Summary
ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.
Abstract
מיקרוטובולים דינמיים הם היסוד תהליכים תאיים רבים, ועל מדידות מדויקות של הדינמיקה microtubule יכול לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים מווסתים תהליכים אלה וכיצד הרגולציה ההשפעה הגנטית מוטציות. כימות של דינמיקה microtubule במודלים מטזואניים יש מספר אתגרים הקשורים, כולל צפיפות ומגבלות microtubule גבוהה על מניפולציות גנטיות. לעומת זאת, המודל שמרים הניצנים מציע יתרונות כי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הדינמיקה של מיקרוטובולים יחיד בתאים חיים שמרים. תאים המבטאים טובולין מתויג fluorescently הם דבקו תאי שקופית התאספו, המאפשר רכישת תמונה יציבה זמן לשגות. מדריך מפורט על מהירות גבוהה, רכישת תמונה ארבע-ממדית מסופק גם, כמו גם פרוטוקול לכימות המאפיינים של מיקרוטובולים דינמי ערימות התמונה confocal. שיטה זו, בשילוב עם גנטיקה שמרים קונבנציונאלי, Provאידו גישה מתאימה באופן ייחודי להערכת ההשפעות כמותית של רגולטורי microtubule או מוטציות המשנים את הפעילות של יחידות משנת טובולין.
Introduction
Microtubules הם פולימרי cytoskeletal עשויים יחידות משנת חלבון αβ טובולין ו משמש במגוון רחב של קשרים הסלולר, כולל הובלה תאית, חלוקת תא, morphogenesis, ואת תנועתיות. כדי לבנות רשתות microtubule לתפקידים מגוונים אלה, תאים חייבים להסדיר בזהירות היכן ומתי טופס מיקרוטובולים. תקנה זו מושגת על ידי שליטה על התגובות כי גם להרכיב יחידות משנה αβ טובולין לתוך פולימרים microtubule או מיקרוטובולים לפרק לתוך תת-יחידות חינם; זה נקרא דינמיקת microtubule.
יעד מרכזי של שדה microtubule הוא להבהיר את המנגנונים המולקולריים מווסתים דינמיקת microtubule, כולל מחקרים של תת-יחידות-טובולין αβ ורגולטורים חיצוניים אשר נקלטים על ידי טובולין ו / או מיקרוטובולים. גישה ניסיונית ומבוססת היא לשקם מערכת זו במבחנה באמצעות חלבון αβ טובולין מטוהר, לעתים קרובות combination עם רגולטורים חיצוניים מטוהרים. למרות שמדובר בגישה שימושי, ברור כי הדינמיקה microtubule במערכות מחדש שונה מאוד מזו שנצפתה תאים חיים. לדוגמה, microtubules לגדול מהר יותר להתכווץ לאט in vivo מ במבחנה. הבדלים אלה ניתן לייחס את הזמינות של רגולטורים חיצוניים ידועים 1, כמו גם לגורמים-מוגדרים עדיין בתאים. לכן, חשוב לקבוע את פעילות רגולטורי microtubule מוטנטים משבשי דינמיקה בהקשר הסלולר ילידים.
למרות מודלים מטזואניים שהוכחו המערכות מרוויחות על חקירת פונקצית microtubule וארגון מסדר גבוה, כמה חששות מעשיים קשות להגביל את השירות של מודלים אלה עבור המדידה המדויקת של דינמיקת microtubule. ראשית, המספר הגבוה של מיקרוטובולים, החל מעשרות אלפי לכל תא, מקשה בביטחוןלעקוב מיקרוטובולים בודדים לאורך זמן. מחקרים רבים בהתמודדות עם אתגר זה באמצעות הדמיה חלבונים כי למקם באופן סלקטיבי הקצוות microtubule, כגון חלבונים במשפחה מחייב-סוף (EB). עם זאת, חלבונים אלה ידועים למקם רק עד הקצה גוברת מיקרוטובולים ב metazoans 2. לכן, השירות של חלבונים אלה מוגבלים מדידה ישירות שיעורי צמיחה, תוך עקיפה בלבד למדידת היבטים אחרים של דינמיקה, כגון תדירות הקטסטרופה. שנית, למרות ההתקדמות הטכנולוגית העריכה בגנום, יצירת תאים ביציבות להביע fluorescently שכותרתו טובולין או החדרת מוטציות לתמרן טובולין או microtubule הרגולטורים סלקטיבי עדיין מהווה אתגר משמעותי. יתר על כן, נוכחותם של isotypes טובולין רב metazoans מקעקע החקר כיצד מוטציות להשפיע גני טובולין פרט.
מערכת שמרי הניצנים מספקת מספר יתרונות חשובים למדידה ב microtubu vivoדינמיקת le. שמרים יש רשת microtubule פשוטה המאפשרת הדמיה של מיקרוטובולים הפרט. בשמרים, microtubules נובע ארגון מרכזי המכונה גופי מוט ציר (SPBs), אשר מוטמעים מעטפת גרעין 3. SPBs לשמש פיגומי מתחמים קטנים טובולין γ כי nucleate מיקרוטובולים 4, 5. SPBs nucleate שתי כיתות של מיקרוטובולים, microtubules ציר ו microtubules האסטרלי. Microtubules ציר הפרויקט לתוך nucleoplasm והם חשובים עבור הצמדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוטובולים קינטוכור לייצוב ציר דרך חופפים מיקרוטובולים interpolar 6. בניגוד לכך, פרויקט מיקרוטובולים אסטרלי החוצה לתוך cytosol והם נדירים יחסית בהשוואה לרשת הצפופה של microtubules ציר. במהלך מיטוזה, תאים טרום anaphase יש רק 1-2 מיקרוטובולים אסטרלי הבוקע משני SPB; אלה קיימים כמו שאנימיקרוטובולים ndividual ולא כמו חבילות 7. תפקידיו של מיקרוטובולים אסטרלי במהלך מיטוזה הוא להעביר את הגרעין ואת הציר לתוך הצומת בין תאי אמא ניצן, המכונים צוואר הניצן. תנועה זו כרוכה מסלולים מוגדרים היטב שיוצרים כוח על מיקרוטובולים אסטרלי, מושכים את הגרעין ואת הציר כלפי ובסופו של דבר לתוך ניצן הצוואר 8.
יתרון נוסף של המערכת שמרים הוא כלי הגנטיקה שלה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור הרגולטורים microtubule ואת יחידות משנה טובולין עם דיוק ללא תחרות. שמרים גם בעלי רפרטואר פשוט של isotypes טובולין: סינגל β טובולין גן (TUB2) ושני גני α-טובולין (TUB1 ו TUB3). מוטציות יכולות להיות הציגו בקלות לתוך הגנים הללו ולמדו ובכך באוכלוסיית טובולין הומוגנית 9, 10. ישנם מספר נרחבבונה זמינה עבור microtubules תיוג, והוא יכול להיות ממוקד אלה לשילוב בבית הלוקוסים כרומוזומליות לביטוי יציב (ראה דיון).
המטרה הכוללת של שיטה זו היא מיקרוטובולים יחיד תמונה בתאים חיים שמרים בארבעה ממדים (X, Y, Z, ו- T) למדידות ברזולוציה גבוהה של דינמיקת microtubule. שיטות לשילוב בונים עבור הביטוי המכונן, ברמה הנמוכה של טובולין שכותרתו fluorescently בתאי שמרים מתוארות. לפני הדמיה, תאים חיים הם רכובים לתוך תאי שקופיות מצופה לקטינים concanavalin א לייצב את התאים עבור הדמיה לטווח ארוך. הפרמטרים האופטימליים לרכישת תמונה, כמו גם עבודה לניתוח נתונים, מתואר גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צלחות נשירה -LEU
- מוסיפים 800 מ"ל מים סטריליים, ללא יונים (DiH 2 O) בבקבוק L 2. להוסיף 26.71 גרם של בסיס נשיר אבקה (תאריך הלידה), 0.69 גרם של CSM-Leu, ו 20 גרם של אגר. מערבבים עם בר ומערבבים מגנטי. מביאים 1 L עם DiH 2 O.
- חיטוי ב 121 ° C ו 19 psi עבור 30 דקות.
- הסר את הבקבוק מן החיטוי ולאפשר לו להתקרר ~ 65 ° C עם ערבוב עדין.
- יוצקים 30 מ"ל / צלחת לתוך צלחות בקוטר 100 מ"מ. תנו אלה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 36-48 שעות לפני אחסון ב- C ° 4.
2. שילוב GFP-Tub1 עבור ביטוי המכונן של טובולין GFP שכותרתו
- מרתיחים ריכוז מלאי של 10 מ"ג / מ"ל חד-גדילי דנ"א (ssDNA) עבור 3 דקות.
- שלב 2 μL של ssDNA המבושל עם 400 ננוגרם של DNA פלסמיד ה- GFP-Tub1 המטוהר 11.
הערה: יש מגוון של פלסמידים שיכולים לשמש עבור התיוג היציב, פלורסנטשל מיקרוטובולים בשמרים כי לנצל fluorophores חלופה וסמנים לבחירה. כמה חלופות אלה מתוארים בסעיף הדיון. - מוסיף את תערובת DNA כדי aliquot 50 μL של תאי שמרים מוסמכים.
הערה: הכן תאים שמרים המוסמכות עם פתרון סורביטול (SORB; 100 מ"מ LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 מ"מ EDTA pH 8, ו 1 M סורביטול, מותאם עם חומצה אצטית מדוללת ל- pH 8). לתיאור מפורט של הפיכת תאי שמרים מוסמכים, ראה התייחסות 12. - וורטקס ביסודיות.
- להוסיף 6x הנפח הכולל של פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון (100 מ"מ LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, ו 40% PEG3350) לתערובת DNA תאים.
- וורטקס ביסודיות.
- דגירה של 1 h לפחות 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- להוסיף sulfoxide דימתיל (DMSO) כדי 10% מנפח מערבולת הכולל.
- לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 5 דקות.
- תאי פלייט על צלחת נשירה -LEU.
הערה: מבנה GFP-Tub1 מכיל סמן auxotrophic לאוצין, בעוד מבנים אחרים יכולים להשתמש סמן חלופה. מדיום הנשירה צריך להיות ספציפי סמן auxotrophic של המבנה. - אפשר התאים שינו לגדול במשך 3-5 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.
- Re-פס מושבות טרנספורמציה יחידות על צלחת נשירה -LEU טריה על ידי העברת מושבות באמצעות קיסם לעקר. דגירה את צלחת הלילה ב- C ° 30.
- מבחינה ויזואלית במסך בכל transformant עבור אות GFP ידי השעיית כ 1 μL של תאים ממושבה אחת מהצלחת בשלב 2.14 ב 2 μL של מים בשקופית נקיה. מכסים את התאים מושעה עם coverslip ולבחון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- להלהיב את transformants עם אור 488 ננומטר ולחפש בנוכחות אות ה- GFP.
- להלהיב את transformants עם אור 488 ננומטר ולחפש בנוכחות אות ה- GFP.
3. תרבית שמרים נוזלי Growing
- לחסן ~ 1 μL של תאים שמרים ממושבה יחידה על צלחת ב 3 מיליליטר של מדיום להשלים סינטטי. אפשר התאים לגדול לילה בשעה 30 ° C עם רועד ב 250 סל"ד.
- לדלל את התרבות הרוויה למחרת כדי OD 600 של <0.1 במדיום. מחזירים את התרבות מדולל על שייקר C 30 ° 3-4 שעות או עד OD 600 הוא בין 0.4 לבין 0.8, כאשר התאים מוכנים להיות טעון לתוך תאי הדמיה.
4. הכנת תזרים לשכת שקופיות
- גזירהגיליון של הסרט פרפין לתוך חתיכת 4 ב רחב 7 ב ארוך.
- מקום שקופית מיקרוסקופ רגיל לאורכם על רוחב 4 אינץ של סרט פרפין לעטוף את הסרט סביב המגלשה 3-4 פעמים כאלה כי השקופית מכוסית בסרט כי הוא עבה 3-4 שכבות. מהדק את השכבות יחד כדי להבטיח ישנו חותם סביר; זה יקל לחתוך. הימנע לחיצה קשה מדי או גרימת הסרט להתקמט.
- חותכים את הסרט פרפין בשולי מחוץ לשקופית באמצעות גילוח חותך תיבת נקי. להשתמש בשקף אחר כדי לספק קצה ישר לחיתוך.
- מקלף את הסרט העודף מעל השקופית עובדת וזורקים. הערימות הנותרות של סרט תכסינה הפנים לאחד השקופיות תשמשנה על מנת להפוך את הקירות בין תאי הדמיה.
- באמצעות השקופית השנייה בתור קצה ישר, לחתוך את שכבות סרט המוערמות לאורך ציר זמן של השקופית לתוך כעשר רצועות, כל 2-4 מ"מ הרוחב.
- חותכים את שכבות הסרט פרפין מוערמים בניצבהקיצוצים שנעשו בשלב 4.5, לאורך הציר הקצר של השקופית, כדי ליצור רצועות 2-4 מ"מ רוחב, 23-24 מ"מ אורך, ו 3-4 שכבות עבות.
- קולפים את רצועות לחתוך באמצעות סכין גילוח בזווית 45 מעלות. בעזרת מלקחיים, שווה להפיץ את רצועות סרט לגזור על שקופיות מיקרוסקופ נקיות כדי ליצור את המספרים הרצויים של תאי. עד 3 תאים (עשו עם 4 רצועות פרפין סרט) ניתן ליצור בשקופית אחת.
- מניחים coverslip יחיד על גבי רצועות של הסרט ולהעביר אותה במקומה באמצעות מלקחיים.
- מניחים את השקף מוכן, coverslip עד, על פלטה חמה להגדיר ב ~ 95 ° C (זה בערך ההגדרה נמוכה בינונית ברוב כיריים). מחממים את השקופית עד רצועות הסרט הם שקופים (כ 3 דק ') ולאחר מכן לאטום את שקופיות coverslip יחד על ידי לחיצה בעדינות על coverslip עם פינצטה.
הערה: חשוב לעיתונות רק על האזורים של coverslip כי הם ישירות מעל רצועות סרט פרפין, כמו גירוד באזורים מעל גhambers יכול להקטין את איכות התמונה. יש להקפיד לא לחמם יותר מדי את השקופית; הסרט יהיה מתאדה המעיל הפנימי של החדר עם סרט הידרופובי שמונע את התאים מפני הדבקות. - שימוש במלקחיים כדי להסיר את השקופית מן הפלטה החשמלית (המגלשה תהיה חמה) ולהגדיר אותו בצד להתקרר עם צד coverslip פונה כלפי מעלה; כשקופית מקררת, הסרט יחזור גוון לבן, אטום.
הערה: בשלב זה, את השקופיות מוכנות להיות עמוסים תאיים שמרים מתורבתים. שקופיות נוספות יכולות להתבצע בשלב זה ומאוחסנים במיקום נקי ויבש יותר ללא הגבלת זמן.
5. בתאי שמרים טוענים לתוך שקופיות לשכת תזרים הוכנו
- הפשרה aliquot קפוא, 200 μL של concanavalin A (2 מ"ג / מ"ל ב DiH 2 O סטרילי).
- להוסיף כ 100 μL של A concanavalin מופשר לכל תא של השקופית שהוכן על ידי pipetting לתוך אחד הקצוות הפתוחים. להוסיף מספיק concanavalin א למלא את התא. בשביל זה זהTEP, א concanavalin יימשך דרך התא באמצעות כוח הנימיות.
- לתלות את השקופית, למטה coverslip, בין שני מתלים microfuge צינור או עטים עבור 5 דקות כדי לאפשר א concanavalin לדבוק coverslip (כלומר, התא).
- חזרה לשקופית למיקום coverslip-אפ. שטפו את החדר עם 2x נפח תא (שנקבע בשלב 5.2, לעיל; כ 200 μL) של המדיום להשלים סינתטי להסיר את א concanavalin
- זרימת המדיום דרך התא, או באמצעות בפינה של מגבת נייר או נייר פילטר מקופל לשניים, כדי לשאוב נוזל מתוך בקצה אחד של החדר תוך pipetting נוזל טרי זמנית לתוך השני. לחלופין, להשתמש aspirator ואקום כדי לשאוב נוזל בקפידה מתוך בקצה אחד בעוד pipetting נוזל טרי לתוך השני.
- תאי עומס ידי זורם 2x נפח התא (כ 200 μL) של השעית תא (משלב 3.4) באמצעות metho הזרימה המכוונתד שמתואר בשלב 5.4.1.
הערה: המטרה היא תמונת שכבת תאים אחת על coverslip. לכן, חשוב לטעון ריכוז של תאים קטנים מספיק שהם לא להעמיס על גבי זו, אבל גדולים מספיק תאים מספיק נוכחים בתחום לאסוף את הסכום המקסימאלי של נתונים לרכישת תמונה. הריכוז האופטימלי של תאים בתוך החדר יכול להשתנות וצריך להיקבע באופן אמפירי. כדי להגדיל את הריכוז של תאים בתא הזרימה, בעדינות גלולה תרבית תאי XG ב 1000 עבור 2 דקות ולהסיר חלק supernatant. כדי להקטין את הריכוז של תאים, להוסיף בינוני להשלים סינטטי טרי השעית התא. הריכוז של תאים ניתן להעריך אחרי צעד 5.7 (להלן) באמצעות בדיקת ה- הקאמרית על מיקרוסקופ לעומת שלב. בשלב זה, תאים נוספים ניתן להוסיף לתא ידי זורם השעיה סלולרית יותר. עם זאת, הפחתת צפיפות תאים בשלב זה היא לא ריאלית ולא מושגת הטובה על ידי טעינה קאמרית חדשה עם השעית תא מדוללת. - לתלות את coverslip למטה שקופיות, כפי שמתואר בשלב 5.3, עבור 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק coverslip.
- ממאורותיהם תאים unadhered ידי זורם דרך 4x נפח תא (כ 400 μL) של המדיום להשלים סינתטי. זה יבטל תאי "פנויות" בתא, אשר יכול לזהם רכישת תמונה.
- בזהירות לייבש כל סוף הקאמרי עם פינה נקיה של מגבת נייר, להביא את המניסקוס לקצה של coverslip.
- חותם בכל קצה של החדר עם חם (75 מעלות צלזיוס) איטום (למשל, VALAP; בחלקים שווים וזלין, צמר שעווה, שעוות פרפין).
הערה: בשלב זה, את השקופית מוכנה תמונה. התאים ניתן הדמיה של עד 9 שעות, תלוי בצפיפות של תאים בכל תא. התאים ייצרו דו תחמוצת הפחמן (CO 2) לאורך זמן, אשר בהדרגה תיצור בועות כי דוחקות את התאים.
התחת = "jove_title"> 6. רכישת תמונה
- תביאו את השקופית מיקרוסקופ הפוכה מצויד מטרה 1.45 NA 100X CFI תוכנית Apo, במה פיזואלקטריים, יחידת סורק confocal דיסק מסתובב, לייזר תאורה, ואת המצלמה EMCCD. לשמור על טמפרטורה של השלב בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במהלך הרכישה.
הערה: מספרי הצמצם הגבוה מאפשר רזולוציית תמונה גדולה יותר, ועל הבמה פיזואלקטריים מאפשרת מהירות גבוהה Z- מחסנית רכישה. דרישות מיקרוסקופ המינימום הן מטרת 100X, ליזר התאורה, ואת מצלמת EMCCD. - תביאו את התאים אל המוקד. ודא שהשדה הרכישה יש לפחות 5-6 תאים מקובצים יחדיו על ידי חיפוש השקופית עבור תאים מקובצים יחד.
הערה: למרות שזה לא הכרחי לתמונה יותר מתא אחד בכל פעם, מספר תאי הדמיה באותו השדה משפר את היעילות של רכישת נתונים מבלי לפגוע באיכות נתונים. עם זאת, חשוב כיתאים הם באותו מישור המוקד ולא נערמו על גבי זו. - לתכנת רכישה רבה-ממדי כדי לאסוף z-סדרות מרובות לאורך זמן.
- התאם את ההגדרות בתוך גדרות רכישה הפעילות הבא: עומק-Z הכולל = 6 מיקרומטר, כדי להקיף את התא שמרים כולו; Z-צעד size = 300 ננומטר, על מנת למקסם את אוסף אור ללא דגימת יתר; משך הזמן הכולל = 10 דקות; זמן במרווחים = Z-series כל 4 s; וזמן חשיפה = 90 מילישניות לכל z-מטוס.
שים לב: בפעם החשיפה אופטימלית תשתנה בהתאם למצלמה, מקור אור העירור, וגורמים נוספים. באופן כללי, את זמן החשיפה האופטימלי יהיה הפעם המינימאלית הדרושה כדי להשיג 3: יחס 1 של אות מ מיקרוטובולים אסטרלי GFP שכותרתו לאותת מן הציטופלסמה בוסס על ערכי פיקסל נמדדים EMCCD.
- התאם את ההגדרות בתוך גדרות רכישה הפעילות הבא: עומק-Z הכולל = 6 מיקרומטר, כדי להקיף את התא שמרים כולו; Z-צעד size = 300 ננומטר, על מנת למקסם את אוסף אור ללא דגימת יתר; משך הזמן הכולל = 10 דקות; זמן במרווחים = Z-series כל 4 s; וזמן חשיפה = 90 מילישניות לכל z-מטוס.
- בגין הרכישה על ידי לחיצה על "הפעל". לאפשר לו לפעול למשך 10 דקות מלאות. שמור את הנתונים כתמונההסדרה (.tiff או .nd2).
- בחר תחום חדש לתמונה בתוך התא וחזור על שלבי 6.2-6.4.
הערה: תא יחיד אמור להניב בין 15 ו 20 שדות של תאים, בהתאם לצפיפות התא בתוך התא. צפיפות תא גבוהה תניב שדות כוללים נמוכים, כמו CO 2 בתא יהיה לבנות מהר.
ניתוח תמונה 7.
- פתח את קובץ התמונה ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) בתור hyperstack באמצעות תוסף יבואן ביו-פורמטים.
- ImageJ פתח לגרור את ערימת התמונה רכשה ממדור 6 ישירות על לוח הבקרה. היבואן ביו-הפורמטים יתחיל באופן אוטומטי. בחר "אוקי" כדי לטעון את המחסנית תמונה בתור hyperstack.
הערה: ההודעה "ביו-פורמטי אפשרויות יבוא" תפתח ולהבטיח כי תחת "Stack צופה" בסעיף, "צפו מחסנית עם:" מוגדרת "hyperstack"; ו "להזמין מחסנית:" מוגדר "XYCZT."
- ImageJ פתח לגרור את ערימת התמונה רכשה ממדור 6 ישירות על לוח הבקרה. היבואן ביו-הפורמטים יתחיל באופן אוטומטי. בחר "אוקי" כדי לטעון את המחסנית תמונה בתור hyperstack.
- כווץ כל Z-series לתוך בעוצמה מקסימלית, הקרנה 2-ממדית באמצעות הפונקציה פרויקט-Z.
- בחרו בתפריט "תמונה", תפריט המשנה "Stack", והתכונה "Z-פרויקט". בחר "הקרנה מקסימלי" מהרשימה הנפתחת ולחץ על "אישור".
- החל מסנן חציון אל ערימת התמונה כדי להקטין רעש שנקר על ידי בחירת תפריט "התהליך", תפריט המשנה "מסננים", ותכונת "החציון". זן 2.0 פיקסלים לתוך תיבת הרדיוס ולחץ על "אישור".
- זיהוי תאים טרום anaphase בתחום.
הערה: אלו מאופיינים ניצני בינוניות ציר המיטוטי קצר, 1-1.5 מיקרומטר אורך (איור 1; נקודות ראש החץ על ציר המיטוטי קצר). תאים בשלב זה הם אידיאליים עבור ניתוח הדינמיקה microtubule משום שהם בדרך כלל מציגים רק Feמיקרוטובולים אסטרלי w נובעת הקטבים ציר 7. מיקרוטובולים אסטרל ניתן לזהות כמו סיבים ליניארי כי התערוכה עוצמת אות ה- GFP אחידה מסוף מינוס, על SPB, עד סוף פלוס, בציטופלסמה. - החל ב timepoint הראשון של סדרת התמונה, השתמש בכלי הקו המפולחים לצייר קו לאורך microtubule יחיד אסטרלי, מסוף מינוס, הממוקם בצומת בין microtubule האסטרלי לבין microtubules ציר שכותרתו ביתר שאת, עד הסוף פלוס , המהווה בציטופלסמה (ראה את הקווים האדומים באיור 1). לחץ פעמיים על סוף microtubule כדי להשלים את קו מפולח.
- רשום את המדידה בטבלת התוצאות באמצעות התכונה "מידה" על ידי לחיצה על הכפתור "M" במקלדת.
הערה: תכונות נוספות, כגון עוצמת אפורה, ניתן להקליט על ידי קביעת המדידות בתפריט "לנתח" ו "מדידות Set" תפריט משנה. - להתקדם timepoint הבא על ידי לחיצה על החץ ימינה בבר-מחוון Z או לחיצה על המקש "./>" במקלדת. חזור על שלבים 7.5 ו 7.6 עבור כל timepoints ברצף תמונה.
- העתק את נתוני טבלת התוצאות ולהדביק אותם לתוך גיליון אלקטרוני. שמור את הנתונים על ידי בחירה "שמירה בשם".
הערה: מדידות אלה תכלולנה ערכים כמה, אבל הערכים החשובים ביותר הם פרוס, אשר מציין את timepoint בסדרה, ואת האורך, אשר מציין את אורך הקו (כלומר, את microtubule האסטרלי). עמודות המכילות מדידות אחרות (למשל, באזור, אומר ערך פיקסל, זווית, וכו ') יכול להשאיר או מושלך. - צור עמודה חדשה בגיליון האלקטרוני על ידי לחיצה ימנית ו באמצעות הפונקציה "הכנס". קלט את הזמן (ים) של כל timepoint.
- צור עלילת פיזור XY של אורך microtubule (מיקרומטר) כפונקציה של זמן (ים) באמצעות "הקו הכנסתרשים" תכונה; לבחור את מדידות האורך כמו 'Y', וטור הזמן כמו 'איקס'
- לזהות אזורים של פילמור, depolymerization, ואת הפסקה ידי מחפש שינויים חיוביים ושליליים באורך לאורך זמן על פיזור העלילה משלב 7.10.
הערה: אירועים פלמור להגדיל אורך microtubule ידי לפחות 0.5 מיקרומטר פני מינימום של 3 timepoints ולהשתלב רגרסיה ליניארית עם R 2 ≥ 0.9 ו R-ערך> 0 (איור 1B ו- D, נקודות ירוקות). אירועי Depolymerization להקטין אורך microtubule ידי לפחות 0.5 מיקרומטר פני מינימום של 3 timepoints ולהשתלב רגרסיה ליניארית עם R 2 ≥ 0.9 ו R-ערך <0 (איור 1B ו- D, נקודות ורודות). אירועים השהה נפרדים פילמור depolymerization. השהיות מוגדרות שינויים נטו באורך microtubule פחות מ 0.5 מיקרומטר פני מינימום של 3 timepoints;מתאים רגרסיה ליניארית עם ערך R בין -0.4 ו 0.4; ויש מדרון כי אינו שונה סטטיסטית מאפס, כפי שנקבע על ידי מבחן F. - באמצעות פיזור העלילה כמדריך, לזהות את החלקים של זמן כאשר השינוי באורך חיובי ולהאיר אותם בצבע ירוק. דגש אזורים של זמן כאשר השינוי באורך שלילי בצבע ורוד.
- חשב את רגרסיה ליניארית של כל מסומן סעיף ולהקליט את -Value 2 R- ו R עבור כל מקטע בעמודות הפרוקסימלי אזורים. לסווג כל אזור בצבע כמו גם אירוע פילמור או אירוע depolymerization.
- לזהות אזורים של פילמור, depolymerization, ואת הפסקה ידי מחפש שינויים חיוביים ושליליים באורך לאורך זמן על פיזור העלילה משלב 7.10.
- חשב את שיעורי פילמור על ידי חלוקת השינוי נטו אורך ידי שינוי זמן עבור כל אירוע צמיחה. רשום תוצאות אלה בעמודה בצמודה לערכי רגרסיה ליניארית משלב 7.10.3.
- חשב את שיעורי depolymerization ידי חלוקת השינוי נטו אורך ידי שינוי זמן לכל shrinkinהאירוע גרם. רשמו תוצאות אלה בעמודה בצמוד לערכים שיעור פילמור משלב 7.11.
- חשב את תדר הקטסטרופה ידי חלוקת מספר מעברי פילמור אל depolymerization לפי הזמן הכולל של כל אירועי הצמיחה 13. רשמו תוצאות אלה בעמודה בצמוד לערכים שיעור depolymerization משלב 7.12.
- חשב את תדר ההצלה על ידי חלוקת מספר מעברי depolymerization-אל-פילמור על ידי הזמן הכולל של כל אירועי ההצטמקות 13. רשמו תוצאות אלה בעמודה סמוך ערכי תדר קטסטרופה משלב 7.13.
- חשב את dynamicity ידי חלוקת סכום הערך המוחלט של כל השינויים באורך של משך הזמן הכולל של רכישת התמונה, המחושבים בשלב 7.10.1, ומכפיל אותו 27.0833 להשיג יחידות משנה טובולין לכל 14 שניים. רשמו תוצאות אלה בעמודה בסמוך Val תדירות הצלהUES משלב 7.14 ולשמור בטבלת התוצאות.
הערה: אפשר להפוך את תהליך הניתוח המתואר צעדים 7.10-7.15 באמצעות תוכנית מחוייט (. Estrem, et al, כתב היד שהוגשה). התוכנית נועדה לזהות תקופות של פילמור depolymerization של מדידות אורך ידי ביצוע הפרמטרים שפורטו לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדידת דינמיקת microtubule בתאים חיים שמר מספקת כלי משכנע להעריך כיצד מוטציות בגני מקודדי רגולטורי microtubule או טובולין יחידות משנת פילמור השפעה ושיעורי depolymerization, כמו גם את תדירות המעבר בין המצבים הללו. איור 1 מציג סדרה עתית של הדינמיקה microtubule אסטרלי בתא wild-type תא מוטציה עם מוטציה β טובולין (tub2- 430Δ). Microtubules מסומנים עם טובולין α GFP-tagged לדמיין אורך microtubule. החיצים האדומים לעקוב אחר אורך microtubule אסטרלי בכל תמונה (Figure1A ו 1 C). אורכי microtubule נמדדו בכל timepoint עבור 8 דקות, ואת אורכי הידור אלה מתוארים עלילות חיים (איור 1B ו 1 D). נתונים אלו שימשו לקביעת שיעור פילמור, שיעור depolymerization, פילמור duratiעל, משך depolymerization, תדירות הצלה, תדירות הקטסטרופה, ואת dynamicity.
איור 1. זמן לשגות הדמיה של מיקרוטובולים GFP שכותרתו והמידות של Dynamics microtubule אסטרל. (A ו- C) התמונות הרציפות החמש הראשונות של הדמית הזמן לשגות עבור הסוג-בר tub2 -430Δ תאים מוטנטיים. Microtubules מסומן עם GFP-Tub1 צלם ב-anaphase מראש של מחזור התא. כל תמונה היא הקרנת מקסימום בעצימות מסדרה-Z confocal. ברי סולם: 1 מיקרומטר. חותמות זמן מציג את הזמן הכולל בכל רכישת מסגרת. החיצים האדומים לבצע יחד את האורך הכולל של microtubule אסטרלי, עם ראשי החץ המציינים את קצות פלוס. (B ו- D) מגרשי חי microtubule להציג את האורכים של מיקרוטובולים האסטרלי יחידים לאורך זמן. הנקודה הירוקההים לציין פילמור ואת הנקודות הוורודות לציון depolymerization. ראשי החץ להצביע על אירועי קטסטרופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1 מדגים הדינמיקה microtubule שינו בין זן wild-type זן מוטנטי חסר 27 חומצות אמינו של β טובולין על-מסוף C, מוטציה כי הוצגה בעבר לבעלי microtubules יציבה יותר 15. כפי המוצג חלקות החיים microtubule, את microtubule מוטציה tub2 -430Δ ארוך ותערוכות פחות אסונות מאשר microtubule wild-type (איור 1B ו- D ראשי חץ; טבלה 1). בנוסף, שיעורי פילמור depolymerization, נקבע מהמורדות של עולים leng microtubule יורדths, הם ירדו ב מוטציה בהשוואה wild-type (איור 1B ו 1D; טבלה 1). לבסוף, microtubule בתא מוטציה tub2 -430Δ מבלה זמן רב יותר במצבים של פילמור depolymerization ו ירד dynamicity בהשוואה wild-type (לוח 1).
| מתח | Dynamicity (תת-יחידות / ים) | שיעור פילמור (מיקרומטר / min) | % זמן פילמור | שיעור Depolym (מיקרומטר / min) | זמן% ב Depoly- merization | % שעת הפסקה | תדירות הצלה (אירועים / min) | תדירות קטסטרופה (EV מציג / min) |
| Wild-type n = 1 | 54 | 1.8 ± 0.5 | 48 | 3.0 ± 0.3 | 29 | 3 | 1.8 | 1.4 |
| tub2-430Δ n = 1 | 40 | 1.4 ± 0.1 | 41 | 1.5 ± 0.2 | 32 | 0 | 0.8 | 0.7 |
| קיצורים הם כדלקמן: מיקרומטר, מיקרון; דקות, דקה; הים, שני; n, microtubule היחיד נתח מן עלילת חי microtubule (Fig1B, D). ערכים הם מתכוון ± שגיאת התקן של הממוצע. | ||||||||
טבלה 1: מדידות Dynamics microtubule עבור תאים באיור 1. הערכים הם ממוצעים ± שגיאת התקן של ממוצע מתחילת מדידות של מיקרוטובולים היחיד שמוצג באיור 1.
= "1"> נתונים כגון זה ניתן לרכוש מן מגרשי חיי פרט של מיקרוטובולים מרובים (בממוצע, לפחות 50 מיקרוטובולים מנותחים) והשתמשו בניתוח סטטיסטי כדי לקבוע שינויים משמעותיים דינמיקת microtubule פני אוכלוסייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל שמרים הניצנים מציע יתרונות גדולים לאיסוף מדיד ברזולוציה גבוהה של דינמיקת microtubule בסביבת in vivo, כולל היכולת מיקרוטובולים יחיד תמונה לאורך זמן ואת היכולת לתפעל tubulins ורגולטורי microtubule באמצעות הכלים של גנטיקת שמרים.
תאי-מצופה concanavalin לספק מספר יתרונות על פני המנגנון שתואר לעיל, כולל רפידות אגר מותכת. שקופיות עם תאים ניתן מראש ומאוחסנות לטווח ארוך או ניתן להשתמש מייד. בנוסף, התאים-מצופים concanavalin מסוגלים culturing תאי שמרים עבור> 6 h באותו המדיום שבו התאים היו במקור תרבותיים. חשוב לציין כי מספר התאים בתוך התא יכתיב כמה זמן בתא ניתן הדמיה. התאים מצופים להבטיח כי רק שכבה אחת של תאי שמרים שומרת על coverslip. לבסוף, יצירת תאים מרובים מאפשרתמספר זני שמרים שונים להיות צילמו באותו שקופית.
ישנם אתגרים משמעותיים הדמית דינמיקת microtubule בשמרי ניצנים, כולל רמות אות נמוכות יחסית ואת האופי הדינמי ביותר של התהליך. מיקרוסקופי widefield מספיקים עבור לכידת תמונות timepoint היחיד של מיקרוטובולים שכותרתו. עם זאת, מיקרוסקופיה widefield גורמת מהר photobleaching בשל פעמי חשיפה ארוכות ועל ההפצצה של המדגם עם out-of-פוקוס אור. כמו כן, מיקרוסקופים confocal סריקת לייזר אינם מספיקים בשל photobleaching מהר. ספינינג מיקרוסקופ דיסק confocal מתאימה באופן ייחודי עבור הדמיה הדינמיקה microtubule ב ניצני שמרים. מערכת מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב משמשת כאן נועדה עם דרישות אלו בחשבון.
מערכת מיקרוסקופ חייבת להיות מתוכננת עבור מהירות גבוהה ורגישות גבוהה. למרות מגוון רחב של מערכות מיקרוסקופ עשוי להוכיח מתאים, מספר מרכיבים חיוניים. 100Xמטרה עם צמצם מספרי גבוה (1.45NA) יש צורך לפתור מיקרוטובולים פרט ושינויים באורך בסדר הגודל של 100 ננומטר. סורק confocal הדיסק מסתובב יש צורך למזער photobleaching ורעילה, על ידי חסימה מחוץ מוקד אור, ועל מנת למקסם את הרזולוציה ורגישות, על ידי איסוף בלבד פוקוס אור. המצלמה EMCCD חייב להיות מהיר ורגיש לאסוף מספיק אות GFP-Tub1 במהלך כל 90 אלפיות של רכישת זמן לשגות. נכון לעכשיו, מצלמות EMCCD הן הבחירה הטובה ביותר עבור יישום זה. מצלמות חיישן CMOS נוכחיות חוסר הרגישות של EMCCDs המתקדם; עם זאת, הטכנולוגיה הזו היא שיפור משמעותי ועשוי בקרוב להיות מתאים. לבסוף, בשלב פיזואלקטריים נדרש תנועה מהירה ומדויקת ב Z, אשר יכול להיות צעד שער הגבלה ברכישת תמונה ארבעה ממדים.
מערכת מיקרוסקופ הספציפית המתואר בפרוטוקול זה עלולה להציג מחסום אם ציוד דומה היא לא זמין. ג שינוייםלהיעשות כדי להכיל מערכות הדמיה שונות, אך שינויים אלה עשויים לבוא על חשבון הפתרון זמני ו / או מרחבית. מנוע שלב מונחה כישור יכול לשמש במקום השלב פיזואלקטריים. עם זאת, מנועים אלו איטיים, פחות מדויקים, ונוטים להיסחף. תמונה ייצוב-פוסט-רכישת תוספות שניתן להשתמש בהם כדי למזער את הסחף הממדים XY הקשורים בשלבים מונע במנוע אלה. בנוסף, מצלמות חלופיות עם מהירויות readout איטיות יכולות לשמש. כדי להתאים רכישה בשיעור איטי יותר, Z-series יכול להיאסף בתדירות נמוכה יותר (כלומר, יותר זמן בין-סדרת Z). עם זאת, הגדלת זמן בין Z-series סיכוני מעברים חסרים שעלולים להתרחש בין timepoints. לחלופין, את המרחק בין המטוסים-Z ניתן להגדיל כדרך להקטין את מספר התמונות שנאספו לכל סדרת Z. עם זאת, הגדלת המרווח הזה סיכונים לאבד מידע תמונה בין המטוסים, אשר יפגע ביכולת של הנסיין accurately לזהות קצוות microtubule. ברור, יכולים להתבצע שינויים כדי להתאים מערכות הדמיה אלטרנטיביות, אך שינויים אלה חייבים להישקל כנגד האובדן הפוטנציאלי של מידע תמונה.
מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא אובדן המידע מרחבית כאשר ערימות תמונה תלת מימדית מומרות תחזיות תמונה דו-ממדיות. Microtubule אסטרלי בודדים בתא שמרים טרום anaphase הוא בדרך כלל בין 0.5 לבין 2.0 מיקרומטר באורך ופרויקטים ברחבי המרחב התלת-ממדי של הציטופלסמה. לכן זה קריטי לרכוש תמונות מתוך סדרה של תפקידים Z כדי לאסוף את כל המידע המרחבי של microtubule הפרט. בעוד רכישת הזמן לשגות, זה יכול לייצר סט נתונים מורכב, עם 20 Z-פרוס בכל אחד 150 timepoints, עבור סכום כולל של 3000 תמונות. כדי להתמודד עם אתגר זה, וכדי לפשט את ניתוח התמונה, המידע המרחבי של Z- ערימות נדחס במהלך הניתוח. בעוד benef זההניתוח שלה, מדובר במחיר של מידע מרחבים מן-ממד Z. כמה מידע הולך לאיבוד כאשר Z-מימד דחוס? כדי לאמוד את ההפסד הזה, ניסויים נערכו על מנת למדוד את המרחק בין SPBs בתאים טרום anaphase, אשר קלים יחסית למדוד משום Spc110-GFP שכותרתו SPBs להפגין מוקדים כדוריים עם יחס אות לרעש גבוה. למרות הציר עשוי להפגין תזוזה שונה Z מ מיקרוטובולים אסטרלי, האורך הממוצע הוא דומה (~ 1.5 מיקרומטר) ולכן מספקים proxy שימושי. אורכים שפינדל הם, בממוצע, 15% יותר כאשר נמדדו ערימות תמונה תלת-ממדיות מלאות מ כשאותו הפלכים נמדדים תחזיות דו-ממדי (JM, תוצאות לא פורסמו). לכן, לטובת הנתונים הפשוטים להגדיר והמדידות צריכה להישקל כנגד העלות של מידע מושלך Z.
הקהילה בביולוגיה של התא שמרים פיתחה ערכת כלים תכליתי עבור רשתות microtubule הדמיהKS. זה כולל מגוון רחב של חלבוני ניאון התמזגו אלפא-טובולין / Tub1 ומסומן עם סמני auxotrophic שונים. המבנים כוללים LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11, אשר משתלב ב לוקוס LEU2 כרומוזומליות, וכמה בשילובים כדי GFP ו fluorophores אחרים, אשר משתלבים ב לוקוס URA3, כולל URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16, URA3 :: CFP-TUB1 (pAFS125-CFP), ו URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. בנוסף, קבוצה של תערובות Tub1 כדי חלבוני ניאון מגוונים לאחרונה נוצרה כי שילוב היעד או לוקוס כרומוזומליות URA3 או לוקוס סמוך לוקוס TUB1 יליד 18. צבעים נרחבים זה של fluorophores וסמנים הם מאוד שימושיים עבור ניסויי שיתוף לוקליזציה עם חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי. היתוך GFP-Tub1 נשאר הכלי הטוב ביותר עבור זמן לשגות הדמיה של microtuהדינמיקה Bule בשל בהירות גדולה יותר בצילום שלה. היתוך GFP-Tub1 נוצר על ידי מילות & Lee (pSK1050) 11 מכיל שילוב של GFP אל התחנה הסופית-אמינו של α-טובולין / Tub1 ומשלבת ב לוקוס LEU2 להציל auxotrophy לאוצין. לכן, חלבון ההיתוך מתבטא ectopically בנוסף α-טובולין ילידים וכולל ~ 20% של α-טובולין הכולל בתא 9. חשוב לציין כי היתוך GFP-Tub1 לא להציל את הפונקציה של ילידי α-טובולין / Tub1 (JM, התוצאות לא פורסם). הדבר נכון גם של היתוך TUB1 אחר בונה 18.
עם הכלים הזמינים לדמיין מיקרוטובולים וחלבונים המחייבים שלהם, נבגי שמרים הוא מערכת אידיאלית ללמוד מוטציות tubulins ורגולטורי microtubule אחרים. בנוסף, המספר המוגבל של גני טובולין מאפשר לחקר הישיר של ברכת הומוגנית של טובולין מוטציה. בנוסף למוטציותגני טובולין, נבגי שמרים יש מספר החלבונים הקשורים microtubule (מפות) כי הם הומולוגיים עמיתיהם מטזואניים. מפות אלו ניתנים ללמוד ישירות, ואת ההשפעות שיש מוטציות על חוטי microtubule יחידים יכולות גם להיבחן. הפרוטוקול המפורט כאן מאפשר החקירה של שני הליכים הפנימיים וחיצוניים המשפיעים דינמיקת microtubule.
לסיכום, microtubules חייב להיות דינאמי לתפקד כראוי במהלך תהליכים תאיים רבים. יש צורך להבין את הגורמים מהותיים טובולין ואת החלבונים קשורים חיצוני המווסתים דינמיקת microtubule. ניצני שמרים היא מערכת אידיאלית כדי לחקור את ההשפעה של גורמים אלה על ידי לכימות הדינמיקה ישירות של microtubule יחיד. הפרוטוקול המפורט לעיל מתאר כיצד לשלב חלבון היתוך פלורסנט ביציבות לתוך הגנום שמרים ואיך לרכוש ולנתח תמונה confocal ערימות לכמת הדינמיקה microtubule in vivo
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים קרי בלום (אוניברסיטת צפון קרוליינה), קיונג לי (NCI), סטיבן מרקוס (קולורדו סטייט), ואת אלמר Schiebel (Universität היידלברג) על שיתוף פלסמידים FP-TUB1 שונים. אנו מודים מליסה גרדנר (אוניברסיטת מינסוטה) להכשרת אותנו בשיטת הכנה קאמרית שקופיות. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) להעניק R01GM112893-01A1 (כדי JKM) ו T32GM008730 (כדי לספירה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
