Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Summary

Knoppande jäst är en fördelaktig modell för att studera mikrotubuli dynamik in vivo på grund av dess kraftfulla genetik och enkelheten i dess mikrotubuluscytoskelettet. Följande protokoll beskriver hur man förvandlar och kultur jästceller, förvärva konfokalmikroskopi bilder och kvantitativt analysera mikrotubuli dynamik i levande jästceller.

Abstract

Dynamiska mikrotubuli är grundläggande för många cellulära processer, och noggranna mätningar av mikrotubuli dynamik kan ge insikt i hur celler reglerar dessa processer och hur genetiska mutationer slagreglering. Kvantifiering av mikrotubuli dynamik i metazoiska modeller har ett antal associerade utmaningar, inklusive en hög mikrotubuli täthet och begränsningar på genetiska manipulationer. Däremot erbjuder den spirande jästen modell fördelar som övervinner dessa utmaningar. Detta protokoll beskriver en metod för att mäta dynamiken i enstaka mikrotubuli i levande jästceller. Celler som uttrycker fluorescensmärkta tubulin följs monterade glidkamrar, vilket möjliggör stabil tidsförlopp bild förvärv. En detaljerad guide för höghastighets, är fyrdimensionell bild förvärv tillhandahålls också, såväl som ett protokoll för att kvantifiera egenskaperna hos dynamiska mikrotubuli i konfokala bildstaplar. Denna metod, i kombination med konventionella jästgenetik, provIdes ett tillvägagångssätt som är unikt lämpad för kvantitativ bedömning av effekterna av mikrotubuli regulatorer eller mutationer som förändrar aktiviteten av tubulin subenheter.

Introduction

Mikrotubuli är cytoskelettala polymerer tillverkade av ap-tubulin proteinsubenheter och används i ett stort antal olika cellulära kontexter, inklusive intracellulär transport, celldelning, morfogenes, och motilitet. Att bygga mikrotubuli nätverk för dessa olika roller, måste cellerna noggrant reglerar var och när mikrotubuli formulär. Denna reglering åstadkoms genom reglering av de reaktioner som antingen montera ap-tubulin-subenheter till mikrotubuli polymerer eller ta isär mikrotubuli till fria subenheter; detta är känt som mikrotubuli dynamik.

Ett viktigt mål för mikrotubuli fältet är att belysa de molekylära mekanismer som reglerar mikrotubuli dynamik, inklusive studier av ap-tubulin-subenheter och yttre regulatorer som binder till tubulin och / eller till mikrotubuli. En väletablerad experimentell metod är att rekonstituera detta system in vitro med användning av renat αβ-tubulin protein, ofta i comkombination med renade yttre regulatorer. Även om detta är en användbar metod, är det uppenbart att mikrotubuli dynamik i rekonstituerade system skiljer sig kraftigt från vad som observerats i levande celler. Till exempel mikrotubuli växa snabbare och krymper långsammare in vivo än in vitro. Dessa skillnader kan tillskrivas tillgängligheten av kända extrinsiska regulatorer ^1, såväl som till ännu-odefinierade faktorer i celler. Därför är det viktigt att bestämma verksamheten i mikrotubuli regulatorer och mutanter som stör dynamiken i en infödd cellulär sammanhang.

Även flercelliga modeller har visat sig vara rådande system för att undersöka mikrotubuli funktion och högre ordningens organisation, flera praktiska bekymmer allvarligt begränsar användbarheten av dessa modeller för exakt mätning av mikrotubuli dynamik. Först det stora antalet mikrotubuli, allt från tiotals till tusentals per cell, gör det svårt att tryggtspåra enskilda mikrotubuli över tiden. Många studier itu med denna utmaning genom avbildning proteiner som selektivt lokaliseras till mikrotubulus ändar, såsom proteiner i slut bindning (EB) familjen. Emellertid är dessa proteiner kända för att endast lokalisera till ändarna på växande mikrotubuli i metazoans ^2. Därför är användbarheten av dessa proteiner begränsade till direkt mätning av tillväxthastigheter, medan endast indirekt mätning av andra aspekter av dynamik, såsom frekvens av katastrof. För det andra, trots framsteg inom genomet redigering teknik skapar celler som stabilt uttrycker fluorescent märkt tubulin eller införa mutationer för att selektivt manipulera tubulin eller mikrotubuli regulatorer är fortfarande en stor utmaning. Dessutom förekomsten av många tubulin isotyper i metazoans blandar ihop studiet av hur mutationer påverkar enskilda tubulin gener.

Den spirande jästen systemet tillhandahåller flera viktiga fördelar för mätning in vivo microtubule dynamik. Jäst har en förenklad mikrotubuli nätverk som tillåter visualisering av enskilda mikrotubuli. I jäst, mikrotubuli emanerar från att organisera centra kända som kämspolepolkroppar (SPBs), som är inbäddade i kärnhöljet ^3. De SPBs tjänar som ställningar för y-tubulin små komplex som kärnor mikrotubuli ^{4, 5.} SPBs kärnor två klasser av mikrotubuli, spindel mikrotubuli och astrala mikrotubuli. Spindel mikrotubuli projekt i nukleoplasman och är viktiga för att fästa till kromosomer via kinetokoren mikrotubuli och för att stabilisera spindeln via överlappande mellanrummet mikrotubuli ^6. I kontrast, astrala mikrotubuli projektet utåt in i cytosolen och är relativt sällsynt jämfört med tätt nätverk av spindel mikrotubuli. Under mitos, pre-Anafasa celler har bara 1-2 astrala mikrotubuli som utgår från antingen SPB; sådana finns som jagndividual mikrotubuli snarare än som buntar ^7. Rollen av astrala mikrotubuli under mitos är att flytta kärnan och spindeln i övergången mellan mor och knopp fack, kända som knoppen hals. Denna rörelse medför väldefinierade vägar som genererar kraft astrala mikrotubuli, dra kärnan och spindeln mot och så småningom in i knoppen halsen ^8.

En annan fördel med jästsystemet är användbarheten av dess genetik, som kan användas för att undersöka mikrotubuli regulatorer och tubulin-subenheter med oöverträffad precision. Jäst besitter också en förenklad repertoar av tubulin isotyper: en enda β-tubulin-genen (TUB2) och två a-tubulin-gener (TUB1 och TUB3). Mutationer kan lätt införas i dessa gener och därigenom studeras i en homogen tubulin population ^{9, 10.} Det finns ett antal allmänttillgängliga konstruktioner för märkning av mikrotubuli, och dessa kan riktas för integration vid kromosom loci för stabil uttryck (se diskussion).

Det övergripande målet med denna metod är att bildenkel mikrotubuli i levande jästceller i fyra dimensioner (X, Y, Z, och T) för högupplösta mätningar av mikrotubuli dynamik. Metoder för att integrera konstruktioner för den konstitutiva, låg nivå uttryck av fluorescensmärkt tubulin i jästceller beskrivs. Före avbildning, är levande celler monterade i glidkamrar belagda med lektinet Concanavalin A för att stabilisera cellerna för långsiktig avbildning. De optimala parametrarna för bildupptagning, samt ett arbetsflöde för dataanalys, beskrivs också.

Protocol

1. Förberedelse -Leu dropout Plattor

1. Lägga 800 ml sterilt, avjoniserat vatten (DIH ₂ O) till en 2 liter kolv. Lägga 26,71 g dropout bas (DOB) pulver, 0,69 g av CSM-Leu, och 20 g agar. Blanda med en magnetisk omrörarstav. Sätta till ett L med DIH ₂ O.
2. Autoklav vid 121 ° C och 19 psi under 30 min.
3. Avlägsna kolven från autoklaven och låt den svalna till ~ 65 ° C under försiktig omröring.
4. Häll 30 ml / platta till plattor mm diameter 100. Låta dessa sitta vid rumstemperatur under 36-48 h före förvaring vid 4 ° C.

2. Integrera GFP-Tub1 för konstitutivt uttryck av GFP-märkt Tubulin

1. Koka en stamkoncentration av 10 mg / ml enkelsträngat DNA (ssDNA) under 3 min.
2. Kombinera 2 mikroliter av kokt ssDNA med 400 ng renat GFP-Tub1 plasmid-DNA ^11.
   OBS: Det finns en mängd olika plasmider som kan användas för stabil, fluorescerande märkningav mikrotubuli i jäst som utnyttjar alternativa fluoroforer och selekterbara markörer. Några av dessa alternativ beskrivs i diskussionsavsnittet.
3. Lägg DNA-blandningen till en 50 | il alikvot av kompetenta jästceller.
   OBS: Förbered kompetenta jästceller med sorbitollösning (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, och 1 M sorbitol, justerades med utspädd ättiksyra till pH 8). För en detaljerad beskrivning av att kompetenta jästceller, se ¹² referens.
4. Vortex noggrant.
5. Lägga 6x den totala volymen av polyetylenglykol (PEG) -lösning (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, och 40% PEG3350) till DNA-cellblandningen.
6. Vortex noggrant.
7. Inkubera under åtminstone 1 h vid 30 ° C under försiktig omrörning.
8. Lägga dimetylsulfoxid (DMSO) till 10% av den totala volymen och vortexa.
9. Inkubera vid 42 ° C under 15 min.
10. Centrifugera vid 2500 xg under 5 min.
2 O.
11. Platt celler på en -Leu dropout platta.
    OBS! GFP-Tub1 konstruktionen innehåller en leucin auxotrof markör, medan andra konstruktioner kan använda en alternativ markör. Bortfallet mediet bör vara specifika för auxotrofa markör för konstruktionen.
12. Låta de transformerade cellerna att växa under 3-5 dagar vid 30 ° C.
13. Re-strimma enkeltransformations kolonier på en färsk -Leu dropout plattan genom att överföra kolonier med användning av en autoklaverad tandpetare. Inkubera plattan över natten vid 30 ° C.
14. Screena visuellt varje transformant för en GFP-signal genom att suspendera cirka 1 mikroliter av celler från en enda koloni från plattan i steg 2,14 i 2 mikroliter av vatten på en ren bild. Täcka de suspenderade cellerna med ett täckglas och observera med användning av fluorescensmikroskopi.
    1. Excite transforman med 488 nm ljus och leta efter förekomst av en GFP-signal.
       

3. Växande Flytande jästkultur

1. Inokulera ~ 1 mikroliter av jästceller från en enda koloni på en platta i 3 ml av syntetiskt fullständigt medium. Tillåta cellerna att växa över natten vid 30 ° C med skakning vid 250 rpm.
2. Späd den mättade kulturen följande dag till en OD ₆₀₀ av <0,1 i mediet. Returnera den utspädda kulturen till 30 ° C skakare under 3-4 h eller tills OD ₆₀₀ är mellan 0,4 och 0,8, när cellerna är redo att laddas i kammare för avbildning.

4. Förberedelser Flow Chamber Slides

1. Skäraett ark av paraffinfilm till en bit 4 i bred och 7 i lång.
2. Placera en standardobjektglas på längden på 4 tums bredd av paraffinfilm och linda filmen kring sliden 3-4 gånger så att sliden är täckt av film som är 3-4 lager tjock. Tryck ihop lagren att se till att det är en rimlig tätning; Detta kommer att göra det lättare att skära. Undvik att trycka för hårt eller orsakar filmen att skrynklas.
3. Skära paraffinfilmen längs ytterkanterna av sliden med en ren brytkniv rakkniv. Använd en annan bild för att ge en rak kant för att skära.
4. Skala överskottsfilmen från arbetssliden och kasta. De återstående staplar av filmen kommer att täcka en yta av objektglaset och kommer att användas för att göra väggarna mellan avbildningskammare.
5. Användning av den andra sliden som en rak kant, skär de travade filmskikten längs den långa axeln av sliden till cirka tio remsor, vardera 2-4 mm i bredd.
6. Skära de staplade paraffinfilmskikten vinkelrätt motsnitten som görs i steg 4,5, längs den korta axeln av sliden, för att skapa remsor 2-4 mm i bredd, 23-24 mm i längd, och 3-4 skikten tjocka.
7. Skala de skurna remsorna med hjälp av en rakkniv i en 45 ° vinkel. Med användning av pincett, jämnt fördela de skurna filmremsor på en ren objektglas för att skapa de önskade antalet kamrar. Upp till 3 kammare (gjorda med 4 paraffin filmremsor) kan skapas på ett objektglas.
8. Placera en enda täck ovanpå remsor av film och flytta den på plats med pincett.
9. Placeras det preparerade objektglaset, täckglas upp, på en värmeplatta inställd på ~ 95 ° C (detta är approximativt låg till medelhög inställning på de flesta kokplattor). Värma sliden tills folieremsorna är genomskinliga (ca 3 min) och sedan försegla sliden och täckglas tillsammans genom att försiktigt trycka på täckglas med pincett.
   OBS: Det är viktigt att bara press på de regioner i täck som är direkt ovanför paraffin filmremsor, som skrapa regionerna ovanför cHambers kan minska bildkvaliteten. Se till att inte överhetta slide; förångad film kommer belägga insidan av kammaren med en hydrofob film som förhindrar cellerna från att fastna.
10. Använd pincett för att avlägsna sliden från kokplattan (sliden kommer att vara varm) och den åt sidan för att svalna med täckglas vänd uppåt; som glid svalnar, kommer filmen att återgå till en vit, opak färg.
    OBS: Vid denna punkt, bilderna är redo att laddas med odlade jästceller. Extra diabilder kan göras till denna punkt och lagras i en ren och torr plats under en obestämd tid.

5. Loading jästceller i förberedda flödeskammare Slides

1. Tina en frusen, 200 mikroliter alikvot av Concanavalin A (2 mg / ml i sterilt DIH ₂ O).
2. Tillsätt ungefär 100 mikroliter av den upptinade Concanavalin A till varje kammare i den preparerade objektglaset genom att pipettera in i en av de öppna ändarna. Tillsätt tillräckligt Concanavalin A för att fylla kammaren. För detta ärtep kommer Concanavalin A dras genom kammaren via kapillärverkan.
3. Hänga sliden, täckglas-ner, mellan två mikrofugrör rörställ eller pennor för fem minuter för att låta Concanavalin A för att ansluta sig till täckglas (dvs kammaren).
4. Återgå bilden till en täck-up position. Tvätta kammaren med 2x kammarvolymen (bestämd i steg 5,2, ovan; cirka 200 | il) av syntetiskt fullständigt medium för att avlägsna Concanavalin A.
   1. Strömma mediet genom kammaren, med användning av antingen hörnet av en pappershandduk eller ett filterpapper viks i halv för att dra fluid ut ur en ände av kammaren under samtidig pipettering färsk fluid i den andra. Alternativt använda en vakuumsuganordning för att noggrant dra vätska ut ur en ände medan pipettering färsk fluid i den andra.
5. Lastceller genom att strömma 2x kammarvolymen (approximativt 200 | il) av cellsuspension (från steg 3,4) med användning av riktat flöde metod beskrivs i steg 5.4.1.
   OBS: Målet är att bilden ett enda lager av celler på täckglas. Därför är det viktigt att ladda en koncentration av celler tillräckligt små för att de inte stapla ovanpå varandra, men tillräckligt stor för att tillräckligt många celler finns i området för att samla den maximala mängden data per bildtagning. Den optimala koncentrationen av celler inuti kammaren kan variera och bör bestämmas empiriskt. För att öka koncentrationen av celler i flödeskammaren, försiktigt pellecellkulturen vid 1000 xg under 2 minuter och avlägsnande av en del av supernatanten. Att minska koncentrationen av celler, tillsätt färskt syntetiskt fullständigt medium till cellsuspensionen. Koncentrationen av celler kan utvärderas efter steg 5,7 (nedan) genom att inspektera kammare på ett faskontrastmikroskop. Vid denna punkt, kan ytterligare celler tillsättas till kammaren genom att strömma i mer cellsuspension. Emellertid, vilket minskar celltätheten på denna punkt inte är möjlig och uppnås bästgenom laddning av en ny kammare med en utspädd cellsuspension.
6. Hänga glidtäckglas-ner, såsom beskrivs i steg 5,3, under 10 min för att tillåta cellerna att vidhäfta till täckglas.
7. Spola ut eventuella olimmade celler genom att strömma genom 4x kammarvolymen (ungefär 400 pl) av syntetiskt komplett medium. Detta kommer att eliminera fritt flytande celler i kammaren, vilket kan förorena bildtagning.
8. Noggrant torka varje ände av kammaren med en ren hörn av en pappershandduk, vilket menisken till kanten av täckglas.
9. Försegla varje ände av kammaren med varmt (75 ° C) tätningsmedel (t ex valap; lika delar vaselin, ull vax, och paraffinvax).
   OBS: Vid denna punkt, är redo att bilden bilden. Kamrarna kan avbildas för upp till 9 h, beroende på densiteten av celler i varje kammare. Cellerna kommer att producera koldioxid (CO ₂₎ över tiden, som gradvis kommer att skapa bubblor som förskjuter cellerna.

1. Föra sliden till ett inverterat mikroskop utrustat med en 1,45 NA 100X CFI Plan Apo objektiv, en piezoelektrisk skede, en snurrande skiva konfokala skannerenheten, en belysningslaser, och en EMCCD kamera. Bibehålla temperaturen hos det skede vid rumstemperatur (25 ° C) under förvärvet.
   OBS: Den hög numerisk öppning medger en större bildupplösning, och det piezoelektriska stadium möjliggör höghastighets z-stack förvärvet. Minimi mikroskop kraven är 100X mål belysnings laser och EMCCD kameran.
2. Ta cellerna i fokus. Se till att förvärvet fält har minst 5-6 celler klustrade tillsammans genom att söka på bild för celler grupperade.
   OBS: Även om det inte är nödvändigt att avbilda mer än en cell i taget, imaging flera celler inom samma område förbättrar effektiviteten i datainsamling utan att försämra kvaliteten av data. Det är dock viktigt att denceller är på samma fokalplan och inte staplade ovanpå varandra.
3. Programmera en flerdimensionell förvärv för att samla flera z-serier över tiden.
   1. Justera inställningarna inom de aktiva förvärvs inställningar till följande: totalt Z-djup = 6 | im, för att omfatta hela jästcell; Z-stegstorlek = 300 nm, för att maximera ljusinsamling utan översampling; total tidsvaraktighet = 10 min; tidsintervall = Z-serien var 4 s; och exponeringstid = 90 ms för varje z-planet.
      OBS: Den optimala exponeringstiden kommer att variera beroende på kameran, exciteringsljuskällan, och andra faktorer. I allmänhet, kommer den optimala exponeringstiden vara den minsta tid som krävs för att uppnå en 3: 1 förhållande av signal från GFP-märkta astrala mikrotubuli att signalera från cytoplasman baserat på pixelvärden som mäts av EMCCD.
4. Börja förvärv genom att klicka på 'Kör'. Låt den gå hela 10 min varaktighet. Spara data som en bildserien (.tiff eller .nd2).
5. Välj ett nytt fält till bilden i kammaren och upprepa steg från 6,2 till 6,4.
   OBS: En enda kammare bör ge mellan 15 och 20 fält av celler, beroende på celldensiteten inuti kammaren. Högre celltätheter kommer att ge lägre totala fält, såsom CO ₂ i kammaren kommer att bygga upp snabbare.

7. Bildanalys

1. Öppna bildfilen i ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) som en Hypers med hjälp av bio-format importör plugin.
   1. Öppen ImageJ och dra den förvärvade bildstapel från sektion 6 direkt på kontrollpanelen. BIO-format importör startar automatiskt. Välj "OK" för att ladda bildstapel som Hypers.
      OBS: "Bio-format importalternativ" prompt öppnas och se till att under "Stack Viewing" avsnittet "Visa stack med:" är inställd på "Hypers"; och "Stack Order" är inställt på "XYCZT."
2. Kollapsa varje Z-serien till en maximal intensitet, 2-dimensionell projektion med hjälp av Z-projektet funktion.
   1. Välj "Bild" menyn, "Stack" undermeny och "Z-projektet" funktionen. Välj "Största projektions" från listrutan och klicka på "OK".
3. Applicera ett medianfilter till bild stacken för att minska fläck buller genom att välja "Process" menyn, "Filter" menyn och "Median" -funktionen. Ange 2,0 pixlar i radien rutan och klicka på "OK".
4. Identifiera pre-Anafasa celler inom området.
   OBS: Dessa kännetecknas av medelstora knoppar och en kort mitotisk spindel, 1-1,5 ^ m i längd (figur 1; Pilspetsen pekar på en kort mitotisk spindel). Celler i detta skede är idealiska för att analysera mikrotubuli dynamik eftersom de vanligtvis uppvisar endast en few astrala mikrotubuli som utgår spindel polerna ^7. Astrala mikrotubuli kan identifieras som linjära filament som uppvisar en likformig GFP signalintensitet från minuspolen, på SPB, till plus änden, i cytoplasman.
5. Med början vid den första tidpunkten av bilden serien använder den segmenterade linjen verktyg för att dra en linje längs en enda astrala mikrotubuli, från minus ände, lokaliserad vid korsningen mellan den astrala mikrotubulus och mer intensivt märkta spindel mikrotubuli, till plus änden , vilket är i cytoplasman (se de röda linjer i fig 1). Dubbelklicka på slutet av mikrotubuli att slutföra den segmenterade linjen.
6. Spela mätningen i resultattabellen med "åtgärd" -funktionen genom att trycka på knappen "M" på tangentbordet.
   OBS: Ytterligare funktioner, såsom grå intensitet, kan spelas in genom att ställa in mätningarna i menyn "Analysera" och "Set Measurements" undermeny.
7. Gå vidare till nästa tidpunkt genom att antingen klicka på högerpilen i Z-reglaget eller trycka på "./>" på tangentbordet. Upprepa steg 7,5 och 7,6 för alla tidpunkter i bildsekvensen.
8. Kopiera data från resultattabellen och klistra in dem i ett kalkylprogram. Spara data genom att välja "Spara som".
   OBS: Dessa mätningar kommer att omfatta flera värden, men de viktigaste värdena är den skiva, som indikerar tidpunkt i serien, och längden, som anger längden på linjen (dvs den astrala mikrotubuli). Kolonner innehållande andra mätningar (t ex området, menar pixelvärde, vinkel, etc.) kan antingen hållas eller kasseras.
9. Skapa en ny kolumn i kalkylbladet genom att högerklicka och använda "Infoga" -funktion. Mata in tid (s) i varje tidpunkt.
10. Skapa en XY punktdiagram av mikrotubuli längd (^ m) som en funktion av tid (er) med användning av "Infoga LinjeDiagrammet" -funktionen; välja de längdmätningar som 'Y' och tiden kolonnen som 'X'
    1. Identifiera regioner av polymerisation, depolymerisation, och paus genom att leta efter positiva och negativa förändringar i längd över tid på punktdiagrammet från steg 7,10.
       OBS: Polymerisationsbetingelser händelser öka mikrotubuli längd med minst 0,5 um över en minst 3 tidpunkter och montera en linjär regression med en R ² ≥ 0,9 och en R-värde> 0 (Figur 1B och D, gröna punkter). Depolymeriseringsprodukter händelser minska mikrotubuli längd med minst 0,5 um över en minst 3 tidpunkter och montera en linjär regression med en R ² ≥ 0,9 och en R-värde <0 (Figur 1B och D, rosa punkter). Pause händelser är skilda från polymerisering och depolymerisation. Pauser definieras som nettoförändringar i mikrotubuli längd mindre än 0,5 um över en minst 3 tidpunkter;passa en linjär regression med ett R-värde mellan -0,4 och 0,4; och ha en lutning som inte är statistiskt skilt från noll, bestämt med ett F-test.
    2. Använda punktdiagram som en guide, identifiera delar av tiden då ändra längden är positiv och markera dem i en grön färg. Markera regioner när ändra längden är negativ i en rosa färg.
    3. Beräkna den linjära regressionen av varje markerade avsnittet och registrera R- och R ² -värde för varje avsnitt i kolumnerna proximala till regionerna. Klassificera varje färgad region som antingen en polymerisation händelse eller en depolymerisation händelse.
11. Beräkna polymerisationshastigheter genom att dividera nettoförändringen i längd med förändringen i tid för varje tillväxt händelse. Spela in dessa resultat i kolonnen intill de linjära regressionsvärdena från steg 7.10.3.
12. Beräkna depolymerisationen priser genom att dividera nettoförändringen i längd av förändringen i tid för varje shrinking händelse. Spela in dessa resultat i kolonnen intill de polymerisations hastighetsvärdena från steg 7,11.
13. Beräkna katastrof frekvensen genom att dividera antalet av polymerisation-to-depolymerisation övergångar genom att den totala tiden för alla tillväxthändelser ^13. Spela in dessa resultat i kolonnen intill de depolymerisering hastighetsvärdena från steg 7,12.
14. Beräkna räddnings frekvens genom att dividera antalet depolymerisering mot polymerisation övergångar genom att den totala tiden för alla krympningshändelser ^13. Spela in dessa resultat i kolonnen intill de katastrof frekvensvärdena från steg 7,13.
15. Beräkna dynamik genom att dividera summan av absolutvärdet av alla längdändringar av den totala varaktigheten för bildupptagning, som beräknades i steg 7.10.1, och multiplicera med 27,0833 att erhålla tubulin subenheter per sekund ^14. Spela in dessa resultat i kolonnen intill undsättning frekvens valUE från steg 7.14 och spara resultattabellen.
    OBS: Det är möjligt att automatisera analysprocessen beskrivs i stegen 7,10-7,15 med användning av en skräddarsydd programmet (. Estrem, et al, manuskript inlämnat). Programmet är utformat för att identifiera perioder av polymerisation och depolymerisation i mätningarna längd genom att följa parametrarna som anges ovan.

Representative Results

Mätning mikrotubuli dynamik i levande jästceller erbjuder en övertygande verktyg för att bedöma hur mutationer i gener som kodar för mikrotubuli regulatorer eller tubulin subenheter slag polymerisation och depolymeriseringsprodukter hastigheter, liksom frekvensen av övergången mellan dessa tillstånd. Figur 1 visar en tidsserie av astrala mikrotubuli dynamik i en vild-typ cell och en mutant cell med en mutation i β-tubulin (tub2- 430Δ). Mikrotubuli är märkta med GFP-märkta α-tubulin att visualisera mikrotubuli längd. De röda pilarna spåra längden på astrala mikrotubuli i varje bild (Figure1A och 1 C). Mikrotubuli längder mättes vid varje tidpunkt för 8 min och dessa sammanställda längder avbildas i livs tomter (Figur 1B och ett D). Dessa data användes för att bestämma polymerisationshastigheten, depolymerisation hastighet, polymerisation duratipå, depolymerisation varaktighet, räddnings frekvens, katastrof frekvens och dynamik.

Figur 1. Time-lapse avbildning av GFP-märkta Mikrotubuli och Mätningar av Astral mikrotubulus Dynamics. (A och C) De första fem sekventiella bilder av tidsförlopp avbildning för vildtypen och tub2 -430Δ mutantceller. Mikrotubuli är märkta med GFP-Tub1 och avbildas i pre-anafas av cellcykeln. Varje bild är en maximal intensitet projektion av en konfokala Z-serien. Scale bars: 1 ^ M. Tidsstämplar visar den totala tiden vid varje ram förvärvet. De röda pilarna följa med den totala längden av en astral mikrotubulus, med pilspetsar som betecknar de plus ändar. (B och D) mikrotubuli livs tomter visar längderna av enkel astrala mikrotubuli över tiden. Den gröna punktens betecknar polymerisation och de rosa punkter betecknar depolymerisation. Pilarna pekar på katastrofhändelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1 visar förändrade mikrotubuli dynamiken mellan en vildtypsstam och en mutantstam som saknar de 27 aminosyrorna av β-tubulin på C-terminalen, en mutant som tidigare visade sig ha mer stabila mikrotubuli ^15. Som det visas i de mikrotubuli livs tomter, är mikrotubulus i tub2 -430Δ mutanten längre och uppvisar färre katastrofer än vildtyps-mikrotubulus (figur 1B och D pilspetsar; Tabell 1). Dessutom är de polymerisationsförfaranden och depolymeriseringsprodukter priser, bestämdes från sluttningarna av de stigande och fallande mikrotubuli Lengths, minskas i mutanten jämfört med vildtypen (Figur 1B och 1D; tabell 1). Slutligen, mikrotubuli i tub2 -430Δ mutantcellen spenderar mer tid i tillstånd av polymerisation och depolymerisation och har minskat dynamik jämfört med vildtypen (Tabell 1).

Anstränga	Dynamik (subenheter / s)	Polymerisationsgraden (^ m / min)	% Tid i Polymerisation	Depolym hastighet (^ m / min)	% Tid i Depoly- merization	% Tid i Paus	Räddnings frekvens (händelser / min)	Katastrof frekvens (events / min)
Vildtyp n = 1	54	1,8 ± 0,5	48	3,0 ± 0,3	29	3	1,8	1,4
tub2-430Δ n = 1	40	1,4 ± 0,1	41	1,5 ± 0,2	32	0	0,8	0,7
Förkortningar är enligt följande: ^ m, micron; min, minut; s, andra; n, singel mikrotubulus analyseras från mikrotubuli liv plot (Fig1B, D). Värdena är medelvärden ± standardfel av medelvärdet.

Tabell 1: mikrotubulus Dynamics Mätningar för celler i figur 1. Värdena är medelvärdet ± standardfelet av medelvärdet från mätningar av de enskilda mikrotubuli som visas i figur 1.

Discussion

Den spirande jäst modellen erbjuder stora fördelar för att samla högupplösta mätningar av mikrotubuli dynamik i en in vivo miljö, inklusive möjligheten att avbilda enskilda mikrotubuli över tid och möjlighet att manipulera tubulins och mikrotubuli regulatorer med hjälp av verktygen i jäst genetik.

De Concanavalin A-belagda kamrar ger ett antal fördelar jämfört med tidigare beskrivna anordningarna, inklusive smält agar dynor. Glider med kamrarna kan vara pre-made och lagras lång sikt eller kan användas omedelbart. Dessutom är Concanavalin A-belagda kamrarna är i stånd att odla jästceller för> 6 h i samma medium i vilket cellerna ursprungligen odlades. Det är viktigt att notera att antalet celler i kammaren kommer att diktera hur länge kammaren kan avbildas. De belagda kamrarna säkerställa att endast ett enda skikt av jästceller vidhäftar täckglas. Slutligen, skapa flera kammare möjliggörflera olika jäststammar som skall avbildas på samma glas.

Det finns stora utmaningar för avbildning mikrotubuli dynamik i knoppande jäst, innefattande relativt låga signalnivåer och den mycket dynamiska naturen hos processen. Widefield mikroskop är tillräckliga för att fånga en enda tidpunkt bilder av märkta mikrotubuli. Men orsakar widefield mikroskopi snabbare fotoblekning på grund av längre exponeringstider och bombardemang av provet med out-of-fokus ljus. Likaså laserskanning konfokala mikroskop är otillräckliga på grund av snabbare fotoblekning. Spinning disk konfokalmikroskopi är unikt lämpad för avbildning mikrotubuli dynamik i spirande jäst. Den snurrande skiva konfokalmikroskop system som används här har utformats med dessa krav i åtanke.

Mikroskopet systemet måste utformas för hög hastighet och hög känslighet. Även om en mångfald mikroskopsystem kan vara lämpligt, flera komponenter är väsentliga. En 100Xobjektiv med en hög numerisk apertur (1.45NA) är nödvändigt för att lösa enskilda mikrotubuli och längdändringar i storleksordningen 100 nm. En roterande skiva konfokala scanner är nödvändigt för att minimera fotoblekning och toxicitet, genom att blockera out-of-fokus ljus, och för att maximera upplösning och känslighet, genom att samla endast i fokus ljus. Den EMCCD kamera måste vara snabb och känslig att samla in tillräckligt GFP-Tub1 signal under varje 90-ms av time-lapse förvärv. För närvarande EMCCD kameror är det bästa valet för denna applikation. Aktuella CMOS sensor kameror saknar känsligheten av high-end EMCCDs; dock denna teknik förbättras avsevärt och kan snart vara lämpliga. Slutligen behövs en piezoelektrisk scen för snabb och exakt rörelse i Z, som kan vara det hastighetsbegränsande steget i fyrdimensionell bild förvärv.

Det specifika mikroskopsystem beskrivs i detta protokoll kan utgöra ett hinder om liknande utrustning är inte lätt tillgänglig. ombyggnader cen göras för att tillgodose olika bildsystem, men dessa modifieringar kan ske på bekostnad av tidsmässiga och / eller rymdupplösning. En spindel driven stegsmotor kan användas i stället för den piezoelektriska steget. Men dessa motorer är långsammare, mindre exakt, och benägna att driva. Efter förvärvet bildstabiliserande plugin-program kan användas för att minimera avdrift i XY dimensioner associerade med dessa motordrivna stadier. Dessutom kan alternativa kameror med långsammare avläsningshastigheter användas. För att rymma en långsammare upptagningshastighet, kunde Z-serien samlas mindre ofta (dvs mer tid mellan Z-serien). Att öka tiden mellan Z-serien riskerar saknas övergångar som kan uppstå mellan tidpunkter. Alternativt kan avståndet mellan Z-plan ökas som ett sätt att minska antalet bilder som samlas per Z-serien. Att öka detta avstånd riskerar att förlora bildinformation mellan plan, vilket försämrar försöks förmåga att accurbart identifiera mikrotubuli ändar. Uppenbarligen kan förändringar göras för att tillgodose alternativa bildsystem, men dessa förändringar måste vägas mot den potentiella förlusten av bildinformation.

En annan begränsning hos detta protokoll är förlusten av rumslig information när tredimensionella bild stackar omvandlas till tvådimensionella bildprojektioner. En individuell astrala mikrotubuli i en pre-anafas jästcell är typiskt mellan 0,5 och 2,0 | im i längd och projekt över den tredimensionella rymden av cytoplasman. Det är därför viktigt att förvärva bilder från en serie av Z-positioner för att samla in all geografisk information om en enskild mikrotubuli. I en time-lapse förvärv, kan detta ge en komplex datauppsättning, med 20 Z-segment vid var och en av de 150 tidpunkter, för totalt 3000 bilder. För att ta itu med denna utmaning och att förenkla bildanalysen är geografisk information av Z-stackar komprimeras under analysen. Även om detta benefsin analys kommer det på bekostnad av rumslig information från Z-dimension. Hur mycket information går förlorad när Z-dimensionen komprimeras? För att uppskatta denna förlust, utfördes experiment för att mäta avståndet mellan SPBs i förut anafas celler, som är relativt lätt att mäta på grund Spc110-GFP-märkta SPBs uppvisar sfärisk foci med högt signal-till-brusförhållanden. Även om spindeln kan uppvisa annorlunda förskjutning i Z än astrala mikrotubuli, är medellängden lika (~ 1,5 ^ m) och därför ger en användbar proxy. Spindel längder, i genomsnitt, 15% längre vid mätning i fullt tredimensionella bildstaplar än när samma spindlarna mäts i tvådimensionella projektioner (JM, opublicerade resultat). Därför bör nyttan av de förenklade datamängden och mätningar vägas mot kostnaden för kasserade Z information.

Jäst cellbiologi samfundet har utvecklat en mångsidig verktygslåda för avbildning mikrotubuli nätverks. Detta inkluderar en mängd olika fluorescerande proteiner fuserade till a-tubulin / Tub1 och märkta med olika auxotrofa markörer. Dessa konstruktioner innefattar LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) ^11, som integrerar vid det kromosomala LEU2 lokus, och flera fusioner till GFP och andra fluoroforer, som integrerar vid URA3-locus, inklusive URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) ^16, URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125-GFP), och URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) ^17. Dessutom har en uppsättning av Tub1 fusioner till olika fluorescerande proteiner nyligen skapats som mål-integration till antingen den kromosomala URA3-locus eller till ett lokus intill den nativa TUB1 locus ^18. Denna omfattande palett av fluoroforer och markörer är mycket användbart för sam-lokalisering experiment med differentiellt märkta proteinerna. GFP-Tub1 fusion är det bästa verktyget för time-lapse avbildning av microtuBule dynamik på grund av dess ljusstyrka och fotostabilitet. GFP-Tub1 fusion skapades av Song & Lee (pSK1050) ¹¹ innehåller en fusion av GFP till aminoänden hos α-tubulin / Tub1 och integrerar vid LEU2-lokus för att rädda leucin-auxotrofi. Således är fusionsproteinet uttrycks ektopiskt förutom nativ α-tubulin och omfattar ~ 20% av den totala α-tubulin i cellen ^9. Viktigt är GFP-Tub1 fusion inte rädda funktionen hos nativa α-tubulin / Tub1 (JM, opublicerade resultat). Detta gäller även för andra TUB1 fusion konstruerar ^18.

Med de tillgängliga verktygen för att visualisera mikrotubuli och deras bindande proteiner, spirande jäst är ett idealiskt system för att studera mutationer i tubulins och andra mikrotubuli tillsynsmyndigheter. Dessutom det begränsade antalet tubulin gener möjliggör direkt studie av en homogen pool av mutant tubulin. Utöver mutationer itubulin-gener, knoppande jäst har ett antal mikrotubulusassocierade proteiner (MAP) som är homologa med metazoiska motsvarigheter. Dessa kartor kan studeras direkt och effekterna att mutationer har på enskilda mikrotubuli trådar kan också undersökas. Protokollet beskrivs här möjliggör för undersökning av både inre och yttre processer som påverkar mikrotubuli dynamik.

Sammanfattningsvis måste mikrotubuli vara dynamisk för att fungera under många cellulära processer. Det är nödvändigt att förstå de faktorer inneboende till tubulin och yttre associerade proteiner som reglerar mikrotubuli dynamik. Knoppande jäst är ett idealiskt system för att studera effekten av dessa faktorer genom att direkt kvantifiera dynamiken i en enda mikrotubuli. Det protokoll som beskrivs ovan beskriver hur man stabilt integrera ett fluorescerande fusionsprotein i jästgenomet och hur att förvärva och analysera konfokal bild stackar att kvantifiera mikrotubuli dynamik in vivo

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)