Анатомически вдохновленные трехмерные микротамовые инженерные нейронные сети для восстановления, модуляции и моделирования нервной системы

Summary

В этой рукописи подробно описывается изготовление микросердечных нейронных сетей: трехмерные микронные конструкции, состоящие из длинных выровненных аксональных трактов, охватывающих совокупную совокупность нейронов, заключенных в трубчатый гидрогель. Эти живые леса могут служить в качестве функциональных реле для восстановления или модуляции нейронных схем или в виде биофиделических пробирок, имитирующих нейроанатомию серо-белого вещества.

Abstract

Функциональное восстановление редко происходит после травмы или вызванной болезнью дегенерации в центральной нервной системе (ЦНС) из-за тормозной среды и ограниченной способности к нейрогенезу. Мы разрабатываем стратегию одновременного устранения нейронных и аксональных потерь пути в поврежденной ЦНС. В этой рукописи представлен протокол изготовления микроштучных инженерных нейронных сетей (micro-TENNs), имплантируемых конструкций, состоящих из нейронов и выровненных аксональных трактов, охватывающих просвет внеклеточного матрикса (ECM) из предварительно сформированного цилиндра гидрогеля диаметром в сотни микрон, который может увеличиваться в сантиметрах в длину. Нейронные агрегаты разделены на крайности трехмерной оболочки и натянуты на аксонные проекции. Микро-TENN уникально сбалансированы как стратегия реконструкции ЦНС, имитируя аспекты цитоархитектуры мозговых соединений и потенциально обеспечивая средства для замены сети. НейРональные агрегаты могут синаптироваться с тканями хозяина, чтобы сформировать новые функциональные реле для восстановления и / или модуляции отсутствующих или поврежденных схем. Эти конструкции могут также выступать в качестве провосстановительных «живых лесов», способных использовать механизмы развития миграции клеток и аксоновского пути, обеспечивая синергические структурные и разрешимые сигналы на основе состояния регенерации. Микро-TENN изготавливают путем заливки жидкого гидрогеля в цилиндрическую форму, содержащую иглу с продольным центрированием. Как только гидрогель гелеобразно, игла удаляется, оставляя полый микроколонец. К просвету добавляют ECM-раствор для обеспечения среды, подходящей для адгезии нейронов и роста аксонов. Диссоциированные нейроны механически агрегируются для точного посева на одном или обоих концах микроколони. Эта методология надежно создает самодостаточные миниатюрные конструкции с длинно проецирующими аксональными трактами, которые могут повторять признаки нейроанатомии мозга. Synaptic immНеметаллические и генетически закодированные индикаторы кальция свидетельствуют о том, что микро-TENN обладают обширным синаптическим распределением и собственной электрической активностью. Следовательно, микро-TENN представляют собой перспективную стратегию для целенаправленной нейрохирургической реконструкции путей мозга и могут также применяться в качестве биофиделических моделей для изучения нейробиологических явлений in vitro .

Introduction

Общей характеристикой расстройств и заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как травматическая травма головного мозга (TBI), травма спинного мозга (SCI), инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, является разъединение аксональных путей и нейронных клеток Потери ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Например, когда ишемический инсульт не лечится, считается, что аксоны теряются со скоростью 7 миль аксонов в минуту ⁵ . В случае TBI, который ежегодно испытывает приблизительно 1,7 миллиона человек в США, аксональная дегенерация может продолжаться и после нескольких лет после травмы, поскольку первоначальная травма ускоряет долгосрочное нейродегенеративное состояние ⁴ . Усугубляя эти вредные эффекты, ЦНС имеет строго ограниченный capaГород для регенерации ^{1 , 7 , 8 , 9} . После травмы развивается тормозная среда, которая характеризуется отсутствием направленного руководства к отдаленным мишеням, наличию ингибиторов, связанных с миелином, которые препятствуют росту нейритов и образованию глиального шрама реактивными астроцитами ^{8 , 10 , 11 , 12} . Глиальный шрам служит биохимическим и физическим барьером для регенерации, причем молекулы, такие как протеогликаны хондроитинсульфата, препятствуют росту аксонов ^{8 , 11} . Кроме того, несмотря на то, что нейронные стволовые клетки обнаружены во взрослой ЦНС, производство новых нейронов ограничено, поскольку последовательные доказательства нейрогенеза были обнаружены только в обонятельной луковице, гиппокампеСубгранулярная зона, перивентрикулярная область и центральный канал спинного мозга ^{13 , 14} . Эти препятствия препятствуют функциональному восстановлению потерянных нейронов и архитектуры белого вещества после травмы или заболевания, что приводит к часто меняющимся и продолжительным последствиям этих состояний.

Несмотря на отсутствие регенерационной способности у взрослых ЦНС, было продемонстрировано, что регенерация аксонов возможна, если адекватные экологические сигналы представлены в принимающих нейронах ^{15 , 16 , 17 , 18} . Исследователи пытались доставить и манипулировать факторами роста ( например, фактором роста нервов, эпидермальным фактором роста, глиально-зависимым фактором роста и нейротрофическим фактором-3) и другими молекулами наведения для стимулирования пластичности и регенерации аксонов ^{14 , <}/ Sup> ^{18 , 19} . Несмотря на то, что эти исследования подтвердили, что взрослые аксоны способны реагировать на факторы роста, эти стратегии ограничены низкой проницаемостью гематоэнцефалического барьера и специфическими пространственными и временными градиентами, необходимыми для стимулирования регенерации ^{14 , 18 , 19} . Другие подходы основывались на гиперактивации факторов транскрипции, связанных с регенерацией, в нейронах ЦНС. Например, сверхэкспрессия фактора транскрипции Stat3 стимулировала регенерацию аксонов в зрительном нерве ²⁰ . Тем не менее, как доставка биомолекулы, так и избыточная экспрессия факторов транскрипции не позволяют заменить потерянные популяции нейронов. Клеточные стратегии в основном сосредоточены на трансплантации нервных стволовых клеток (НСК) в ЦНС, используя их способность заменять нейроны ЦНС, высвобождать трофические факторы,И поддерживать попытки нейрогенеза, которые возникают после травмы ¹⁷ . Несмотря на это, все еще существуют насущные проблемы, мешающие этому подходу, в том числе затрудненная способность пересаженных нейронных клеток выжить, интегрироваться с хозяином и оставаться пространственно ограничена поврежденной областью ^{6 , 14 , 17 , 21} . Кроме того, доставка клеток сама по себе неспособна восстановить цитоархитектуру поврежденных или потерянных аксональных путей. Альтернативный подход, который решает проблемы, стоящие перед стратегиями доставки клеток и наркотиков / химических веществ, сочетает эти подходы с использованием биоматериалов ^{14 , 22 , 23} . Биоматериалы, такие как гидрогели, способны эмулировать биохимические и физические свойства внеклеточного матрикса (ECM), помогая в доставке клетокD в пределах поврежденной области и доставки факторов роста и других биоактивных молекул с контролируемым высвобождением ²² . Привлекательные характеристики этих стратегий на основе биоматериалов привели к доказательству регенерации аксонов in vivo после трансплантации лесов в пораженные участки ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30} . Однако стратегии бесклеточного биоматериала не заменяют потерянные нейронные популяции; При использовании в качестве средств доставки для нейронных, глиальных или нейронных клеток-предшественников, биоматериалы не способны восстанавливать сети аксонов на большие расстояния. Задача разработки подхода, который решает как дегенерацию аксонального пути, так и потерю нейронов, связанную с повреждением ЦНС и заболеванием, по-прежнему остается <Sup class = "xref"> 31.

Наша исследовательская группа ранее сообщала о разработке имплантируемых микро-тканевых нейронных сетей (micro-TENNs), которые являются типом «живого леса», состоящего из тел нейронных клеток, ограниченных одним или обоими концами микроколона с агарозным гидрогелем-ECM , С выровненными аксональными трактами, проходящими по всему внутреннему пространству этого трехмерного (3D) корпуса ^{1 , 10 , 31 , 32} . Одним из основных различий между этим методом и предыдущими подходами является то, что цитоархитектура микро-TENN создается полностью in vitro и затем трансплантируется ^{33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,} <Sup class = "xref"> 39 ^{, 40 , 41} . Изготовление in vitro предлагает обширный пространственный и временный контроль клеточного фенотипа и ориентации, механические / физические свойства, биохимические сигналы и экзогенные факторы, что выгодно для интеграции этих лесов с хозяином после имплантации ^{41 , 42} . Micro-TENN анатомически вдохновлены, потому что они эмулируют нейроанатомию мозга, отображая аксональные тракты, похожие на те, которые соединяют различные функциональные области мозга ( рис. 1A ) ¹ . Таким образом, эта стратегия может быть в состоянии физически заменить потерянные участки белого вещества и нейроны после имплантации в поврежденную область. Этот метод также вдохновлен механизмами развития, в которых «естественные живые леса», образованные радиальными глиальными клетками и пионерскими аксонами, действуют в качестве направляющих пути для клетокМиграция из субвентрикулярной зоны и рост аксонов соответственно ⁴³ . Эти механизмы рекапилируются в выровненных аксональных участках микро-TENN, которые могут представлять живые пути миграции нейронных клеток и регенерации аксонов с помощью аксоноподобного аксонового выроста ( рис. 1C ) ⁴³ . Кроме того, в этой стратегии используется синаптическая интеграция между нейронами микро-TENN и собственной схемой, образуя новые реле, которые могут способствовать функциональному восстановлению ( рис. 1B ) ⁴³ . Способность к образованию синапсов также может предоставить этому подходу способность модулировать ЦНС и реагировать на ткань хозяина в соответствии с сетевой обратной связью. Например, оптогенетически активные нейроны в живых каркасах могут стимулироваться для модуляции нейронных хозяев через синаптические взаимодействия ( рис. 1D ).

Кроме того, трубчатый контур на основе биоматериаловМикроэнтенозы обеспечивают адекватную среду для клеточной адгезии, роста, расширения нейритов и сигнализации, в то время как миниатюрные размеры конструкций потенциально допускают минимально инвазивную имплантацию и обеспечивают частично секвестрированную микроокружение для постепенной интеграции в мозг. Действительно, недавние публикации продемонстрировали потенциал микро-TENN для имитации нейронных путей после имплантации в мозг крысы. После стереотаксической микроинъекции мы ранее сообщали об обнаружении выживаемости нейронов микро-TENN, поддержании архитектуры аксонального тракта и расширении нейритов в корте головного мозга до, по меньшей мере, 1 месяца in vivo ^{10 , 31} . Более того, маркировка синапсином давала гистологические свидетельства синаптической интеграции с нативной тканью ^{10 , 31} . В целом, микро-TENN могут быть уникальными для восстановления и модуляции поврежденныхCNS путем замены потерянных нейронов, синаптической интеграции с хост-схемой, восстановления утраченной аксонной цитоархитектуры и, в некоторых случаях, обеспечения регенерации аксонов соответствующими сигналами пути.

Рисунок 1: Принципы и вдохновение для разработки микросердечных нейронных сетей (микро-TENN). ( A ) Микро-TENN имитируют цитоархитектуру мозгового соединения (фиолетового), в котором функционально различные области связаны длинными выровненными аксональными трактами в однонаправленном (красном, зеленом) или двунаправленном (синем) порядке. Например, микро-TENN могут восстанавливать утраченные связи в кортикоталамическом и нигростриаторном путях или в перфорантном пути от энторинальной коры до гиппокампа (адаптировано из Struzyna et al. , 2015) ¹ . ( B ) Диаграмма однонаправленногоL и двунаправленный микро-TENN (красный и синий соответственно), синаптически интегрируемые с главной схемой (фиолетовый), чтобы служить функциональным реле между обоими концами поражения. ( C ) Схема аксональных трактов однонаправленного микро-TENN (зеленая), служащая в качестве ориентира для облегченной аксоном регенерации аксонов хозяина (фиолетового) в направлении мишени, с которой взаимодействует микро-TENN. ( D ) Концептуальная схема использования оптико-активных микро-TENNS в качестве нейромодуляторов, с использованием синаптической интеграции с возбуждающими или тормозящими нейронами (снизу). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В настоящей рукописи подробно изложена методология, используемая для изготовления микро-TENN с использованием эмбрионально полученных церебральных кортикальных нейронов. Примечательно, что микро-TENN могут быть изготовлены с использованием других типов нейронных клеток. ДляДостаточно, исходные сообщения об успешной разработке микро-TENN показали нейроны дорзального корня ганглия (DRG) ³² . Микроэлементы гидрогеля могут быть сгенерированы ( рис. 2А ) путем добавления жидкой агарозы к изготовленной на заказ цилиндрической канальной решетке с лазером или к капиллярным трубкам, содержащим выровненные иглы для иглоукалывания. Игла образует просвет и определяет внутренний диаметр (ID) микроколоны, в то время как идентификатор капиллярной трубки и диаметр цилиндров в устройстве для лазерной резки определяют внешний диаметр (OD) конструкций. OD и ID могут быть выбраны в соответствии с желаемым применением путем выбора различных диаметров для устройства / капиллярных труб и игл для иглоукалывания соответственно. Также можно варьировать длину микроколонок; На сегодняшний день мы сообщили о строительстве микро-ТЭНД длиной до 20 мм в длину ¹⁰ и активно преследуем еще более длинные длины. После агарозных гелей и иглоукалывания nЭдельы удаляются, к просвету конструкций добавляется раствор ECM, обычно состоящий из коллагена I типа и ламинина ( фиг. 2C ). Ядро ECM обеспечивает эшафот для поддержки адгезии нейронных клеток и роста аксонов. Первоначально первичные крысиные нейроны крыс были высеяны в микроколонах с использованием диссоциированных клеточных суспензий ^{10 , 31 , 32} . Однако этот подход не вызывал целевой цитоархитектуры во всех случаях, которая определялась как тела нейронных клеток, ограниченные концами микроколонок, причем центральный просвет состоял из чистых выровненных аксональных трактов. С тех пор использование метода агрегации принудительных нейронов (на основе протоколов, адаптированных из Ungrin и др .) Позволило более надежную и последовательную разработку микро-TENN с идеальной структурой ( рис. 2B ) ⁴⁴ . В дополнение к описанию текущегоМетодологии, в этой статье будут представлены типичные фазоконтрастные и конфокальные изображения микро-TENN, которые демонстрируют формирование аксональных трактов с течением времени, а также завершенную целевую цитоархитектуру. Эта рукопись также расширит заслуживающие внимания аспекты протокола и остающиеся проблемы и будущие направления технологии микро-TENN.

Рисунок 2: Принципиальная схема трехступенчатого процесса изготовления микро-TENN. ( A ) Разработка агарозного гидрогеля: (i) первоначально небольшая иглоукалывающая игла ( например , диаметр 180-350 мкм) вставляется в цилиндрические каналы изготовленной на заказ пресс-формы для лазерной резки или капиллярной трубки ( например, , 380-700 мкм в диаметре). На следующем этапе жидкая агароза в DPBS вводится в цилиндрические каналы или капиллярные трубки. (Ii) После агарозных гелей игла удаляется иПресс-форму разобрали, чтобы получить полые агарозные микроколоны. (Iii) Эти конструкции затем стерилизуют и хранят в DPBS. ( B ) Первичная культура нейронов и агрегированный метод: (i) Агрегирование нейронов выполняется в пирамидальных массивах микроячейки, отлитых из трехмерных печатных форм, которые помещаются в лунки 12-луночного планшета. (Ii) Микро-TENN включают первичные нейроны крыс, диссоциированные от эмбриональных мозгов крыс эмбрионального дня-18. После диссоциации ткани трипсином-EDTA и ДНКазой I готовят клеточный раствор с плотностью 1,0-2,0 × 10 ⁶ клеток / мл. (Iii) 12 мкл этого раствора переносят в каждую лунку в пирамидальной микроячейке. Пластину, содержащую эти микро-лунки, центрифугируют для получения клеточных агрегатов. (Iv) Затем их инкубируют в течение ночи перед нанесением покрытия в микроколонах. ( C ) Изготовление сердечника ECM и клеточного посева: (i) Перед посевом клеток, ECM-раствор, содержащий 1 мг / мл коллагена I типа и 1 мг / млЛаминин переносят внутрь микро-TENN и дают возможность полимеризоваться. (Ii) В зависимости от того, изготавливаются ли однонаправленные или двунаправленные микро-TENN, агрегат помещается в одну или обе крайности микроколона соответственно. (Iii) После периода инкубации для содействия адгезии микро-TENN культивируют в чашках Петри, залитых добавленной эмбриональной нейронной базальной средой. (Iv) Через 3-5 дней в культуре окончательная микро-TENN-структура должна демонстрировать клеточные агрегаты в экстремумах микроколона, с аксональными трактами, охватывающими ее длину. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию в Университете штата Пенсильвания и Медицинским центром по делам ветеранов Майкла Дж. Крешенца и придерживались руководящих принципов, изложенных в Политике общественного здравоохранения NIH по гигиеническому уходу и использованию лаборатории Животные (2015).

1. Разработка Agarose Hydrogel (Acellular Component of micro-TENNs)

1. Подготовка раствора агарозы
   1. В шкафу для биобезопасности подготовьте резервуары для микроколонок, переместив 20 мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбекко (DPBS) в каждую из двух чашек Петри 10 см. Стерилизовать тонкие щипцы и микроскальпели с помощью стерилизатора горячего шарика.
   2. Взвесьте 3 г агарозы и перенесите ее в стерильный стакан внутри шкафа для биобезопасности. Добавить 100 мл DPBS для конечной концентрации 3% вес / объем (мас. / Об.). Включите чистый магнитный стержень и накройте стакан алюминиемNum foil.
   3. С помощью горячей плиты / мешалки разогрейте стакан при 100 ° C и перемешайте при 120-200 об / мин, чтобы полностью растворить агарозу (раствор превратится из облачного в прозрачный). Поддержание нагрева и перемешивание впоследствии для предотвращения гелеобразования и изменения температуры нагрева, если необходимо, чтобы избежать сжигания агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Изготовление с помощью устройства для лазерной резки и капиллярных труб представлено ниже в подразделах 1.2 и 1.3 соответственно. Перейдите к подразделу 1.4 после завершения шагов, описанных в любом из подразделов. Для обоих методов изготовления микроколонок быстро добавляйте жидкую агарозу, так как агароза быстро затвердевает при охлаждении. При стерилизации с помощью автоклава на любой из следующих этапов используйте стандартные условия, применяемые к посуде.
2. Подготовка микроколонок с использованием устройства для лазерной резки
   ПРИМЕЧАНИЕ. Устройство для лазерной резки вырезается из прозрачного акрила с использованием коммерческого резака с CO ₂ лазером. ФабриКатион структур и устройств с помощью лазерной резки хорошо документирован для ряда инженерных и исследовательских приложений ^{45 , 46 , 47} . Эта форма ( рис. 3 ) состоит из массива из пяти цилиндрических каналов, каждый из которых имеет диаметр 398 мкм и длину 6,35 мм. Эти цилиндрические массивы формируются вдоль их длины двумя частями: нижняя половина (длина: 25,4 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 6,0 мм) и верхняя половина (длина: 31,5 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 12,7 мм ), Как показано на фиг.3А и 3В , соответственно. Две половины могут быть зажаты вместе передним и задним крышками, показанные на рисунке 3C (длина 31,5 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 12,7 мм), которые имеют четыре отверстия для выравнивания, которые совпадают с двумя отверстиями в верхней и нижней частях Которые помогают скреплять все детали вместе при завинчивании. Эти колпачки также включеныЛюбящие пять отверстий, концентрические по отношению к цилиндрическим каналам, в которые иглы для иглоукалывания могут быть вставлены для образования просвета микроколонок.
   1. Стерилизовать устройство, показанное на рисунке 3 , покрыв его алюминиевой фольгой и автоклавированием. Соберите устройство, как показано на рисунке 3D , выровняв переднюю и заднюю крышки с помощью только нижней части и закрепив три части двумя винтами и гайками № 4-40 (диаметр резьбы 3.05 мм) в нижних центрирующих отверстиях.
   2. Полностью ввести иглу иглоукалывания (диаметр: 180 мкм, длина: 30 мм) в отверстия иглы либо на передней, либо на задней крышке устройства ( рисунок 3D ). С помощью микропипетки налейте достаточную жидкую агарозу (~ 1 мл на пять каналов) на половину куска, чтобы полностью заполнить каждую из цилиндрических половин канала.
   3. Немедленно поместите верхнюю часть устройства в нижнюю половину и надавите, пока он не будетМесто для завершения цилиндрических каналов (трение между колпачками и верхней частью будет поддерживать последнее на месте). Подождите ~ 5 мин при комнатной температуре после добавления агарозы, чтобы обеспечить его гелеобразование внутри каналов устройства.
   4. Вручную извлеките иглу из каждого из отверстий на крышках устройства. Выверните винты и вручную отделите две крышки и верхнюю половину от нижней части, где последняя будет удерживать микроколоны гидрогеля.
   5. Используйте тонкие щипцы для аккуратного удаления микроколонок из каналов на нижней части куска и поместите их в предварительно приготовленную чашку Петри, содержащую DPBS (шаг 1.1.1). Повторно использовать устройство для другого раунда изготовления микроколонок. Перейдите к подразделу 1.4.
3. Изготовление микроколонок с использованием капиллярных трубок
   1. Перенесите стеклянные капиллярные трубки (диаметр: 398,78 мкм, длина 32 мм) внутрь шкафа биобезопасности. Вручную разбитьДлинные трубки в фрагменты размером 2,0-2,5 см и полностью вставляют в каждый фрагмент одну иглу иглоукалывания (диаметр: 180 мкм, длина 30 мм) ( рисунок 2А ).
   2. Перенесите 1 мл жидкой агарозы из стакана на поверхность пустой чашки Петри. Удерживая капиллярную трубку и введенную иглу, поместите один конец трубки в контакт с жидким агарозным пулом, чтобы заполнить его капиллярным действием. Агитируйте трубку, чтобы способствовать подъему капилляров.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Заполните капиллярные трубки жидкой агарозой так высоко, как это позволяет капиллярное действие; Впоследствии эти микроколоны могут быть разрезаны на меньшие конструкции в зависимости от желаемой длины. 1-мл агарозный пул обычно используют только для одной трубки, так как агароза быстро охлаждается и гели, предотвращая дальнейшее капиллярное действие.
   3. Когда жидкость перестает подниматься, удалите капиллярную трубку из бассейна и поместите ее горизонтально на поверхность чашки Петри. Подождите 5 минут, чтобы агарозный гель находился внутри труб. </ Li>
   4. Расположите указательный и указательный палец по обе стороны трубки и нажмите на нее. Используйте другую руку, чтобы быстро вытащить иглу, используя большой палец и указательный палец, чтобы сама микроколонка не соскользнула из трубки. Вставьте иглу 30 калибра в капиллярную трубку, чтобы медленно вывести микроколонец в блюдо, содержащее DPBS (шаг 1.1.1).
4. Обрезка и стерилизация микроколонны
   1. Деликатно перенесите один микроколонок из DPBS в пустую посуду, используя тонкие щипцы. Добавьте 10 мкл DBPS в верхнюю часть микроколонки с микропипеткой, чтобы предотвратить сушку. Поместите последнее блюдо под стереоскоп для визуального наведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На протяжении всего протокола сушка или дегидратация микроколонок относится к приобретению смятой структуры, которая визуально отличается от типичного гидратированного внешнего вида этих конструкций. Обезвоженные микроколоны прочно прикрепляются к поверхности чашек Петри и cАннота легко перемещаться, тогда как гидратированные конструкции, как правило, скользят по поверхности после манипуляции с пинцетом. На рис. 8А показано фазово-контрастное изображение полностью высушенного микроколона.
   2. Обрежьте микроколонку микроскальпелем, чтобы сократить ее до желаемой длины (здесь 2-5 мм). Транспортируйте обрезанный микроколонец с помощью тонких пинцетов на другую чашку DPBS Petri, приготовленную на этапе 1.1.1.
   3. Повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2 для каждого изготовленного микроколона.
   4. Стерилизуйте микроколоны в содержащих DPBS чашках Петри под ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 1 часа. Храните чашки Петри при температуре 4 ° C перед добавлением ECM и клеточным покрытием.

2. Первичная культура нейронов и метод агрегирования вынужденных клеток

1. Подготовка пирамидальной микроячейки
   ПРИМЕЧАНИЕ. В этом разделе используется трехмерная печатная форма, состоящая из цилиндрического основания (диаметр: 2,2 см, высота: 7,0 мм) aИ девять квадратных пирамид сверху (длина стороны: 4,0 мм, угол наклона: 60 ​​°), организованный в массив 3 х 3, как показано на рисунке 3Е . Процесс изготовления добавок с использованием имеющихся в продаже трехмерных принтеров хорошо документирован. Программное обеспечение для автоматизированного проектирования может использоваться для проектирования пресс-формы. Затем полученный файл проекта можно преобразовать в цифровой форме в путь инструмента для 3D-принтера. Каждый принтер имеет разные спецификации, и инструкции по настройке и эксплуатации 3D-принтера изменяются соответственно.
   1. Используйте сверло 3/32 "для прокола 16 отверстий в 4 х 4-х массивах (длина стороны: 4 см, разделение отверстий: 1 см), центрированная в крышке чашки Петри 10 см. Внутри вытяжного колпачка с химическим составом используйте Нижний кусок чашки Петри для взвешивания 27 г полидиметилсилоксана (PDMS) и 3 г отвердителя (для соотношения 1:10). Размешайте с помощью микро-шпателя для равномерного распределения агента.
   2. Накройте PDMS / отвердитель проколотой крышкой. Подсоедините один конец шланга к вакууM порт вытяжного шкафа и вставьте другой конец в стержень воронки (диаметр рта: 10 см, длина штока: 3 см, диаметр штока: 1,5 см).
   3. Сделайте отверстие с помощью сверла 3/32 дюйма в верхней части луковицы пипетки объемом 1 мл и вставьте и закрепите наконечник микропипетки емкостью 1000 мкл в отверстие (с заостренным концом вверх). Поместите лампу и наконечник в шланг и вытяните Шланг вверх, пока лампочка не закрепит шланг в штоке воронки.
   4. Поместите воронку на проколотую крышку и закрепите шланг с помощью прочной опоры. Откройте вакуумный клапан в течение 5 мин для всасывания и доведите пузырьки воздуха до поверхности.
   5. Закройте клапан, удалите воронку и нажмите на чашку Петри на поверхность вытяжного колпака ~ 3 раза, чтобы вырвать все оставшиеся пузырьки воздуха.
   6. Поместите пирамидально-хорошо трехмерную печатную форму в каждую лунку на 12-луночном планшете с пирамидами, направленными вверх. Налейте PDMS / отвердитель поверх форм до тех пор, пока каждая лунка tОн заполнен. Закройте 12-луночный планшет крышкой и перенесите его в духовку на 1 час при 60 ° C для сушки.
   7. Осторожно удалите из массива микрошариков PDMS ( рис. 3F ) микропланшет. Закройте массивы PDMS алюминиевой фольгой и стерилизовать автоклавированием. Внутри шкафа для биобезопасности вставьте одну микрояручную решетку в каждую лунку 12-луночного планшета ( рис. 2В ).
2. Изоляция корковых нейронов крыс
   1. Добавьте ~ 20 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) к каждой из четырех-шести чашек Петри 10 см (по одной для каждой расчлененной ткани) внутри шкафа для биобезопасности. Перенесите эти блюда в раскрывающийся капюшон и поместите их на лед. Стерилизуйте инструменты для рассечения, такие как микроскальпели, ножницы и щипцы, с помощью стерилизатора горячего шарика.
   2. Предварительно нагретая базальная среда эмбрионального нейрона + 2% без сыворотки + 0,4 мМ L-глутамина (называемая «культуральной средой»)Г) и 0,25% трипсина + 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 ° С. Дезоксирибонуклеазу оттаивания (ДНКазу) I, помещая ее при комнатной температуре. Подготовьте 1,5 мл 0,17 мг / мл раствора ДНК-I в HBSS и поддерживайте раствор на льду.
   3. Усыплять беременную эмбриональную день-18 крыс с помощью ингаляции углекислого газа и подтвердить смерть путем обезглавливания. Перенесите тушку в стерильный вскрывающий колпак и положите ее в брюшную сторону вверх. Тщательно промойте живот 70% этанолом.
   4. Откройте матку и удалите плоды (обычно ~ 11) из амниотических мешков с помощью ножниц и перенесите их щипцами в чашку Петри, содержащую холодный HBSS, как описано ⁴⁸ . Поместите охлажденный (-20 ° C) гранитный блок под стереоскоп. Поместите чашку Петри на поверхность этого холодного блока, чтобы сохранить низкую температуру HBSS во время процедуры вскрытия.
   5. Промойте щенков, размахивая HBSS, а затем перенесите их на следующее чистое блюдоСодержащий HBSS. С помощью стереоскопа и инструментов для рассечения последовательно удаляйте головки, полушария головного мозга и коры плодов и переносите каждую ткань с помощью щипцов на новую заполненную HBSS тарелку после каждого вскрытия ⁴⁸ .
   6. Аспирируйте только коры с пипеткой Пастера и поместите ткань в стерильную пробирку для центрифуги 15 мл. Отбросьте другие расчлененные ткани. Промойте коры три раза, последовательно добавляя и удаляя ~ 5 мл HBSS с серологической пипеткой. Поместите трубку на лед, когда она не используется.
   7. Перенесите коры с помощью пипетки Пастера в пробирку объемом 15 мл, содержащую предварительно нагретый трипсин-ЭДТА (4-6 кортик на 5 мл трипсина-ЭДТА). Вручную встряхните трубку один раз и поместите ее при 37 ° C. Инвертируйте трубку каждые 3 мин, чтобы предотвратить сгущение ткани.
   8. Остановите воздействие трипсином через ~ 10 минут, удалив ткань пипеткой Пастера и перенесите ее в чистую центрифугу на 15 млтруба. Добавьте 0,15 мг / мл раствора ДНКазы I (1,5 мл) в пробирку с помощью пипетки.
   9. Используйте пипетку Пастера для ручного разрушения тканевых скоплений, а затем вихря (~ 30 с) до тех пор, пока раствор не станет однородным и в жидкости не останется оставшихся фрагментов ткани. Если невозможно полностью гомогенизировать раствор, извлеките нерастворимые фрагменты, потянув их в кончик пипетки Пастера.
   10. Центрифугируют раствор гомогенных клеток, полученный на стадии 2.2.9, при 200 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант с помощью пипетки Пастера, следя за тем, чтобы не повредить гранулированные клетки. Добавьте 2 мл культуральной среды с серологической пипеткой и вихрем для ресуспендирования клеток.
   11. Подсчитайте количество клеток в растворе, приготовленном на этапе 2.2.10, с использованием гемоцитометра; Ожидаемый выход составляет 3,0-5,0 × 10 ⁶ клеток / корковое полушарие. Подготовьте 1 мл или более клеточной суспензии в культуральной среде с плотностью 1,0-2,0 × 10 ⁶ клеток / мл.
3. Образование агрегатов нейронных клеток
   1. С помощью микропипетки добавьте 12 мкл суспензии клеток 1,0-2,0 × 10 ⁶ / мл в каждую микроячейку матрицы PDMS (которую помещают в планшет на этапе 2.1.7).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Концентрацию клеток можно регулировать в зависимости от идентификатора микростолбца и желаемого размера заполнителя ячейки, так как более высокие концентрации дают большие агрегаты.
   2. Центрифугируйте пластину при 200 xg в течение 5 мин, чтобы заставить агрегацию клеток на дне микроячейки ( рис. 2B ). Тщательно добавьте ~ 2 мл культуральной среды в верхнюю часть каждой группы PDMS, чтобы покрыть все посевные микроузлы, стараясь не нарушать агрегированные клетки.
   3. Если клетки не будут трансдуцированы вирусным вектором, инкубируйте планшет в течение 12-24 часов при 37 ° C и 5% CO _2, а затем перейдите к разделу 3. Если агрегаты будут трансдуцированы, пропустите инкубацию и перейдите к разделу 2.4 ,
4. TranИндукция с вирусным вектором для наблюдения передачи сигналов кальция
   Примечание. Эти шаги выполняются для трансдукции нейронов с вирусным вектором, содержащим генно-кодированный индикатор кальция (GECI). Результаты, показанные в этой статье, были получены с использованием коммерчески доступного аденоассоциированного вируса (AAV) (серотип 1) с GCaMP6f, GECI с быстрой кинетикой, состоящей из зеленого флуоресцентного белка (GFP), кальмодулина (CaM) и пептида M13, Управляемый промотором синапсина I человека. Раствор вирусного вектора может потребовать разбавления в стерильных DPBS перед трансдукцией в зависимости от концентрации исходного раствора. Здоровье клеток / морфология и сила сигнала GCaMP6f должны наблюдаться с течением времени для диапазона векторных концентраций. Эта процедура оптимизации должна выполняться каждым исследователем для определения соответствующего титра для их собственных культур клеток. Типичное время экспрессии GCaMP6f составляет 7-8 дней после трансдукции, которая возникает во время инкубации, проведенной в stEp 2.4.2.
   1. С помощью микропипетки добавьте требуемый объем раствора вирусного вектора (для конечной концентрации ~ 3,0 × 10 ⁹ геномных копий на агрегат) в культуральную среду, покрывая агрегаты. Медленно пипетируйте вверх и вниз, чтобы гарантировать, что векторное решение равномерно распределено по всей культуральной среде.
   2. Инкубируйте планшет с посеянными пирамидальными микрозондами в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO _2, чтобы обеспечить трансдукцию вируса GCaMP6f.
      

3. Разработка сотового компонента микро-TENN

1. Изготовление сердечника ECM
   1. После инкубации агрегата добавьте коллаген I и ламинин I в культуральную среду (для концентрации 1 мг / мл каждый) в микроцентрифужную пробирку для приготовления раствора ECM. Выполните шаги 3.1.2-3.1.4 при комнатной температуре, но поддерживайте трубку с ECM на льду, когда она не используется, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.
      
   2. Отрегулируйте pH раствора ECM, переведя 1-2 мкл на лакмусовую бумагу, чтобы проверить начальный рН, добавив 1 мкл 1 н. Гидроксида натрия (NaOH) и / или 1 н. Соляной кислоты (HCl) в ECM, при необходимости, И повторяется до тех пор, пока рН не станет 7,2-7,4. Обеспечьте гомогенизацию раствора ECM путем пипетирования вверх и вниз, избегая образования пузырьков воздуха.
   3. Перенесите микроколоны с помощью стерилизованных щипцов из блюд на этапе 1.4.3, чтобы выпустить 35- или 60-миллиметровые чашки Петри. Работайте на 4-5 микроколонах за раз, чтобы предотвратить обезвоживание. Прикрепите наконечник на 10 мкл, прикрепленный к наконечнику 1000 мкл к микропипетке. Используя стереоскоп для визуального наведения, поместите наконечник на один конец микроколонок и всасывайте для извлечения остаточных DPBS и пузырьков воздуха из просвета.
   4. Быстро выработать 4-5 мкл ECM в микропипетке. Наблюдение подРеоскопа, поместите наконечник микропипетки на один из концов микроколонок и выпустите достаточное количество ECM для заполнения просвета. Подтвердите отсутствие воздушных пузырьков в просвете, так как они могут препятствовать нарастанию аксонов через ECM. Если существуют пузырьки воздуха, удалите ECM, как описано в пункте 3.1.3, и снова добавьте ECM.
   5. Чтобы предотвратить обезвоживание, добавьте ~ 2 мкл ECM вокруг каждой микроколоны. Инкубируйте микроколоны гидрогеля / ECM в чашках Петри при 37 ° C и 5% CO _{2 в} течение 25 мин. Перейдите к посеву клеток сразу после инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубационный период на этапе 3.1.5 предназначен для обеспечения времени полимеризации коллагена и ламинина внутри микроколонок.
2. Поселение нейрональных клеток в микроколонах
   ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы изменить культуральную среду трансдуцированных агрегатов, наклоните пластину, используйте микропипетку для удаления среды, которая собирается на стенке лунки, а затем медленно добавьте ~ 1 мл против(Чтобы избежать нарушения агрегатов в пирамидальных микрозондах). Повторите эту замену второй раз.
   1. После инкубационного периода на этапе 3.1.5 переносите приблизительно 10-20 мкл культуральной среды на две свободные области в чашках Петри, содержащих микроколоны. Используйте микропипетку для индивидуальной передачи агрегатов в чашку Петри, содержащую конструкции, и перемещайте их с помощью щипцов в один из небольших пулов культуральной среды для сохранения здоровья клеток.
   2. Наблюдая за стереоскопом, вставьте агрегат на каждом конце микроколонок для двунаправленных микро-TENN или на одном конце для однонаправленной архитектуры (по желанию) с использованием щипцов. Подтвердите размещение агрегатов внутри микроколонок с помощью стереоскопа. Используйте щипцы для перемещения посевных микроколонок в другой небольшой пул культуральной среды, чтобы избежать обезвоживания и сохранения совокупного здоровья.
   3. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO _{2 в} течение 45 минут доОхладите агрегаты, чтобы они соответствовали ECM. Убедитесь, что агрегаты остаются на концах микроколонок, используя стереоскоп; Повторно ввести клеточные агрегаты и повторить шаг инкубации по мере необходимости.
   4. Тщательно наполните чашки Петри, содержащие микро-TENN, культуральной средой (3 или 6 мл для чашки Петри 35 или 60 мм, соответственно), используя серологическую пипетку. Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO ₂ для долгосрочной культуры.
   5. Выполняйте полусредние изменения каждые 2 дня с культуральной средой. Осторожно удалите половину старой среды с помощью пипетки и используйте стереоскоп для визуального наведения, чтобы избежать отсасывания микро-TENN. Замените, медленно добавляя свежую, предварительно нагретую среду с пипеткой.
   6. Для повторного использования массивов микроуровней PDMS удалите культуральную среду, кипятите массивы в деионизированной воде в течение 30 мин и стерилизуйте в автоклаве для еще одного раунда образования и культуры заполнителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В желаемые моменты времениЦитоархитектура микро-TENN может быть проверена с использованием фазово-контрастной микроскопии. Здесь для захвата фазово-контрастных изображений использовалось время экспозиции 5-8 мс и 10X (0,64 мкм / пиксель) и 20X (0,32 мкм / пиксель) цели. Флуоресценцию, связанную с изменениями концентрации кальция в вирально-трансдуцированных микро-TENN, фиксировали с использованием высокоскоростного флуоресцентного микроскопа с временем экспозиции 50 мс, объективом 10X (0,64 мкм / пиксель) и твердотельным светом с полосовыми фильтрами ~ 480 Нм и ~ 510 нм для возбуждения и излучения, соответственно, для визуализации сигнала флуоресценции GCaMP6f.

4. Иммуноцитохимия для исследований in vitro

Примечание: для изображений, показанных здесь, использовались следующие первичные антитела: мышь-туй-1 / бета-III тубулин (1: 500) и антисинапсин-1 кролика (1: 500) для маркировки аксонов и префикса -синаптические бутоны, соответственно. Вторичными антителами были осел анти- мышь 568 (1: 500) и осел-анти-кролик 488 (1: 500). Необходимые объемы готовых растворов первичных и вторичных антител, а также объемы растворов формальдегида, лошадиной сыворотки и моющих средств зависят от объема, необходимого для полного покрытия конструкций. Эти объемы можно свести к минимуму с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы ограничить площадь, окружающую каждую микроколону.

ВНИМАНИЕ: В этом разделе используются формальдегид и Hoechst. Формальдегид является токсичным соединением, которое, как известно, является канцерогенным, и Hoechst является известным мутагеном. Поэтому эти соединения должны быть утилизированы в соответствующем контейнере для отходов. Всегда обрабатывайте их в химическом вытяжном шкафу при использовании соответствующего средства индивидуальной защиты, такого как лабораторное покрытие, защитные очки и перчатки.

1. Подготовьте раствор объемного / объемного (объемного) формальдегида 4,0% в 1х фосфатном буферном растворе (PBS) внутри химического вытяжного шкафа.
2. Удалите культуральную среду из чашек Петри.Микро-TENN с микропипеткой. Добавьте достаточное количество раствора формальдегида в посуду, чтобы полностью покрыть микро-TENN. Замачивайте микро-TENN в растворе формальдегида в течение 35 минут при 18-24 ° C для фиксации клеток внутри микроколонок.
3. Удалите 4,0% раствор формальдегида из чашек Петри с помощью пипетки и утилизируйте соответствующие рекомендации по утилизации опасных материалов.
4. Выполните два быстрых полоскания, добавив достаточно PBS, чтобы полностью покрыть фиксированные микро-TENN, а затем удалить PBS с помощью пипетки. Выполните третье долгое полоскание, промояв конструкции в PBS в течение 10 мин.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Отбросьте PBS, используемый для промывки, возможно, содержащий следы формальдегида.
5. Подготовьте 0,3% об. / Об. Раствор неионного моющего средства в 4% об. / Об. Лошадиной сыворотке в PBS. Удалите PBS из чашек Петри, содержащих фиксированные микро-TENN, и добавьте достаточный объем раствора моющего средства 0,3% для покрытия конструкций. Замачивание в течение 60 мин при 18-24 & #176; C для проницаемости клеток.
6. Удалите раствор моющего средства с помощью пипетки. Выполните два быстрых полоскания путем добавления и последующего удаления PBS. Затем выполните три более длительных полоскания, промояв конструкции в PBS в течение 5 минут во время каждого полоскания.
7. Разбавляют первичные антитела в 4% лошадиной сыворотке. Удалите PBS из чашек Петри, содержащих фиксированные и проницаемые микро-TENN. Добавьте достаточное количество раствора первичных антител к микроколонам, чтобы полностью покрыть их. Уплотнить чашки Петри парафильмом для предотвращения испарения и инкубации в течение ночи (12-16 часов) при 4 ° C.
8. Удалите раствор первичного антитела из посуды и промойте, как описано в шаге 4.6. В темноте, подготовить вторичный раствор антитела в 4,0% лошадиной сыворотке. Добавьте достаточное количество раствора вторичных антител, чтобы полностью покрыть конструкции, накрыть посуду алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 2 часов при температуре 18-24 ° C.
9. Подготовьте раствор Hoechst (1: 10000) в PBS для окрашивания ядер.
ПРИМЕЧАНИЕ. Изображения для иммуноблочных микро-TENN были взяты с помощью лазерного конфокального микроскопа с разрешением 2048 (~ 8 с / кадр), объективом 10X (0,64 мкм / пиксель), возбуждением 487 нм и длиной волны излучения 525 нм для Зеленая флуоресценция, 561 нм возбуждение и длина волн излучения 595 нм для красной флуоресценции и ~ 3.22 мкм / срез с ~ 60 срезами в среднем для z-стеков.

Representative Results

Микро-TENN контролировали с использованием фазово-контрастной микроскопии для оценки их цитоархитектуры и аксоновского выроста ( рис. 4 ). В однонаправленных микротенках с длиной волны 2 мм нейронные агрегаты были ограничены одним концом микроколонки и проецировали пучок аксонов через внутренний сердечник. Аксоны охватывали всю длину колонки на 5 дней in vitro (DIV) ( рисунок 4A ). Наблюдалась большая начальная скорость роста аксонов в двунаправленных 2-миллиметровых микро-TENN, так как аксоны охватывали весь микроколонец на 3 DIV ( рис. 4B ). На 5 DIV двунаправленные микро-TENN характеризовались плотными аксональными трактами, которые связывали агрегаты, поддерживаемые в крайних точках микроколони. Эта цитоархитектура также наблюдалась в 5-миллиметровых микро-TENN с аксонами, охватывающими микроколонку на 5 DIV ( рис. 4C ). Как отмечалось во всех случаях, ECM в просвете и геометрической конфигурацииСодержащая агароза, обеспечивала направленность, необходимую для образования аксонных трактов, которые структурно имитируют особенности естественной нейроанатомии.

Методы иммуноцитохимии были применены в этом протоколе, и были сделаны конфокальные изображения для проверки компонентов микро-TENN-архитектуры. Ядра клеток, окрашенные Hoechst (синие), были локализованы почти исключительно внутри агрегатов в экстремальных направлениях однонаправленных и двунаправленных микроколонок, по существу не окрашивая Hoechst во внутренней части ( рис. 5 ). Это наблюдение подтвердило то, что было выведено из фазово-контрастных изображений: популяции нейронов были ограничены концами, и только аксоны (красным) охватывали просвет микро-TENN. Однако после того, как аксоны пересекали агрегаты, миграция клеток наблюдалась вдоль аксонных трактов во внутреннем просвете, что наблюдалось при наличии ядер (синий) во внутренней области при 28 DIV для двумерного бира длиной 2 ммCtional micro-TENN ( рисунок 6 ). Кроме того, синапсин I-иммунокалибровка (зеленая) была обнаружена во всех телах клеток и аксональных трактах ( рис. 6 ). Синапсин I является пресинаптическим терминальным белком, участвующим в регуляции высвобождения нейротрансмиттеров, и указывает на присутствие пресинаптических терминалов при обнаружении в точечном распределении; Он ранее коррелировал с образованием активных синапсов с помощью записей цельной ячейки ⁴⁹ . Синапсиновое окрашивание в обогащенной аксоном центральной зоне микро-TENN, по-видимому, представляет собой комбинацию puncta, а также синапсина, транспортируемого по аксонам в направлении досинаптических терминалов. Тем не менее, присутствие синапсина puncta в агрегатах микро-TENN предполагает, что эти конструкции обладают способностью связываться через синапсы, хотя для дальнейшего структурного доказательства функциональных синапсов потребуется колокализация синапсина с постсинаптическим белком. </ Р>

Микро-TENN также были изготовлены с помощью агрегатированных нейронов, которые были трансдуцированы с помощью AAV, содержащего индикатор кальция GCaMP6f, чтобы предварительно исследовать электрофизиологические свойства этих конструкций. Эти конструкции выражали индикатор кальция по всей их длине, как показано флуоресценцией как в агрегатах нейронов, так и в аксональных трактах ( рис. 7А ). Обратите внимание, что из-за настроек микроскопа, направленных на максимизацию интенсивности в агрегатах, флуоресценция в аксональных трактах оказалась слабее. Эти трансдуцированные микро-TENN были проанализированы с течением времени с помощью высокоскоростной флуоресцентной микроскопии (без внешней электрической стимуляции), а несколько интересующих размеров клеток (ROI) были выбраны случайным образом в типичном микро-TENN для характеристики пропускной способности этих строит. Вспышки концентрации кальция наблюдались почти во всех ROI, что отразилось на ассоциированных( Рис. 7B ). В частности, различные ROI, казалось, демонстрировали почти постоянную периодичность увеличения концентрации кальция ( рисунок 7B ). Эти изменения концентрации кальция предполагаются результатом спонтанных, присущих потенциалов действия, сигнализации клеток в отдельных агрегатах и ​​/ или сигнализации через аксоны из отдельных агрегатов. Необходимы дальнейшие анализы, чтобы полностью охарактеризовать электрофизиологические свойства нейронов и аксональных путей в микро-TENN. Тем не менее, эти первоначальные результаты показывают, что микро-TENN демонстрируют прочную эндогенную / базовую электрическую активность.

Рисунок 3: Чертежи устройства для изготовления микроколонок с лазерной резкой и трехмерная пирамидальная микроячейка для клеточной агрегации. ( A) - ( B ) Схема и изображение нижней и верхней половин цилиндрической решетки каналов, соответственно, используемые для изготовления микроколонок гидрогеля. ( C ) Схема и изображение крышек, используемых для удержания устройства вместе. Как передняя, ​​так и задняя части имеют одинаковые размеры. ( D ) Изображение собранного устройства, необходимое для изготовления микроколонок. Только два колпачка и нижняя половина зажимаются вместе с винтами в нижних двух установочных отверстиях (слева). Сломанные линии показывают размещение игл иглоукалывания через пять отверстий на каждой крышке. Жидкую агарозу добавляют к нижней половине цилиндров, а затем верхнюю половину (справа) помещают на устройство для формования жидкой агарозы в форму. ( E ) Схема трехмерных печатных форм, используемых для создания массивов микроячейки PDMS. ( F ) Изображения 3D-печатной формы (слева) и массивов микро-колодок PDMS (справа). Все размеры указаны в милли Метров (мм). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Наблюдение роста аксонов в микро-TENNS путем фазово-контрастной визуализации однонаправленных и двунаправленных конструкций в зависимости от дней in vitro . ( A ) Однонаправленные микро-TENN длиной 2 мм показывают аксональные тракты, простирающие почти всю длину микроколона на 5 DIV. ( B ) По сравнению с однонаправленными микро-TENN двунаправленные 2-миллиметровые микро-TENN демонстрируют более быстрый темп роста аксонов. ( C ) Для 5-миллиметровых двунаправленных микро-TENN аксональные тракты заполняют длину микроколона при 5 DIV. Эта архитектура поддерживается как минимум до 10 DIV. Шкала шкалы = 200 мкм./ftp_upload/55609/55609fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Цитоархитектура Micro-TENN наблюдается с конфокальными изображениями иммуноблочных однонаправленных и двунаправленных микро-TENN. Клетки окрашивали на ядра клеток (Hoechst, blue) и аксоны (Tuj1; красный). ( A ) Фазово-контрастное изображение 5-мм двунаправленного микро-TENN (28 DIV). Конфокальные реконструкции ( D ) - ( F ) и ( I ) - ( K ) двунаправленного (28 DIV) 5 мм и однонаправленного (25 DIV) микро-TENN, соответственно, показывают меченые ядра клеток ( D ), ( I ) И аксонов ( E ), ( J ), а также наложения ( F ), ( K ). Шкалы шкалы: 500 мкм. Вставки в ( A F ) и ( K ) относятся к фазоконтрастным ( B ) - ( C ) и конфокальным ( G ) - ( H ), ( L ) - ( M ) масштабированиям нейронных агрегатов и аксональных трактов , Изображения показывают агрегаты, ограниченные концами микро-TENN, в то время как просвет натянут выравниванными аксональными трактами. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Экспрессия синаптического концевого белка синапсина I в типичном двунаправленном микро-TENN. Конструкция окрашивалась для ядер клеток (Hoechst; blue), аксонов (Tuj1; красный) и досинаптических бутонов (синапсин I, зеленый). ( A ) Фаза-contrAst 2-миллиметрового двунаправленного микро-TENN при 28 DIV. ( D ) - ( G ) Конфокальные реконструкции, показывающие ядра клеток ( D ), аксоны ( E ), пресинаптические бутоны ( F ) и наложение ( G ) трех каналов. Коробки показывают масштабирование ( B ) - ( C ), ( H ) - ( I ) фазово-контрастных и накладываемых изображений для нейронных агрегатов соответственно. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Спонтанная сигнальная активность в двунаправленном микро-TENN, наблюдаемом посредством экспрессии генетически кодированного индикатора кальция. ( A ) FluorescencЭлектронная микроскопия подтвердила экспрессию репортера GCaMP, наблюдаемого флуоресценцией по всему агрегатам и аксонам. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ) Изменения флуоресценции, связанные с изменениями концентрации кальция, измерялись без внешней стимуляции в нескольких интересующих областях (ROI) как функция времени. Пронумерованные цветные круги в ( A ) обозначают эти ROI. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Фазово-контрастные изображения общих режимов отказа в методологии микро-TENN. ( A ) Полностью обезвоженный / высушенный агарозный микроколонец в результате удаления и / или испарения DPBS на начальных стадиях изготовления. Шкала шкалы = 5081; м. ( B ) Гидрогелевая микроколона с просветом, выстилающим наружную стенку конструкции из-за отсутствия концентрического выравнивания иглы иглоукалывания с капиллярной трубкой. Шкала шкалы = 100 мкм. ( C ) Пропитанный микро-TENN с обоими агрегатами, присутствующими в 1 DIV. ( D ) Один из агрегатов отвалился от того же микроколона, что и ( C ), в 3 DIV. ( E ) Однонаправленный микро-TENN при 4 DIV. ( F ) Совокупный и аксональный тракт выпадали из микроколоны в ( E ) и оставались плавающими в культуральной среде при 5 DIV. Шкала шкалы для ( C ) - ( E ) = 300 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Повреждение и заболевание ЦНС обычно приводят к потере или дисфункции дальних аксональных путей, которые включают мозговое соединение, с или без сопутствующей нейронной дегенерации. Это усугубляется ограниченной способностью ЦНС способствовать нейрогенезу и регенерации. Несмотря на то, что стратегии восстановления, такие как фактор роста, клеток и биоматериалов, как индивидуальный или комбинаторный подход, такие методы не могут одновременно учитывать как дегенерацию нейронных клеток, так и потерю аксонных соединений ^{14 , 22} . Эти пробелы в технологии ограничивают способность восстанавливать, изменять и зондировать нейронные сети контролируемым и устойчивым образом. Соответственно, технология микро-TENN была разработана для устранения необходимости в стратегии нейронного ремонта, которая в отличие от существующих методов облегчает как замену нейронов, так и восстановление длинных аксональных соединений. микрофонRo-TENN - это имплантируемые живые леса с предварительно сформированной цитоархитектурой, которая приближается к структурным блокам системного соединения мозга, которые специально разработаны для целенаправленной реконструкции, замены и модификации нейронных цепей хозяина. Эти леса состоят из дискретной популяции (ней) нейронов, соединенных длинными аксональными трактами в ECM-содержащем просвете миниатюрных цилиндрических агарозных гидрогелей. Эти конструкции могут функционировать как синаптические реле для замены потерянных путей и динамической модуляции нативной схемы. Кроме того, в случае изолированной аксональной дегенерации (при отсутствии исходных нейронов) микро-TENN могут служить направляющими для регенерации аксонов на основе механизма регенерации аксонов с аксоном. В этой рукописи представлен протокол изготовления для надежного создания микро-TENN с контролируемой геометрией, фенотипом и функциональными характеристиками. Фазоконтрастная микроскопия, иммуноцитохимияStry и конфокальной микроскопии показали, что микро-TENN, полученные с протоколом, обладают требуемой цитоархитектурой и экспрессируют синапсин с синаптическим концевым белком. Кроме того, было показано, что микро-TENN обладают собственной сигнальной активностью, возможно, из-за потенциалов действия, в отсутствие внешнего моделирования. Это было подтверждено наличием почти синхронных флуктуаций флуоресценции, связанных с генетически кодированным репортером кальция.

Разработка микро-TENN может быть суммирована тремя этапами: (1) изготовление полых гидрогелевых труб, (2) добавление раствора ECM в просвет трубки и (3) посев агрегатов изолированных нейронов в Концы трубки. Микроколонки могут быть изготовлены со стеклянными капиллярными трубами или с микропорошковым устройством, содержащим цилиндрические каналы. Это устройство может быть создано с помощью любого высокоточного метода микропроизводства, доступного исследователю. жидкостьАгарозу выливают в каналы устройства или в капиллярные трубки, содержащие центрированную иглу для иглоукалывания, для создания микроколонок гидрогеля. После агарозного гелеобразования иглу иглоукалывания удаляют для получения полой просвета. Несколько общих ошибок, возникающих во время изготовления или роста, показаны на рисунке 8 . Обратите внимание, что некоторые из изображений, изображенных на рисунке 4 и крайнем случае на рисунке 8B , показывают просветную часть, неустойчивую близко к стенке цилиндра. Чтобы получить ровную толщину стенки при использовании метода капиллярной трубки, узел трубки и иглы следует держать вертикально при введении в контакт с агарозой, и игла должна поддерживаться в центре трубки. Хранение узла трубки и иглы под углом относительно поверхности агарозы способствует децентрализации иглы. Тем не менее, эти меры предосторожности трудно реализовать, и игла чаще всего не покоитсяG - стенки капиллярных труб. Напротив, основным преимуществом микропредставленного устройства является то, что в нем имеются отверстия для игл, концентрично совмещенные с цилиндрическими каналами, что способствует адекватной централизации иглы и просвета относительно канала и микроколоны соответственно. Кроме того, устройство увеличивает пропускную способность, одновременно способствуя изготовлению нескольких микроколонок. Несмотря на преимущества, предоставляемые устройством, нецентральные просветы все еще могут быть созданы с помощью изогнутых игл для иглоукалывания. Микротехнологические методы также обладают присущей толерантностью, которая ограничивает их эффективность. В общем, дегидратация микроколонок, для которой крайний случай показан на рисунке 8А , не должен быть помехой, если соблюдаются рекомендации, предусмотренные в протоколе. Обратите внимание, что физическим свойствам агарозы, используемой для внешней оболочки, может потребоваться оптимизация для альтернативных подтипов нейронов, поскольку улучшенный корковый нейрон sНаблюдается рост urvival и neurite при более высоких (3-4%) и более низких (1-2%) концентрациях агарозы ¹⁰ .

Разработка микро-TENN продолжается с внедрением ECM в просвет микроколонок, который служит для создания среды, адекватной адгезии нейронов, выживанию и разрастанию. Кроме того, ECM в сочетании с геометрическим ограничением и низкой пористостью, обеспечиваемой гидрогелем агарозы, ограничивает рост аксонов в продольном направлении для получения требуемой архитектуры. Содержимое решения ECM можно оптимизировать для используемого типа нейрона. Например, только один коллаген способствует выживанию и росту аксонов в микро-TENN DRG, тогда как комбинация коллагена и ламинина требуется для кортикальных нейронов ¹⁰ . Более того, полимеризация ECM внутри микроколонки является критической до клеточного покрытия, поскольку совместная доставка клеток с неполимеризованным ECM приводит к уменьшению количества нейритов outgrOwth и fasciculation ³¹ . Обратите внимание, что даже если микро-колонка изначально заполнена раствором ECM, ее содержимое полимеризуется в мягкий гель и, как правило, сокращается во время инкубационного периода, создавая пространство, позволяющее вводить клеточные агрегаты. Кроме того, важно подтвердить, что ECM вошел в интерьер микроколонок, осмотрев под стереоскоп; Полное отсутствие и / или карманы отсутствующих ECM приводит к отсутствию аксоновского выроста из агрегатов. Изготовление микро-TENN завершается посевом кортикальных нейронных агрегатов на крайних участках леса. Эти нейроны были вскрыты у крыс-плодов с использованием известных процедур ⁴⁸ . Можно сделать вывод, что большинство изолированных клеток являются нейронами, потому что эмбриональная крысиная крыса во время беременности, используемая для выделения, состоит из 99% нейронов, и определенная культуральная среда, используемая в протоколе, метаболически ограничивает глиальную пролиферацию ⁴⁹ . Следовательно, должно быть минимальное глиальное загрязнение, хотя для подтверждения требуется окрашивание для определенных маркеров. В то время как в этой рукописи было представлено изготовление микро-TENN кортикальными нейронами, нейроны из разных областей мозга ( например, ниграл , таламин и гиппокамп) или с различными фенотипами ( например, возбуждающее, ингибирующее и дофаминергическое) могут быть использованы в соответствии с желаемым применением и Область имплантации. Предыдущие итерации протокола изготовления микро-TENN включали высевание диссоциированных клеток ^{10 , 31 , 32} . Хотя желаемая цитоархитектура была получена с использованием диссоциированного метода, она не была достигнута во всех случаях. Во многих случаях диссоциированные клетки затопляли внутреннее пространство и приводили к нескольким кластерам клеточного тела по всему просвету, причем процессы, соединяющие их в обширной трехмерной сетиRef "> 10 ^{, 31.} Агрегатный метод, с другой стороны, обеспечивает сдерживание клеточных тел до крайностей и, следовательно, является неотъемлемой частью успеха технологии микро-TENN ( рисунок 5 ). Показанные микро-TENN показаны На рисунках 4-6 были изготовлены с более крупными агрегатами, которые не были полностью вставлены, и это может иногда приводить к выпадению агрегатов из микроколонок в культуре, как примеры, показанные на фиг. 8D и 8E . Чтобы этого избежать, агрегаты могут Быть полностью вставлены внутри микроколоночного интервала.Если эта ситуация возникает даже после применения предыдущей стратегии, начальный период инкубации может быть расширен, чтобы обеспечить достаточное время для адгезии агрегата с ECM. Во время культуры осторожное обращение с микро-TENN Рекомендуется сохранить целостность гидрогелевой оболочки и цитоархитектуры, проблемы во время микро-TЭНН-манипуляция является причиной кривизны, полученной в обращенных друг к другу аксональных трактах ( рис. 5 ). Тем не менее, следуя протоколу, представленному в этой статье, следует привести к последовательной разработке микро-TENN с ожидаемой архитектурой нейронов / аксонов, распределением досинаптического бутона и внутренней электрической активностью.

Несмотря на обещание, что микро-TENN держат, есть еще проблемы, которые могут ограничить применение этой технологии. Текущая технология изготовления микроколонок ограничена децентрализацией просвета микроколонок, что может привести к несогласованному представлению механических сигналов к ячейкам ( например, жесткости), разрыву стенки микроколонок и последующему воздействию аксональных трактов К внешнему виду и проблемам при имплантации. Несмотря на то, что использование микроизготовленного устройства улучшило исход по сравнению с капиллярными трубками, микропрепарат повышенной точностиДля повышения воспроизводимости размеров этих конструкций требуется n методов. Результаты этой рукописи показали, что методология микро-TENN может надежно производить живые леса, состоящие из нейронов и аксональных путей, которые напоминают нативную нейроанатомию, в частности аксональные пути, которые соединяют различные области мозга. Тем не менее, длина микро-TENN является препятствием, в зависимости от длины ходового аксонального пути, который необходимо заменить. Например, тканевые нервные трансплантаты (TENG) представляют собой отдельную стратегию жизнедеятельности, используемую нашей исследовательской группой для восстановления чрезвычайно длинных травм нервов. Чтобы заменить эти длинные промежутки, аксоны в TENG можно удлинить до десятков сантиметров, применяя непрерывное механическое натяжение в пользовательских механобиореакторах ^{1 , 23 , 50} . Этот метод «роста растяжения» также применялся для управления длиной астроцитарного процесса до бетаR имитируют структуру радиальных глиальных путей ⁵¹ . Напротив, настоящая технология микро-TENN пока не предлагает такой степени контроля; Максимальная достижимая длина в настоящее время ограничена тем, насколько длинные аксональные пути могут расти in vitro на основе традиционного роста, конусного опосредованного расширения. Более того, даже несмотря на то, что ЦНС обладает внутренней способностью к нейрофизиологической перестройке в ответ на различные стимулы, а трансплантированные клетки обладают способностью синаптически интегрироваться с нативной схемой, другое ограничение этой технологии заключается в том, что микро-TENN полагаются на пластичность нативного мозга И способность сетей-хозяев функционально интегрироваться с имплантированной конструкцией ^{52 , 53 , 54 , 55} . Наконец, врожденный недостаток всех подходов, основанных на имплантатах, таких как микро-TENN, является их инвазивностью. Поскольку нейроныОбычно в непосредственной близости от капилляров, любой тип хирургической процедуры может привести к нарушению в гематоэнцефалическом барьере, утечке факторов крови в паренхиму головного мозга и острую (и даже хроническую) воспалительную реакцию ³¹ . Этот ответ может повредить нейроны хозяина и микро-TENN, отрицая полезные аспекты этой техники. Тем не менее, микро-TENN, имплантированные в кортикоталамический путь крыс, выжили в течение по крайней мере 1 месяца и показали доказательства структурной интеграции с корой головного мозга ^{10 , 31} . Кроме того, в предыдущей публикации из нашей исследовательской группы была представлена ​​методика, позволяющая без имплантации имплантации микро-TENN в мозг крысы ³¹ . В этом подходе эта стратегия гидрогелевого покрытия была дополнена включением тонкого (~ 20 мкм) покрытия карбоксиметилцеллюлозы, которое при умеренной дегидратации представляло достаточную жесткость для проникновенияМозг, не требующий иглы или направляющей ³¹ . Этот метод без имплантации без иглы в сочетании с небольшим поперечным сечением микроколонок должен минимизировать повреждение головного мозга во время и после процедуры стереотаксической имплантации.

Несмотря на предварительный успех микро-TENN in vivo , в будущих исследованиях необходимо будет подтвердить, что эти конструкции синаптически интегрируются с родной тканью и исследовать, было ли функциональное восстановление получено в моделях повреждения ЦНС и нейродегенеративных заболеваний ^{10 , 31} . Например, адаптированные микро-TENN могут быть разработаны с конкретными клеточными фенотипами и имплантированы в соответствующий дегенерированный путь для восстановления сети и восстановления функции. Чтобы уменьшить острую воспалительную реакцию после имплантации, гидрогелевую оболочку микро-TENN можно легировать противовоспалительными и про-выживающими агентами. Альтернативное изготовлениеМетоды ( например, трехмерная печать) могут быть разработаны для создания микроколонок гидрогеля с большей легкостью и с более точными характеристиками, включая последовательную централизацию просвета и воспроизводимость размеров. Та же схема биоматериалов, используемая в микро-TENN, может быть модифицирована для решения других характерных патологий повреждения ЦНС и болезней. Например, наша группа ранее разрабатывала конструкции, состоящие из продольно выровненных астроцитарных пучков вдоль просвета с коллагеновым покрытием из агарозного гидрогеля, которые структурно эмулируют радиальные глиальные пути и глиальную трубку для облегчения регенерации аксонов и миграции нейронов ⁵⁶ . Кроме того, могут быть включены стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки человека (HESC), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и стероидные клетки, полученные из жировой ткани (ASC), для изготовления аутологичных микро-TENN на основе пациентов на более Близко напоминают утраченную цитоархитектуру и фенотип клеток. Эти футуПовторные модификации увеличили бы способность микро-TENN заменять дегенерированные пути in vivo и позволили бы для реконструкции более сложных тканевых архитектур, включая астроглиальную поддержку и аксоновую миелинизацию, среди других функций. Генетически сконструированные нейроны также могут быть засеяны либо для увеличения регенеративного действия микро-TENN путем высвобождения трофических факторов, либо для модуляции ЦНС путем оптико-электронной стимуляции ионно-оптических каналов ⁴³ . Эти строительные леса могут быть изготовлены с возбуждающими или ингибирующими нейронами для синаптической модуляции существующих дисфункциональных соединений хозяев в таких условиях, как эпилепсия, депрессия, наркомания или болевые расстройства ¹ . Например, микро-TENN, образующие преимущественно ГАМКергические или глутаматергические синапсы, могут быть сконструированы для подавления или стимуляции соответственно вверх или де-регулируемых путей посредством синаптической интеграции и / или объемного нейронаВыпуск передатчика. Важно отметить, что такие автономные модуляторные конструкции теоретически будут реагировать на основе обратной связи с сетью хостов ¹ . Аналогично, микро-TENN можно применять в качестве интерфейсов мозгового компьютера (BCI) с использованием оптико-индуцированных микро-TENN, служащих промежуточными звеньями между мозгом и неорганическими стимулятивными или записывающими устройствами. Это приложение может быть альтернативой BCI с микроэлектродом, которые не имеют специфического клеточного таргетинга и механической стабильности и вызвали воспалительные реакции, образование глиального шрама и миграцию или потерю нейронов при проникновении в мозг ^{57 , 58} .

Как и тестовые пробирки in vitro , микро-TENN могут стать мощной платформой для изучения нейробиологии и электрофизиологии, выступающей в качестве биофиделических моделей нервной системы. Кроме того, 3D-конструкции могут служить в качестве испытательных стендов для стратегий лечения при использовании в качестве нейронного вредаУри и болезни ⁵⁹ . В качестве 3D-конструкций микро-TENN способны моделировать среду in vivo , которая характеризуется сложными взаимодействиями клеток-клеток и клеток-ECM во всех пространственных направлениях, которые не могут быть точно представлены в плоских культурах ^{42 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65} . Действительно, многочисленные исследования показали, что тип среды имеет решающее значение для клеток, чтобы представить морфологию, пролиферацию, миграцию, экспрессию генов, дифференцировку и сигнализацию, проявленные в естественной обстановке ⁶⁰ . Сходство между 3D-средой этих лесов и самим мозгом дополняется степенью контроля, которую эти конструкции предлагают по своим физическим и биохимическим параметрамОперациями ⁴² . Это позволяет разработать микро-TENN с различными наборами механических, гаптотаксических и хемотаксических сигналов для изучения влияния этих сигналов, индивидуально или синергически, на выживаемость, созревание, расширение аксонов, синаптогенез и механотрансдукцию ^{32 , 42 , 63} . Кроме того, гибкость дизайна этой технологии микро-тканевой инженерии позволяет строить живые леса, которые имитируют другие особенности ткани мозга, такие как столбчатая, разделенная структура неокортекса, натянутая на аксонные тракты соединителя, для дальнейшего увеличения Мощь этой системы как платформы in vitro для изучения мозга ⁶⁵ . В качестве исследовательских платформ микро-TENN используют контролируемую настройку типичных моделей in vitro , экспансивную доступность конструктивных параметров в ткани enПодходы к генетическим исследованиям и повышенная физиологическая и патофизиологическая значимость 3D-платформ, чтобы стать идеальным испытательным слоем для продвижения нейробиологических знаний. Множество будущих направлений этой технологии олицетворяет универсальность микро-TENN. Эта рукопись продемонстрировала, что протокол микро-TENN может надежно создавать тканестроительные живые леса, которые имитируют важнейшие черты нейроанатомии мозга, чтобы предложить новое понимание нейробиологических явлений, включая процессы развития, болезни и восстановления. Эти конструкции также могут синфанически интегрироваться с нативной тканью для восстановления поврежденных участков белого вещества, замены потерянных нейронных клеток и модулирования дисрегулированных путей после повреждения и заболевания ЦНС.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser cutter	Universal Laser Systems	PLS4.75	Used to fabricate the laser-cut micro-channel mold.
Laser-cut micro-column fabrication device	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Screws	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Nuts	--------------	--------------	#4-40 with a thread diameter of 3.05 mm
Acupuncture needle (180 µm diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Capillary tube (398 µm diameter)	Fisher	21170D	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N	Used for all dissection steps and for micro-TENN fabrication.
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Mouse laminin	Corning	354232	Maintain at 4 ºC and remove only when needed.  Use ice to preserve its temperature when in use.
Neurobasal medium	Invitrogen	21103049	Basal medium for the culture of pre-natal and embryonic neuronal cells. Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (DNase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement added to Neurobasal medium for the culture of hippocampal and cortical neurons. Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Printer	Stratasys	--------------	Used to fabricate the pyramidal micro-well molds.
3D-printed pyramidal well mold	Custom-made	--------------	Contact our research group if interested. Dimensions and blueprints provided in the manuscript.
Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent	Fisher	NC9285739	Comes as kit with elastomer and curing agent. Use inside a chemical fume hood.
Funnel	Fisher	10-348C
1 ml pipette bulb	Sigma	Z509035
Micro-spatula	Fisher	S50821
12-well culture plate	EMESCO	1194-353043
Oven	Fisher	11-475-154
Incubator	Fisher	13 998 076
AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Commercially available adeno-associated virus (AAV) with the GCaMP6f calcium indicator.
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Triton X-100	Sigma	T8787	Non-ionic surfactant used to permeabilize cell membranes.
Horse serum	Gibco	16050-122
Mouse anti-Tuj-1/beta-III tubulin primary antibody	Sigma	T8578-200UL	Store at -20ºC.
Rabbit anti-synapsin 1 primary antibody	Synaptic Systems	106-001	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC.  Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen.  Therefore, it must be disposed of in a separate container.
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	--------------	Used for taking the phase-contrast images.  With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).
High-speed Fluorescence Microscope	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti microscope paired with an ANDOR Neo/Zyla camera for calcium imaging.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Used to identify calcium transients from the recordings taken with the high-speed fluorescence microscope.