TENNs que demuestran la formación de tractos axonales a lo largo del tiempo, así como la citoarquitectura objetivo final. Este manuscrito también se ampliará en los aspectos notables del protocolo y los desafíos restantes y las direcciones futuras de la tecnología micro-TENN.

Figura 2: Diagrama esquemático del proceso de fabricación de micro-TENN en tres etapas. ( A ) Desarrollo del hidrogel de agarosa: (i) Inicialmente, se inserta una pequeña aguja de acupuntura ( por ejemplo , 180-350 μm de diámetro) en los canales cilíndricos de un molde moldeado por láser hecho a medida o un tubo capilar ( por ejemplo, , 380 - 700 mu m de diámetro). En el paso siguiente, la agarosa líquida en DPBS se introduce en los canales cilíndricos o tubos capilares. (Ii) Después de los geles de agarosa, se retira la aguja yEl molde se desmonta para producir las microcolumnas huecas de agarosa. (Iii) Estas construcciones se esterilizan a continuación y se almacenan en DPBS. ( B ) Cultivo de neuronas primarias y el método agregado: (i) La agregación neuronal se realiza en matrices de pocillos piramidales, moldeados a partir de moldes impresos en 3D, que encajan en los pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos. (Ii) Los micro-TENN incluyen neuronas primarias de rata disociadas de cerebros fetales de ratas día 18 embrionarias. Después de la disociación tisular con tripsina-EDTA y DNasa I, se prepara una solución celular con una densidad de 1,0-2,0 x 106 células / ml. (Iii) se transfieren 12 μl de esta solución a cada pocillo de la matriz de pocillos piramidales. La placa que contiene estos micro pocillos se centrifuga para producir agregados celulares. (Iv) Estos se incuban a continuación durante la noche antes del chapado en las microcualas. ( C ) Fabricación de núcleos de ECM y siembra de células: (i) Antes de la siembra de células, una solución de ECM que contiene 1 mg / ml de colágeno tipo I y 1 mg / mlLaminina se transfiere al interior de los micro-TENNs y se deja polimerizar. (Ii) Dependiendo de si se están fabricando micro-TENNs unidireccionales o bidireccionales, un agregado se coloca en uno o ambos extremos de la micro-columna, respectivamente. (Iii) Después de un período de incubación para promover la adhesión, los micro-TENN se cultivan en placas de Petri inundadas con un medio basal neuronal embrionario suplementado. (Iv) Después de 3-5 días en cultivo, la estructura final del micro-TENN debe demostrar los agregados celulares en los extremos de la micro-columna, con los tractos axonales que abarcan su longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales en la Universidad de Pensilvania y el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Michael J. Crescenz y se adhieron a las directrices establecidas en la Política del Servicio de Salud Pública de NIH sobre Cuidado Humano y Uso de Laboratorio Animales (2015).

1. Desarrollo del hidrogel de agarosa (componente acelular de micro-TENNs)

1. Preparación de la solución de agarosa
   1. Dentro de un gabinete de bioseguridad, prepare depósitos para las micro-columnas transfiriendo 20 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a cada una de dos placas de Petri de 10 cm. Esterilizar fórceps finos y microscalpels con un esterilizador de cuentas calientes.
   2. Pesar 3 g de agarosa y transferirlo a un vaso de precipitados estéril dentro del gabinete de bioseguridad. Añadir 100 mL de DPBS para una concentración final de 3% peso / volumen (p / v). Incluya una barra magnética limpia y cubra el vaso con aluminioNumfil
   3. Con una placa caliente / agitador, caliente el vaso de precipitados a 100 ° C y agite a 120-200 rpm para disolver completamente la agarosa (la solución cambiará de nublada a transparente). Mantener el calentamiento y la agitación después para evitar la gelificación y cambiar la temperatura de calentamiento según sea necesario para evitar quemar la agarosa.
      NOTA: La fabricación con el dispositivo de corte por láser y los tubos capilares se presenta a continuación en las subsecciones 1.2 y 1.3, respectivamente. Proceda a la subsección 1.4 después de finalizar los pasos descritos en cualquiera de las subsecciones. Para ambos métodos de fabricación de micro-columnas, agregue rápidamente la agarosa líquida, ya que la agarosa se solidifica rápidamente a medida que se enfría. Cuando esterilice con un autoclave en cualquiera de los siguientes pasos, use las condiciones estándar aplicadas a la cristalería.
2. Preparación de microcolumna utilizando un dispositivo de corte por láser
   NOTA: El dispositivo de corte por láser se corta de acrílico transparente usando un cortador de láser CO ₂ comercial. El fabricanteCación de estructuras y dispositivos mediante el corte por láser está bien documentada para una serie de aplicaciones de ingeniería e investigación ^{45 , 46 , 47} . Este molde ( figura 3 ) consiste en una disposición de cinco canales cilíndricos, cada uno con un diámetro de 398 μm y una longitud de 6,35 mm. Estas matrices cilíndricas están formadas a lo largo de su longitud por dos piezas: una mitad inferior (longitud: 25,4 mm, ancho: 6,35 mm, altura: 6,0 mm) y una mitad superior (longitud: 31,5 mm, ancho: 6,35 mm, altura: 12,7 mm ), Como se muestra en las Figuras 3A y 3B , respectivamente. Las dos mitades pueden ser fijadas juntas por las tapas anterior y posterior observadas en la Figura 3C (longitud: 31,5 mm, ancho: 6,35 mm, altura: 12,7 mm), que presentan cuatro orificios de alineación que coinciden con dos orificios en la parte superior e inferior Piezas y que ayudan a asegurar todas las piezas juntas cuando se atornilla. Estas tapas también incCinco agujeros, concéntricos a los canales cilíndricos, en los cuales pueden insertarse las agujas de acupuntura para formar el lumen de las microcuñas.
   1. Esterilizar el dispositivo mostrado en la Figura 3 cubriéndolo con papel de aluminio y autoclave. Montar el dispositivo como se muestra en la Figura 3D alineando las tapas anterior y posterior con sólo la mitad inferior y sujetando las tres partes con dos tornillos # 4 - 40 y tuercas (diámetro de rosca: 3,05 mm) en los orificios de alineación inferiores.
   2. Introduzca completamente una aguja de acupuntura (diámetro: 180 μm, longitud: 30 mm) en los orificios de las agujas en la tapa anterior o posterior del dispositivo ( Figura 3D ). Con una micropipeta, vierta suficiente agarosa líquida (~ 1 ml para los cinco canales) en la mitad inferior para llenar completamente cada una de las mitades del canal cilíndrico.
   3. Coloque inmediatamente la pieza de la mitad superior del dispositivo sobre la mitad inferior y aplique presión hasta que esté firmemente enLugar para completar los canales cilíndricos (la fricción entre las tapas y la pieza superior mantendrá este último en su lugar). Espere ~ 5 min a temperatura ambiente después de la adición de agarosa para permitir su gelificación dentro de los canales del dispositivo.
   4. Extraiga manualmente la aguja de cada uno de los agujeros en las tapas del dispositivo. Quite los tornillos y separe manualmente las dos tapas y la mitad superior de la pieza de la mitad inferior, donde esta última mantendrá las microcolumnas del hidrogel.
   5. Utilice fórceps finos para quitar suavemente las microcortinas de los canales de la pieza de la mitad inferior y colóquelas en la placa de Petri previamente preparada que contiene DPBS (paso 1.1.1). Reutilizar el dispositivo para otra ronda de fabricación de micro-columnas. Continúe con la subsección 1.4.
3. Fabricación de microcristalinas con tubos capilares
   1. Transferencia de tubos capilares de vidrio (diámetro: 398,78 μm, longitud: 32 mm) al interior del gabinete de bioseguridad. Romper manualmente elTubos largos en fragmentos de 2,0-2,5 cm y insertar completamente una aguja de acupuntura (diámetro: 180 mu m, longitud: 30 mm) en cada fragmento ( Figura 2A ).
   2. Transferir 1 ml de agarosa líquida del vaso de precipitados a la superficie de una placa de Petri vacía. Sosteniendo el tubo capilar y la aguja introducida, coloque un extremo del tubo en contacto con el depósito de agarosa líquido para llenarlo por acción capilar. Agitar el tubo para promover el aumento capilar.
      NOTA: Llenar los tubos capilares con agarosa líquida tan alto como lo permita la acción capilar; Después, estas micro-columnas se pueden cortar en construcciones más pequeñas dependiendo de la longitud deseada. El pool de agarosa de 1 mL se usa típicamente para un solo tubo, ya que la agarosa se enfría y se gelifica rápidamente, impidiendo la acción capilar adicional.
   3. Cuando el líquido deja de subir, retire el tubo capilar de la piscina y colóquelo horizontalmente sobre la superficie de una placa de Petri. Espere 5 minutos para dejar que el gel de agarosa dentro de los tubos <Li
   4. Coloque el pulgar y el dedo índice a cada lado del tubo y presione contra él. Utilice la otra mano para sacar rápidamente la aguja mientras usa el pulgar y el dedo índice para evitar que la propia micro columna se deslice fuera del tubo. Inserte una aguja de calibre 30 en el tubo capilar para empujar lentamente la micro-columna hacia fuera en un plato que contenga DPBS (paso 1.1.1).
4. Recorte y esterilización de micro-columnas
   1. Delicadamente transferir una micro-columna de DPBS a un plato vacío con pinzas finas. Agregue 10 μl de DBPS a la parte superior de la micro-columna con una micropipeta para evitar el secado. Coloque el último plato debajo de un estereoscopio para obtener una guía visual.
      NOTA: A lo largo del protocolo, el secado o deshidratación con microcolumna se refiere a la adquisición de una estructura arrugada que es visualmente distinguible de la apariencia hidratada típica de estas construcciones. Las micro-columnas deshidratadas se adhieren firmemente a la superficie de las placas de Petri y cNo se pueden mover fácilmente, mientras que las construcciones hidratadas tienden a deslizarse a través de la superficie después de ser manipuladas con fórceps. En la figura 8A se muestra una imagen de contraste de fase de una microc columna completamente seca.
   2. Recortar la micro-columna con un microscalpel para acortarlo a la longitud deseada (aquí, 2-5 mm). Transportar la micro-columna recortada con fórceps finos a la otra placa Petri de DPBS preparada en el paso 1.1.1.
   3. Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2 para cada micro-columna fabricada.
   4. Esterilizar las micro-columnas en las placas Petri que contienen DPBS bajo luz ultravioleta (UV) durante 1 h. Almacenar las placas de Petri a 4 ° C antes de la adición de ECM y el recubrimiento celular.

2. Cultura de Neuronas Primaria y Método de Agregación de Células Forzadas

1. Preparación de la matriz piramidal de micro-pozos
   NOTA: En esta sección se emplea un molde impreso 3D que consiste en una base cilíndrica (diámetro: 2,2 cm, altura: 7,0 mm) aY nueve pirámides cuadradas en la parte superior (lado de la longitud: 4,0 mm, ángulo de inclinación: 60 °), organizado en una matriz de 3 x 3, como se muestra en la Figura 3E . El proceso de fabricación aditivo que utiliza impresoras 3D comercialmente disponibles está bien documentado. Software de diseño asistido por computadora se puede utilizar para diseñar el molde. El archivo de diseño resultante se puede convertir digitalmente en una ruta de herramienta para una impresora 3D. Cada impresora tiene especificaciones diferentes, y las instrucciones para configurar y operar una impresora 3D varían en consecuencia.
   1. Utilice una broca de 3/32 "para perforar 16 agujeros en una matriz de 4 x 4 (longitud de lado: 4 cm, separación de agujeros: 1 cm), centrado en la tapa de una placa de Petri de 10 cm. La parte inferior de la cápsula de Petri para pesar 27 g de polidimetilsiloxano (PDMS) y 3 g de agente de curado (para una proporción de 1:10) Se agita con una micro espátula para distribuir el agente uniformemente.
   2. Cubra el PDMS / agente de curado con la tapa perforada. Conecte un extremo de una manguera a la vacuuM de la campana e introduzca el otro extremo en el tallo de un embudo (diámetro de la boca: 10 cm, longitud del vástago: 3 cm, diámetro del vástago: 1,5 cm).
   3. Haga una abertura con una broca de 3/32 "en la parte superior de un bulbo de pipeta de 1 ml e inserte y asegure una punta de micropipeta de 1.000 μl en la abertura (con el extremo puntiagudo hacia arriba) Coloque la bombilla y la punta en la manguera y tire La manguera hacia arriba hasta que el bulbo sella la manguera en el vástago del embudo.
   4. Coloque el embudo sobre la tapa perforada del plato y asegure la manguera con un soporte robusto disponible. Abra la válvula de vacío durante 5 minutos a la succión y llevar las burbujas de aire a la superficie.
   5. Cierre la válvula, retire el embudo y golpee la placa de Petri contra la superficie de la campana de humos ~ 3 veces para estallar cualquier burbuja de aire restante.
   6. Coloque un molde piramidal bien impreso 3D en cada uno de los pozos en una placa de cultivo de 12 pocillos, con las pirámides apuntando hacia arriba. Vierta el PDMS / agente de curado en la parte superior de los moldes hasta que cada pocillo de tEl plato está lleno. Cubrir la placa de 12 pocillos con su tapa y transferirla a un horno durante 1 h a 60 ° C para secar.
   7. Retire con cuidado cada conjunto de pocillos de PDMS ( Figura 3F ) de la placa con una microespátula. Cubra las matrices PDMS con papel de aluminio y esterilice en autoclave. Dentro de un gabinete de bioseguridad, inserte una matriz de micro pocillos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos ( Figura 2B ).
2. Aislamiento neuronal cortical de fetos de rata
   1. Añadir ~ 20 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada uno de cuatro a seis platos de Petri de 10 cm (uno para cada tejido disecado) dentro de un gabinete de bioseguridad. Transferir estos platos a una campana de disección y colocarlos en hielo. Esterilice los instrumentos de disección, como microescalpeles, tijeras y fórceps, con un esterilizador de cuentas calientes.
   2. Medio basal de la neurona embrionaria pre-caliente + suplemento sin suero al 2% + L-glutamina 0,4 mM (denominado "medio de cultivo" aquíR) y tripsina al 0,25% + ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA) a 37ºC. Descongele la desoxirribonucleasa (DNasa) I colocándola a temperatura ambiente. Preparar 1,5 ml de una solución de DNAse I de 0,15 mg / ml en HBSS y mantener la solución sobre hielo.
   3. Eutanasiar una rata embrionaria-día-18 embarazada cronometrada por inhalación de dióxido de carbono y confirmar la muerte por decapitación. Transfiera la carcasa a una campana estéril de disección y colóquela ventral hacia arriba. Enjuague el abdomen a fondo con etanol al 70%.
   4. Abra el útero y retire los fetos (generalmente ~ 11) de los sacos amnióticos con tijeras y transfiéralos con fórceps a una placa de Petri que contenga HBSS frío, como se describe ⁴⁸ . Coloque un bloque de granito enfriado (-20 ° C) debajo del estereoscopio. Coloque la placa de Petri en la superficie de este bloque frío para conservar la baja temperatura del HBSS durante todo el procedimiento de disección.
   5. Enjuague a los cachorros por batir el HBSS alrededor y luego transferirlos al siguiente plato limpioQue contiene HBSS. Con la ayuda del estereoscopio y los instrumentos de disección, retire secuencialmente las cabezas, los hemisferios cerebrales y los córtices de los fetos y transfiera cada tejido con fórceps a un nuevo plato lleno de HBSS después de cada disección ⁴⁸ .
   6. Aspirar sólo los córtices con una pipeta Pasteur y colocar el tejido en un tubo estéril de centrífuga de 15 ml. Deseche los otros tejidos disecados. Enjuague las cortezas tres veces añadiendo y eliminando secuencialmente ~ 5 mL de HBSS con una pipeta serológica. Coloque el tubo sobre hielo cuando no esté en uso.
   7. Transferir las córtices con una pipeta Pasteur a un tubo de 15 mL que contenga tripsina-EDTA precalentada (4-6 cortezas por 5 mL de tripsina-EDTA). Agite manualmente el tubo una vez y colóquelo a 37 ° C. Invertir el tubo cada 3 min para evitar que el tejido se agrupe.
   8. Detener la exposición a la tripsina después de ~ 10 min eliminando el tejido con una pipeta Pasteur y transfiriéndola a una centrífuga limpia de 15 mltubo. Añadir la solución de 0,15 mg / ml de DNasa I (1,5 ml) al tubo con una pipeta.
   9. Utilice una pipeta Pasteur para romper manualmente los grumos de tejido y luego vórtice (~ 30 s) hasta que la solución aparezca homogénea y no haya fragmentos de tejido restantes en el líquido. Si no es posible homogeneizar completamente la solución, extraer los fragmentos insolubles tirando de ellos en la punta de una pipeta Pasteur.
   10. Centrifugar la solución celular homogénea obtenida en la etapa 2.2.9 a 200 xg durante 3 min. Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no alterar las células sedimentadas. Añadir 2 ml de medio de cultivo con una pipeta serológica y vórtice para resuspender las células.
   11. Contar el número de células en la solución preparada en el paso 2.2.10 usando un hemocitómetro; El rendimiento esperado es 3,0-5,0 x 106 células / hemisferio cortical. Preparar 1 ml o más de suspensión celular en medio de cultivo, con una densidad de 1,0-2,0 x 10 ⁶ células / ml.
3. Formación de agregados de células neuronales
   1. Con una micropipeta, añada 12 μl de la suspensión celular 1.0-2.0 x 10 ⁶ / mL en cada micro-pocillo de la matriz PDMS (que se colocó en la placa en la etapa 2.1.7).
      NOTA: La concentración celular puede ajustarse dependiendo de la ID de la micro-columna y del tamaño del agregado celular deseado, ya que las concentraciones más altas producen agregados mayores.
   2. Centrifugar la placa a 200 xg durante 5 min para forzar la agregación de células en el fondo de los micro-pozos ( Figura 2B ). Añadir cuidadosamente ~ 2 ml de medio de cultivo a la parte superior de cada matriz PDMS para cubrir todos los micro-pocillos sembrados, teniendo cuidado de no perturbar las células agregadas.
   3. Si las células no se transducen con un vector viral, incubar la placa durante 12-24 h a 37 ° C y 5% de CO ₂ y luego proceder a la sección 3. Si los agregados se transducen, omitir la incubación y pasar a la sección 2.4 .
4. tranScción con un vector viral para observar la señalización del calcio
   Nota: Estos pasos se realizan para transducir neuronas con un vector viral que contiene un indicador de calcio genéticamente codificado (GECI). Los resultados que se muestran en este artículo se obtuvieron utilizando un virus adenoasociado (AAV) disponible comercialmente (serotipo 1) con GCaMP6f, un GECI con cinética rápida que consiste en proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina (CaM) y el péptido M13, Impulsado por el promotor de la sinapsina I humana. La solución del vector viral puede requerir dilución en DPBS estéril antes de la transducción, dependiendo de la concentración de la solución madre. La salud / morfología celular y la fuerza de la señal de GCaMP6f deben observarse en el tiempo para un rango de concentraciones de vectores. Este procedimiento de optimización debe ser realizado por cada investigador para determinar el título apropiado para sus propios cultivos celulares. El tiempo de expresión típico GCaMP6f es de 7-8 días después de la transducción que se produce durante la incubación realizada en stEp 2.4.2.
   1. Con una micropipeta, añadir el volumen requerido de solución de vectores virales (para una concentración final de ~ 3,0 x 10 ⁹ copias genómicas por agregado) al medio de cultivo, cubriendo los agregados. Lentamente pipetee hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la solución del vector se distribuye homogéneamente a través del medio de cultivo.
   2. Incubar la placa con los micro-pocillos piramidales sembrados durante 24 h a 37 ° C y 5% de CO ₂ para permitir la transducción viral de GCaMP6f.
      

3. Desarrollo del componente celular de los micro-TENN

1. Fabricación de núcleo ECM
   1. Después de la incubación de agregados, agregar colágeno tipo I y laminina al medio de cultivo (para una concentración de 1 mg / ml cada uno) en un tubo de microcentrífuga para preparar la solución de ECM. Realice los pasos 3.1.2-3.1.4 a temperatura ambiente, pero mantenga el tubo con ECM sobre hielo cuando no esté en uso para prevenir la gelificación prematura.
      
   2. Ajustar el pH de la solución ECM transfiriendo 1-2 μL al papel de tornasol para verificar el pH inicial, añadiendo 1 μl de hidróxido de sodio 1 N (NaOH) y / o ácido clorhídrico 1 N (HCl) a la ECM, según sea necesario, Y repitiendo hasta que el pH sea de 7,2-7,4. Asegurar la homogeneización de la solución de ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando la formación de burbujas de aire.
   3. Transferir las micro-columnas con fórceps esterilizados de los platos en el paso 1.4.3 para vaciar las placas Petri de 35 ó 60 mm. Trabajar en 4-5 micro-columnas a la vez para prevenir la deshidratación. Conecte una punta de 10 μL unida a una punta de 1,000 μL a una micropipeta. Utilizando el estereoscopio para guiarlo visualmente, coloque la punta en un extremo de las microcuñas y la succión para extraer el DPBS residual y las burbujas de aire del lumen.
   4. Prepare rápidamente 4-5 μl de ECM en una micropipeta. Observando bajo un steReoscopio, coloque la punta de la micropipeta en uno de los extremos de las micro-columnas y descargue suficiente ECM para llenar el lumen. Confirme la ausencia de burbujas de aire en el lumen, ya que pueden inhibir el crecimiento axonal a través de la ECM. Si existen burbujas de aire, retire el ECM, como se explica en el paso 3.1.3, y agregue el ECM nuevamente.
   5. Para evitar la deshidratación, añada ~ 2 μL de ECM alrededor de cada micro-columna. Incubar las micro-columnas de hidrogel / ECM en las cápsulas de Petri a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 25 min. Proceda a la siembra de células inmediatamente después de la incubación.
      NOTA: El período de incubación en la etapa 3.1.5 pretende dar tiempo para la polimerización de colágeno y laminina dentro de las microcualas.
2. La siembra de células neuronales en las micro-columnas
   NOTA: Para cambiar el medio de cultivo de los agregados transducidos, incline la placa, utilice una micropipeta para retirar el medio que se acumula en la pared del pozo, y luego añada lentamente ~ 1 ml contra el(Para evitar perturbar los agregados en los micro-pozos piramidales). Repita este cambio de medio una segunda vez.
   1. Después del período de incubación en la etapa 3.1.5, se transfieren aproximadamente 10-20 μl de medio de cultivo a dos áreas libres en las placas de Petri que contienen las microcuñas. Utilice una micropipeta para transferir individualmente los agregados a la placa de Petri que contiene las construcciones y muévalas con pinzas a una de las pequeñas charcas del medio de cultivo para preservar la salud celular.
   2. Mientras se observa bajo un estereoscopio, inserte un agregado en cada extremo de las microcuñas para micro-TENNs bidireccionales o en un extremo para una arquitectura unidireccional (como se desee) usando fórceps. Confirmar la colocación de los agregados en el interior de las micro-columnas utilizando el estereoscopio. Utilice fórceps para mover las micro-columnas sembradas a la otra piscina pequeña de medio de cultivo para evitar la deshidratación y preservar la salud agregada.
   3. Incubar a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 45 min a unaLos agregados a adherirse a la ECM. Verificar que los agregados permanezcan en los extremos de las microcuñas usando el estereoscopio; Reintroducir los agregados celulares y repetir el paso de incubación según sea necesario.
   4. Inundar cuidadosamente las placas de Petri que contienen los micro-TENNs con medio de cultivo (3 ó 6 mL para una placa de Petri de 35 ó 60 mm, respectivamente) usando una pipeta serológica. Colocar los platos en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO ₂ para el cultivo a largo plazo.
   5. Realice media media cambios cada 2 días con medio de cultivo. Retire cuidadosamente la mitad del medio viejo con una pipeta y utilice el estereoscopio para una guía visual para evitar la succión de los micro-TENN. Reemplazar lentamente añadiendo medio fresco precalentado con una pipeta.
   6. Para reutilizar las matrices de micro-pozos de PDMS, eliminar el medio de cultivo, hervir las matrices en agua desionizada durante 30 min, y esterilizar en un autoclave para otra ronda de formación de agregados y cultivo.
      NOTA: En los puntos de tiempo deseados, elLa citoarquitectura de micro-TENNs puede ser verificada utilizando microscopía de contraste de fase. En este caso, se utilizaron un tiempo de exposición de 5-8 ms y 10X (0,64 μm / pixel) y 20X (0,32 μm / pixel) para capturar las imágenes de contraste de fase. La fluorescencia asociada con los cambios de concentración de calcio en los micro-TENNs transducidos por virus se capturó utilizando un microscopio de fluorescencia de alta velocidad con un tiempo de exposición de 50 ms, un objetivo 10X (0,64 μm / píxel) y una luz de estado sólido con filtros pasabanda de ~ 480 Nm y ~ 510 nm para excitación y emisión, respectivamente, para visualizar la señal de fluorescencia GCaMP6f.

4. Inmunocitoquímica para Estudios In Vitro

Nota: Para las imágenes mostradas aquí, se usaron los siguientes anticuerpos primarios: tubulina anti-Tuj-1 / beta-III de ratón (1: 500) y anti-sinapsina-1 de conejo (1: 500) para el marcaje de axones y pre -sinápticos boutons, respectivamente. Los anticuerpos secundarios fueron burro anti- murciélago 568 (1: 500) y burro anti - conejo 488 (1: 500). Los volúmenes requeridos de las soluciones de anticuerpo primario y secundario preparadas, así como los volúmenes de las soluciones de formaldehído, suero de caballo y detergente, dependen del volumen requerido para cubrir completamente las construcciones. Estos volúmenes pueden minimizarse usando una pluma de barrera hidrófoba para limitar el área que rodea cada micro-columna.

PRECAUCIÓN: Esta sección emplea formaldehído y Hoechst. El formaldehído es un compuesto tóxico conocido como cancerígeno, y Hoechst es un mutagénico conocido. Por lo tanto, estos compuestos deben eliminarse en un recipiente de residuos apropiado. Siempre manipúleslos en una campana extractora de humos químicos mientras usas el equipo de protección personal apropiado, como una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes.

1. Preparar una solución de 4,0% de volumen / volumen (v / v) de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) dentro de una campana de humo químico.
2. Eliminar el medio de cultivo de las placas de PetriNg los micro-TENNs con una micropipeta. Añada suficiente volumen de la solución de formaldehído a los platos para cubrir completamente los micro-TENN. Remoje los micro-TENNs en la solución de formaldehído durante 35 minutos a 18-24 ° C para fijar las células dentro de las micro-columnas.
3. Retire la solución de formaldehído al 4,0% de las cápsulas de Petri con una pipeta y deseche siguiendo las normas apropiadas de eliminación de materiales peligrosos.
4. Realice dos enjuagues rápidos añadiendo suficiente PBS para cubrir completamente los micro-TENNs fijos y luego eliminar el PBS con una pipeta. Realizar un tercer enjuague largo remojando las construcciones en el PBS durante 10 min.
   PRECAUCIÓN: Deseche el PBS utilizado para el enjuague, ya que posiblemente contenga trazas de formaldehído.
5. Preparar una solución al 0,3% v / v de detergente no iónico en suero de caballo al 4% v / v en PBS. Eliminar el PBS de las placas de Petri que contienen los micro-TENNs fijos y añadir un volumen suficiente de la solución de detergente al 0,3% para cubrir las construcciones. Remoje durante 60 minutos a 18-24 y #176; C para permeabilizar las células.
6. Retire la solución detergente con una pipeta. Realice dos enjuagues rápidos añadiendo y eliminando posteriormente el PBS. Después, realice tres enjuagues más largos empapando las construcciones en PBS durante 5 min durante cada enjuague.
7. Diluir los anticuerpos primarios en suero de caballo al 4%. Eliminar el PBS de las placas de Petri que contiene el fijo y permeabilized micro-TENNs. Añadir suficiente solución de anticuerpo primario a las micro-columnas para cubrirlos completamente. Seal las placas de Petri con parafilm para evitar la evaporación e incubar durante la noche (12-16 h) a 4 ° C.
8. Retire la solución de anticuerpo primario de los platos y enjuague como se explica en el paso 4.6. En la oscuridad, preparar la solución de anticuerpos secundarios en 4,0% de suero de caballo. Añadir suficiente solución de anticuerpos secundarios para cubrir completamente las construcciones, cubrir los platos con papel de aluminio e incubar durante 2 h a 18-24 ° C.
9. Preparar la solución de Hoechst (1: 10.000) en PBS para teñir los núcleos.
NOTA: Las imágenes para los micro-TENN inmunomarcados se tomaron con un microscopio confocal láser con una resolución de 2,048 (~ 8 s / marco), una longitud de onda de 10X objetivo (0,64 μm / píxel), de excitación de 487 nm y ~ 525 nm para Fluorescencia verde, excitación de 561 nm y longitudes de onda de emisión de ~ 595 nm para fluorescencia roja, y ~ 3,22 μm / rebanada con ~ 60 rebanadas en promedio para las pilas z.

Representative Results

Micro-TENNs fueron monitoreados mediante microscopía de contraste de fase para evaluar su citoarquitectura y el crecimiento axonal ( Figura 4 ]. Dentro de unidireccional, de 2 mm de largo micro-TENNs, agregados neuronales se restringieron a un extremo de la micro-columna y proyecta un haz de axones a través del núcleo interno. Los axones abarcaban toda la longitud de la columna 5 días in vitro (DIV) ( Figura 4A ). Hubo una mayor tasa de crecimiento axonal inicial bidireccional de 2 mm de largo micro-TENNs, como axones abarcó toda la micro-columna de 3 DIV ( Figura 4B ]. Por 5 DIV, micro-TENN bidireccional presentó densa axonal tracts que conectó los agregados mantenidos en los extremos de la micro-columna. Esta citoarquitectura también se observó en 5-mm micro-TENNs, con axones que abarcan la micro-columna de 5 DIV ( Figura 4C ]. Como se observa en todos los casos, la ECM en el lumen y el resto geométricoCción presentada por la agarosa proporcionó la direccionalidad requerida para formar tractos axonales que imitan estructuralmente características de neuroanatomía nativa.

En este protocolo se aplicaron técnicas inmunocitoquímicas, y se tomaron imágenes confocales para verificar los componentes de la arquitectura micro-TENN. Los núcleos celulares teñidos con Hoechst (azul) se localizaron casi exclusivamente dentro de los agregados en los extremos de las micro-columnas unidireccionales y bidireccionales, con esencialmente ninguna tinción Hoechst en el interior ( Figura 5 ). Esta observación confirmó lo que se dedujo de las imágenes de contraste de fase: las poblaciones neuronales estaban restringidas a los extremos, y sólo axones (en rojo) abarcaba la luz de los micro-TENN. Sin embargo, después de que los axones cruzaron los agregados, la migración celular se observó a lo largo de los tractos axonales en el lumen interno, como se observa por la presencia de núcleos (azul) en el interior a 28 DIV para un bidire de 2 mm de longitudMicro-TENN ( Figura 6 ). Además, sinapsina I immunolabeling (verde) se encontró a lo largo de los cuerpos celulares y axonal tracts ( Figura 6 ]. La sinapsina I es una proteína terminal pre-sináptica implicada en la regulación de la liberación del neurotransmisor y es indicativa de la presencia de terminales pre-sinápticos cuando se encuentra en una distribución punteada; Se ha correlacionado previamente con la formación de sinapsis activos por grabaciones de parches de células enteras [ ^49] . La tinción de la sinapsina en la zona central rica en axones del micro-TENN es probable que una combinación de puncta, así como la sinapsina que se transporta axones hacia los terminales pre-sináptica. Sin embargo, la presencia de synapsin puncta dentro de los agregados de micro-TENN sugiere que estas construcciones tienen la capacidad de comunicarse a través de sinapsis, aunque la colocalización de sinapsina con una proteína post-sináptica sería necesaria para evidencia estructural adicional de sinapsis funcionales.Pabellón

También se fabricaron micro-TENN con neuronas agregadas que se transdujeron con un AAV que contenía el indicador de calcio GCaMP6f para someter preliminarmente las propiedades electrofisiológicas de estas construcciones. Estas construcciones expresaron el indicador de calcio a lo largo de toda su longitud, como se muestra por fluorescencia tanto en los agregados neuronales como en los tractos axonales ( Figura 7A ). Obsérvese que debido a los ajustes del microscopio dirigidos a maximizar la intensidad en los agregados, la fluorescencia en los tractos axonales parecía más débil. Estos transduced micro-TENNs se analizaron en el tiempo con microscopía de fluorescencia de alta velocidad (sin estimulación eléctrica externa), y varias de tamaño de las células de interés (ROI) fueron seleccionados al azar en un representativo micro-TENN para caracterizar la capacidad de señalización de estos Construcciones. Se observaron ráfagas de concentración de calcio en casi todos los ROI, como seA lo largo del tiempo ( Figura 7B ). Particularmente, varios ROI parecen mostrar una periodicidad casi constante de concentración de calcio aumenta ( Figura 7B ). Estos cambios en la concentración de calcio se deducen como resultado de potenciales de acción espontáneos inherentes, señalización celular dentro de agregados individuales y / o señalización a través de axones de agregados distintos. Se requieren análisis adicionales para caracterizar completamente las propiedades electrofisiológicas de las neuronas y los tractos axonales dentro de los micro-TENN. Sin embargo, estos resultados iniciales demuestran que los micro-TENNs muestran una actividad eléctrica endógena / basal robusta.

Figura 3: Planos del dispositivo de fabricación de microcuadros cortados por láser y el molde de pocillos piramidales impresos en 3D para la agregación de células. Un) - ( B ) Esquema e imagen de las mitades inferior y superior de la serie de canales cilíndricos, respectivamente, utilizados para fabricar las microcualdas de hidrogel. ( C ) Plan e imagen de las tapas usadas para sostener el dispositivo juntos. Tanto las piezas anteriores como las posteriores comparten las mismas dimensiones. ( D ) Imagen del dispositivo ensamblado requerido para fabricar las micro-columnas. Solamente las dos tapas y la mitad inferior se sujetan con tornillos en los dos agujeros de alineación inferiores (izquierda). Las líneas quebradas muestran la colocación de las agujas de acupuntura a través de los cinco agujeros en cada tapa. La agarosa líquida se añade a la mitad inferior de los cilindros y, a continuación, se coloca la mitad superior (derecha) en el dispositivo para moldear la agarosa líquida en forma. ( E ) Esquema de los moldes impresos en 3D utilizados para hacer matrices de micro-pozos PDMS. ( F ) Imágenes del molde impreso en 3D (izquierda) y las matrices de micro-pozos PDMS (derecha). Todas las dimensiones están en milli Metros (mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Observación del crecimiento axonal en micro-TENNS por contraste de fase de imágenes de construcciones unidireccionales y bidireccionales en función de los días in vitro . ( A ) Los micro-TENNs unidireccionales de 2 mm de largo muestran tramas axonales que se extienden casi por toda la longitud de la micro-columna por 5 DIV. ( B ) En comparación con los micro-TENN unidireccionales, los micro-TENN bidireccionales de 2 mm muestran una tasa de crecimiento axonal más rápida. ( C ) Para los micro-TENN bidireccionales de 5 mm, los tractos axonales pueblan la longitud de la micro-columna a 5 DIV. Esta arquitectura se mantiene al menos hasta 10 DIV. Barras de escala = 200 μm./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: cytoarchitecture Micro-TENN observado con imágenes confocales de micro-TENN unidireccional y bidireccional inmunomarcada. Las células se tiñeron para núcleos celulares (Hoechst, azul) y axones (Tuj1, rojo). ( A ) Imagen de contraste de fase de un micro-TENN bidireccional de 5 mm (28 DIV). Las reconstrucciones confocales ( D ) - ( F ) e ( I ) - ( K ) de un micro-TENN bidireccional de 5 mm (28 DIV) y un micro-TENN unidireccional (25 DIV) muestran, respectivamente, núcleos celulares marcados ( D ) Y axones ( E ), ( J ), así como la superposición ( F ), ( K ). Barras graduadas: 500 μm. Inserciones en ( A F ) y ( K ) se refieren a los contrastes de contraste de fase ( B ) - ( C ) y confocal ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) de los agregados neuronales y los tractos axonales . Las imágenes muestran los agregados restringidos a los extremos del micro-TENN, mientras que el lumen está atravesado por tramos axonales alineados. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Expresión de la sinapsina I de la proteína terminal pre-sináptica en un micro-TENN bidireccional representativo. La construcción se tiñó de núcleos celulares (Hoechst, azul), axones (Tuj1, rojo), y boutons pre-sináptica (sinapsina I, verde). ( A ) Fase-contrAst de un micro-TENN bidireccional de 2 mm a 28 DIV. ( D ) - ( G ) Reconstrucciones confocales que muestran los núcleos celulares ( D ), axones ( E ), boutons pre-sinápticos ( F ) y una superposición ( G ) de los tres canales. Las cajas muestran los acercamientos ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) de las imágenes de contraste de fase y de superposición para los agregados neuronales, respectivamente. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Actividad de señalización espontánea en un micro-TENN bidireccional observado mediante la expresión de un indicador de calcio codificado genéticamente. ( A ) FluorescencLa microscopía confirmó la expresión del reportero de GCaMP, observada por fluorescencia en los agregados y axones. Barra de escala = 100 μm. ( B ) Los cambios de fluorescencia asociados con las variaciones de la concentración de calcio se midieron sin estimulación externa en varias regiones de interés (ROI) en función del tiempo. Los círculos de color numerados en ( A ) designan estos ROI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes de contraste de fase de los modos comunes de falla en la metodología del micro-TENN. ( A ) Una micro-columna de agarosa completamente deshidratada / secada como resultado de la eliminación y / o evaporación de DPBS en las etapas iniciales de fabricación. Barra de escala = 5081; m. ( B ) Micro-columna de hidrogel con el lumen recubriendo la pared externa de la construcción debido a la falta de alineación concéntrica de la aguja de acupuntura con el tubo capilar. Barra de escala = 100 μm. ( C ) Micro-TENN sembrado con ambos agregados presentes en 1 DIV. ( D ) Uno de los agregados cayó de la misma micro-columna que ( C ) a 3 DIV. ( E ) Micro-TENN unidireccional a 4 DIV. ( F ) Los tractos agregados y axonales cayeron de la microcolumna en ( E ) y permanecieron flotando en el medio de cultivo a 5 DIV. Barra de escala para ( C ) - ( E ) = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Las lesiones y enfermedades del SNC típicamente dan como resultado la pérdida o disfunción de las vías axonales de larga distancia que comprenden el conector cerebral, con o sin degeneración neuronal concomitante. Esto se ve agravado por la limitada capacidad del SNC para promover la neurogénesis y la regeneración. A pesar de la búsqueda de estrategias de reparación como el factor de crecimiento, la célula y el suministro de biomateriales como abordajes individuales o combinatorias, estas técnicas no son capaces de explicar simultáneamente tanto la degeneración de las células neuronales como la pérdida de conexiones axonales ^{14 , 22} . Estos vacíos en tecnología limitan la capacidad de reparar, alterar y probar redes neuronales de una manera controlada y sostenida. En consecuencia, la tecnología micro-TENN se desarrolló para abordar la necesidad de una estrategia de reparación neural que, a diferencia de los métodos existentes, facilita tanto el reemplazo neuronal como la reconstrucción de conexiones axonales largas. MicLos ro-TENNs son andamios vivos implantables con una citoarquitectura preformada que se aproxima a los bloques de construcción a nivel de sistemas de la conexión cerebral que están específicamente diseñados para la reconstrucción, reemplazo y modificación de circuitos neuronales del huésped. Estos andamios están formados por poblaciones discretas de neuronas conectadas por tramos axonales largos dentro de la luz que contiene ECM de hidrogeles cilíndricos de agarosa en miniatura. Estas construcciones pueden ser capaces de funcionar como relés sinápticos para reemplazar rutas perdidas y modular dinámicamente los circuitos nativos. Además, en los casos de degeneración axonal aislada (con neuronas fuente que permanecen intactas), los micro-TENNs posiblemente pueden servir como guías para la regeneración axonal basada en el mecanismo de la regeneración de axones facilitada axón. Este manuscrito presentó el protocolo de fabricación para crear confiablemente micro-TENNs, con geometría controlada, fenotipo y características funcionales. Microscopía de contraste de fase, immunocytochemiStry y microscopía confocal demostraron que los micro-TENNs producidos con el protocolo exhiben la citoarquitectura requerida y expresan la sinapsina de la proteína terminal pre-sináptica. Además, se demostró que los micro-TENNs poseen actividad de señalización intrínseca, posiblemente debido a potenciales de acción, en ausencia de simulación externa. Esto se comprobó por la presencia de fluctuaciones casi sincrónicas en la fluorescencia asociada con un informador de calcio codificado genéticamente.

El desarrollo del Micro-TENN se puede resumir en tres pasos: (1) la fabricación del tubo hueco del hidrogel, (2) la adición de la solución del ECM al lumen del tubo, y (3) la siembra de agregados de neuronas aisladas en el Los extremos del tubo. Las micro-columnas pueden ser fabricadas con tubos capilares de vidrio o con un dispositivo microfabricado que contiene canales cilíndricos. Este dispositivo se puede crear con cualquier método de micro-fabricación de alta precisión disponible para el investigador. LíquidoSe vierte agarosa en los canales del dispositivo o en tubos capilares que contienen una aguja de acupuntura centrada para crear las microcolumnas de hidrogel. Después de la gelificación de agarosa, se retira la aguja de acupuntura para producir el lumen hueco. En la Figura 8 se destacan varios errores comunes que ocurren durante la fabricación o el crecimiento. Obsérvese que algunas de las imágenes mostradas en la Figura 4 y un caso extremo en la Figura 8B muestran la porción luminal precariamente cercana a la pared del cilindro. Con el fin de producir un espesor de pared uniforme cuando se utiliza el método de tubo capilar, el conjunto de aguja de tubo se debe mantener en posición vertical cuando se pone en contacto con agarosa y la aguja debe mantenerse en el centro del tubo. Mantener el conjunto tubo-aguja en un ángulo con respecto a la superficie de agarosa favorece la descentralización de la aguja. Sin embargo, estas precauciones son difíciles de implementar, y la aguja es más a menudo que descansarG de las paredes de los tubos capilares. Por el contrario, el principal activo del dispositivo microfabricado es que presenta orificios de aguja alineados concéntricamente con los canales cilíndricos, promoviendo una centralización adecuada de la aguja y del lumen con respecto al canal y la microcualumna, respectivamente. Además, el dispositivo aumenta el rendimiento al facilitar la fabricación de varias microcortinas al mismo tiempo. A pesar de la ventaja proporcionada por el dispositivo, los lúmenes descentrados pueden todavía ser creados usando agujas de acupuntura dobladas. Las técnicas de microfabricación también tienen una tolerancia inherente que limita su eficacia. En general, la deshidratación con microcolumna, para la que se muestra un caso extremo en la figura 8A , no debería ser un obstáculo si se siguen las recomendaciones proporcionadas a lo largo del protocolo. Obsérvese que las propiedades físicas de la agarosa utilizada para el recubrimiento exterior pueden necesitar optimización para subtipos neuronales alternativos, ya que la neurona cortical mejoradaUrvival y neurite crecimiento a mayor (3-4%) frente menor (1-2%) las concentraciones de agarosa se observó [ ^10] .

El desarrollo de Micro-TENN continúa con la introducción de ECM en el lumen de la micro-columna, que sirve para proporcionar un ambiente adecuado para la adhesión neuronal, la supervivencia y la proliferación. Además, la ECM, en combinación con la restricción geométrica y la baja porosidad proporcionada por el hidrogel de agarosa, restringe el crecimiento axonal a la dirección longitudinal para producir la arquitectura requerida. El contenido de la solución ECM puede optimizarse para el tipo de neurona utilizada. Por ejemplo, el colágeno solo promueve la supervivencia y la proliferación axonal en DRG micro-TENNs, mientras que una combinación de colágeno y laminina es necesaria para las neuronas corticales [ ^10] . Por otra parte, la polimerización ECM dentro de la micro-columna es crítica antes de la galjanoplastia celular, ya que la co-entrega de células con ECM no polimerizado conduce a disminuir neurita outgrOwth y fasciculación ³¹ . Obsérvese que aunque la microcristalina se llena inicialmente con solución de ECM, su contenido se polimeriza en un gel blando y tiende a contraerse durante el período de incubación, creando un espacio que permite la inserción de los agregados celulares. Además, es importante confirmar que la ECM ha entrado en el interior de la micro-columna inspeccionando bajo el estereoscopio; La ausencia completa y / o los bolsillos de ECM faltantes dan lugar a una falta de crecimiento axonal de los agregados. La fabricación de micro-TENN culmina en la siembra de agregados neuronales corticales en los extremos del andamio. Estas neuronas se disecaron de fetos de rata utilizando procedimientos conocidos [ ^48] . Se puede inferir que la mayoría de las células aisladas son neuronas porque la corteza de rata embrionaria al momento de la gestación utilizada para el aislamiento está compuesta de neuronas del 99% y el medio de cultivo definido en el protocolo es metabólicamente limitante para la proliferación glial ⁴⁹ . En consecuencia, debe haber una mínima contaminación glial, aunque para la confirmación se requiere tinción para marcadores específicos. Si bien este manuscrito presentado micro-TENN fabricación de neuronas corticales, neuronas de diferentes regiones del cerebro ( eg, nigral, talámico, y el hipocampo) o con diferentes fenotipos ( por ejemplo, excitador, inhibitorio, y dopaminérgico) podría ser utilizado de acuerdo a la aplicación deseada y Área de implantación. Las iteraciones anteriores del protocolo de fabricación de micro-TENN implicaron siembra de células disociadas ^{10 , 31 , 32} . Aunque la citoarquitectura deseada se ha obtenido utilizando el método disociado, no se consiguió en todos los casos. En muchos casos, las células disociadas inundaron el interior y dio lugar a varios grupos de células del cuerpo a lo largo de la luz, con los procesos de conexión de ellos en una extensa red 3DPor otra parte, el método agregado asegura la contención de los cuerpos celulares a los extremos y, por lo tanto, es parte integral del éxito de la tecnología micro-TENN ( Figura 5 ) .Los micro-TENN representativos mostrados En las Figuras 4-6 se fabricaron con agregados más grandes que no estaban completamente insertados, y esto puede ocasionar ocasionalmente que los agregados caigan fuera de las microcualas en cultivo, como los ejemplos mostrados en las Figuras 8D y 8E . Para evitar esto, los agregados pueden Si se presenta esta situación incluso después de aplicar la estrategia anterior, el período de incubación inicial puede ampliarse para proporcionar tiempo suficiente para la adhesión del agregado a la ECM Durante el cultivo, el manejo suave de los micro-TENNs es Recomendado para preservar la integridad del recubrimiento de hidrogel y la citoarquitectura, problemas durante la micro-TLa manipulación de ENN es la causa de las curvaturas obtenidas en los tramos axonales alineados de otro modo ( Figura 5 ). Sin embargo, siguiendo el protocolo presentado en este artículo debe resultar en la fabricación consistente de micro-TENNs con la arquitectura neuronal / axonal esperada, distribución de botones pre-sináptica y actividad eléctrica intrínseca.

A pesar de la promesa que tienen los micro-TENNs, hay retos pendientes que pueden limitar las aplicaciones de esta tecnología. La técnica actual de fabricación de microcuadros está limitada por la descentralización del lumen de la microcolumna, lo que puede causar una presentación inconsistente de las señales mecánicas a las células ( por ejemplo, rigidez), la ruptura de la pared de la micro-columna y la subsiguiente exposición de los tractos axonales Al exterior, y problemas durante la implantación. A pesar de que el uso de un dispositivo micro-fabricado ha mejorado el resultado en comparación con los tubos capilares, de alta precisión micro-fabricatioN son necesarias para aumentar la reproducibilidad dimensional de estas construcciones. Los resultados en este manuscrito mostraron que la metodología de micro-TENN puede producir de manera fiable andamios vivos compuestos de neuronas y tractos axonales que se asemejan a la neuroanatomía nativa, particularmente los tractos axonales que conectan distintas regiones del cerebro. Sin embargo, la longitud de micro-TENN es un obstáculo, dependiendo de la longitud de la vía axonal del huésped que necesita ser reemplazada. Por ejemplo, los injertos de tejido de ingeniería de nervio (TENGs) son una estrategia de andamios vivos separados utilizados por nuestro grupo de investigación para reparar las lesiones nerviosas extremadamente largas. Para reemplazar estos intervalos largos, los axones en TENG pueden alargarse a decenas de centímetros aplicando una tensión mecánica continua en los mecano-biorreactores personalizados ^{1 , 23 , 50} . Esta técnica de "crecimiento de estiramiento" también se ha aplicado para manipular la longitud del proceso astrocítico a betteR imitan la estructura de las vías gliales radiales ⁵¹ . Por el contrario, la actual tecnología micro-TENN aún no ofrece este grado de control; La longitud máxima alcanzable está actualmente limitada por cuánto tiempo los tractos axonales pueden crecer in vitro basándose en la extensión tradicional mediada por cono de crecimiento. Además, a pesar de que el SNC tiene una capacidad intrínseca para el recableado neurofisiológico en respuesta a diversos estímulos, y las células trasplantadas tienen la capacidad de integrarse sinápticamente con circuitos nativos, otra limitación de esta tecnología es que los micro-TENN se basan en la plasticidad del cerebro nativo Y la capacidad de las redes de acogida para integrarse funcionalmente con la construcción implantada ^{52 , 53 , 54 , 55} . Por último, una deficiencia innata de todos los enfoques basados ​​en implantes, como los micro-TENN, es su invasividad. Dado que las neuronas sonGeneralmente en las proximidades de los capilares, cualquier tipo de procedimiento quirúrgico puede causar alteración en la barrera hematoencefálica, fuga de factores sanguíneos al parénquima cerebral y una respuesta inflamatoria aguda (e incluso crónica) ³¹ . Esta respuesta puede dañar las neuronas del huésped y del micro-TENN, negando los aspectos beneficiosos de esta técnica. Sin embargo, los micro-TENN implantados en la vía corticotalámica de las ratas sobrevivieron durante al menos 1 mes y mostraron evidencia de integración estructural con la corteza cerebral huésped [ ^{10 , 31]} . Además, una publicación anterior de nuestro grupo de investigación presentó una metodología que permite la implantación sin agujas de micro-TENNs en la rata de cerebros [ ^31] . En este enfoque, esta estrategia de recubrimiento de hidrogel se aumentó para incluir un recubrimiento fino (~ 20 μm) de carboximetilcelulosa, que, después de una deshidratación suave, presentaba suficiente rigidez para penetrarEl cerebro sin necesidad de una aguja o guía ³¹ . Este método de implante sin aguja, junto con la pequeña sección transversal de las microcualdas, debe minimizar el daño al cerebro durante y después del procedimiento de implantación estereotáxica.

A pesar del éxito preliminar de los micro-TENN in vivo , los estudios futuros deberán confirmar que estos constructos se integran sinápticamente con el tejido nativo y para investigar si la recuperación funcional se obtiene en los modelos de lesión del SNC y enfermedades neurodegenerativas [ ^{10 , 31]} . Por ejemplo, micro-TENNs adaptados pueden ser diseñados con fenotipos celulares específicos e implantados en la vía degenerada correspondiente para reconstruir la red y restaurar la función. Para reducir la respuesta inflamatoria aguda después de la implantación, la cáscara de hidrogel de micro-TENN puede estar dopada con agentes antiinflamatorios y pro-supervivencia. Fabricación alternativaSe pueden desarrollar técnicas ( por ejemplo, impresión 3D) para generar las microcolumnas de hidrogel con mayor facilidad y con características más precisas, incluyendo una centralización consistente del lumen y la reproducibilidad de las dimensiones. El mismo esquema de biomateriales empleado con micro-TENNs puede ser modificado para abordar otras patologías características de lesión y enfermedad del SNC. Por ejemplo, nuestro grupo ha desarrollado previamente constructos compuestos de haces astrocíticos alineados longitudinalmente a lo largo del lumen revestido con colágeno de un hidrogel de agarosa que emulan estructuralmente las vías gliales radiales y el tubo glial para facilitar la regeneración axonal y la migración neuronal ⁵⁶ . Además, se pueden incorporar células madre, como células madre embrionarias humanas (HESCs), células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) y células madre derivadas de adipos (ASCs), para fabricar micro-TENNs autólogos, por paciente, a más Se asemejan mucho a la citoarquitectura perdida y al fenotipo celular. Estos futuRe modificaciones aumentarían la capacidad de los micro-TENNs para reemplazar las vías degeneradas in vivo y permitirían la reconstrucción de arquitecturas de tejidos más sofisticadas, incorporando soporte astroglial y mielinización axonal, entre otras características. Las neuronas modificadas genéticamente también podrían ser sembradas para aumentar la acción regenerativa de los micro-TENNs mediante la liberación de factores tróficos o permitir la modulación del SNC mediante la estimulación optogenética de los canales iónicos ligeros ⁴³ . Estos andamios podrían fabricarse con neuronas excitadoras o inhibidoras para modular sinápticamente las conexiones disfuncionales existentes en el huésped en condiciones tales como la epilepsia, la depresión, la adicción a las drogas o los trastornos del dolor ¹ . Por ejemplo, pueden construirse micro-TENNs que forman predominantemente sinapsis GABAérgicas o glutamatérgicas para suprimir o estimular, respectivamente, vías ascendentes o desreguladas mediante integración sináptica y / o por masa neurLiberación del otransmisor. Es importante destacar que tales construcciones moduladoras autónomas serían teóricamente sensibles basándose en la retroalimentación de la red de acogida ¹ . De forma similar, los micro-TENN podrían ser aplicados como interfaces cerebro-computadora (BCI), con micro-TENNs manipulados optogenetically que sirven como intermediarios entre el cerebro y los dispositivos inorgánicos de estimulación o grabación. Esta aplicación puede ser una alternativa a los BCI microelectrode, que carecen de orientación celular específica y estabilidad mecánica y han causado respuestas inflamatorias, formación de cicatrices gliales y migración o pérdida neuronal cuando penetran en el cerebro ^{57 , 58} .

Como bancos de pruebas in vitro , los micro-TENNs pueden proporcionar una potente plataforma para el estudio de la neurobiología y la electrofisiología, sirviendo como modelos biofidelic del sistema nervioso. Además, las construcciones 3D pueden servir como bancos de pruebas para estrategias de tratamiento cuando se usan como neural injY modelos de enfermedad ⁵⁹ . Como construcciones 3D, los micro-TENNs son capaces de simular el ambiente in vivo , que se caracteriza por complejas interacciones célula-célula y célula-ECM en todas las direcciones espaciales que no pueden representarse con exactitud en los cultivos planares ^{42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65} . De hecho, numerosas investigaciones han establecido que el tipo de ambiente es crítico para que las células presenten la morfología, la proliferación, la migración, la expresión génica, la diferenciación y la señalización exhibidas en el entorno nativo ⁶⁰ . Las similitudes entre el entorno 3D de estos andamios y el propio cerebro se complementan con el grado de control que ofrecen estas construcciones sobre su físico y bioquímico prOperaciones ⁴² . Esto permite la ingeniería de micro-TENNs con diferentes conjuntos de señales mecánicas, haptotaxicas, y quimiotaxicas para estudiar el efecto de estas señales, individual o sinérgicamente, sobre la supervivencia neuronal, maduración, extensión axonal, sinaptogénesis y mecanotransducción ^{32 , 42 , 63} . Además, la flexibilidad de diseño de esta técnica de ingeniería de micro-tejidos permite la construcción de andamios vivos que imitan otras características del tejido cerebral, tales como la estructura columnar, compartimentada del neocórtex, atravesada por los tractos axonales del conector, para aumentar aún más el Potencia de este sistema como una plataforma in vitro para estudiar el cerebro [ ^65] . Como plataformas de investigación, los micro-TENNs aprovechan la configuración controlada de modelos in vitro típicos, la disponibilidad expansiva de parámetros de diseño en los tejidos enY la creciente relevancia fisiológica y fisiopatológica de las plataformas 3D para convertirse en un banco de pruebas ideal para avanzar en el conocimiento neurobiológico. La miríada de direcciones futuras para esta tecnología simboliza la versatilidad de los micro-TENN. Este manuscrito ha demostrado que el protocolo micro-TENN puede producir de manera fiable andamios vivos de ingeniería tisular que imitan características cruciales de la neuroanatomía cerebral para ofrecer nuevos conocimientos sobre los fenómenos neurobiológicos, incluyendo el desarrollo, las enfermedades y los procesos de reparación. Estas construcciones también pueden integrarse sinápticamente con tejido nativo para reconstruir los tractos dañados de la sustancia blanca, reemplazar las células neuronales perdidas y modular las vías desreguladas después de la lesión y enfermedad del SNC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	--------------	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.