Summary
Knopskydende gær er et fordelagtigt model til undersøgelse mikrotubulusdynamik in vivo på grund af sin stærke genetik og dens enkle mikrotubuluscytoskelettet. Den følgende protokol beskriver, hvordan man omdanne og kultur gærceller, erhverve konfokal mikroskopi billeder, og kvantitativt analysere mikrotubulusdynamik i levende gærceller.
Abstract
Dynamiske mikrotubuli er fundamentale for mange cellulære processer, og nøjagtige målinger af mikrotubulusdynamik kan give indsigt i, hvordan celler regulerer disse processer og hvordan genetiske mutationer indvirkning regulering. Kvantificeringen af mikrotubulusdynamik i metazoiske modeller har en række tilknyttede udfordringer, herunder en høj mikrotubulus tæthed og begrænsninger i genetiske manipulationer. I modsætning hertil spirende gærmodel giver fordele, der kan overvinde disse udfordringer. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at måle dynamikken i enkelte mikrotubuli i levende gærceller. Celler, der udtrykker fluorescensmærkede tubulin overholdes samles gliderkamre, hvilket muliggør stabil time-lapse billede erhvervelse. En detaljeret guide til højhastighedstog, er fire-dimensionelle billede erhvervelse også tilvejebragt, samt en protokol til kvantificering egenskaberne af dynamiske mikrotubuli i konfokale billedstakke. Denne fremgangsmåde kombineret med konventionelle gærgenetik, provIdes en tilgang, der er unikt egnet til kvantitativ vurdering af virkningerne af mikrotubuli regulatorer eller mutationer, der ændrer aktiviteten af tubulin underenheder.
Introduction
Mikrotubuli er cytoskelet polymerer fremstillet af ap-tubulin proteinunderenheder og anvendes i en lang række af cellulære sammenhænge, herunder intracellulær transport, celledeling, morfogenese, og motilitet. At opbygge mikrotubuli netværk til disse forskellige roller, skal cellerne omhyggeligt regulerer, hvor og hvornår mikrotubuli formular. Denne regulering opnås ved styring af reaktioner, som enten samle ap-tubulin underenheder i mikrotubuli polymerer eller adskille mikrotubuli til frie underenheder; dette er kendt som mikrotubulusdynamik.
Et vigtigt mål for mikrotubulus felt er at belyse de molekylære mekanismer, der regulerer mikrotubulusdynamik, herunder undersøgelser af ap-tubulin underenheder og ydre regulatorer, der binder til tubulin og / eller til mikrotubuli. En veletableret eksperimentelle fremgangsmåde er at rekonstituere dette system in vitro ved anvendelse af oprenset αβ-tubulin protein, ofte i comkombination med oprensede ydre regulatorer. Selv om dette er en nyttig fremgangsmåde, er det klart, at mikrotubulusdynamik i rekonstruerede systemer afviger kraftigt fra den, der observeres i levende celler. For eksempel mikrotubuli vokser hurtigere og krymper langsommere in vivo end in vitro. Disse forskelle kan tilskrives tilgængeligheden af kendte ydre regulatorer 1, samt endnu-udefinerede faktorer i celler. Derfor er det kritisk at bestemme aktiviteter mikrotubuli regulatorer og mutanter, der forstyrrer dynamik i en nativ cellulær sammenhæng.
Selvom metazo modeller har vist sig at være de fremherskende systemer til undersøgelse mikrotubulusfunktion og højere ordens organisation, adskillige praktiske betænkeligheder alvorligt begrænse anvendeligheden af disse modeller til præcis måling af mikrotubulusdynamik. Først det store antal af mikrotubuli, der spænder fra snesevis til tusindvis per celle, gør det vanskeligt at trygtspore individuelle mikrotubuli over tid. Mange undersøgelser tage denne udfordring af imaging proteiner, der selektivt lokaliserer til mikrotubuli ender, såsom proteiner i slutningen-binding (EB) familie. Imidlertid er disse proteiner vides at kun lokalisere til enderne af voksende mikrotubuli i metazoans 2. Derfor er anvendeligheden af disse proteiner begrænset til direkte måling vækstrater, mens kun indirekte måling af andre aspekter af dynamik, som hyppigheden af katastrofe. For det andet, på trods af fremskridt i genom redigering teknologi, skabe celler, der stabilt udtrykker fluorescerende mærket tubulin eller indfører mutationer til selektivt manipulere tubulin eller mikrotubuli regulatorer er fortsat en stor udfordring. Desuden er tilstedeværelsen af mange tubulin isotyper i metazoans forvirrer studiet af hvordan mutationer påvirke individuelle tubulingener.
Den knopskydende gær system giver flere vigtige fordele til måling in vivo microtubule dynamik. Gær har en forenklet mikrotubuli netværk, der tillader visualisering af individuelle mikrotubuli. I gær mikrotubuli hidrører fra tilrettelæggelse centre kendt som spindelpol organer (SPBs), der er indlejret i kernekappen 3. De SPBs tjene som scaffolds for y-tubulin små komplekser, der nucleate mikrotubuli 4, 5. SPBs kim to klasser af mikrotubuli, spindel mikrotubuli og astrale mikrotubuli. Spindel mikrotubuli rager ind nukleoplasmaet og er vigtige for fastgørelse til kromosomer via kinetochoren mikrotubuli og til stabilisering af spindlen via overlappende interpolar mikrotubuli 6. I modsætning hertil er astrale mikrotubuli projekt udad ind i cytosolen og relativt sjældne i forhold til det tætte net af spindel mikrotubuli. Under mitose, præ-anafase celler har kun 1-2 astrale mikrotubuli udgår fra enten SPB; disse findes som jegndividual mikrotubuli snarere end som bundter 7. Rollen af astrale mikrotubuler under mitose er at bevæge kernen og spindlen ind i overgangen mellem mor og bud rum, kendt som knop hals. Denne bevægelse involverer veldefinerede veje, der genererer kraft på astrale mikrotubuler, trækker kernen og spindlen hen imod og til sidst ind i knop hals 8.
En anden fordel ved gær-systemet er nytten af sine genetik, som kan bruges til at undersøge mikrotubuli regulatorer og tubulin underenheder med uovertruffen præcision. Gær også besidder en forenklet repertoire af tubulin isotyper: en enkelt β-tubulin-genet (TUB2) og to a-tubulin-gener (TUB1 og TUB3). Mutationer kan let indføres i disse gener og derved undersøgt i en homogen tubulin population 9, 10. Der er en række af vidttilgængelige konstruktioner til mærkning mikrotubuli, og disse kan målrettes til integration ved kromosomale loci til stabil ekspression (se Diskussion).
Det overordnede mål med denne metode er at billeddata enkelt mikrotubuli i levende gærceller i fire dimensioner (X, Y, Z, og T) til høj opløsning målinger af mikrotubulusdynamik. Metoder til integrering konstrukter for den konstitutive, lavt niveau ekspression af fluorescensmærket tubulin i gærceller er beskrevet. Før billeddannelse, er levende celler monteret i gliderkamre coatet med lectin Concanavalin A at stabilisere cellerne for langsigtet billeddannelse. De optimale parametre for erhvervelse billede, samt et workflow til dataanalyse, er også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse -Leu Dropout Plader
- Tilføj 800 ml sterilt, deioniseret vand (DIH 2 O) til en 2 liters kolbe. Tilføje 26.71 g dropout base (DOB) pulver, 0,69 g CSM-Leu, og 20 g agar. Bland med en magnetisk omrører. Bring til 1 liter med DIH 2 O.
- Autoklav ved 121 ° C og 19 psi i 30 minutter.
- Fjern kolben fra autoklaven og lad den afkøle til ~ 65 ° C under forsigtig omrøring.
- Hæld 30 ml / plade i plader 100 mm diameter. Lad disse stå ved stuetemperatur i 36-48 timer før opbevaring ved 4 ° C.
2. Integration GFP-Tub1 for konstitutiv ekspression af GFP-mærket tubulin
- Koge en bestand koncentration på 10 mg / ml enkeltstrenget DNA (ssDNA) i 3 minutter.
- Kombiner 2 pi kogt ssDNA med 400 ng renset GFP-Tub1 plasmid-DNA 11.
BEMÆRK: Der er en række plasmider, som kan anvendes til den stabile, fluorescensmærkningaf mikrotubuli i gær, der udnytter alternative fluoroforer og selekterbare markører. Nogle af disse alternativer er beskrevet i Diskussion sektion. - Tilføje DNA-blandingen til en 50 pi alikvot af kompetente gærceller.
BEMÆRK: Forbered kompetente gærceller med sorbitolopløsning (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA pH 8, og 1 M sorbitol, justeret med fortyndet eddikesyre til pH 8). For en detaljeret beskrivelse af at gøre kompetente gærceller, se reference 12. - Vortex grundigt.
- Tilføj 6x det totale volumen af polyethylenglycol (PEG) opløsning (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, og 40% PEG3350) til DNA-celleblandingen den.
- Vortex grundigt.
- Der inkuberes i mindst 1 time ved 30 ° C med forsigtig omrøring.
- Tilføj dimethylsulfoxid (DMSO) til 10% af det samlede volumen og vortex.
- Inkuber ved 42 ° C i 15 min.
- Centrifugere ved 2500 xg i 5 min.
- Plate celler på en Leu dropout plade.
BEMÆRK: GFP-Tub1 konstruktionen indeholder en leucin auxotrof markør, mens andre konstruktioner kunne benytte en alternativ markør. Dropout medium bør være specifikke for den auxotrofe markør af konstruktionen. - Tillad de transformerede celler til at vokse i 3-5 dage ved 30 ° C.
- Re-streak enkelt transformation kolonier på en frisk Leu frafald plade ved at overføre kolonier under anvendelse af en autoklaveret tandstikker. Inkuber pladen natten over ved 30 ° C.
- Screene visuelt hver transformant til et GFP signal ved at suspendere ca. 1 pi af celler fra en enkelt koloni fra pladen i trin 2.14 i 2 pi vand på et rent objektglas. Dække de suspenderede celler med et dækglas og observere ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
- Excite transformanterne med 488 nm lys og se efter tilstedeværelsen af et GFP-signal.
- Excite transformanterne med 488 nm lys og se efter tilstedeværelsen af et GFP-signal.
3. Voksende flydende gær Kultur
- Pode ~ 1 pi af gærceller fra en enkelt koloni på en plade i 3 ml syntetisk komplet medium. Lade cellerne vokse natten over ved 30 ° C med rystning ved 250 rpm.
- Fortynd den mættede kultur den følgende dag til en OD 600 på <0,1 i mediet. Returnere den fortyndede kultur til 30 ° C rysteapparat i 3-4 timer eller indtil OD600 er mellem 0,4 og 0,8, når cellerne er klar til at blive fyldt i kamre til billeddannelse.
4. Forberedelse Flow Chamber Slides
- Skæreet ark af paraffin film i et stykke 4 i bred og 7 i lang.
- Placer en standard mikroskopobjektglas langs på 4 inch bredde af paraffin film og wrap film omkring slæden 3-4 gange, således at slæden er dækket i film, der er 3-4 lag tykt. Trykke lagene sammen at der er en rimelig forsegling; dette vil gøre det nemmere at skære. Undgå at trykke for hårdt eller forårsager filmen til rynke.
- Skær paraffin filmen langs de udvendige kanter af dias ved hjælp af en ren kasse kutter barbermaskine. Brug en anden dias til at give en lige kant til at skære.
- Skræl den overskydende film off arbejdsslæden og kasseres. De resterende stabler af film vil dække en flade af glideren og vil blive anvendt til at gøre væggene mellem billeddannende kamre.
- Anvendelse af den anden slæde som en lige kant, skæres de stakkede filmlag langs den lange akse af slæden i ca. ti strimler, hver 2-4 mm i bredde.
- Skær de stakkede paraffin folielagene vinkelret pånedskæringer i trin 4.5, langs den korte akse af slæden, for at skabe strimler 2-4 mm i bredden, 23-24 mm langt og 3-4 lag tykke.
- Skræl afskårne strimler under anvendelse af en barbermaskine i en 45 ° vinkel. Med pincet, fordeler de afskårne filmstrimler på et rent mikroskopobjektglas for at skabe de ønskede antal kamre. Op til 3 kamre (fremstillet med 4 paraffin filmstrimler) kan oprettes på et objektglas.
- Placer et enkelt dækglas oven på filmstrimler og flytte den på plads med pincet.
- Placer den forberedte dias, dækglas op, på en varmeplade indstillet til ~ 95 ° C (dette er omtrent den lave medium indstilling på de fleste kogeplader). Varm slæden indtil foliestrimlerne er gennemsigtige (ca. 3 min) og derefter forsegle objektglasset og dækglasset sammen ved forsigtigt at trykke på dækglasset med en pincet.
BEMÆRK: Det er vigtigt at kun trykke på regionerne i dækglasset, der er direkte over paraffin filmstrimler, som skrabe regionerne over cHambers kan mindske billedkvaliteten. Pas på ikke at overophede slide; fordampet film vil belægge indersiden af kammeret med en hydrofob film, der forhindrer cellerne i at klæbe. - Brug pincet til at fjerne objektglasset fra varmepladen (slæden bliver varmt), og sæt den til side til afkøling med dækglas opad; som slæden køler, vil filmen tilbage til en hvid, uigennemsigtig farve.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, dias er klar til at blive lastet med dyrkede gærceller. Ekstra dias kan foretages til dette punkt, og opbevares på et rent og tørt sted på ubestemt tid.
5. Loading gærceller i forberedt Flow Chamber Slides
- Tø en frossen, 200 pi alikvot af Concanavalin A (2 mg / ml i sterilt DIH H2O).
- Tilsæt ca. 100 pi optøet Concanavalin A til hvert kammer af den fremstillede objektglas ved pipettering i en af de åbne ender. Tilføj nok Concanavalin A at fylde kammeret. Til dette stoe vil Concanavalin A trækkes gennem kammeret via kapillærvirkning.
- Hænge slide, dækglasset-down, mellem to mikrofuge rør stativer eller folde til 5 minutter for at tillade den Concanavalin A til at klæbe til dækglasset (dvs. kammeret).
- Retur dias til et dækglas-up position. Vask kammeret med 2x kammeret volumen (bestemt i trin 5.2, ovenfor; ca. 200 pi) af syntetisk komplet medium til fjernelse af Concanavalin A.
- Flow mediet gennem kammeret, enten ved hjælp hjørnet af et papirhåndklæde eller et filtrerpapir foldes på midten at trække fluid ud af den ene ende af kammeret samtidig pipettering frisk væske i den anden. Alternativt bruge et vakuum aspirator til omhyggeligt trække fluid ud af den ene ende, mens pipettering frisk væske i den anden.
- Vejeceller ved at strømme 2x kammeret volumen (ca. 200 pi) cellesuspension (fra trin 3.4) under anvendelse af strømning method beskrevet i trin 5.4.1.
BEMÆRK: Målet er at billedet et enkelt lag af celler på dækglasset. Derfor er det vigtigt at indlæse en koncentration af celler, der er små nok, at de ikke hober sig oven på hinanden, men store nok til, at et tilstrækkeligt celler er til stede i området for at indsamle den maksimale mængde data pr billedoptagelse. Den optimale koncentration af celler i kammeret, kan variere og bør bestemmes empirisk. At forøge koncentrationen af celler i strømningskammeret, forsigtigt pelletere cellekulturen ved 1.000 xg i 2 min og fjerne noget af supernatanten. At mindske koncentrationen af celler, tilsættes frisk syntetisk komplet medium til cellesuspensionen. Koncentrationen af celler kan vurderes efter trin 5.7 (nedenfor) ved at inspicere kammeret på et fasekontrastmikroskop. På dette tidspunkt, kan yderligere celler tilsættes til kammeret ved at strømme i mere cellesuspension. Men reducerer celle tæthed på dette tidspunkt ikke er muligt og bedst opnåsved at indlæse en ny kammer med en fortyndet cellesuspension. - Hænge slide dækglasset-down, som beskrevet i trin 5.3, i 10 minutter for at tillade cellerne at klæbe til dækglasset.
- Skylle eventuelle klæbet celler ved at strømme gennem 4x kammeret volumen (ca. 400 pi) af syntetisk komplet medium. Dette vil fjerne frit flydende celler i kammeret, som kan forurene billedoptagelse.
- tørre omhyggeligt hver ende af kammeret med en ren hjørne af en papirserviet, bringer menisken til kanten af dækglasset.
- Forsegle hver ende af kammeret med varmt (75 ° C) tætningsmiddel (fx VALAP; lige dele vaseline, uldvoks, og paraffinvoks).
BEMÆRK: På dette tidspunkt, det dias er klar til billedet. Kamrene kan afbildes i op til 9 timer, afhængigt af densiteten af celler i hver kammer. Cellerne vil producere kuldioxid (CO 2) over tid, som gradvist vil skabe bobler, der fortrænger cellerne.
- Bringe objektglasset til et omvendt mikroskop forsynet med et 1,45 NA 100X CFI Plan Apo mål, en piezoelektrisk stadium en roterende skive konfokal skanner enhed, en belysning laser, og en EMCCD kamera. Holde temperaturen af scenen ved stuetemperatur (25 ° C) under indsamling.
BEMÆRK: høj numerisk blænde giver mulighed for en større billedopløsning, og den piezoelektriske fase giver høj hastighed z-stak erhvervelse. Den mindste mikroskop krav er de 100X mål, belysningen laser, og EMCCD kamera. - Bring cellerne i fokus. Sørg for, at erhvervelsen felt har mindst 5-6 celler grupperet sammen ved at søge på dias for celler, der er grupperet.
BEMÆRK: Selvom det ikke er nødvendigt at billedet mere end én celle ad gangen, imaging flere celler i samme område forbedrer effektiviteten af datafangst uden at forringe kvaliteten af data. Det er imidlertid afgørende, at denceller er på samme fokale plan og ikke stablet oven på hinanden. - Programmere en multidimensional erhvervelse til at indsamle flere z-serie over tid.
- Justere indstillingerne i de aktive indstillinger erhvervelse til følgende: total Z-dybde = 6 um, til at omfatte hele gærcelle; Z-trinstørrelse = 300 nm, for at maksimere lysindsamlingen uden oversampling; tidsvarighed total = 10 min; tidsintervaller = Z-serie hver 4 s; og eksponeringstid = 90 ms for hver z-planet.
BEMÆRK: Den optimale eksponeringstid vil variere afhængigt af kameraet, excitationslyskilden, og andre faktorer. I almindelighed vil den optimale eksponeringstid være den minimale tid til at opnå en 3: 1 forhold mellem signal fra GFP-mærket astrale mikrotubuli at signalere fra cytoplasmaet baseret på pixelværdier målt ved EMCCD.
- Justere indstillingerne i de aktive indstillinger erhvervelse til følgende: total Z-dybde = 6 um, til at omfatte hele gærcelle; Z-trinstørrelse = 300 nm, for at maksimere lysindsamlingen uden oversampling; tidsvarighed total = 10 min; tidsintervaller = Z-serie hver 4 s; og eksponeringstid = 90 ms for hver z-planet.
- Begynd købet ved at klikke på 'Kør'. Lad det køre for den fulde 10 min varighed. Gem dataene som et billedeserien (.tiff eller .nd2).
- Vælg et nyt felt til billedet i kammeret, og gentag trin 6,2-6,4.
BEMÆRK: En enkelt kammer bør give mellem 15 og 20 områder af celler, afhængigt af celletætheden i kammeret. Højere celletætheder vil give lavere samlede felter, som CO2 i kammeret vil opbygge hurtigere.
7. Billedanalyse
- Åbn billedfilen i ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) som en hyperstack ved hjælp af bio-formater importør plugin.
- Åbn ImageJ og træk den erhvervede billedstak fra afsnit 6 direkte på kontrolpanelet. Den bio-formater importør starter automatisk. Vælg "Ok" for at indlæse stak billedet som en hyperstack.
BEMÆRK: "Bio-formater Import Options" prompt åbner og sikre, at i henhold til "Stack Viewing" sektionen, "Vis stak med:" er indstillet til "Hyperstack"; og "Stack Order:" er indstillet til "XYCZT."
- Åbn ImageJ og træk den erhvervede billedstak fra afsnit 6 direkte på kontrolpanelet. Den bio-formater importør starter automatisk. Vælg "Ok" for at indlæse stak billedet som en hyperstack.
- Kollapse hvert Z-serie i højst intensitet, 2-dimensional projektion anvendelse funktion Z-projektet.
- Vælg "Image" menuen, "Stack" undermenuen, og "Z-projekt" funktion. Vælg "Maksimal projektion" fra drop-down listen og klik på "OK."
- Påfør en median filter til stakken billedet for at reducere speckling støj ved at vælge "processen" i menuen, de "filtre" undermenuen, og "Median" funktionen. Indtast 2,0 pixels ind i radius, og klik "OK".
- Identificere præ-anafase celler i marken.
BEMÆRK: Disse er kendetegnet ved mellemstore knopper og en kort mitotisk spindel, 1-1,5 um i længde (figur 1, hvoraf det pilespids peger på en kort mitotisk spindel). Celler på dette stadie er ideelle til analyse mikrotubulusdynamik fordi de udviser typisk kun en few astrale mikrotubuler udgår spindlen poler 7. Astrale mikrotubuli kan identificeres som lineære filamenter, der udviser en ensartet GFP signalintensitet fra minus ende, på SPB, til plus ende, i cytoplasmaet. - Fra den første tidspunkterne af billedet serien, skal du bruge den segmenterede linie til at tegne en linje langs en enkelt astrale mikrotubuli, fra minus ende, som ligger ved krydset mellem det astrale mikrotubuli og mere intenst mærkede spindel mikrotubuli, til plus ende , som er i cytoplasmaet (se de røde linier i figur 1). Dobbeltklik på enden af mikrotubuli til at fuldføre den segmenterede linie.
- Optag målingen i resultattabellen ved hjælp af "foranstaltning" funktionen ved at trykke på knappen "M" på tastaturet.
BEMÆRK: Yderligere funktioner, såsom grå intensitet, kan optages ved at sætte målingerne i "Analyser" menuen og "Set Målinger" undermenuen. - Gå videre til næste tidspunkterne ved enten at klikke på pilen til højre i Z-skyderen eller trykke på "./>" tasten på tastaturet. Gentage trin 7.5 og 7.6 for alle tidspunkter i billedsekvensen.
- Kopier data fra resultattabellen og indsætte dem i et regneark. Gem dataene ved at vælge "Gem som".
BEMÆRK: Disse målinger vil omfatte flere værdier, men de vigtigste værdier er den skive, der angiver tidspunkterne i serien, og længden, hvilket indikerer længden af linien (dvs. den astrale mikrotubuli). Søjler, der indeholder andre målinger (for eksempel området, betyder pixelværdi, vinkel, etc.) kan enten holdes eller kasseres. - Opret en ny kolonne i regnearket ved at højreklikke og bruge "Indsæt" funktion. Input tiden (s) af hvert tidspunkt.
- Skabe et XY scatter plot af mikrotubulus længde (um) som funktion af tid (s) under anvendelse af "Indsæt LinjeDiagram" funktion; vælge længde målinger som 'Y' og den tid søjle som 'X'
- Identificere regioner af polymerisation, depolymerisering, og pause ved at lede efter positive og negative ændringer i længde over tid på punktgrafen fra trin 7,10.
BEMÆRK: Polymerisations- begivenheder øge mikrotubulus længde med mindst 0,5 um over mindst 3 tidspunkter og passer til en lineær regression med en R2 ≥ 0,9 og en R-værdi> 0 (figur 1B og D, grønne prikker). Depolymeriseringsprodukter begivenheder falde mikrotubulus længde med mindst 0,5 um over mindst 3 tidspunkter og passer til en lineær regression med en R2 ≥ 0,9 og en R-værdi på <0 (figur 1B og D, lyserøde point). Pause begivenheder er adskilt fra polymerisering og depolymerisering. Pauser defineres som nettoændringer i mikrotubulus længde på mindre end 0,5 um over mindst 3 tidspunkter;passe en lineær regression med en R-værdi mellem -0,4 og 0,4; og har en hældning, der ikke er statistisk forskellig fra nul, som bestemt ved en F-test. - Brug af scatter plot som en guide, identificere de dele af tiden, når længden forandring er positiv og fremhæve dem i en grøn farve. Fremhæv områder af tid, når længden forandring er negativ i en lyserød farve.
- Beregne den lineære regression af hver fremhævet afsnit og notere R- og R2-værdi for hver sektion i kolonnerne proximalt til regionerne. Klassificere hver farvet region som enten en polymerisationsinitiator begivenhed eller en depolymerisation begivenhed.
- Identificere regioner af polymerisation, depolymerisering, og pause ved at lede efter positive og negative ændringer i længde over tid på punktgrafen fra trin 7,10.
- Beregne polymeriseringshastigheder ved at dividere nettoændring i længde ved ændringen i tid for hver vækst begivenhed. Registrere disse resultater i kolonnen ved siden af lineær regression værdier fra trin 7.10.3.
- Beregningen af depolymeriseringsprodukter satser ved at dividere nettoændring i længde ved ændringen i tid for hver shrinking begivenhed. Registrere disse resultater i kolonnen ved siden polymerisationshastigheden værdier fra trin 7.11.
- Beregne katastrofe frekvens ved at dividere antallet af polymerisering-til-depolymerisering overgange af den totale tid for alle vækst- begivenheder 13. Registrere disse resultater i kolonnen støder op til depolymerisation bpm fra trin 7.12.
- Beregne redning frekvens ved at dividere antallet af depolymerisation-til-polymerisation overgange af den totale tid for alle krympning begivenheder 13. Registrere disse resultater i kolonnen støder op til katastrofe frekvensværdier fra trin 7.13.
- Beregne dynamik i henseende ved at dividere summen af den absolutte værdi af alle længdeændringer af den samlede varighed for billeddannelsen, beregnet i trin 7.10.1, og multiplikation med 27,0833 til opnåelse tubulin subunits per sekund 14. Registrere disse resultater i kolonnen støder op til redning frekvens valdier fra trin 7.14 og gemme resultaterne bordet.
BEMÆRK: Det er muligt at automatisere analysen, der er beskrevet i trin 7,10-7,15 bruger specialfremstillet program (. Estrem et al, manuskript indsendt). Programmet er designet til at identificere perioder med polymerisation og depolymerisering i målingerne for længde ved at følge ovenfor beskrevne parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Måling mikrotubulusdynamik i levende gærceller giver en overbevisende værktøj til at vurdere, hvordan mutationer i gener, som koder mikrotubulus regulatorer eller tubulin underenheder polymerisation virkning og depolymeriseringsprodukter satser, samt hyppigheden af overgang mellem disse tilstande. Figur 1 viser en tidsserie af astrale mikrotubulusdynamik i en vildtype celle og en mutant celle med en mutation i β-tubulin (tub2- 430Δ). Mikrotubuli er mærket med GFP-mærkede α-tubulin at visualisere mikrotubulus længde. De røde pile spore længden af astrale mikrotubulus i hvert billede (Figure1A og 1 C). Mikrotubulus længder blev målt ved hvert tidspunkt i 8 min, og disse kompilerede længder er afbildet i life plots (figur 1B og 1 D). Disse data blev anvendt til at bestemme polymerisationshastigheden, depolymerisation rate, polymerisation duratipå, depolymerisering varighed, redning frekvens, katastrofe frekvens, og dynamik i henseende.
Figur 1. Time-lapse Imaging af GFP-mærkede Mikrotubuli og Målinger af Astral mikrotubulusdynamik. (A og C) De første fem sekventielle billeder af tidsforskudt billeddannelse for vildtype og tub2 -430Δ mutantceller. Mikrotubuli er mærket med GFP-Tub1 og afbildes i præ-anafase af cellecyklussen. Hvert billede er en maksimal intensitet projektion fra et konfokalt Z-serien. Målestok: 1 uM. Timestamps viser den samlede tid på hver erhvervelse ramme. De røde pile følge med den samlede længde af en astrale mikrotubulus, med pilespidserne betegner de plus ender. (B og D) mikrotubulus life plots viser længderne af enkelte astrale mikrotubuler over tid. Det grønne punkts betegne polymerisering og de lyserøde punkter angiver depolymerisering. Pilene peger på katastrofebegivenheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1 viser ændrede mikrotubulusdynamik mellem en vildtype-stamme og en mutant stamme, der mangler de 27 aminosyrer i β-tubulin på C-terminalen, en mutant, der tidligere viste sig at have mere stabile mikrotubuli 15. Som vist i de mikrotubulus life plots, det mikrotubulus i tub2 -430Δ mutanten er længere og udviser færre katastrofer end vildtype-mikrotubulus (figur 1B og D pilespidser, tabel 1). Desuden polymeriseringsresultaterne og depolymeriseringsprodukter satser, bestemt ud fra hældningerne af op- og nedadgående mikrotubulus Lengths, er nedsat hos mutanten sammenlignet med vildtype (figur 1B og 1D; tabel 1). Endelig mikrotubulus i tub2 -430Δ mutantcellen tilbringer mere tid i tilstande af polymerisation og depolymerisering og er faldet dynamik i forhold til vildtype (tabel 1).
| Strain | Dynamik i henseende (subunits / s) | Polymerisationshastigheden (um / min) | % Tid i polymerisation | Depolym rate (um / min) | % Tid i depolyme- merization | % Tid i Pause | Rescue frekvens (events / min) | Katastrofe frekvens (events / min) |
| Vildtype n = 1 | 54 | 1,8 ± 0,5 | 48 | 3,0 ± 0,3 | 29 | 3 | 1.8 | 1.4 |
| tub2-430Δ n = 1 | 40 | 1,4 ± 0,1 | 41 | 1,5 ± 0,2 | 32 | 0 | 0,8 | 0,7 |
| Forkortelser er som følger: um, micron; min, minut; s, sekund; n, enkelt mikrotubulus analyseret fra mikrotubulus liv plot (Fig1B, D). Værdierne er gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien. | ||||||||
Tabel 1: mikrotubulusdynamik Målinger for celler i figur 1. Værdierne er middelværdier ± standardfejl på middelværdien fra målinger af de enkelte mikrotubuli vist i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den spirende gær model tilbyder store fordele til indsamling af målinger i høj opløsning af mikrotubulusdynamik i en in vivo indstilling, herunder evnen til at billedet enkelt mikrotubuli over tid og evnen til at manipulere tubuliner og mikrotubuli regulatorer ved hjælp af værktøjerne i gær genetik.
De Concanavalin A-overtrukne kamre giver et antal fordele i forhold til tidligere beskrevne apparater, herunder smeltet agar pads. Objektglassene med kamre kan præ-made og opbevaret langsigtede eller kan bruges straks. Derudover Concanavalin A-overtrukne kamre er i stand til at dyrke gærceller for> 6 timer i det samme medium, i hvilket cellerne blev oprindeligt dyrket. Det er vigtigt at bemærke, at antallet af celler i kammeret vil diktere, hvor længe kammeret kan afbildes. De overtrukne kamre sikre, at kun et enkelt lag af gærceller klæber til dækglas. Endelig oprette flere kamre tilladerflere forskellige gærstammer, der skal afbildes på samme glas.
Der er store udfordringer til imaging mikrotubulusdynamik i knopskydende gær, herunder relativt lave signalniveauer og den meget dynamiske karakter af processen. Widefield mikroskoper er tilstrækkelige til at opfange single-tidspunkterne billeder af mærkede mikrotubuli. Men vidvinklede mikroskopi forårsager hurtigere fotoblegning grund af længere eksponeringstider og bombardementet af prøven med ud af fokus lys. Ligeledes laserscanning konfokale mikroskoper er utilstrækkelige på grund af hurtigere fotoblegning. Spinning disk konfokal mikroskopi er unikt egnet til billeddannelse mikrotubulusdynamik i knopskydende gær. Den roterende skive konfokalmikroskop system, der anvendes her er designet med disse krav i tankerne.
Mikroskopsystemet skal være konstrueret til høj hastighed og høj følsomhed. Selv om en række mikroskopsystemer kan vise sig egnet, flere komponenter er vigtigt. En 100XFormålet med en høj numerisk apertur (1.45NA) er nødvendig for at løse individuelle mikrotubuli og længdeændringer i størrelsesordenen 100 nm. En roterende skive konfokal scanner er nødvendigt for at minimere fotoblegning og toksicitet, ved at blokere ud-af-fokus lys, og for at maksimere opløsning og følsomhed, ved at samle kun i fokus lys. Den EMCCD kamera skal være hurtig og følsom til at indsamle nok GFP-Tub1 signal under hver 90 ms af erhvervelsen time-lapse. I øjeblikket EMCCD kameraer er det bedste valg for denne ansøgning. Nuværende CMOS sensor kameraer mangler følsomhed high-end EMCCDs; dog er denne teknologi forbedrer markant og kan snart være egnet. Endelig er der behov en piezoelektrisk fase for hurtig og præcis bevægelse i Z, som kan være det hastighedsbegrænsende trin i fire-dimensionelle billede erhvervelsen.
Den specifikke mikroskopsystem beskrevet i denne protokol kan udgøre en hindring, hvis tilsvarende udstyr ikke er let tilgængelig. Alterations cen gøres for at imødekomme forskellige billeddannende systemer, men disse modifikationer kan komme på bekostning af tidsmæssig og / eller rumlig opløsning. En spindel drevet trinsmotor kan anvendes i stedet for det piezoelektriske fase. Men disse motorer er langsommere, mindre nøjagtige, og tilbøjelige til at glide. Post-billede erhvervelse-stabiliserende plug-ins kan bruges til at minimere afdrift i xy dimensioner i forbindelse med disse motordrevne faser. Derudover kan alternative kameraer med langsommere readout hastigheder anvendes. For at imødekomme en langsommere erhvervelse sats, kunne Z-serie indsamles sjældnere (dvs. mere tid mellem Z-serien). Men at øge tiden mellem Z-serien risikerer manglende overgange, der kan opstå mellem tidspunkter. Alternativt kan afstanden mellem Z-fly forøges som en måde at nedbringe antallet af billeder indsamlet pr Z-serien. Men at øge denne afstand risikerer at miste billedinformation mellem planer, som vil forringe eksperimentatorens evne til at accurbart identificere mikrotubulus ender. Tydeligt kan ændringer foretages for at imødekomme alternative billeddannende systemer, men disse ændringer skal afvejes mod det potentielle tab af billedinformation.
En anden begrænsning ved denne protokol er tabet af geografisk information når tredimensionale billedstakke omdannes til todimensionale billede fremspring. En individuel astrale mikrotubulus i en præ-anafase gærcelle er typisk mellem 0,5 og 2,0 um i længde og rager på tværs af tredimensionale rum i cytoplasmaet. Det er derfor afgørende at erhverve billeder fra en serie af Z-positioner for at indsamle alle de geografisk information af en individuel mikrotubulus. I en tid-lapse erhvervelse, kan dette frembringe en kompleks datasæt, med 20 Z-skiver ved hver af de 150 tidspunkter, for i alt 3.000 billeder. For at løse denne udfordring og for at forenkle billedanalyse, er den rumlige information af Z-stakke komprimeret under analysen. Mens dette benefsin analyse, det kommer på bekostning af geografisk information fra Z-dimension. Hvor meget information går tabt, når Z-dimensionen er komprimeret? For at estimere dette tab, blev udført forsøg for at måle afstanden mellem SPBs i præ-anafase celler, som er relativt lette at måle, fordi Spc110-GFP-mærkede SPBs udviser sfæriske foci med højt signal-til-støj-forhold. Selv spindlen kan udvise anderledes forskydning i Z end astrale mikrotubuler, den gennemsnitlige længde er ens (~ 1,5 um) og derfor giver et nyttigt proxy. Spindel længder er i gennemsnit 15% længere målt i fuld tredimensional billedstakke end når de samme spindler måles i todimensionelle fremspring (JM, upublicerede resultater). Således bør fordel for forenklet datasæt og målinger afvejes mod omkostningerne ved kasseret Z information.
Gæren cellebiologi samfund har udviklet en alsidig værktøjskasse til billedbehandling mikrotubuli netværks. Dette omfatter en række forskellige fluorescerende proteiner fusioneret til a-tubulin / Tub1 og mærket med forskellige auxotrofe markører. Disse konstruktioner indbefatter LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11, som integrerer i det kromosomale LEU2 locus, og flere fusioner til GFP og andre fluoroforer, som integrerer på URA3-locus, herunder URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16, URA3 :: CFP-TUB1 (pAFS125-CFP), og URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. Desuden har et sæt Tub1 fusioner til forskellige fluorescerende proteiner nylig blevet oprettet dette mål integration til enten det kromosomale URA3-locus eller til et sted tilstødende til det native TUB1 locus 18. Denne omfattende palet af fluoroforer og markører er meget nyttig til co-localization eksperimenter med differentielt mærkede proteiner. GFP-Tub1 fusion forbliver det bedste værktøj til time-lapse billeddannelse af microtubule dynamik på grund af sin lysstyrke og fotostabilitet. GFP-Tub1 fusion skabt af Song & Lee (pSK1050) 11 indeholder en fusion af GFP til aminoterminalen af α-tubulin / Tub1 og integrerer på LEU2 locus at redde leucin auxotrofi. Således er fusionsproteinet udtrykkes ektopisk foruden native α-tubulin og omfatter ~ 20% af den totale α-tubulin i cellen 9. Vigtigere, er GFP-Tub1 fusion ikke redde funktion af native α-tubulin / Tub1 (JM, upublicerede resultater). Dette gælder også for andre TUB1 fusionskonstruktioner 18.
Med de tilgængelige værktøjer til at visualisere mikrotubuli og deres bindende proteiner, spirende gær er et ideelt system til at studere mutationer i tubuliner og andre mikrotubuli regulatorer. Derudover det begrænsede antal tubulingener giver mulighed for direkte undersøgelse af en homogen pool af mutant tubulin. Ud over mutationer itubulingener, knopskydende gær har en række mikrotubuli-associerede proteiner (MAP'er), som er homologe med metazo modstykker. Disse kort kan studeres direkte, og de virkninger, at mutationer har på enkelte mikrotubuli filamenter kan også undersøges. Protokollen beskrevet her giver mulighed for undersøgelse af både de interne og eksterne processer, der har indflydelse mikrotubulusdynamik.
Sammenfattende må mikrotubuli være dynamisk fungerer ordentligt i mange cellulære processer. Det er nødvendigt at forstå de faktorer, der er karakteristiske for tubulin og ydre proteiner, der regulerer mikrotubulusdynamik. Knopskydende gær er et ideelt system til at undersøge virkningen af disse faktorer ved direkte kvantificering dynamikken i en enkelt mikrotubulus. Protokollen beskrevet ovenfor beskriver, hvordan man stabilt at integrere et fluorescerende fusionsprotein i gærgenomet og hvordan at erhverve og analysere konfokalt billede stakke at kvantificere mikrotubulusdynamik in vivo
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University) og Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) til deling af forskellige FP-TUB1 plasmider. Vi er taknemmelige for Melissa Gardner (University of Minnesota) til at træne os i slide kammer fremstillingsmetoden. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) give R01GM112893-01A1 (til JKM) og T32GM008730 (CE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
