Summary
Levadura en ciernes es un modelo ventajoso para el estudio de la dinámica de microtúbulos in vivo debido a sus potentes genética y la simplicidad de su citoesqueleto de microtúbulos. El siguiente protocolo describe cómo transformar células de levadura y la cultura, adquirir imágenes de microscopía confocal, y analizar cuantitativamente la dinámica de microtúbulos en las células vivas de levadura.
Abstract
microtúbulos dinámicos son fundamentales para muchos procesos celulares, y las mediciones precisas de la dinámica de microtúbulos pueden dar una idea de cómo las células regulan estos procesos y cómo las mutaciones genéticas regulación impacto. La cuantificación de la dinámica de los microtúbulos en los modelos de metazoos tiene una serie de desafíos asociados, incluyendo una alta densidad de microtúbulos y limitaciones a las manipulaciones genéticas. Por el contrario, el modelo de levadura en ciernes ofrece ventajas que superan estos desafíos. Este protocolo describe un método para medir la dinámica de los microtúbulos individuales en células de levadura viva. Las células que expresan tubulina marcado con fluorescencia se adhieren a las cámaras de diapositivas ensambladas, lo que permite la adquisición de imágenes de lapso de tiempo estable. Una guía detallada para la alta velocidad, también se proporciona la adquisición de imágenes de cuatro dimensiones, así como un protocolo para la cuantificación de las propiedades de los microtúbulos dinámicos en pilas de imágenes confocal. Este método, combinado con la genética de levadura convencionales, provIdeS un enfoque que es especialmente adecuado para evaluar cuantitativamente los efectos de los reguladores de microtúbulos o mutaciones que alteran la actividad de subunidades de tubulina.
Introduction
Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto hechas de subunidades de la proteína delta gamma-tubulina y se utilizan en una amplia variedad de contextos celulares, incluido el transporte intracelular, la división celular, la morfogénesis y la motilidad. Para construir redes de microtúbulos para estas diversas funciones, las células deben regular cuidadosamente dónde y cuándo se forma microtúbulos. Esta regulación se lleva a cabo mediante el control de las reacciones que, o bien montar subunidades delta gamma-tubulina en microtúbulos polímeros o microtúbulos desmonte en subunidades libres; esto se conoce como dinámica de los microtúbulos.
Un objetivo importante del campo de microtúbulos es dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la dinámica de los microtúbulos, incluyendo estudios de las subunidades delta gamma-tubulina y reguladores extrínsecos que se unen a la tubulina y / o a los microtúbulos. Un enfoque experimental bien establecido es para reconstituir este sistema in vitro usando proteína αβ-tubulina purificada, a menudo en comcombinación con los reguladores extrínsecos purificados. Aunque este es un enfoque útil, está claro que la dinámica de los microtúbulos en los sistemas reconstituida difiere considerablemente de la observada en las células vivas. Por ejemplo, los microtúbulos crecen más rápido y más lento se reducen in vivo que in vitro. Estas diferencias pueden ser atribuidas a la disponibilidad de reguladores extrínsecos conocidos 1, así como a factores aún no definido en las células. Por lo tanto, es fundamental para determinar las actividades de los reguladores de microtúbulos y mutantes que perturban la dinámica en un contexto celular nativo.
Aunque los modelos de metazoos han demostrado ser los sistemas existentes para la investigación de función de los microtúbulos y la organización de orden superior, varias preocupaciones prácticas limitan severamente la utilidad de estos modelos para la medición precisa de la dinámica de los microtúbulos. En primer lugar, el elevado número de microtúbulos, que van desde decenas a miles por célula, hace que sea difícil de confianzarealizar un seguimiento de los microtúbulos individuales a través del tiempo. Muchos estudios abordan este reto por imágenes proteínas que se localizan selectivamente a los extremos de los microtúbulos, tales como proteínas en la familia de unión final (EB). Sin embargo, se sabe que estas proteínas para localizar sólo a los extremos de creciente microtúbulos en metazoos 2. Por lo tanto, la utilidad de estas proteínas está limitada a la medición directa de las tasas de crecimiento, mientras que sólo medir indirectamente otros aspectos de la dinámica, como la frecuencia de catástrofe. En segundo lugar, a pesar de los avances en la tecnología de edición genoma, la creación de células que expresan de forma estable la tubulina marcada con fluorescencia o la introducción de mutaciones para manipular selectivamente de tubulina o microtúbulos reguladores sigue siendo un desafío significativo. Por otra parte, la presencia de numerosos isotipos de tubulina en metazoos confunde el estudio de cómo las mutaciones afectan a los genes de tubulina individuales.
El sistema de levadura en ciernes ofrece varias ventajas importantes para la medición en vivo microtubuLe dinámica. La levadura tiene una red de microtúbulos simplificada que permite la visualización de los microtúbulos individuales. En la levadura, los microtúbulos emanan de la organización de los centros conocidos como cuerpos de barra de husillo (SPBs), que están incrustados en la envoltura nuclear 3. Los SPBs sirven como andamios para gamma-tubulina pequeños complejos que nuclean microtúbulos 4, 5. SPBs nuclean dos clases de microtúbulos, los microtúbulos del huso y los microtúbulos astrales. Proyecto microtúbulos del huso en la nucleoplasma y son importantes para la fijación a los cromosomas a través de los microtúbulos del cinetocoro y para estabilizar el husillo a través de la superposición de los microtúbulos interpolares 6. En contraste, el proyecto de microtúbulos astrales hacia el exterior en el citosol y son relativamente raras en comparación con la densa red de microtúbulos del huso. Durante la mitosis, las células pre-anafase tienen sólo 1-2 microtúbulos astrales que emanan de o bien SPB; estos existen como imicrotúbulos ndividual en lugar de como haces 7. El papel de los microtúbulos astrales durante la mitosis es mover el núcleo y eje en la unión entre los compartimentos de la madre y el brote, conocidos como la yema del cuello. Este movimiento implica vías bien definidas que generan fuerza sobre los microtúbulos astrales, tirando el núcleo y husillo hacia y, finalmente, en la yema del cuello 8.
Otra ventaja del sistema de levadura es la utilidad de su genética, que pueden ser utilizados para investigar los reguladores de microtúbulos y subunidades de tubulina con una precisión sin precedentes. La levadura también poseen un repertorio simplificado de isotipos de tubulina: a β-tubulina único gen (tub2) y dos genes alfa-tubulina (TUB1 y tub3). Las mutaciones se pueden introducir fácilmente en estos genes y de ese modo estudiaron en una población de tubulina homogénea 9, 10. Hay una serie de ampliamenteconstrucciones disponibles para los microtúbulos de etiquetado, y estos pueden ser objeto de integración en loci cromosómicos para la expresión estable (véase la discusión).
El objetivo general de este método es a imagen microtúbulos individuales en células de levadura que viven en cuatro dimensiones (X, Y, Z, y t) para mediciones de alta resolución de la dinámica de microtúbulos. Se describen métodos para la integración de construcciones para la expresión constitutiva de bajo nivel de tubulina marcada con fluorescencia en células de levadura. Antes de la formación de imágenes, las células vivas están montados en cámaras de diapositivas revestidas con la lectina Concanavalina A para estabilizar las células para formación de imágenes a largo plazo. Los parámetros óptimos para la adquisición de imágenes, así como un flujo de trabajo para el análisis de datos, también se describen.
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Protocol
1. Preparación de placas Leu Dropout
- Añadir 800 ml de agua estéril, desionizada (DiH _ 2 O) a un matraz de 2 L. Añadir 26.71 g de polvo de base de deserción (DOB), 0,69 g de CSM-Leu, y 20 g de agar. Mezclar con una barra de agitación magnética. Llevar a 1 L con DiH _ 2 O.
- Autoclave a 121 ° C y 19 psi durante 30 min.
- Retirar el matraz del autoclave y se deja que se enfríe a ~ 65 ° C con agitación suave.
- Verter 30 ml / placa en placas de 100 mm de diámetro. Dejar que estos se sientan a temperatura ambiente durante 36-48 h antes de almacenar a 4 ° C.
2. La integración de GFP-TUB1 para la expresión constitutiva de la tubulina GFP marcado
- Hervir una concentración madre de 10 mg / ADN monocatenario ml (ssDNA) durante 3 min.
- Combinar 2 l de ssDNA hervida con 400 ng de purificado GFP-TUB1 plásmido ADN 11.
NOTA: Hay una variedad de plásmidos que se pueden utilizar para el marcaje estable, fluorescentede los microtúbulos en la levadura que utilizan fluoróforos alternativos y marcadores seleccionables. Algunas de estas alternativas se describen en la sección de Discusión. - Añadir la mezcla de ADN a una alícuota de 50! L de células de levadura competentes.
NOTA: Preparar células de levadura competentes con solución de sorbitol (SORB; mM LiOAc 100, 10 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 1 mM pH 8, y 1 M sorbitol, ajustado con ácido acético diluido a pH 8). Para una descripción detallada de hacer las células de levadura competentes, véase la referencia 12. - Mezclar bien.
- Añadir 6x el volumen total de solución de polietilenglicol (PEG) (mM LiOAc 100 mM, Tris-HCl 10 pH 8, EDTA 1 mM / NaOH pH 8, y 40% PEG3350) a la mezcla de células de ADN.
- Mezclar bien.
- Incubar durante al menos 1 h a 30 ° C con agitación suave.
- Añadir sulfóxido de dimetilo (DMSO) al 10% del volumen total y vórtice.
- Incubar a 42 ° C durante 15 min.
- Centrifugar a 2500 xg durante 5 min.
- células de la placa en una placa de Leu de deserción.
NOTA: El constructo GFP-TUB1 contiene un marcador auxótrofo de leucina, mientras que otros constructos podrían utilizar un marcador alternativo. El medio de abandono debe ser específico para el marcador auxotrófico de la construcción. - Permitir que las células transformadas crezcan durante 3-5 días a 30 ° C.
- Re-racha colonias de transformación individuales en una placa Leu deserción fresco mediante la transferencia de colonias utilizando un palillo de dientes esterilizado en autoclave. Incubar la placa durante la noche a 30 ° C.
- Detectar visualmente cada transformante para una señal de GFP mediante la suspensión de aproximadamente 1 l de células a partir de una sola colonia de la placa en la etapa 2.14 en 2 l de agua en un portaobjetos limpio. Cubrir las células suspendidas con un cubreobjetos y observar mediante microscopía de fluorescencia.
- Excitar los transformantes con luz de 488 nm y buscar la presencia de una señal de GFP.
- Excitar los transformantes con luz de 488 nm y buscar la presencia de una señal de GFP.
3. Cultivo cultivo de levadura Liquid
- Inocular ~ 1 l de células de levadura de una sola colonia en una placa en 3 ml de medio completo sintético. Permitir que las células crezcan durante una noche a 30 ° C con agitación a 250 rpm.
- Diluir el cultivo saturado el día siguiente hasta una DO 600 de <0,1 en el medio. Devolver el cultivo diluido a la C agitador 30 ° durante 3-4 h o hasta que la DO 600 es de entre 0,4 y 0,8, cuando las células están listas para ser cargado en las cámaras de formación de imágenes.
4. Preparación de flujo Cámara Diapositivas
- Cortaruna lámina de película de parafina en una pieza 4 en ancho y 7 en mucho tiempo.
- Colocar un portaobjetos de microscopio estándar longitudinal de la anchura de 4 pulgadas de película de parafina y envolver la película alrededor de la corredera de 3-4 veces de tal manera que la corredera está cubierta de película que es de 3-4 capas de espesor. Pulse las capas entre sí para asegurar que no es un sello razonable; esto hará que sea más fácil de cortar. Evitar presionar demasiado duro o provocando que la película se arrugue.
- Cortar la película de parafina a lo largo de los bordes exteriores de la corredera usando una maquinilla de afeitar cortador de cajas limpio. Utilice otra diapositiva para proporcionar un borde recto para el corte.
- Pelar el exceso de película fuera de la corredera de trabajo y desechar. Las pilas restantes de película cubrirán una cara de la corredera y se utiliza para hacer las paredes entre las cámaras de formación de imágenes.
- Usando la segunda diapositiva como un borde recto, corte las capas de película apiladas a lo largo del eje largo de la diapositiva en aproximadamente diez tiras, cada uno de 2-4 mm de ancho.
- Cortar las capas de película de parafina apiladas perpendicularmente alos cortes realizados en el paso 4.5, a lo largo del eje corto de la corredera, para crear tiras de 2-4 mm de ancho, 23-24 mm de longitud, y 3-4 capas gruesas.
- Pelar las tiras cortadas utilizando una maquinilla de afeitar a un ángulo de 45 °. El uso de pinzas, distribuir uniformemente las tiras de película del corte en un portaobjetos de microscopio limpio para crear los números deseados de cámaras. Hasta 3 cámaras (hechas con 4 tiras de película de parafina) se pueden crear en una diapositiva.
- Coloque un único cubreobjetos en la parte superior de las tiras de película y mover en su posición con fórceps.
- Colocar el portaobjetos preparado, cubreobjetos hacia arriba, sobre una placa calefactora puesta a ~ 95 ° C (esto es aproximadamente la posición baja intermedia en la mayoría de placas de cocción). Calentar la corredera hasta que las tiras de película son translúcidas (aproximadamente 3 min) y luego sellar la corredera y el cubreobjetos juntos presionando suavemente sobre el cubreobjetos con las pinzas.
NOTA: Es importante solamente de prensa sobre las regiones del cubreobjetos que están directamente por encima de las tiras de película de parafina, como rascarse las regiones por encima de la cHambers pueden disminuir la calidad de imagen. Tenga cuidado de no sobrecalentar la diapositiva; vaporizado capa voluntad película el interior de la cámara con una película hidrófoba que evita que las células se adhieran. - El uso de fórceps para retirar la corredera de la placa de cocción (la corredera estará caliente) y ajuste a un lado para enfriar con el lado de cubreobjetos hacia arriba; como la corredera se enfría, la película va a volver a un blanco, coloración opaca.
NOTA: En este punto, las diapositivas son listo para ser cargado con las células de levadura cultivadas. diapositivas adicionales se pueden hacer a este punto y se almacenan en un lugar limpio y seco durante un período indefinido de tiempo.
5. Carga de células de levadura en Preparado Cámara de flujo de Diapositivas
- Descongelar a, 200 alícuota l congelada de Concanavalina A (2 mg / ml en estéril DiH _ 2 O).
- Añadir aproximadamente 100 l de descongelado Concanavalina A a cada cámara del portaobjetos preparado pipeteando en uno de los extremos abiertos. Agregar suficiente Concanavalina A para llenar la cámara. Para este step, la Concanavalina A se tira a través de la cámara a través de la acción capilar.
- Colgar el portaobjetos, cubreobjetos hacia abajo, entre dos bastidores de tubo de microfuga o plumas durante 5 min para permitir que la Concanavalina A se adhiera a la cubreobjetos (es decir, la cámara).
- Devolver el carro a una posición cubreobjetos en marcha. Lavar la cámara con 2x el volumen de la cámara (determinado en el paso 5.2, anteriormente; aproximadamente 200 l) de medio completo sintético para eliminar la Concanavalina A.
- El flujo del medio a través de la cámara, usando ya sea la esquina de una toalla de papel o un papel de filtro doblado por la mitad para extraer fluido de un extremo de la cámara mientras que pipetear simultáneamente fluido fresco en el otro. Alternativamente, utilizar un aspirador de vacío para extraer cuidadosamente fluido fuera de un extremo mientras el pipeteado de fluido fresco en el otro.
- Las celdas de carga por fluye 2x el volumen de la cámara (aproximadamente 200 l) de suspensión celular (de la etapa 3.4), usando el metho flujo dirigidoD descrito en el paso 5.4.1.
NOTA: El objetivo es la imagen de una sola capa de células en el portaobjetos. Por lo tanto, es importante para cargar una concentración de células tan pequeñas que no se acumulen en la parte superior uno de otro, pero lo suficientemente grandes que las células suficientes están presentes en el campo para recoger la cantidad máxima de datos por adquisición de imágenes. La concentración óptima de células dentro de la cámara puede variar y debe ser determinada empíricamente. Para aumentar la concentración de células en la cámara de flujo, sedimentar suavemente el cultivo celular a 1000 xg durante 2 min y eliminar parte del sobrenadante. Para disminuir la concentración de células, añadir medio completo sintético fresco a la suspensión celular. La concentración de las células se puede evaluar después de la etapa 5.7 (abajo) mediante la inspección de la cámara en un microscopio de contraste de fase. En este punto, las células adicionales pueden ser añadidos a la cámara haciendo fluir en más suspensión celular. Sin embargo, la reducción de la densidad de células en este punto no es factible y se logra mejormediante la carga de una nueva cámara con una suspensión celular diluida. - Cuelgue la diapositiva cubreobjetos hacia abajo, como se describe en el paso 5.3, durante 10 minutos para permitir que las células se adhieren a la cubreobjetos.
- A eliminar cualquier células no adheridas por que fluye a través 4x el volumen de la cámara (aproximadamente 400 l) de medio completo sintético. Esto eliminará las células que flotan libremente en la cámara, que pueden contaminar la adquisición de imágenes.
- secar cuidadosamente cada extremo de la cámara con una esquina limpio de una toalla de papel, con lo que el menisco hasta el borde del cubreobjetos.
- Cerrar cada extremo de la cámara con sellador caliente (75 ° C) (por ejemplo, valap; partes iguales de vaselina, cera de lana, y cera de parafina).
NOTA: En este punto, la tapa está listo para la imagen. Las cámaras se pueden obtener imágenes para hasta 9 h, dependiendo de la densidad de las células en cada cámara. Las células producirán dióxido de carbono (CO 2) con el tiempo, lo que creará gradualmente las burbujas que desplazan a las células.
- Llevar el carro a un microscopio invertido equipado con un objetivo de 1,45 NA 100X CFI Plan de Apo, una etapa piezoeléctrica, una unidad de escáner confocal de disco giratorio, un láser de iluminación, y una cámara de EMCCD. Mantener la temperatura de la etapa a temperatura ambiente (25 ° C) durante la adquisición.
NOTA: La alta apertura numérica permite una mayor resolución de imagen, y la etapa piezoeléctrica permite la adquisición z-pila de alta velocidad. Los requisitos mínimos de microscopio son el objetivo 100X, el láser de iluminación y la cámara EMCCD. - Llevar las células en el foco. Asegúrese de que el campo de la adquisición tiene por lo menos 5-6 células se agruparon mediante la búsqueda en la diapositiva para las células agrupadas.
NOTA: Aunque no es necesario para la imagen más de una célula a la vez, de imágenes múltiples células en el mismo campo mejora la eficiencia de adquisición de datos sin afectar a la calidad de los datos. Sin embargo, es fundamental que lalas células están en el mismo plano focal y no apilados uno encima del otro. - Programar una adquisición multidimensional para recoger múltiples z-series en el tiempo.
- Ajustar la configuración dentro de la configuración de adquisición de activos a la siguiente: Z-profundidad total = 6 m, para abarcar toda la célula de levadura; Z-paso size = 300 nm, para maximizar la recogida de luz sin sobremuestreo; duración tiempo total = 10 min; intervalos de tiempo = Z-series cada 4 s; y tiempo de exposición = 90 ms para cada plano z.
NOTA: El tiempo de exposición óptimo variará dependiendo de la cámara, la fuente de luz de excitación, y otros factores. En general, el tiempo de exposición óptimo será el tiempo mínimo necesario para alcanzar una relación 3: 1 de la señal de microtúbulos astrales marcadas con GFP a la señal desde el citoplasma sobre la base de valores de píxel medidos por el EMCCD.
- Ajustar la configuración dentro de la configuración de adquisición de activos a la siguiente: Z-profundidad total = 6 m, para abarcar toda la célula de levadura; Z-paso size = 300 nm, para maximizar la recogida de luz sin sobremuestreo; duración tiempo total = 10 min; intervalos de tiempo = Z-series cada 4 s; y tiempo de exposición = 90 ms para cada plano z.
- Comience la adquisición haciendo clic en 'Ejecutar'. Permitir que se ejecute durante toda la duración de 10 minutos. Guardar los datos como una imagenserie (.tiff o .nd2).
- Seleccione un nuevo campo para la imagen dentro de la cámara y repita los pasos 6.2 a 6.4.
NOTA: una sola cámara debe producir entre 15 y 20 campos de células, dependiendo de la densidad de las células dentro de la cámara. Densidades celulares más alto producirá campos totales más bajas, ya que el CO 2 en la cámara se acumulará más rápido.
Análisis 7. Imagen
- Abra el archivo de imagen en ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) como un HyperStack mediante el uso de la bio-formatos importador plugin.
- ImageJ abierto y arrastre la pila imagen adquirida de la sección 6 directamente sobre el panel de control. El importador de bio-formatos se iniciará automáticamente. Seleccione "OK" para cargar la pila de imagen como un HyperStack.
NOTA: Los "bio-formatos opciones de importación" del sistema se abrirá y asegurar que bajo la "Pila Visualización de la" sección "Ver pila con:" está ajustado a "HyperStack"; y "Pila orden:" se establece en "XYCZT."
- ImageJ abierto y arrastre la pila imagen adquirida de la sección 6 directamente sobre el panel de control. El importador de bio-formatos se iniciará automáticamente. Seleccione "OK" para cargar la pila de imagen como un HyperStack.
- Contraer cada Z-serie en un máximo de intensidad, la proyección 2 dimensiones utilizando la función de proyecto Z.
- Seleccione el menú "Imagen", el submenú "Pila", y la función de "Proyecto Z". Seleccionar "proyección máxima" de la lista desplegable y haga clic en "Aceptar".
- Aplicar un filtro de mediana a la pila de imagen para reducir el ruido de moteado seleccionando el menú "Acción", el submenú "filtros" y la función de "mediana". Introduzca 2.0 píxeles en el cuadro de radio y haga clic en "Aceptar".
- Identificar las células pre-anafase en el campo.
NOTA: Estos se caracterizan por brotes de tamaño medio y un corto huso mitótico, 1-1,5 m de longitud (Figura 1; los puntos de punta de flecha para un corto huso mitótico). Las células en esta etapa son ideales para el análisis de la dinámica de microtúbulos porque típicamente exhiben solamente una Femicrotúbulos astrales w emanan los polos del huso 7. microtúbulos astrales pueden ser identificados como filamentos lineales que presentan una intensidad de señal GFP uniforme desde el extremo menos, en el SPB, al extremo plus, en el citoplasma. - Comenzando en el primero punto de tiempo de la serie de imágenes, utilice la herramienta de línea segmentada para dibujar una línea a lo largo de un solo microtúbulos astral, desde el extremo menos, situada en la unión entre los microtúbulos astrales y los microtúbulos del huso más intensamente marcadas, al extremo más , que está en el citoplasma (ver las líneas rojas en la Figura 1). Haga doble clic en el extremo de los microtúbulos para completar la línea segmentada.
- Registre la medición en la tabla de resultados utilizando la función de "medida" pulsando el botón "M" en el teclado.
NOTA: Las características adicionales, tales como la intensidad de color gris, se puede grabar mediante el establecimiento de las medidas en el menú "Analizar" y el submenú "Set Mediciones". - Avanzar al siguiente punto de tiempo haciendo clic en la flecha derecha en la barra Z-deslizante o pulsando la tecla "./>" en el teclado. Repetir los pasos 7.5 y 7.6 para todos los puntos de tiempo en la secuencia de imágenes.
- Copiar los datos de la tabla de resultados y pegarlos en una hoja de cálculo. Guardar los datos seleccionando "Guardar como".
NOTA: Estas mediciones incluyen varios valores, pero los valores más importantes son la rebanada, que indica el punto de tiempo en la serie, y la longitud, que indica la longitud de la línea (es decir, los microtúbulos astrales). Las columnas que contienen otras mediciones (por ejemplo, la zona, significan valor de píxel, el ángulo, etc.) puede o bien ser mantenido o desechado. - Crear una nueva columna en la hoja de cálculo haciendo clic derecho y utilizar la función "Insertar". Introduzca el tiempo (s) de cada punto de tiempo.
- Crear un gráfico de dispersión XY de la longitud de los microtúbulos (micras) como una función del tiempo (s) utilizando la "Línea de inserciónGráfico" característica; seleccionar las mediciones de longitud como 'Y' y la columna de tiempo como 'X'
- Identificar regiones de polimerización, despolimerización, y la pausa buscando cambios positivos y negativos en longitud en el tiempo sobre el diagrama de dispersión de la etapa 7.10.
NOTA: los eventos de polimerización aumentar la longitud de los microtúbulos por al menos 0,5 micras a través de un mínimo de 3 puntos de tiempo y se ajustan a una regresión lineal con un R 2 ≥ 0,9 y un valor R> 0 (Figura 1B y D, puntos verdes). Eventos despolimerización disminuyen longitud de microtúbulos por al menos 0,5 micras a través de un mínimo de 3 puntos de tiempo y se ajustan a una regresión lineal con un R 2 ≥ 0,9 y un valor R <0 (Figura 1B y D, puntos de color rosa). eventos Pausa están separadas de polimerización y despolimerización. Las pausas se definen como cambios netos en longitud microtúbulos menos de 0,5 micras a través de un mínimo de 3 puntos de tiempo;ajustar una regresión lineal con un valor R entre -0,4 y 0,4; y tienen una pendiente que no es estadísticamente diferente de cero, según lo determinado por un ensayo F. - Usando el diagrama de dispersión como guía, identificar las secciones del momento en que el cambio de longitud es positivo y poner de relieve en un color verde. Destacar las regiones del momento en que el cambio de longitud es negativa en un color rosa.
- Calcular la sección de la regresión lineal de cada relieve y registrar la R- y R 2-valor para cada sección en las columnas proximal a las regiones. Clasifica cada región de color, ya sea como un evento de polimerización o un evento de despolimerización.
- Identificar regiones de polimerización, despolimerización, y la pausa buscando cambios positivos y negativos en longitud en el tiempo sobre el diagrama de dispersión de la etapa 7.10.
- Calcular las velocidades de polimerización dividiendo el cambio neto en la longitud por el cambio en el tiempo para cada evento crecimiento. Registre estos resultados en la columna adyacente a los valores de regresión lineal de la etapa 7.10.3.
- Calcular las tasas de despolimerización dividiendo el cambio neto en longitud por el cambio en el tiempo para cada shrinking evento. Registre estos resultados en la columna adyacente a los valores de velocidad de polimerización de la etapa 7.11.
- Calcular la frecuencia de catástrofe dividiendo el número de transiciones de polimerización a la despolimerización por el tiempo total de todos los eventos de crecimiento 13. Registre estos resultados en la columna adyacente a los valores de velocidad de despolimerización de la etapa 7.12.
- Calcula la frecuencia de rescate dividiendo el número de transiciones-despolimerización-a polimerización por el tiempo total de todos los eventos de contracción 13. Registre estos resultados en la columna adyacente a los valores de frecuencia catástrofe desde el paso 7,13.
- Calcular la dinamicidad dividiendo la suma del valor absoluto de todos los cambios de longitud de la duración total de la adquisición de la imagen, calculados en el paso 7.10.1, y multiplicando por 27,0833 para obtener subunidades de tubulina por segundo 14. Anote estos resultados en la columna adyacente a la frecuencia de rescate values de paso 7,14 y guardar la tabla de resultados.
NOTA: Es posible automatizar el proceso de análisis descrito en los pasos 7,10-7,15 utilizando un programa hecho a medida (. Estrem, et al, manuscrito presentado). El programa está diseñado para identificar periodos de polimerización y despolimerización en las mediciones de longitud siguiendo los parámetros detallados anteriormente.
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Representative Results
La medición dinámica de los microtúbulos en las células vivas de levadura proporciona una herramienta de peso para evaluar cómo las mutaciones en genes que codifican los reguladores de microtúbulos o tubulina subunidades polimerización impacto y las tasas de despolimerización, así como la frecuencia de transición entre estos estados. La Figura 1 muestra una serie temporal de la dinámica de microtúbulos astrales en una célula de tipo salvaje y una célula mutante con una mutación en β-tubulina (tub2- 430Δ). Los microtúbulos están etiquetados con GFP-etiquetados α-tubulina para visualizar la longitud de los microtúbulos. Las flechas rojas trazan la longitud de los microtúbulos astrales en cada imagen (Figura 1a y 1 C). Longitudes de microtúbulos se midieron en cada punto de tiempo durante 8 min, y estas longitudes compilados se representan en parcelas de vida (Figura 1B y 1 D). Estos datos fueron utilizados para determinar la velocidad de polimerización, la tasa de despolimerización, DURATI polimerizaciónen adelante, la duración despolimerización, la frecuencia de rescate, la frecuencia de catástrofe y dinamismo.
Figura 1. Imaging lapso de tiempo de los microtúbulos y Mediciones del Astral Microtúbulos Dinámica marcadas con GFP. (A y C) Los primeros cinco imágenes secuenciales de formación de imágenes de lapso de tiempo para la de tipo salvaje y tub2 -430Δ células mutantes. Los microtúbulos están etiquetados con GFP-TUB1 y la imagen en la pre-anafase del ciclo celular. Cada imagen es una proyección de máxima intensidad de una Z-series confocal. Barras de escala: 1 m. Las marcas de tiempo muestra el tiempo total en cada adquisición marco. Las flechas rojas siguen a lo largo de la longitud total de una de microtúbulos astral, con las puntas de flecha que indica los extremos más. (B y D) parcelas de vida Microtúbulos muestran las longitudes de los microtúbulos astrales individuales con el tiempo. El punto verdes denotan polimerización y los puntos de color rosa denotan despolimerización. Las puntas de flecha apuntan a eventos catastróficos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 1 demuestra alterados dinámica de los microtúbulos entre una cepa de tipo silvestre y una cepa mutante que carece de los ácidos 27 aminoácidos de β-tubulina en el C-terminal, un mutante que fue demostrado previamente para tener microtúbulos más estables 15. Como se muestra en los gráficos de la vida de los microtúbulos, los microtúbulos en el mutante tub2 -430Δ es más largo y exhibe un menor número de catástrofes que los microtúbulos de tipo salvaje (puntas de flecha Figura 1B y D; Tabla 1). Además, las velocidades de polimerización y despolimerización, determinados a partir de las pendientes de los ascendientes y descendientes leng microtúbulosTHS, están disminuidos en el mutante en comparación con la de tipo salvaje (Figura 1B y 1D; Tabla 1). Por último, los microtúbulos en la célula mutante tub2 -430Δ pasa más tiempo en estados de polimerización y despolimerización y ha disminuido dinamicidad en comparación con la de tipo salvaje (Tabla 1).
| Tensión | Dinamicidad (subunidades / s) | Velocidad de polimerización (m / min) | % Tiempo en La polimerización | Tasa Depolym (m / min) | % Tiempo en Depoly- merization | % Tiempo en pausa | Frecuencia de rescate (eventos / min) | Frecuencia de catástrofe (eventos / min) |
| De tipo salvaje n = 1 | 54 | 1,8 ± 0,5 | 48 | 3,0 ± 0,3 | 29 | 3 | 1.8 | 1.4 |
| tub2-430Δ n = 1 | 40 | 1,4 ± 0,1 | 41 | 1,5 ± 0,2 | 32 | 0 | 0.8 | 0.7 |
| Las abreviaturas son como sigue: m, micras; min, minutos; s, segundo; n, solo microtúbulos analizado desde trama vida microtúbulos (Fig1B, D). Los valores son la media ± error estándar de la media. | ||||||||
Tabla 1: Microtúbulos Dynamics Mediciones para las células en la Figura 1. Los valores son la media ± error estándar de la media de las mediciones de los microtúbulos individuales mostrados en la Figura 1.
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Discussion
El modelo de levadura en ciernes ofrece importantes ventajas para la recopilación de mediciones de alta resolución de la dinámica de microtúbulos en un entorno in vivo, incluyendo la capacidad de imagen microtúbulos individuales en el tiempo y la capacidad de manipular tubulins y reguladores de microtúbulos utilizando las herramientas de la genética de la levadura.
Las cámaras recubiertas-A Concanavalina proporcionan un número de ventajas sobre los aparatos descritos anteriormente, incluyendo almohadillas de agar fundido. Los portaobjetos con cámaras se pueden pre-hechos y se almacenaron a largo plazo o se pueden utilizar inmediatamente. Además, las cámaras revestidas-A Concanavalina son capaces de cultivo de células de levadura para> 6 h en el mismo medio en el que las células fueron originalmente cultivada. Es importante tener en cuenta que el número de células dentro de la cámara dictará el tiempo que la cámara se pueden obtener imágenes. Las cámaras recubiertas garantizar que sólo una única capa de células de levadura se adhiere a la cubreobjetos. Por último, la creación de múltiples cámaras permitevarias cepas de levadura diferentes para obtener imágenes en el mismo portaobjetos.
Hay grandes desafíos a la imagen dinámica de los microtúbulos en la levadura en ciernes, incluyendo los niveles de señal relativamente bajas y la naturaleza altamente dinámica del proceso. microscopios de campo amplio son adecuados para la captura de imágenes de un solo punto de tiempo de microtúbulos marcados. Sin embargo, la microscopía de campo amplio causa más rápida photobleaching debido a los tiempos de exposición más largos y el bombardeo de la muestra con la luz fuera de foco. Del mismo modo, escaneo láser confocal son inadecuados microscopios debido al rápido fotoblanqueo. Girar el disco microscopía confocal es especialmente adecuado para la imagen dinámica de los microtúbulos en la levadura en ciernes. El sistema de microscopio confocal de disco giratorio utilizado aquí fue diseñado con estos requisitos en mente.
El sistema de microscopio debe estar diseñado para alta velocidad y alta sensibilidad. Aunque una variedad de sistemas de microscopio puede resultar adecuado, varios componentes son esenciales. Un 100Xobjetivo con una alta apertura numérica (1.45NA) es necesario para resolver los microtúbulos individuales y los cambios de longitud del orden de 100 nm. Un escáner de giro del disco confocal es necesario minimizar photobleaching y toxicidad, bloqueando la luz fuera de foco, y para maximizar la resolución y sensibilidad, mediante la recopilación de luz sólo tiene el foco. La cámara EMCCD debe ser rápido y sensible para recoger suficiente señal de GFP-TUB1 durante cada uno de 90-ms de la adquisición de lapso de tiempo. Actualmente, las cámaras EMCCD son la mejor opción para esta aplicación. Las cámaras actuales sensor CMOS carecen de la sensibilidad de EMCCDs de gama alta; Sin embargo, esta tecnología está mejorando de manera significativa y pronto puede ser adecuado. Finalmente, se necesita una etapa piezoeléctrico para el movimiento rápido y preciso en Z, que puede ser el paso limitante de la velocidad en la adquisición de imágenes de cuatro dimensiones.
El sistema de microscopio específico descrito en este protocolo puede presentar una barrera si un equipo similar no está fácilmente disponible. alteraciones cun hacerse para adaptarse a diferentes sistemas de imágenes, pero estas modificaciones pueden hacerse a expensas de la resolución temporal y / o espacial. Un motor etapa husillo guiado se puede utilizar en lugar de la etapa piezoeléctrico. Sin embargo, estos motores son más lentos, menos precisa, y con tendencia a la deriva. Posterior a la adquisición de imágenes de estabilización plug-ins se pueden utilizar para minimizar la deriva en las dimensiones XY asociados con estas etapas accionados por motor. Además, las cámaras alternas con velocidades de lectura más lentos pueden ser utilizados. Para dar cabida a una velocidad de adquisición más lento, Z-serie podría ser recogida con menos frecuencia (es decir, más tiempo entre Z-series). Sin embargo, aumentar el tiempo entre la serie Z corre el riesgo de transiciones que faltan que pueden ocurrir entre los puntos de tiempo. Alternativamente, la distancia entre Z-planos se puede aumentar como una forma de reducir el número de imágenes recogidas por Z-series. Sin embargo, el aumento de esta separación el riesgo de perder información de la imagen entre planos, lo que perjudicará la capacidad del experimentador accurtamente identificar extremos de los microtúbulos. Claramente, las alteraciones se pueden hacer para adaptarse a los sistemas de imágenes alternativos, pero estas alteraciones deben ser sopesados contra la pérdida potencial de información de la imagen.
Otra limitación de este protocolo es la pérdida de la información espacial cuando pilas de imágenes tridimensionales se convierten a proyecciones de imágenes bidimensionales. Un microtúbulos astral individual en una célula de levadura pre-anafase es típicamente entre 0,5 y 2,0 m de longitud y proyectos en todo el espacio tridimensional del citoplasma. Por tanto, es fundamental para adquirir imágenes de una serie de Z-posiciones para recoger toda la información espacial de un individuo microtúbulos. En una adquisición de lapso de tiempo, esto puede producir un conjunto de datos complejos, con 20 Z-rodajas en cada uno de los 150 puntos de tiempo, para un total de 3.000 imágenes. Para hacer frente a este reto y para simplificar el análisis de imágenes, la información espacial de los Z-pilas se comprime durante el análisis. Si bien esto benefsu análisis, se trata en el coste de la información espacial de la dimensión Z. ¿Cuánta información se pierde cuando se comprime la dimensión Z? Para estimar esta pérdida, se llevaron a cabo experimentos para medir la distancia entre SPBs en las células pre-anafase, que son relativamente fáciles de medir porque Spc110-GFP marcado SPBs exhiben focos esférica con altas relaciones de señal a ruido. Aunque el husillo puede presentar diferente desplazamiento en Z de los microtúbulos astrales, la longitud media es similar (~ 1,5! M) y por lo tanto proporciona un indicador útil. longitudes para husillos son, en promedio, 15% más largo cuando se mide en pilas de imágenes tridimensionales completos que cuando los mismos husillos se miden en las proyecciones bidimensionales (JM, resultados no publicados). Por lo tanto, el beneficio de los datos simplificados establecidos y mediciones debe ponderarse contra el costo de información Z desechado.
La comunidad de la biología celular de la levadura ha desarrollado un conjunto de herramientas versátil para Networ microtúbulos de imágenesKansas. Esto incluye una variedad de proteínas fluorescentes fusionadas a alfa-tubulina / TUB1 y marcados con diversos marcadores auxotróficos. Estas construcciones incluyen LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11, que integra en el locus LEU2 cromosómica, y varias fusiones con GFP y otros fluoróforos, que se integran en el locus URA3, incluyendo URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16, URA3 :: CFP-TUB1 (pAFS125-PPC), y URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. Además, un conjunto de fusiones TUB1 a diversas proteínas fluorescentes se ha creado recientemente que la integración objetivo ya sea al locus URA3 cromosómico o a un locus adyacente al locus TUB1 nativo 18. Esta extensa paleta de fluoróforos y marcadores es muy útil para los experimentos de co-localización con proteínas diferencialmente marcadas. La fusión GFP-TUB1 sigue siendo la mejor herramienta para la formación de imágenes de lapso de tiempo de microtula dinámica del bule debido a su brillo y fotoestabilidad. La fusión GFP-TUB1 creado por la canción y Lee (pSK1050) 11 contiene una fusión de GFP con el extremo amino-terminal de α-tubulina / TUB1 y se integra en el locus LEU2 para rescatar auxotrofia leucina. Así, la proteína de fusión se expresa ectópicamente además de α-tubulina nativa y comprende ~ 20% del total α-tubulina en la célula 9. Es importante destacar que la fusión GFP-TUB1 no rescata la función de α-tubulina / TUB1 (JM, resultados no publicados) nativas. Esto también es cierto de otra fusión TUB1 construye 18.
Con las herramientas disponibles para visualizar los microtúbulos y sus proteínas de unión, la levadura en ciernes es un sistema ideal para estudiar las mutaciones en tubulinas y otros reguladores de los microtúbulos. Además, el número limitado de genes de tubulina permite el estudio directo de una piscina homogénea de tubulina mutante. Además de las mutaciones engenes de tubulina, la levadura en ciernes tiene un número de proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs) que son homólogas a las contrapartes metazoos. Estos mapas pueden ser estudiados directamente, y los efectos que tienen mutaciones en los filamentos de microtúbulos individuales también pueden ser examinadas. El protocolo detallado aquí permite la investigación de los procesos tanto intrínsecos y extrínsecos que influyen en la dinámica de los microtúbulos.
En resumen, los microtúbulos deben ser dinámicos para funcionar correctamente durante muchos procesos celulares. Es necesario entender los factores intrínsecos a la tubulina y las proteínas extrínsecas asociado que regulan la dinámica de microtúbulos. Levadura en ciernes es un sistema ideal para estudiar el efecto de estos factores mediante la cuantificación directamente la dinámica de un solo microtúbulos. El protocolo detallado anteriormente describe cómo integrar de forma estable una proteína de fusión fluorescente en el genoma de la levadura y la forma de adquirir y analizar la imagen confocal apila para cuantificar la dinámica de microtúbulos in vivo
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Kerry Bloom (Universidad de Carolina del Norte), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Universidad del Estado de Colorado), y Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) para compartir diversos plásmidos FP-TUB1. Estamos muy agradecidos a Melissa Gardner (Universidad de Minnesota) para nosotros la formación en el método de preparación cámara de diapositivas. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de conceder R01GM112893-01A1 (a JKM) y T32GM008730 (a CE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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