L'imagerie à haute résolution et d'analyse de l'individu Astral microtubules Dynamique dans la levure bourgeonnante

Summary

Levure bourgeonnante est un modèle avantageux pour l' étude de la dynamique des microtubules in vivo en raison de sa génétique puissante et la simplicité de son cytosquelette de microtubules. Le protocole suivant décrit comment transformer des cellules de levure et de culture, d'acquérir des images de microscopie confocale, et analyser quantitativement la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure.

Abstract

microtubules dynamiques sont fondamentales pour de nombreux processus cellulaires et des mesures précises de la dynamique des microtubules peut donner un aperçu de la façon dont les cellules régulent ces processus et la façon dont la régulation de l'impact des mutations génétiques. La quantification de la dynamique des microtubules dans les modèles métazoaires a un certain nombre de défis associés, y compris une forte densité de microtubules et les limitations sur les manipulations génétiques. En revanche, le modèle de levure bourgeonnante offre des avantages qui permettent de surmonter ces défis. Ce protocole décrit un procédé pour mesurer la dynamique des microtubules simples dans des cellules vivantes de levure. Les cellules exprimant la tubuline marqués par fluorescence sont collées à des chambres à glissière assemblés, ce qui permet l'acquisition d'image stable time-lapse. Un guide détaillé pour la grande vitesse, l'acquisition d'images en quatre dimensions est également fourni, ainsi qu'un protocole pour quantifier les propriétés des microtubules dynamiques dans des piles d'images confocales. Ce procédé, associé à la génétique des levures classiques, provIdes une approche qui est particulièrement bien adapté pour évaluer quantitativement les effets des régulateurs de microtubules ou des mutations qui modifient l'activité des sous-unités de tubuline.

Introduction

Les microtubules sont des polymères cytosquelette en sous-unités protéiques aß-tubuline et sont utilisés dans une grande variété de contextes cellulaires, y compris le transport intracellulaire, la division cellulaire, la morphogenèse et la mobilité. Pour construire des réseaux de microtubules pour ces divers rôles, les cellules doivent réguler soigneusement où et quand la forme de microtubules. Cette régulation se fait en contrôlant les réactions que soit l'assemblage des sous-unités aß-tubuline en microtubules des polymères ou des microtubules démonter en sous-unités libres; ceci est connu comme la dynamique des microtubules.

Un objectif majeur de la zone de microtubule est d'élucider les mécanismes moléculaires qui régulent la dynamique des microtubules, y compris des études sur les sous-unités aß-tubuline et les régulateurs extrinsèques qui se lient à la tubuline et / ou aux microtubules. Une approche expérimentale bien établie est de reconstituer ce système in vitro en utilisant la protéine αβ-tubuline purifiée, souvent comavec les régulateurs extrinsèques binaison purifiés. Bien que ce soit une approche utile, il est clair que la dynamique des microtubules dans les systèmes fortement reconstitué diffère de celle observée dans les cellules vivantes. Par exemple, les microtubules croissent plus vite et rétrécissent plus lente in vivo que in vitro. Ces différences peuvent être attribuées à la disponibilité des régulateurs connus extrinsèques ^1, ainsi que des facteurs encore à définir et dans les cellules. Par conséquent, il est essentiel de déterminer les activités des régulateurs des microtubules et des mutants qui perturbent la dynamique dans un contexte cellulaire natif.

Bien que les modèles métazoaires se sont avérés être les systèmes en vigueur pour enquêter sur la fonction des microtubules et de l'organisation d'ordre supérieur, plusieurs préoccupations pratiques limitent sérieusement l'utilité de ces modèles pour la mesure précise de la dynamique des microtubules. Tout d'abord, le nombre élevé de microtubules, allant de dizaines à des milliers par cellule, il est difficile de confiancesuivre les microtubules individuels au fil du temps. De nombreuses études abordent ce défi en imagerie des protéines qui localisent sélectivement aux extrémités microtubules, telles que les protéines de la famille contraignante fin (EB). Cependant, ces protéines sont connues pour ne localiser aux extrémités de microtubules de plus en plus métazoaires ^2. Par conséquent, l'utilité de ces protéines est limitée à des taux de croissance mesurant directement, alors que la mesure indirectement d'autres aspects de la dynamique, comme la fréquence de la catastrophe. D'autre part, malgré les progrès de la technologie de montage sur le génome, la création de cellules qui expriment de manière stable marqué par fluorescence mutations tubuline ou l'introduction de manipuler sélectivement tubuline ou régulateurs microtubules reste un défi important. De plus, la présence de nombreux isotypes de tubuline dans l'étude métazoaires déconcerte de la façon dont les mutations affectent les gènes individuels de tubuline.

Le système de levure bourgeonnante offre plusieurs avantages importants pour la mesure dans microtubu vivodynamique. Le La levure a un réseau de microtubules simplifié qui permet la visualisation des microtubules individuels. Dans la levure, les microtubules émanent de l' organisation des centres appelés corps polaires broche (de), qui SPB sont incorporés dans l'enveloppe nucléaire ^3. Les SPB servent échafaudages pour les petits complexes y-tubuline qui nucléée microtubules ^{4, 5.} SPBs deux classes de nucléée microtubules, microtubules broche et microtubules astraux. Projet de broche de microtubules dans le nucléoplasme et sont importants pour la fixation à des chromosomes via microtubules kinétochoriens et pour la stabilisation de la broche par l' intermédiaire de chevauchement microtubules interpolaires ^6. En revanche, le projet de microtubules astraux vers l'extérieur dans le cytosol et sont relativement rares par rapport au réseau dense de microtubules du fuseau. Au cours de la mitose, les cellules pré-anaphase ont seulement 1-2 microtubules astraux émanant de deux SPB; ceux-ci existent en tant que imicrotubules ertaines plutôt que sous forme de faisceaux ^7. Le rôle des microtubules pendant la mitose astrale consiste à déplacer le noyau et la broche dans la jonction entre la mère et les compartiments bourgeon, connu sous le col du bouton. Ce mouvement implique des voies bien définies qui génèrent la force sur les microtubules astraux, en tirant le noyau et la broche en direction et , éventuellement , dans le col du bouton ^8.

Un autre avantage du système de levure est l'utilité de la génétique, qui peuvent être utilisés pour étudier les organismes de réglementation des microtubules et des sous-unités de tubuline avec une précision sans précédent. La levure possède également un répertoire simplifié de tubuline isotypes: un seul gène β-tubuline (TUB2) et deux gènes d' a-tubuline (Bain1 et TUB3). Des mutations peuvent être facilement introduits dans ces gènes et , par conséquent étudié dans une population homogène de la tubuline ^{9, 10.} Il y a un certain nombre de trèsconstructions disponibles pour microtubules d'étiquetage, et ceux-ci peuvent être ciblés pour l'intégration au locus chromosomique pour une expression stable (voir la discussion).

Le but général de cette méthode est d'images individuelles microtubules dans des cellules vivantes de levure en quatre dimensions (X, Y, Z et T) pour des mesures de haute résolution de la dynamique des microtubules. Des procédés pour l'intégration des constructions pour la constitutive, l'expression de faible niveau de tubuline marqué par fluorescence dans les cellules de levure sont décrits. Avant imagerie, les cellules vivantes sont montées dans des chambres de lame enduite avec la lectine concanavaline A pour stabiliser les cellules pour l'imagerie à long terme. Les paramètres optimaux pour l'acquisition d'images, ainsi qu'un flux de travail pour l'analyse des données, sont également décrites.

Protocol

1. Préparation des plaques -Leu Dropout

1. Ajouter 800 ml d'eau stérile, déminéralisée ₍₂ Dih O) dans un ballon de 2 L. Ajouter 26,71 g de poudre de base de décrochage (DOB), 0,69 g de CSM-Leu, et 20 g d'agar. Mélanger avec un barreau d'agitation magnétique. Porter à 1 L avec Dih ₂ O.
2. Autoclave à 121 ° C et 19 psi pendant 30 min.
3. Retirez le flacon de l'autoclave et laisser refroidir à ~ 65 ° C sous agitation douce.
4. Verser 30 ml / plaque dans des plaques de 100 mm de diamètre. Que ces reposer à température ambiante pendant 36-48 h avant de le ranger à 4 ° C.

2. Intégration GFP-tub1 pour l'expression Constitutif de tubuline marqué GFP

1. Faire bouillir une concentration stock de 10 mg / ml d'ADN simple brin (ADNsb) pendant 3 min.
2. Moissonneuse 2 ul de l' ADN sb bouillie avec 400 ng d'ADN de plasmide GFP-Bain1 purifié ^11.
   NOTE: Il existe une variété de plasmides qui peuvent être utilisés pour l'écurie, le marquage fluorescentdes microtubules dans la levure qui utilisent des fluorophores et des marqueurs sélectionnables alternatifs. Certaines de ces solutions sont décrites dans la section Discussion.
3. Ajouter le mélange d'ADN à une aliquote de 50 ul de cellules de levure compétentes.
   NOTE: Préparer des cellules de levure compétentes avec une solution de sorbitol (SORB; 100 mM LiOAc, Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM pH 8, et 1 M de sorbitol, ajusté avec de l'acide acétique dilué à pH 8). Pour obtenir une description détaillée de la fabrication de cellules de levure compétentes, voir référence ^12.
4. Vortex à fond.
5. Ajouter 6x le volume total de solution de polyéthylène glycol (PEG) (100 mM LiOAc, Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM / NaOH pH 8, et 40% de PEG 3350) au mélange ADN-cellules.
6. Vortex à fond.
7. Incuber pendant au moins 1 h à 30 ° C sous agitation douce.
8. Ajouter le diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10% du volume total et vortex.
9. Incuber à 42 ° C pendant 15 min.
10. Centrifuger à 2500 g pendant 5 min.
2 O. Dih
11. Cellules de la plaque sur une plaque de décrochage -Leu.
    REMARQUE: La construction GFP-Bain1 contient un marqueur d'auxotrophie de la leucine, tandis que d'autres constructions peuvent utiliser un marqueur de substitution. Le milieu d'abandon doit être spécifique au marqueur auxotrophe de la construction.
12. Laisser les cellules transformées de croître pendant 3-5 jours à 30 ° C.
13. Re-série de simples colonies de transformation sur une plaque fraîche de décrochage -Leu en transférant des colonies en utilisant un cure-dent autoclave. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C.
14. Cribler visuellement chaque transformant pour un signal de GFP par mise en suspension d' environ 1 ul de cellules à partir d' une seule colonie de la plaque à l' étape 2.14 dans 2 pl d'eau sur une lame propre. Couvrir les cellules en suspension avec une lamelle et observer par microscopie à fluorescence.
    1. Exciter les transformants avec 488 nm de lumière et rechercher la présence d'un signal de GFP.
       

3. Stimuler la culture de levure liquide

1. Ensemencer ~ 1 pi de cellules de levure à partir d'une seule colonie sur une plaque dans 3 mL de milieu complet synthétique. Permettre aux cellules de croître pendant une nuit à 30 ° C sous agitation à 250 tours par minute.
2. Diluer la culture saturée le jour suivant à une DO ₆₀₀ <0,1 dans le milieu. Retour de la culture diluée à l'agitateur 30 ° C pendant 3-4 h ou jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ est compris entre 0,4 et 0,8, lorsque les cellules sont prêtes à être chargées dans des chambres pour l' imagerie.

4. Préparer les diapositives Chambre de circulation

1. Couperune feuille de film de paraffine en une pièce 4 en largeur et 7 en longueur.
2. Placer une lame de microscope standard de la longueur sur la largeur de 4 pouces de film de paraffine et enrouler le film autour de la glissière 3-4 fois de telle sorte que la lame est recouverte d'un film qui a une épaisseur de 3-4 couches. Appuyez sur les couches ensemble pour qu'il y ait un joint raisonnable; ce sera plus facile à couper. Évitez d'appuyer trop fort ou faire le film à se froisser.
3. Couper le film de paraffine le long des bords extérieurs de la lame en utilisant un rasoir de cutter propre. Utiliser une autre glissière pour fournir un bord droit pour la coupe.
4. Pelez le film excès de la lame de travail et le jeter. Les piles restantes du film couvrir une face de la lame et seront utilisés pour fabriquer les parois entre les chambres d'imagerie.
5. Utilisation de la deuxième coulisse en ligne droite, coupe les couches de film superposées le long de l'axe long de la glissière dans environ dix bandes, chacune de 2 à 4 mm de largeur.
6. Couper les couches de film de paraffine empilées perpendiculairement àles coupes faites à l'étape 4.5, le long du petit axe de la glissière, pour créer des bandes de 2-4 mm de large, 23-24 mm de long et 3-4 couches épaisses.
7. Éplucher les bandes découpées au moyen d'un rasoir à un angle de 45 °. En utilisant des pinces, répartir uniformément les bandes de film coupé sur une lame de microscope propre à créer les nombres désirés de chambres. Jusqu'à 3 chambres (4 à base de bandes de film de paraffine) peuvent être créés sur une diapositive.
8. Placer une seule lamelle couvre-objet au-dessus des bandes de film et de le déplacer en position avec une pince.
9. Placer la lame préparée, lamelle couvre-objet en place, sur une plaque chauffante réglée à ~ 95 ° C (ce qui est approximativement le réglage basse-moyenne sur la plupart des plaques de cuisson). Chauffer la glissière jusqu'à ce que les bandes de film sont translucides (environ 3 min), puis sceller la lame et lamelle ensemble en appuyant légèrement sur la lamelle avec la pince à épiler.
   NOTE: Il est important de ne presse sur les régions du qui sont directement lamelle au-dessus des bandes de film de paraffine, comme gratter les régions au-dessus du cHambers peuvent diminuer la qualité de l'image. Prenez soin de ne pas trop chauffer la lame; vaporisée couche de film de la volonté de la intérieur de la chambre avec un film hydrophobe qui empêche les cellules d'adhérer.
10. Utiliser des pinces pour retirer la lame de la plaque de cuisson (le coulisseau sera chaud) et mettre de côté pour refroidir avec le côté de la lamelle orientée vers le haut; que la lame se refroidit, le film sera de retour à une coloration blanche, opaque.
    NOTE: A ce stade, les lames sont prêtes à être chargées avec des cellules de levure cultivées. diapositives supplémentaires peuvent être faites à ce point et stockés dans un endroit propre et sec pour une période de temps indéfinie.

5. Les cellules de levure de chargement dans les diapositives chambre de circulation Préparés

1. Décongeler une gelée, 200 uL aliquote de la concanavaline A (2 mg / ml dans Dih ₂ O stérile).
2. Ajouter environ 100 ul de décongelé Concanavaline A à chaque chambre de la lame préparée par pipetage dans l'une des extrémités ouvertes. Ajouter assez concanavaline A pour remplir la chambre. Pour ce step, la concanavaline A sera tiré à travers la chambre par action capillaire.
3. Accrocher la lame, la lamelle vers le bas, entre les deux supports pour tubes de microcentrifugation ou les stylos pendant 5 minutes pour permettre à la Concanavaline A à adhérer à la lamelle couvre -objet ( par exemple, la chambre).
4. Retour la diapositive à une position de lamelle couvre-up. Laver la chambre avec 2x volume de la chambre (déterminée à l' étape 5.2, ci - dessus; environ 200 pi) de milieu complet synthétique pour enlever la concanavaline A.
   1. L'écoulement du milieu à travers la chambre, en utilisant soit le coin d'une serviette en papier ou un papier filtre plié en deux pour aspirer le fluide sur une extrémité de la chambre tandis que simultanément le pipetage du fluide frais dans l'autre. En variante, en utilisant un aspirateur à vide pour aspirer soigneusement le fluide hors d'une extrémité tandis que le pipetage de liquide frais dans l'autre.
5. Les cellules de charge en faisant circuler 2x le volume de la chambre (environ 200 ul) de la suspension cellulaire (étape 3.4) en utilisant le métho d'écoulement dirigéeD décrit à l'étape 5.4.1.
   NOTE: L'objectif est à l'image d'une seule couche de cellules à la lamelle. Par conséquent, il est important de charger une concentration de cellules suffisamment petites pour ne pas empiler les uns sur les autres, mais assez grandes que les cellules suffisantes sont présentes sur le terrain pour collecter le maximum de données par acquisition d'images. La concentration optimale des cellules à l'intérieur de la chambre peut varier et doit être déterminée empiriquement. Pour augmenter la concentration de cellules dans la chambre d'écoulement, d'une pastille doucement la culture de cellules à 1000 g pendant 2 min et enlever une partie du surnageant. Pour diminuer la concentration de cellules, ajouter un milieu complet synthétique frais à la suspension cellulaire. La concentration des cellules peut être évaluée après l'étape 5.7 (ci-dessous) par l'inspection de la chambre sur un microscope à contraste de phase. A ce stade, les cellules peuvent être ajoutés à la chambre en faisant circuler la suspension de cellules plus. Cependant, la réduction de la densité des cellules à ce stade n'est pas possible et est mieux atteinten chargeant une nouvelle chambre avec une suspension cellulaire diluée.
6. Accrocher la lame couvre-objet vers le bas, tel que décrit à l'étape 5.3, pendant 10 minutes pour permettre aux cellules d'adhérer à la lamelle.
7. Rincer les cellules non collées par écoulement à travers 4x le volume de la chambre (environ 400 pi) de milieu complet synthétique. Cela permettra d'éliminer les cellules flottantes dans la chambre, ce qui peut contaminer l'acquisition d'images.
8. sécher soigneusement chaque extrémité de la chambre avec un coin propre d'une serviette en papier, ce qui porte le ménisque sur le bord de la lamelle.
9. Fermer chaque extrémité de la chambre à agent d' étanchéité à chaud (75 ° C) (par exemple, valap; parties égales de gelée de pétrole, la cire de laine, et de cire de paraffine).
   NOTE: A ce stade, la diapositive est prêt à l'image. Les chambres peuvent être imagés jusqu'à 9 h, en fonction de la densité de cellules dans chaque chambre. Les cellules vont produire du dioxyde de carbone (CO ₂₎ dans le temps, ce qui permettra de créer progressivement les bulles qui déplacent les cellules.

1. Amener le coulisseau à un microscope inversé équipé d'un objectif CFI Plan Apo 1,45 NA 100X, un étage piézo-électrique, un disque rotatif scanner confocal, un laser d'illumination, et une caméra EMCCD. Maintenir la température de l'étape à la température ambiante (25 ° C) lors de l'acquisition.
   REMARQUE: La grande ouverture numérique permet une plus grande résolution d'image, et l'étage piézo-électrique permet l'acquisition z-stack à vitesse élevée. Les exigences minimales de microscope sont l'objectif 100X, le laser d'éclairage, et la caméra EMCCD.
2. Amener les cellules dans le foyer. Faire en sorte que le champ d'acquisition comporte au moins 5-6 cellules regroupées en recherchant le glissement pour les cellules regroupées.
   REMARQUE: Bien qu'il ne soit pas nécessaire à l'image plus d'une cellule à la fois, l'imagerie de plusieurs cellules dans le même domaine améliore l'efficacité de l'acquisition de données sans nuire à la qualité des données. Cependant, il est essentiel que lales cellules sont sur le même plan focal et non empilés l'un sur l'autre.
3. Programmez une acquisition multidimensionnelle pour collecter plusieurs séries z au fil du temps.
   1. Ajuster les paramètres dans les paramètres d'acquisition actifs à ce qui suit: Z-profondeur totale = 6 um, pour englober toute la cellule de levure; taille Z-step = 300 nm, afin de maximiser la collecte de la lumière sans suréchantillonnage; durée totale = 10 min; intervalles de temps = Z-série tous les 4 s; et le temps d'exposition = 90 ms pour chaque plan z.
      NOTE: Le temps d'exposition optimale varie en fonction de l'appareil photo, la source lumineuse d'excitation et d'autres facteurs. En général, le temps d'exposition optimal sera le temps minimum nécessaire pour atteindre un rapport 3: 1 du signal provenant de microtubules astraux marqué GFP pour signaler à partir du cytoplasme en fonction des valeurs de pixels mesurées par le EMCCD.
4. Commencez l'acquisition en cliquant sur « Exécuter ». Lui permettre de fonctionner pendant toute la durée de 10 min. Enregistrer les données sous forme d'imagesérie (Tiff ou .nd2).
5. Sélectionnez un nouveau champ à l'image dans la chambre et répétez les étapes 06.02 à 06.04.
   Remarque: Une seule chambre doit donner entre 15 et 20 champs de cellules, en fonction de la densité de cellules dans la chambre. Densités cellulaires plus élevées produiront des champs totaux inférieurs, comme le CO ₂ dans la chambre va construire plus rapidement.

7. Analyse de l'image

1. Ouvrez le fichier image dans ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) en tant que HyperStack en utilisant le plugin importateur bio-formats.
   1. Ouvrir ImageJ et faire glisser la pile d'images acquises à partir de la section 6 directement sur le panneau de commande. L'importateur bio-formats démarre automatiquement. Sélectionnez « Ok » pour charger la pile d'image en tant que HyperStack.
      NOTE: Les « Bio-formats Options d'importation » rapide sera ouvert et faire en sorte que sous la « pile Voir section », « Vue pile avec: » est réglé sur « HyperStack »; et « Ordre d'empilement: » est réglé sur « XYCZT. »
2. Réduire chaque Z-série en une intensité maximale, projection à 2 dimensions en utilisant la fonction Z-projet.
   1. Sélectionnez le menu « Image », le sous-menu « Stack » et la fonction « Z-projet ». Sélectionnez « projection maximale » dans la liste déroulante et cliquez sur « Ok. »
3. Appliquer un filtre médian à la pile d'image pour réduire le bruit de mouchetures en sélectionnant le menu « Process », le sous-menu « Filtres » et la fonction « médiane ». Entrez 2.0 pixels dans la zone de rayon et cliquez sur « Ok. »
4. Identifier les cellules pré-anaphase dans le domaine.
   NOTE: Ceux - ci sont caractérisés par des boutons de taille moyenne et un court fuseau mitotique, de 1 à 1,5 mm de longueur (figure 1; la flèche pointe vers une broche de court-mitotique). Les cellules à ce stade sont idéales pour analyser la dynamique des microtubules, car ils présentent généralement qu'une few microtubules astraux émanant des pôles du fuseau ^7. Astral microtubules peuvent être identifiées sous forme de filaments linéaires qui présentent une intensité de signal de la GFP uniforme de l'extrémité moins, au SPB, à l'extrémité plus, dans le cytoplasme.
5. A partir du premier point temporel de la série d'images, en utilisant l'outil de ligne segmentée pour tracer une ligne le long d'un microtubule unique astrale, à partir de l'extrémité moins, situé à la jonction entre le microtubule astrale et les microtubules plus broche intensément marqués, à la fin, plus qui se trouve dans le cytoplasme (voir les lignes rouges dans la figure 1). Double-cliquez sur la fin de la microtubules pour compléter la ligne segmentée.
6. Enregistrer la mesure dans le tableau des résultats en utilisant la fonction « mesure » en appuyant sur le bouton « M » sur le clavier.
   REMARQUE: Les fonctions supplémentaires, telles que l'intensité de gris, peuvent être enregistrés en définissant les mesures dans le menu « Analyser » et le sous-menu « Définir des mesures ».
7. Avance à la prochaine timepoint soit en cliquant sur la flèche droite dans la barre Z-curseur ou en appuyant sur la touche « ./> » sur le clavier. Répétez les étapes 7.5 et 7.6 pour tous les points de temps dans la séquence d'images.
8. Copiez les données du tableau des résultats et de les coller dans une feuille de calcul. Sauvegardez les données en sélectionnant « Enregistrer sous. »
   NOTE: Ces mesures comprennent plusieurs valeurs, mais les valeurs les plus importantes sont la tranche, ce qui indique le point temporel de la série, et la longueur, ce qui indique la longueur de la ligne (c. -à- microtubules astral). Les colonnes contenant d' autres mesures (par exemple, la zone, la valeur de pixel moyenne, l' angle, etc.) peut soit être maintenu ou mis au rebut.
9. Créer une nouvelle colonne dans la feuille de calcul en cliquant à droite et en utilisant la fonction « Insérer ». Saisir le temps (s) de chaque point de temps.
10. Créer un diagramme de dispersion XY de la longueur de microtubules (um) en fonction du temps (s) en utilisant le « Insérer une ligneGraphique » fonction, sélectionnez les mesures de longueur comme « Y » et la colonne de temps que « X »
    1. Identifier des régions de la polymérisation, la dépolymérisation et pause en recherchant des changements positifs et négatifs de longueur dans le temps sur le diagramme de dispersion de l'étape 7.10.
       NOTE: les événements de polymérisation augmentent la longueur des microtubules d'au moins 0,5 um sur un minimum de 3 points de temps et ajuster une régression linéaire avec un R ² ≥ 0,9 et une valeur R> 0 (figure 1B et D, points verts). Les événements de dépolymérisation des microtubules diminuer la longueur d'au moins 0,5 um sur un minimum de 3 points de temps et ajuster une régression linéaire avec un R ² ≥ 0,9 et une valeur de R <0 (Figure 1B et D, des points roses). les événements de pause sont séparés de polymérisation et de dépolymérisation. Les pauses sont définis comme étant la variation nette de la longueur des microtubules inférieure à 0,5 um sur un minimum de 3 points de temps;ajuster une régression linéaire avec une valeur R entre -0,4 et 0,4; et ont une pente qui ne sont pas statistiquement différents de zéro, telle que déterminée par un test F.
    2. En utilisant le diagramme de dispersion comme guide, identifier les sections du moment où le changement de longueur est positive et les mettre en évidence dans une couleur verte. Mettez en évidence les régions du moment où le changement de longueur est négatif dans une couleur rose.
    3. Calculer la régression linéaire de chaque section de mise en évidence et enregistrer la R- et R ² -valeur pour chaque section dans les colonnes proximale aux régions. Classer chaque région colorée soit comme un événement de polymérisation ou d'un événement de dépolymérisation.
11. Calculer les vitesses de polymérisation en divisant la variation nette de longueur par le changement dans le temps pour chaque événement de croissance. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de régression linéaire de l'étape 7.10.3.
12. Calculer les taux de dépolymérisation en divisant la variation nette de longueur par le changement dans le temps pour chaque shrinking événement. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de taux de polymérisation de l'étape 7.11.
13. Calculer la fréquence de catastrophe en divisant le nombre de transitions polymérisation-à-dépolymérisation par le temps total de tous les événements de croissance ^13. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de taux de dépolymérisation de l'étape 7.12.
14. Calculer la fréquence de secours en divisant le nombre de transitions dépolymérisation-à-polymérisation par la durée totale de tous les événements de retrait ^13. Enregistrer ces résultats dans la colonne adjacente aux valeurs de fréquence de catastrophe de l'étape 7.13.
15. Calculer la dynamicité en divisant la somme de la valeur absolue de toutes les variations de longueur de la durée totale de l'acquisition d'image, calculée à l' étape 7.10.1, et en multipliant par 27,0833 pour obtenir des sous - unités de tubuline par seconde ^14. Enregistrez ces résultats dans la colonne adjacente à la fréquence de secours values de l'étape 7.14 et enregistrez le tableau des résultats.
    NOTE: Il est possible d'automatiser le processus d'analyse décrit dans les étapes 7.10-7.15 à l' aide d' un programme sur mesure (. Estrem, et al, manuscrit soumis). Le programme est conçu pour identifier les périodes de la polymérisation et de la dépolymérisation dans les mesures de longueur en suivant les paramètres décrits ci-dessus.

Representative Results

Mesure de la dynamique des microtubules dans les cellules vivantes de levure fournit un outil convaincant pour évaluer comment des mutations dans les gènes codant pour des régulateurs de microtubules ou des sous-unités de tubuline polymérisation d'impact et des taux de dépolymérisation, ainsi que la fréquence de transition entre ces états. La figure 1 montre une série temporelle de la dynamique des microtubules astraux dans une cellule de type sauvage et une cellule mutante ayant une mutation dans β-tubuline (tub2- 430Δ). Les microtubules sont marquées avec des α-tubuline marqués de la GFP à visualiser la longueur des microtubules. Les flèches rouges tracent la longueur de la microtubule astrale dans chaque image (Figure1A et 1 C). Les longueurs de microtubules ont été mesurées à chaque heure pendant 8 minutes, et ces longueurs compilées sont représentés dans des parcelles de vie (Figure 1B et 1 D). Ces données ont été utilisées pour déterminer le taux de polymérisation, le taux de dépolymérisation, polymérisation duratisur, la durée de dépolymérisation, la fréquence de secours, la fréquence des catastrophes et dynamicité.

Figure 1. imagerie time-lapse de microtubules marqué GFP et mesures d'Astral microtubules Dynamics. (A et C) Les cinq premières images séquentielles d'imagerie à laps de temps pour le type sauvage et tub2 -430Δ cellules mutantes. Les microtubules sont marquées avec GFP-Bain1 et imagés dans le pré-anaphase du cycle cellulaire. Chaque image est une projection d'intensité maximale à partir d'une série Z confocal. Barres d'échelle: 1 um. Timestamps indique le temps total à chaque acquisition de cadre. Les flèches rouges suivent le long de la longueur totale d'un microtubule astrale, avec des pointes de flèches désignant les extrémités comprises. (B et D) des parcelles de vie microtubules afficher les longueurs des microtubules astraux uniques dans le temps. Le point verts désignent la polymérisation et les points roses représentent dépolymérisation. Les pointes de flèches pointent à des événements de catastrophe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La figure 1 montre la dynamique des microtubules modifiés entre une souche de type sauvage et une souche mutante dépourvue des 27 acides aminés de la β-tubuline de l'extrémité C-terminale, un mutant qui a été précédemment démontré que les microtubules plus stables ^15. Comme le montre dans les parcelles de vie des microtubules, les microtubules dans le mutant -430Δ de tub2 est plus longue et présente moins de catastrophes que les microtubules de type sauvage (figure 1B et D pointes de flèches; tableau 1). En outre, la polymérisation et la dépolymérisation des taux, déterminées à partir des pentes de la monter et descendre microtubules lengths, sont diminuées chez le mutant par rapport au type sauvage (Figure 1B et 1D; tableau 1). Enfin, le microtubules dans la cellule mutante tub2 -430Δ passe plus de temps dans des états de polymérisation et de dépolymérisation et a diminué par rapport à la dynamicité de type sauvage (tableau 1).

Souche	Dynamicité (sous - unités / s)	Taux de polymérisation (um / min)	% Temps de polymérisation	Taux de Depolym (um / min)	% Temps Depoly- merization	% Temps de pause	Fréquence de sauvetage (événements / min)	Fréquence de catastrophe (events / min)
De type sauvage n = 1	54	1,8 ± 0,5	48	3,0 ± 0,3	29	3	1.8	1.4
tub2-430Δ n = 1	40	1,4 ± 0,1	41	1,5 ± 0,2	32	0	0,8	0,7
Les abréviations sont les suivantes: pm, micron; min, minute; s, d'autre part; n, microtubules seule analyse de la parcelle de vie microtubules (Fig1B, D). Les valeurs sont des moyennes ± écart-type de la moyenne.

Tableau 1: Mesures sur les microtubules dynamique des cellules de la figure 1. Les valeurs sont la moyenne ± erreur type de la moyenne à partir des mesures des microtubules individuelles représentées sur la figure 1.

Discussion

Le modèle de levure bourgeonnante offre des avantages majeurs pour la collecte des mesures de haute résolution de la dynamique des microtubules dans un cadre in vivo, y compris la capacité à image unique microtubules au fil du temps et la possibilité de manipuler tubuline et des régulateurs de microtubules en utilisant les outils de la génétique de levure.

Les chambres revêtues A concanavaline fournissent un certain nombre d'avantages par rapport aux dispositifs décrits précédemment, y compris des tampons d'agar fondu. Les lames avec des chambres peuvent être pré-fabriqués et stockés à long terme ou peuvent être utilisés immédiatement. De plus, les chambres revêtues de concanavaline A sont capables de cultiver des cellules de levure pendant> 6 heures dans le même milieu dans lequel les cellules ont été initialement cultivées. Il est important de noter que le nombre de cellules dans la chambre dictera combien de temps la chambre peut être visionnée. Les chambres revêtues de veiller à ce que seule une couche unique de cellules de levure adhère à la lamelle. Enfin, la création de plusieurs chambres permetplusieurs différentes souches de levure à imager sur la même lame.

Il y a des défis majeurs à l'imagerie dynamique des microtubules dans la levure en herbe, y compris les niveaux de signal relativement faibles et la nature hautement dynamique du processus. microscopes sont adéquats pour grand champ capture d'images unique timepoint de microtubules marqués. Cependant, la microscopie à champ large provoque photoblanchiment plus rapide grâce à des temps d'exposition plus longs et le bombardement de l'échantillon avec hors-focus lumière. De même, les microscopes confocale à balayage laser sont insuffisantes en raison de photoblanchiment plus rapide. Spinning microscopie confocale à disque est particulièrement bien adapté pour l'imagerie dynamique des microtubules dans la levure bourgeonnante. Le disque rotatif système de microscope confocal utilisé ici a été conçu avec ces exigences à l'esprit.

Le système de microscope doit être conçu pour la grande vitesse et une sensibilité élevée. Bien qu'une variété de systèmes de microscope peut se révéler approprié, plusieurs éléments sont essentiels. A 100Xobjectif avec une ouverture numérique élevée (de 1.45NA) est nécessaire pour résoudre les microtubules individuels et les changements de longueur de l'ordre de 100 nm. Un dispositif de balayage confocal à disque en rotation est nécessaire pour réduire au minimum le photoblanchiment et la toxicité, en bloquant l'extérieur de la mise au point de lumière, et de maximiser la résolution et la sensibilité, en recueillant seulement de mise au point de la lumière. La caméra EMCCD doit être rapide et sensible pour recueillir suffisamment le signal GFP-tub1 pendant chaque 90 ms de l'acquisition time-lapse. À l'heure actuelle, les caméras EMCCD sont le meilleur choix pour cette application. Capteur CMOS caméras actuelles manquent de sensibilité de EMCCDs haut de gamme; Cependant, cette technologie améliore de manière significative et pourrait bientôt convenir. Enfin, une étape piézoélectrique est nécessaire pour un mouvement rapide et précis dans Z, qui peut être l'étape limitante dans l'acquisition d'images à quatre dimensions.

Le système de microscope spécifique décrit dans ce protocole peut présenter une barrière si un équipement similaire ne sont pas facilement disponibles. c altérationsun être fait pour recevoir des systèmes d'imagerie différentes, mais ces modifications peuvent se faire au détriment de la résolution temporelle et / ou spatiale. Un moteur à platine entraînée par la broche peut être utilisée à la place de l'étage piézo-électrique. Cependant, ces moteurs sont plus lents, moins précis, et sujettes à la dérive. De stabilisation de l'image post-acquisition plug-ins peuvent être utilisés pour minimiser la dérive dans les dimensions XY associés à ces étapes entraînées par moteur. De plus, les caméras alternent avec des vitesses de lecture plus lents peuvent être utilisés. Pour tenir compte d' un taux d'acquisition plus lente, Z-série pourrait être moins souvent collectées ( à savoir, plus de temps entre les séries Z). Cependant, l'augmentation du temps entre les séries Z risque de transitions manquantes qui peuvent se produire entre timepoints. En variante, la distance entre Z-plans peut être augmentée comme un moyen de réduire le nombre d'images recueillies par Z-série. Cependant, l'augmentation de ce risque de perdre l'espacement des informations d'image entre les plans, ce qui nuire à la capacité de l'expérimentateur à Accuridentifier diatement extrémités des microtubules. De toute évidence, des modifications peuvent être apportées pour tenir compte des systèmes d'imagerie de remplacement, mais ces modifications doivent être mis en balance avec la perte potentielle d'informations d'image.

Une autre limitation de ce protocole est la perte de l'information spatiale lorsque des piles d'images en trois dimensions sont converties en projections d'images en deux dimensions. Un microtubule astrale individuelle dans une cellule de levure pré-anaphase est typiquement comprise entre 0,5 et 2,0 um de longueur et projets à travers l'espace en trois dimensions du cytoplasme. Il est donc essentiel d'acquérir des images d'une série de positions Z de recueillir toutes les informations spatiales d'un individu microtubules. Dans une acquisition laps de temps, ce qui peut produire un ensemble de données complexes, avec 20 Z-tranches à chacun des 150 points de temps, pour un total de 3000 images. Pour relever ce défi et de simplifier l'analyse de l'image, l'information spatiale des Z-piles est comprimé lors de l'analyse. Bien que cette bénéfson analyse, il est au prix de l'information spatiale de la dimension Z. Combien d'informations est perdu lorsque la dimension Z est comprimé? Pour estimer cette perte, des expériences ont été menées pour mesurer la distance entre SPBs dans les cellules pré-anaphase, qui sont relativement faciles à mesurer, car Spc110-GFP marqué SPBs présentent des foyers sphériques avec des rapports de haut signal au bruit. Bien que la broche peut présenter un déplacement différent de Z que microtubules astraux, la longueur moyenne est proche de (~ 1,5 pm) et fournit donc une approximation utile. longueurs de broche sont, en moyenne, plus de 15% lorsqu'elle est mesurée dans des piles d'images complètes à trois dimensions que lorsque les mêmes broches sont mesurées dans les projections à deux dimensions (JM, résultats non publiés). Ainsi, l'avantage des données simplifiées établies et des mesures doivent être mis en balance avec le coût de l'information Z mis au rebut.

La communauté de la biologie des cellules de levure a mis au point une boîte à outils polyvalent pour l'imagerie microtubules networks. Cela comprend une variété de protéines fluorescentes fusionnées à l'a-tubuline / Bain1 et marquées avec divers marqueurs auxotrophes. Ces constructions comprennent LEU2 :: GFP-Bain1 (pSK1050) ^11, qui intègre au niveau du locus LEU2 chromosomique et plusieurs fusions de GFP et d' autres fluorophores, qui intègrent au niveau du locus URA3, y compris URA3 :: GFP-Bain1 (pAFS125) ^16, URA3 :: CFP-Bain1 (pAFS125-PCP), et URA3 :: pHIS3-mCherry-Bain1 (pAK011) ^17. En outre, un ensemble de fusions Bain1 à des protéines fluorescentes différentes a été récemment créé que l' intégration de la cible soit au locus URA3 chromosomique ou à un locus adjacent au locus natif de Bain1 ^18. Cette vaste palette de fluorophores et des marqueurs est très utile pour des expériences de co-localisation avec des protéines différentiellement marquées. La fusion GFP-Bain1 reste le meilleur outil pour l'imagerie time-lapse de microtudynamique bule en raison de sa brillance et photostabilité. La fusion GFP-Bain1 créée par Song & Lee (pSK1050) ¹¹ contient une fusion de la GFP à l'extrémité amino-terminale d'α-tubuline / Bain1 et intègre au niveau du locus LEU2 pour sauver leucine auxotrophe. Ainsi, la protéine de fusion est exprimée de manière ectopique en plus d'α-tubuline native et comprend environ 20% de l'α-tubuline totale dans la cellule ^9. Fait important, la fusion GFP-Bain1 ne sauve pas la fonction de α-tubuline / Bain1 natifs (JM, résultats non publiés). Cela est également vrai d'autres constructions de fusion tub1 ^18.

Avec les outils disponibles pour visualiser les microtubules et leurs protéines de liaison, levure bourgeonnante est un système idéal pour étudier des mutations dans tubuline et d'autres régulateurs de microtubules. En outre, le nombre limité de gènes de tubuline permet l'étude directe d'un groupe homogène constitué de tubuline mutant. En plus des mutationsles gènes de tubuline, levure bourgeonnante a un certain nombre de protéines associées aux microtubules (MAP) qui sont homologues à homologues métazoaires. Ces cartes peuvent être étudiés directement, et les effets que les mutations ont unique filaments de microtubules peuvent également être examinés. Le protocole détaillé ici permet de l'enquête sur les processus intrinsèques et extrinsèques qui influent sur la dynamique des microtubules.

En résumé, les microtubules doivent être dynamiques pour fonctionner correctement pendant de nombreux processus cellulaires. Il est nécessaire de comprendre les facteurs intrinsèques à la tubuline et les protéines associées à extrinsèques qui régulent la dynamique des microtubules. levure bourgeonnante est un système idéal pour étudier l'effet de ces facteurs en quantifiant directement la dynamique d'un seul microtubules. Le protocole détaillé ci - dessus décrit comment intégrer de façon stable une protéine de fusion fluorescente dans le génome de la levure et comment acquérir et analyser l' image confocale empile pour quantifier la dynamique des microtubules in vivo

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)