Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

doi: 10.3791/55610 Published: April 20, 2017

Summary

في مهدها الخميرة هو نموذج متميز لدراسة ديناميات أنيبيب في الجسم الحي بسبب الوراثة القوية وبساطة الهيكل الخلوي أنيبيب لها. يصف بروتوكول التالية كيفية تحويل والخلايا الثقافة الخميرة، واكتساب مبائر الصور المجهري، وكميا تحليل ديناميات أنيبيب في الخلايا الحية الخميرة.

Abstract

الأنابيب الدقيقة حيوية أساسية للعديد من العمليات الخلوية، ويمكن أن قياسات دقيقة للديناميات أنيبيب توفير نظرة ثاقبة كيف تنظم خلايا هذه العمليات وكيف راثية الطفرات تنظيم تأثير. القياس الكمي لديناميات أنيبيب في نماذج متعددة الخلايا لديها عدد من التحديات المرتبطة بها، بما في ذلك الكثافة العالية أنيبيب والقيود المفروضة على التلاعب الجيني. في المقابل، فإن نموذج الخميرة في مهدها يوفر المزايا التي تغلب على هذه التحديات. يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس ديناميكية الأنابيب الدقيقة واحدة في الخلايا الحية الخميرة. يتم الالتزام الخلايا معربا عن تويولين الموسومة fluorescently إلى غرف الشريحة تجميعها، والسماح لمستقر الحصول على الصور مرور الزمن. دليل مفصل لسرعة عالية، يتم توفير الحصول على الصور رباعية الأبعاد أيضا، وكذلك بروتوكول لقياس خصائص الأنابيب الدقيقة ديناميكية في مداخن صورة مبائر. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع علم الوراثة الخميرة التقليدية، سفر الأمثالايديس وهو نهج غير مناسبة فريدة لتقييم كمي لآثار المنظمين أنيبيب أو الطفرات التي تغير نشاط مفارز تويولين.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الأنابيب الدقيقة هي البوليمرات هيكل الخلية مصنوعة من مفارز البروتين αβ تويولين وتستخدم في طائفة واسعة من السياقات الخلوية، بما في ذلك النقل داخل الخلايا، انقسام الخلايا، التشكل، والحركة. لبناء شبكات أنيبيب لهذه الأدوار المتنوعة، يجب أن خلايا تنظيم بعناية أين ومتى الأنابيب الدقيقة النموذج. ويتم إنجاز هذا النظام عن طريق التحكم في ردود الفعل التي إما تجميع مفارز-αβ تويولين في البوليمرات أنيبيب أو الأنابيب الدقيقة تفكيك إلى وحدات الحرة؛ هذا هو المعروف باسم ديناميات أنيبيب.

والهدف الرئيسي من حقل أنيبيب هو توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم ديناميات أنيبيب، بما في ذلك دراسات مفارز-αβ تويولين والمنظمين خارجي أن ربط تويولين و / أو الأنابيب الدقيقة. والمنهج التجريبي راسخة هو إعادة هذا النظام في المختبر باستخدام تنقية البروتين αβ تويولين، في كثير من الأحيان في كومbination مع المنظمين خارجي النقاء. ورغم أن هذا هو نهج مفيد، فمن الواضح أن ديناميات أنيبيب في أنظمة أعيد تختلف بشدة من تلك التي لوحظت في الخلايا الحية. على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة تنمو بشكل أسرع وأبطأ يتقلص في الجسم الحي من في المختبر. ويمكن أن يعزى هذه الاختلافات بتوافر المعروف المنظمين خارجي فضلا عن العوامل بعد، غير محددة في الخلايا. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد أنشطة المنظمين أنيبيب والمسوخ التي تعطل ديناميكية في سياق الخلوي الأصلي.

على الرغم من أن نماذج متعددة الخلايا وقد ثبت أن الأنظمة السائدة للتحقيق وظيفة أنيبيب وتنظيم عالي المستوى، والعديد من الاهتمامات العملية تحد بشدة من فائدة هذه نماذج لقياس دقيق للديناميات أنيبيب. أولا، عدد كبير من الأنابيب الدقيقة، التي تتراوح بين عشرات الآلاف في كل خلية، يجعل من الصعب بثقةتتبع الأنابيب الدقيقة الفردية على مر الزمن. وتتناول العديد من الدراسات هذا التحدي من خلال تصوير البروتينات التي توطين بشكل انتقائي لغايات أنيبيب، مثل البروتينات في (EB) أسرة ملزم نهاية. ومع ذلك، ومن المعروف أن هذه البروتينات في توطين فقط إلى أقاصي المتزايد الأنابيب الدقيقة في metazoans 2. ولذلك، يقتصر فائدة هذه البروتينات لقياس مباشرة معدلات النمو، في حين فقط قياس غير مباشر جوانب أخرى من ديناميكية، مثل تكرار كارثة. ثانيا، على الرغم من التقدم في التكنولوجيا التحرير الجينوم، وخلق الخلايا التي تعبر عن ثابت تويولين fluorescently المسمى أو إدخال تحولات على التعامل بشكل انتقائي تويولين أو أنيبيب المنظمين لا يزال يشكل تحديا كبيرا. وعلاوة على ذلك، فإن وجود العديد من isotypes تويولين في metazoans يفند دراسة كيفية تأثير الطفرات الجينات تويولين الفردية.

ويوفر نظام الخميرة في مهدها العديد من المزايا الهامة لقياس في الجسم الحي microtubuديناميات جنيه. الخميرة لديها شبكة أنيبيب مبسطة تسمح التصور من الأنابيب الدقيقة الفردية. في الخميرة، والأنابيب الدقيقة تنبع من تنظيم المراكز المعروفة باسم الهيئات القطب المغزل (SPBs)، والتي هي جزء لا يتجزأ في الغلاف النووي 3. وSPBs بمثابة السقالات لمجمعات للγ تويولين الصغيرة التي nucleate الأنابيب الدقيقة 5. SPBs nucleate فئتين من الأنابيب الدقيقة، الأنابيب الدقيقة المغزل والأنابيب الدقيقة نجمي. ميكروتثبول المغزل مشروع في جبلة النواة ومهمة لربط إلى الكروموسومات عبر الأنابيب الدقيقة الحيز الحركي ولتحقيق الاستقرار في المغزل عبر تداخل الأنابيب الدقيقة بين القطبين 6. في المقابل، مشروع الأنابيب الدقيقة نجمي الخارج في العصارة الخلوية ونادرة نسبيا مقارنة مع شبكة كثيفة من الأنابيب الدقيقة المغزل. خلال الانقسام، وخلايا ما قبل طور الصعود ليس لها سوى 1-2 الأنابيب الدقيقة نجمي المنبثقة من أي SPB. هذه موجودة وأناالأنابيب الدقيقة ndividual بدلا من حزم 7. دور الأنابيب الدقيقة نجمي خلال الانقسام هو نقل نواة والمغزل في تقاطع بين الأم وبرعم المقصورات، والمعروفة باسم الرقبة مهدها. وتنطوي هذه الحركة مسارات واضحة المعالم التي تولد قوة على الأنابيب الدقيقة نجمي، وسحب نواة والمغزل نحو وفي نهاية المطاف إلى الرقبة برعم 8.

ميزة أخرى للنظام الخميرة هي فائدة علم الوراثة، والتي يمكن استخدامها لتحقيق المنظمين أنيبيب ومفارز تويولين بدقة لا مثيل لها. تمتلك الخميرة أيضا مرجع مبسط لisotypes تويولين: واحد-β تويولين الجين (TUB2) واثنين من الجينات ألفا تويولين (TUB1 وTUB3). الطفرات يمكن إدخال بسهولة في هذه الجينات، وبالتالي درس في عدد السكان تويولين متجانسة 9 و 10. وهناك عدد من على نطاق واسعيبني المتاحة لوضع العلامات الأنابيب الدقيقة، وهذه يمكن أن تكون موجهة لتحقيق التكامل في مواضع الكروموسومات للتعبير مستقر (انظر مناقشة).

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو أن الأنابيب الدقيقة صورة واحدة في الخلايا الحية الخميرة في أربعة أبعاد (X، Y، Z، وT) لقياسات عالية الدقة للديناميات أنيبيب. وصفت وسائل لدمج يبني لوالتعبير على مستوى منخفض التأسيسية من تويولين fluorescently المسمى في خلايا الخميرة. قبل التصوير، هي التي شنت الخلايا الحية إلى غرف الشرائح المغلفة مع كتين كونكانافالين A لتحقيق الاستقرار في الخلايا للتصوير على المدى الطويل. المعلمات المثلى لاقتناء الصور، فضلا عن سير العمل لتحليل البيانات، وتوصف أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد لوحات -LEU التسرب

  1. إضافة 800 مل من عقيم، الماء منزوع الأيونات (DIH 2 O) إلى قارورة 2 L. إضافة 26.71 غرام من قاعدة التسرب مسحوق (تاريخ الميلاد)، 0.69 غرام من CSM-لوي، و 20 غراما من أجار. الاختلاط مع شريط مغناطيسي. جلب إلى 1 L مع DIH 2 O.
  2. الأوتوكلاف في 121 ° C و 19 رطل لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة قارورة من الأوتوكلاف والسماح لتبرد إلى ~ 65 درجة مئوية مع التحريك لطيف.
  4. صب 30 مل / لوحة إلى 100 ملم لوحات قطر. فلتكن هذه الجلوس في درجة حرارة الغرفة ل36-48 ساعة قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.

2. دمج GFP-Tub1 للتعبير التأسيسي تويولين المسمى GFP

  1. تغلي تركيز الأسهم من 10 ملغ / مل الذين تقطعت بهم السبل واحد-DNA (ssDNA) لمدة 3 دقائق.
  2. الجمع بين 2 ميكرولتر من ssDNA المغلي مع 400 نانوغرام من تنقية GFP-Tub1 DNA البلازميد 11.
    ملاحظة: هناك مجموعة متنوعة من البلازميدات التي يمكن استخدامها لمستقر، ووضع العلامات الفلوريةمن الأنابيب الدقيقة في الخميرة التي تستخدم fluorophores بديلة وعلامات اختيار. ووصف بعض هذه البدائل في قسم مناقشة.
  3. يضاف خليط DNA لقسامة 50 ميكرولتر من خلايا الخميرة المختصة.
    ملاحظة: إعداد خلايا الخميرة المختصة مع حل السوربيتول (فاكهة الغبيراء؛ 100 ملي LiOAc، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني 8 و 1 M السوربيتول، معدلة مع حمض الخليك المخفف لدرجة الحموضة 8). للحصول على وصف مفصل لصنع خلايا الخميرة المختصة، أنظر المرجع 12.
  4. دوامة بدقة.
  5. إضافة 6X الحجم الكلي للالبولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل (100 ملي LiOAc، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 1 ملم EDTA / هيدروكسيد الصوديوم درجة الحموضة 8، و 40٪ PEG3350) إلى خليط DNA الخلية.
  6. دوامة بدقة.
  7. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 30 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
  8. إضافة سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى 10٪ من إجمالي حجم ودوامة.
  9. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  10. أجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. 2 O.
  12. لوحة الخلايا على صفيحة -LEU التسرب.
    ملاحظة: يحتوي بناء GFP-Tub1 علامة بعامل نمائي ليسين، في حين بنيات أخرى يمكن استخدام علامة بديلة. وينبغي أن يكون وسيلة التسرب محددة لعلامة بعامل نمائي للبناء.
  13. السماح للخلايا تتحول لتنمو لمدة 3-5 أيام عند 30 درجة مئوية.
  14. إعادة خط المستعمرات التحول واحدة على الطازجة لوحة -LEU التسرب عن طريق نقل المستعمرات باستخدام المسواك تعقيمها. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  15. فحص البصر كل المحولة للإشارة GFP من خلال تعليق ما يقرب من 1 ميكرولتر من الخلايا من مستعمرة واحدة من لوحة في الخطوة 2.14 في 2 ميليلتر من الماء على شريحة نظيفة. تغطية الخلايا مع وقف التنفيذ مع ساترة ومراقبة باستخدام المجهر مضان.
    1. تثير transformants مع 488 نانومتر ضوء والبحث في وجود إشارة GFP.

3. تزايد السائلة الثقافة الخميرة

  1. تطعيم ~ 1 ميكرولتر من خلايا الخميرة من مستعمرة واحدة على لوحة في 3 مل من المتوسط ​​الشامل الاصطناعية. السماح للخلايا أن تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
  2. تمييع الثقافة المشبعة في اليوم التالي إلى OD 600 من <0.1 في المتوسط. عودة ثقافة المخفف إلى 30 ° C شاكر لمدة 3-4 ساعة أو حتى OD 600 ما بين 0.4 و 0.8، عندما الخلايا جاهزة للتحميل إلى غرف للتصوير.

4. إعداد تدفق غرفة الشرائح

  1. يقطعورقة من فيلم البارافين في قطعة 4 في نطاق واسع و 7 في فترة طويلة.
  2. ضع شريحة المجهر القياسية بالطول على عرض 4 بوصة من فيلم البارافين والتفاف الفيلم حول الشريحة 3-4 مرات بحيث تغطي الشريحة في الفيلم الذي هو 3-4 طبقات سميكة. اضغط على طبقات معا لضمان وجود ختم معقول؛ وهذا سيجعل من الاسهل للقطع. تجنب الضغط من الصعب جدا أو التسبب في الفيلم لتجاعيد.
  3. قطع الفيلم البارافين على طول الحواف الخارجية من الشريحة باستخدام نظيفة الحلاقة مربع القاطع. استخدام شريحة أخرى لتقديم حافة مستقيمة لقطع.
  4. قشر الزائدة فيلم خارج الشريحة العمل وتجاهل. ومداخن المتبقية من الفيلم تغطي وجها واحدا من الشريحة وسيتم استخدامها لجعل الجدران بين غرف التصوير.
  5. باستخدام الشريحة الثانية كما حافة مستقيمة، وقطع طبقات فيلم مكدسة على طول محور طويل من الانزلاق الى ما يقرب من عشرة اقسام، كل منها 2-4 ملم في العرض.
  6. قطع طبقات فيلم البارافين مكدسة عموديا لالتخفيضات في الخطوة 4.5، وعلى طول محور قصيرة من الشريحة، لخلق شرائح 2-4 ملم في العرض، 23-24 ملم في الطول، و3-4 طبقات سميكة.
  7. قشر قطع شرائح باستخدام شفرة حلاقة في زاوية 45 درجة. باستخدام ملقط، بالتساوي توزيع شرائط قطع الفيلم على شريحة المجهر نظيفة لإنشاء أرقام المطلوب من الغرف. تصل إلى 3 غرف (مع 4 شرائح فيلم البارافين) يمكن إنشاؤها على شريحة واحدة.
  8. وضع ساترة واحدة على رأس شرائط السينما ونقلها إلى موقف بالملقط.
  9. ضع الشريحة مستعدة، ساترة يصل، على موقد وضعت في ~ 95 درجة مئوية (وهذا هو تقريبا متوسطة منخفضة الإعداد على معظم سخانات). حرارة الشريحة حتى يتم شفافة شرائط فيلم (حوالي 3 دقائق)، ثم ختم الشرائح وساترة معا عن طريق الضغط بلطف على ساترة مع ملاقط.
    ملاحظة: من المهم أن الصحافة الوحيد على مناطق ساترة التي هي مباشرة فوق شرائح فيلم البارافين، كما خدش مناطق فوق جيمكن hambers يقلل من جودة الصورة. والحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة الشريحة. المتبخرة إرادة فيلم معطف داخل الغرفة مع فيلم مسعور الذي يمنع الخلايا من الالتصاق.
  10. استخدام ملقط لإزالة الشريحة من موقد (سوف الشريحة تكون ساخنة) وضعه جانبا لتبرد مع الجانب ساترة مواجها لها. كما يبرد الشريحة، فإن الفيلم يعود إلى الأبيض، تلوين مبهمة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الشرائح جاهزة للتحميل مع خلايا الخميرة مثقف. شرائح إضافية يمكن إدخالها على هذه النقطة وتخزينها في مكان نظيف وجاف لفترة غير محددة من الزمن.

5. خلايا الخميرة تحميل في إعداد تدفق غرفة الشرائح

  1. ذوبان الجليد في المجمدة، 200 ميكرولتر قسامة من كونكانافالين ألف (2 ملغ / مل في العقيمة DIH 2 O).
  2. إضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر من إذابة كونكانافالين ولكل غرفة من الشريحة مستعدة قبل pipetting في واحدة من نهايات مفتوحة. إضافة ما يكفي من كونكانافالين A لملء الغرفة. لهذا لياليفاتر، سيتم سحب كونكانافالين A من خلال غرفة عبر العمل الشعري.
  3. تعليق الشريحة، ساترة إلى أسفل، بين اثنين من الرفوف microfuge أنبوب أو الأقلام لمدة 5 دقائق للسماح للكونكانافالين والتمسك ساترة (أي غرفة).
  4. العودة الشريحة إلى موقف ساترة يصل. غسل الغرفة مع 2X حجم الغرفة (تحديدها في الخطوة 5.2 أعلاه؛ ما يقرب من 200 ميكرولتر) من المتوسط الشامل الاصطناعية لإزالة كونكانافالين A.
    1. تدفق المتوسطة من خلال غرفة، وذلك باستخدام إما زاوية منشفة ورقية أو ورق الترشيح في نصف مطوية رسم السوائل من طرف واحد من الغرفة في حين pipetting لفي وقت واحد السائل النقي إلى الآخر. بدلا من ذلك، استخدام الشافطة فراغ لرسم بعناية السوائل من طرف واحد في حين pipetting لسائل جديدة في الآخر.
  5. خلايا الحمل التي تتدفق 2X حجم الغرفة (حوالي 200 ميكرولتر) من تعليق خلية (من الخطوة 3.4) باستخدام metho تدفق موجهةد موضح في الخطوة 5.4.1.
    ملاحظة: إن الهدف هو صورة طبقة واحدة من الخلايا في ساترة. ولذلك، فمن المهم لتحميل تركيز خلايا صغيرة بما يكفي أنهم لا تتراكم فوق بعضها البعض، ولكن كبيرة بما يكفي أن الخلايا كافية موجودة في الميدان لجمع أكبر قدر ممكن من البيانات في الحصول على الصور. تركيز الأمثل للخلايا داخل غرفة يمكن أن تختلف وينبغي أن تحدد تجريبيا. لزيادة تركيز خلايا في غرفة التدفق، بلطف بيليه زراعة الخلايا في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالة بعض من طاف. لتقليل تركيز الخلايا، إضافة المتوسطة كاملة الاصطناعية جديدة لتعليق الخلية. تركيز خلايا يمكن تقييم بعد خطوة 5.7 (أدناه) بتفقد الغرفة على المجهر مرحلة التباين. عند هذه النقطة، يمكن إضافة خلايا إضافية إلى الغرفة التي تتدفق في مزيد من التعليق الخلية. ومع ذلك، والحد من كثافة الخلايا في هذه المرحلة لم يكن ذلك ممكنا، وأفضل طريقة لتحقيق عن طريق تحميل غرفة جديدة مع تعليق خلية المخفف.
  6. تعليق الشريحة ساترة إلى أسفل، كما هو موضح في الخطوة 5.3، لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا على الانضمام إلى ساترة.
  7. طرد أي خلايا unadhered التي تتدفق من خلال 4X حجم الغرفة (حوالي 400 ميكرولتر) من المتوسط ​​الشامل الاصطناعية. هذا سيقضي على خلايا التعويم الحر في الغرفة، التي يمكن أن تلوث الحصول على الصور.
  8. بعناية تجف نهاية كل من غرفة مع زاوية نظيفة من منشفة ورقية، وبذلك يصبح الغضروف المفصلي إلى حافة ساترة.
  9. ختم كل نهاية الغرفة مع دافئ (75 درجة مئوية) تسرب (على سبيل المثال، VALAP، أجزاء متساوية الفازلين، شمع الصوف، وشمع البارافين).
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الشريحة مستعدة للصورة. الدوائر يمكن تصوير لمدة تصل إلى 9 ساعات، اعتمادا على كثافة الخلايا في كل غرفة. الخلايا سوف تنتج ثاني أكسيد الكربون (CO 2) مع مرور الوقت، والتي سوف تخلق تدريجيا الفقاعات التي تحل محل الخلايا.

الحمار = "jove_title"> 6. الحصول على الصور

  1. جلب الشريحة لمجهر مقلوب مجهزة الهدف NA 1.45 100X CFI خطة آبو، مرحلة كهرضغطية، القرص الغزل وحدة الماسح الضوئي متحد البؤر، ليزر إضاءة، وكاميرا EMCCD. الحفاظ على درجة حرارة مرحلة في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) خلال الاستحواذ.
    ملاحظة: الفتحة العددية عالية يسمح لدقة أكبر صورة، والمرحلة كهرضغطية تمكن عالية السرعة اكتساب ض المكدس. متطلبات المجهر الدنيا هي الهدف 100X، ليزر إضاءة، والكاميرا EMCCD.
  2. جعل الخلايا في التركيز. ضمان أن حقل اكتساب ديه على الأقل 5-6 خلايا عنقودية معا من خلال البحث الشريحة للخلايا تجميعها معا.
    ملاحظة: على الرغم من أنه ليس من الضروري أن الصورة أكثر من خلية واحدة في وقت واحد، التصوير خلايا متعددة في نفس المجال يحسن كفاءة الحصول على البيانات دون المساس بجودة البيانات. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان أنالخلايا على متن الطائرة الاتصال نفسه وليس مكدسة فوق بعضها البعض.
  3. برمجة اكتساب متعدد الأبعاد لجمع متعددة ض سلسلة مع مرور الوقت.
    1. ضبط إعدادات ضمن إعدادات شراء نشطة لما يلي: إجمالي Z-عمق = 6 ميكرون، ليشمل في خلية الخميرة بأكملها؛ Z-خطوة حجم = 300 نانومتر، لتعظيم جمع الضوء من دون الإفراط. مجموع المدة الزمنية = 10 دقيقة. الساعة فترات = Z-سلسلة كل 4 ق. ووقت التعرض = 90 مللي لكل ض الطائرة.
      ملاحظة: الساعة التعرض الأمثل سوف تختلف اعتمادا على الكاميرا، ومصدر ضوء الإثارة، وعوامل أخرى. بشكل عام، فإن الوقت الأمثل التعرض أن يكون الحد الأدنى من الوقت اللازم لتحقيق نسبة 3: 1 من إشارة من الأنابيب الدقيقة نجمي المسمى GFP إشارة من السيتوبلازم على أساس القيم بكسل يقاس EMCCD.
  4. تبدأ عملية الاستحواذ عن طريق النقر 'تشغيل'. السماح ليتم تشغيله لمدة 10 دقيقة كاملة. حفظ البيانات كصورةسلسلة (و tiff أو .nd2).
  5. حدد حقل جديد إلى صورة داخل غرفة وكرر الخطوات من 6،2-6،4.
    ملاحظة: A غرفة واحدة ينبغي أن تسفر بين 15 و 20 حقلا من الخلايا، اعتمادا على كثافة الخلايا داخل الغرفة. سوف كثافة الخلية أعلى تسفر مجموع الحقول أقل، كما CO 2 في غرفة سيبني بشكل أسرع.

تحليل 7. صورة

  1. فتح ملف الصورة في يماغيج ( https://imagej.nih.gov ) باعتباره hyperstack باستخدام تنسيقات الحيوي المستورد المساعد.
    1. فتح يماغيج واسحب كومة صورة تم الحصول عليها من القسم 6 مباشرة على لوحة التحكم. سيبدأ تنسيقات الحيوي المستورد تلقائيا. حدد "موافق" لتحميل كومة الصورة كما hyperstack.
      ملاحظة: "بيو صيغ خيارات استيراد" سوف موجه فتح وضمان أنه في ظل "المكدس الشخصية" القسم "، عرض كومة مع:" يتم تعيين إلى "Hyperstack". و "المكدس النظام:" من المقرر أن "XYCZT".
  2. طي كل Z-سلسلة إلى أقصى كثافة، والإسقاط 2-الأبعاد باستخدام وظيفة المشروع Z.
    1. حدد "صورة" القائمة، و "المكدس" القائمة الفرعية، و "المشروع Z" الميزة. حدد "إسقاط الحد الأقصى" من القائمة المنسدلة وانقر فوق "موافق".
  3. تطبيق عامل تصفية متوسط ​​إلى المكدس صورة للحد من الضوضاء التنقيط عن طريق اختيار "عملية" القائمة، و"الفلاتر" القائمة الفرعية، و "وسيطة" الميزة. أدخل 2.0 بكسل في مربع نصف القطر وانقر على زر "موافق".
  4. تحديد الخلايا ما قبل طور الصعود في هذا المجال.
    ملاحظة: وتتميز هذه من قبل براعم متوسطة الحجم والمغزل الإنقسامية القصير، 1-1،5 ميكرومتر في الطول (الشكل 1؛ النقاط رأس السهم إلى المغزل الإنقسامية قصيرة). الخلايا في هذه المرحلة هي مثالية لتحليل ديناميات أنيبيب لأنها عادة ما تظهر فقط لا الحصرالأنابيب الدقيقة نجمي ث المنبثقة القطبين المغزل 7. يمكن التعرف على الأنابيب الدقيقة نجمي كما خيوط الخطية التي يحمل موحدة كثافة إشارة GFP من نهاية ناقص، في SPB، وحتى نهاية زائد، في السيتوبلازم.
  5. بدءا من timepoint الأول من سلسلة صورة، استخدم أداة سطر مجزأة لرسم خط على طول أنيبيب نجمي واحد، من نهاية ناقص، وتقع عند تقاطع بين أنيبيب نجمي والأنابيب الدقيقة المغزل وصفت بشكل مكثف، وحتى نهاية زائد ، والتي هي في السيتوبلازم (انظر الخطوط الحمراء في الشكل 1). انقر نقرا مزدوجا على نهاية أنيبيب لاستكمال خط مجزأة.
  6. تسجيل القياس في جدول النتائج باستخدام "التدبير" الميزة عن طريق الضغط على زر "M" على لوحة المفاتيح.
    ملاحظة: ميزات إضافية، مثل كثافة الرمادية، يمكن تسجيلها من خلال تحديد القياسات في القائمة "تحليل" و "تعيين القياسات" القائمة الفرعية.
  7. تقدم إلى timepoint المقبل إما عن طريق النقر على السهم الأيمن في شريط Z-المنزلق أو الضغط على "./>" مفتاح على لوحة المفاتيح. كرر الخطوات من 7.5 و 7.6 بالنسبة لجميع timepoints في تسلسل الصور.
  8. نسخ البيانات من جدول النتائج ولصقها في جدول بيانات. حفظ البيانات عن طريق اختيار "حفظ باسم".
    ملاحظة: وسوف تشمل هذه القياسات عدة قيم، ولكن أهم القيم هي شريحة، مما يدل على timepoint في هذه السلسلة، وطول، مما يدل على طول الخط (أي أنيبيب النجمي). الأعمدة التي تحتوي على قياسات أخرى (على سبيل المثال، منطقة، يعني قيمة بكسل، زاوية، وغيرها) يمكن أن تكون إما الاحتفاظ أو التخلص منها.
  9. إنشاء عمود جديد في جدول البيانات عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن وباستخدام وظيفة "إدراج". إدخال الوقت (ق) من كل timepoint.
  10. إنشاء مؤامرة XY مبعثر من طول أنيبيب (ميكرون) بوصفها وظيفة من الزمن (ق) باستخدام "إدراج الخطالرسم البياني "الميزة، تحديد قياسات الطول مثل" Y "والعمود الوقت باسم" اكس "
    1. تحديد مناطق البلمرة، والتحلل، وقفة من قبل تبحث عن التغييرات الإيجابية والسلبية في الطول مع مرور الوقت على مؤامرة مبعثر من الخطوة 7.10.
      ملاحظة: أحداث البلمرة زيادة طول أنيبيب بنسبة 0.5 ميكرون على الأقل في ما لا يقل عن 3 timepoints وتناسب الانحدار الخطي مع R 2 ≥ 0.9 والقيمة R> 0 (1B الشكل وD، النقاط الخضراء). أحداث التحلل انخفاض طول أنيبيب بنسبة 0.5 ميكرون على الأقل في ما لا يقل عن 3 timepoints وتناسب الانحدار الخطي مع R 2 ≥ 0.9 والقيمة R <0 (1B الشكل وD، ونقاط الوردي). أحداث وقفة منفصلة عن البلمرة والتحلل. وتعرف توقف كما صافي التغيرات في طول أنيبيب أقل من 0.5 ميكرون عبر ما لا يقل عن 3 timepoints.تناسب الانحدار الخطي مع القيمة R بين -0.4 و 0.4. ويكون منحدر لا تختلف إحصائيا من الصفر، كما هو محدد من قبل F-الاختبار.
    2. استخدام مؤامرة مبعثر كدليل، وتحديد أقسام وقت التغيير طول ايجابية وتسليط الضوء عليها في اللون الأخضر. تسليط الضوء على مناطق وقت التغيير طول سلبي في اللون الوردي.
    3. حساب الانحدار الخطي لكل أبرز القسم وتسجيل R- وR 2 -value لكل مقطع في الأعمدة الأقرب إلى المناطق. تصنيف كل المنطقة الملونة إما الحدث البلمرة أو حدث التحلل.
  11. حساب معدلات البلمرة بقسمة صافي التغير في طول من التغيير في الوقت المناسب لكل حدث نمو. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور للقيم الانحدار الخطي من الخطوة 7.10.3.
  12. حساب معدلات التحلل بقسمة صافي التغير في طول من التغيير في الوقت المناسب لكل shrinkinز الحدث. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور لقيم معدل البلمرة من الخطوة 7.11.
  13. احسب تردد كارثة بقسمة عدد من التحولات البلمرة إلى التحلل من الوقت الكلي لجميع الأحداث نمو 13. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور لقيم معدل التحلل من الخطوة 7.12.
  14. احسب تردد الإنقاذ بقسمة عدد من التحولات التحلل إلى البلمرة في الوقت الكلي لجميع الأحداث انكماش 13. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور للقيم تردد كارثة من الخطوة 7.13.
  15. حساب dynamicity بقسمة مجموع القيمة المطلقة لجميع التغييرات طول من إجمالي مدة الحصول على الصور، وتحسب في خطوة 7.10.1، وضرب من قبل 27.0833 للحصول مفارز تويولين في الثانية 14. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور لفال تردد الإنقاذUES من الخطوة 7.14 وحفظ جدول النتائج.
    ملاحظة: من الممكن لأتمتة عملية تحليل موضح في الخطوات 7،10-7،15 باستخدام برنامج حسب الطلب (. Estrem، وآخرون، وقدمت مخطوطة). تم تصميم هذا البرنامج لتحديد فترات البلمرة والتحلل في قياسات طول باتباع المعايير المفصلة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قياس ديناميات أنيبيب في الخلايا الحية الخميرة يوفر أداة مقنعة لتقييم مدى الطفرات في الجينات ترميز المنظمين أنيبيب أو تويولين مفارز البلمرة تأثير ومعدلات التحلل، وكذلك وتيرة الانتقال بين هذه الدول. الشكل (1) يعرض سلسلة زمنية من ديناميات أنيبيب نجمي في خلية من النوع البري وخلية متحولة مع طفرة في β تويولين (tub2- 430Δ). وصفت الأنابيب الدقيقة مع الموسومة GFP α تويولين لتصور طول أنيبيب. السهام الحمراء تتبع طول أنيبيب نجمي في كل صورة (Figure1A و 1 C). تم قياس أطوال أنيبيب في كل timepoint لمدة 8 دقائق، وصورت هذه أطوال جمعت في مؤامرات الحياة (الشكل 1B و 1 D). واستخدمت هذه البيانات لتحديد معدل البلمرة، ومعدل التحلل، durati البلمرةعلى، مدة التحلل، تردد الإنقاذ، تردد كارثة، وdynamicity.

شكل 1
الشكل 1. التصوير الوقت الفاصل بين ميكروتثبول وقياسات بالنجوم أنيبيب حيوية، المسمى GFP. (A و C) أول خمس صور متتابعة من الوقت الفاصل بين التصوير لمن النوع البري وtub2 -430Δ خلايا متحولة. وصفت الأنابيب الدقيقة مع GFP-Tub1 وتصوير في مرحلة ما قبل طور الصعود من دورة الخلية. كل صورة هي إسقاط أقصى كثافة من مبائر Z-سلسلة. الحانات الحجم: 1 ميكرون. معارض الطوابع الوقت الإجمالي في كل اكتساب الإطار. السهام الحمراء متابعة على طول الكلي من أنيبيب نجمي، مع النصال تدل على طرفي زائد. (B و D) المؤامرات الحياة أنيبيب عرض أطوال الأنابيب الدقيقة نجمي واحدة على مر الزمن. النقطة الخضراءالصورة دلالة البلمرة والنقاط الوردية دلالة التحلل. وتشير النصال للأحداث كارثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الشكل 1 ديناميات أنيبيب المتغيرة بين سلالة من النوع البري وسلالة متحولة تفتقر إلى الأحماض الأمينية 27 من β تويولين على C-المحطة، المسخ الذي ظهر سابقا أن يكون أكثر استقرارا الأنابيب الدقيقة 15. كما هو معروض في المؤامرات الحياة أنيبيب وأنيبيب في متحولة tub2 -430Δ أطول والكوارث المعارض أقل من النوع البري أنيبيب (السهام الشكل 1B و الجدول 1). وبالإضافة إلى ذلك، فإن معدلات البلمرة والتحلل، تحديد من سفوح تصاعدي وتنازلي لينغ أنيبيبتي إتش إس، وانخفضت في متحولة مقارنة البرية من نوع (1B الشكل و1D، الجدول 1). وأخيرا، فإن أنيبيب في خلية متحولة tub2 -430Δ تنفق المزيد من الوقت في حالات البلمرة والتحلل وانخفض dynamicity مقارنة البرية من نوع (الجدول 1).

التواء Dynamicity (مفارز / ث) معدل البلمرة (ميكرون / دقيقة) ٪ الوقت في البلمرة معدل Depolym (ميكرون / دقيقة) ٪ الوقت في Depoly-
merization
٪ الوقت في وقفة تردد الإنقاذ (أحداث / دقيقة) تردد كارثة (إف الوالدان / دقيقة)
البرية من نوع ن = 1 54 1.8 ± 0.5 48 3.0 ± 0.3 29 3 1.8 1.4
tub2-430Δ ن = 1 40 1.4 ± 0.1 41 1.5 ± 0.2 32 0 0.8 0.7
الاختصارات هي كما يلي: ميكرون، ميكرون. دقيقة، دقيقة، الصورة، الثانية، ن، أنيبيب واحد تحليلها من الحياة أنيبيب مؤامرة (Fig1B، D). القيم يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط.

الجدول 1: أنيبيب حيوية قياسات للخلايا في الشكل 1. القيم هي متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط من قياسات الأنابيب الدقيقة الواحدة هو مبين في الشكل (1).

= "1"> البيانات مثل هذه يمكن الحصول عليها من مؤامرات الحياة الفردية من الأنابيب الدقيقة متعددة (في المتوسط، ويتم تحليل لا يقل عن 50 الأنابيب الدقيقة) وتستخدم في التحليل الإحصائي لتحديد تغييرات كبيرة في ديناميات أنيبيب عبر السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويقدم نموذج الخميرة في مهدها المزايا الرئيسية لجمع قياسات عالية الدقة للديناميات أنيبيب في مكان في الجسم الحي، بما في ذلك القدرة على الأنابيب الدقيقة صورة واحدة مع مرور الوقت والقدرة على التعامل مع tubulins والمنظمين أنيبيب باستخدام أدوات علم الوراثة الخميرة.

توفر غرف كونكانافالين A المغلفة عددا من المزايا على الأجهزة التي سبق وصفها، بما في ذلك منصات مصهور أجار. الشرائح مع الغرف يمكن مسبقة الصنع وتخزينها فترة طويلة أو يمكن استخدامها على الفور. بالإضافة إلى ذلك، غرف كونكانافالين A المغلفة قادرة على زراعة خلايا الخميرة ل> 6 ساعات في نفس الوسط الذي كانت الخلايا المستزرعة في الأصل. ومن المهم أن نلاحظ أن عدد الخلايا داخل الغرفة سوف تملي متى يمكن تصوير الغرفة. غرف المغلفة تضمن أنه ليس هناك سوى طبقة واحدة من خلايا الخميرة تلتزم ساترة. وأخيرا، وخلق دوائر متعددة تسمح للعدة سلالات الخميرة مختلفة ليتم تصويرها على نفس الشريحة.

هناك تحديات كبيرة لتصوير ديناميات أنيبيب في مهدها الخميرة، بما في ذلك مستويات إشارة منخفضة نسبيا وطبيعة ديناميكية للغاية من هذه العملية. المجاهر Widefield كافية لالتقاط صور عالية timepoint واحد من الأنابيب الدقيقة المسمى. ومع ذلك، المجهري widefield يسبب أسرع photobleaching من بسبب التعرض مرات أطول والقصف من العينة مع خارج نطاق التركيز الضوء. وبالمثل، المسح الضوئي ليزر مجهر بؤري غير كافية بسبب أسرع photobleaching من. الغزل قرص الفحص المجهري متحد البؤر غير مهيأ خصيصا لتصوير ديناميات أنيبيب في مهدها الخميرة. وقد تم تصميم نظام المجهر متحد البؤر القرص الغزل المستخدمة هنا مع هذه المتطلبات في الاعتبار.

يجب أن يتم تصميم النظام المجهر لسرعة عالية وحساسية عالية. على الرغم من مجموعة متنوعة من النظم مجهر قد تكون مناسبة، عدة مكونات أساسية. A 100Xالهدف مع الفتحة العددية عالية (1.45NA) ضروري لحل الأنابيب الدقيقة الفردية والتغيرات طول بناء على أمر من 100 نانومتر. ماسحة الغزل القرص مبائر ضروري لتقليل photobleaching من وسمية، من خلال منع ضوء خارج التركيز، وتعظيم القرار، وحساسية، من خلال جمع ضوء فقط في التركيز. يجب أن تكون الكاميرا EMCCD سريع وحساس لجمع ما يكفي إشارة GFP-Tub1 خلال كل 90 مللي اكتساب الوقت الفاصل. حاليا، والكاميرات EMCCD هي الخيار الأفضل لهذا التطبيق. الحالية كاميرات استشعار CMOS تفتقر إلى حساسية EMCCDs الراقية. ومع ذلك، فإن هذه التكنولوجيا تتحسن بشكل كبير وربما يكون قريبا ملائمة. وأخيرا، هناك حاجة إلى مرحلة كهرضغطية للحركة سريعة ودقيقة في Z، والذي يمكن أن يكون خطوة تحد من معدل في الحصول على الصور رباعي الأبعاد.

نظام المجهر معين الموصوفة في هذا البروتوكول قد يشكل عائقا إذا معدات مماثلة ليست متاحة بسهولة. التعديلات جعلى أن تبذل لاستيعاب أنظمة التصوير المختلفة، ولكن هذه التعديلات قد تأتي على حساب القرار الزماني و / أو المكاني. مرحلة محرك يحركها المغزل يمكن استخدامها بدلا من مرحلة كهرضغطية. ومع ذلك، فإن هذه المحركات هي أبطأ، أقل دقة، وعرضة للانجراف. بعد الاستحواذ-استقرار الصورة المكونات الإضافية يمكن استخدامها للحد من الانجراف في الأبعاد XY المرتبطة بهذه المراحل بالمحركات. وبالإضافة إلى ذلك، والكاميرات بديلة بسرعات أبطأ قراءات يمكن استخدامها. لاستيعاب نسبة الاستحواذ أبطأ، يمكن جمعها Z-سلسلة كثير من الأحيان أقل (أي المزيد من الوقت بين Z-سلسلة). ومع ذلك، وزيادة الوقت بين Z-سلسلة مخاطر التحولات في عداد المفقودين التي قد تحدث بين timepoints. بدلا من ذلك، والمسافة بين Z-الطائرات يمكن زيادة كوسيلة لتقليل عدد الصور التي تم جمعها في Z-سلسلة. ومع ذلك، وزيادة هذا التباعد يخاطر بفقدان معلومات الصورة بين الطائرات، والتي سوف يضعف القدرة المجرب لaccurتحديد ately نهايات أنيبيب. بشكل واضح، ويمكن إجراء تعديلات على استيعاب أنظمة التصوير بديلة، ولكن يجب أن توزن هذه التعديلات ضد الخسائر المحتملة من معلومات الصورة.

قيود أخرى من هذا البروتوكول هو فقدان المعلومات المكانية عندما يتم تحويل أكوام صورة ثلاثية الأبعاد لتوقعات صورة ثنائية الأبعاد. وأنيبيب نجمي الفردية في خلية الخميرة قبل طور الصعود عادة بين 0.5 و 2.0 ميكرومتر في الطول والمشاريع عبر الفضاء ثلاثي الأبعاد من السيتوبلازم. ولذلك فمن الأهمية بمكان الحصول على صور من سلسلة من Z-وظائف لجمع كل المعلومات المكانية من أنيبيب الفردية. في اكتساب الوقت الفاصل، وهذا يمكن أن تنتج مجموعة البيانات المعقدة، مع 20 Z-شرائح في كل من 150 timepoints، أي ما مجموعه 3000 الصور. لمواجهة هذا التحدي وتبسيط تحليل الصور، يتم ضغط المعلومات المكانية من Z-مداخن خلال التحليل. في حين أن هذا benefتحليله، فإنه يأتي على حساب المعلومات المكانية من Z-البعد. كم المعلومات المفقودة عندما يتم ضغط البعد Z؟ لتقدير هذه الخسارة، وأجريت تجارب لقياس المسافة بين SPBs في الخلايا ما قبل طور الصعود، والتي هي سهلة نسبيا لقياس لSpc110-المسمى GFP SPBs تظهر بؤر كروية مع نسب عالية الإشارة إلى الضوضاء. على الرغم من أن المغزل قد يحمل التشريد مختلفة في Z من الأنابيب الدقيقة نجمي، فإن متوسط ​​طول مماثل (~ 1.5 ميكرون)، وبالتالي يوفر وكيل مفيد. و، في المتوسط، 15٪ أطول عند قياس أطوال المغزل في كامل مداخن صورة ثلاثية الأبعاد مما كانت عليه عندما يتم قياس نفس مغزل في التوقعات ثنائية الأبعاد (JM، نتائج غير منشورة). وبالتالي، ينبغي أن يكون وزنه صالح بيانات مبسطة تحديد وقياس مقابل التكلفة من المعلومات المطروحة Z.

وقد وضعت المجتمع بيولوجيا الخلايا الخميرة مجموعة أدوات متعددة لالشبكه التصوير أنيبيبكانساس. وهذا يشمل مجموعة متنوعة من البروتينات الفلورية تنصهر ألفا تويولين / Tub1 وتميز مع مختلف علامات بعامل نمائي. وتشمل هذه التركيبات LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11، والذي يدمج في LEU2 موضع الكروموسومات، واندماج عدة لGFP وfluorophores الأخرى، التي تدمج في موضع URA3، بما في ذلك URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16، URA3 :: CFP-TUB1 (pAFS125-CFP)، وURA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. وبالإضافة إلى ذلك، تم مؤخرا خلق مجموعة من اندماج Tub1 إلى البروتينات الفلورية المتنوعة التي التكامل الهدف إما إلى موضع الكروموسومات URA3 أو إلى مكان مجاور لمكان TUB1 الأصلي 18. هذه اللوحة واسعة من fluorophores وعلامات مفيد جدا للتجارب شارك في التعريب مع البروتينات الموسومة تفاضلي. يبقى الانصهار GFP-Tub1 أفضل وسيلة للتصوير الوقت الفاصل بين microtuديناميات بولي بسبب سطوع وصمود. الانصهار GFP-Tub1 التي أنشأتها الأغنية ولي (pSK1050) 11 يحتوي على مزيج من GFP إلى الأمينية محطة من α تويولين / Tub1 ويدمج في موضع LEU2 لانقاذ يسين auxotrophy. وهكذا، يتم التعبير عن بروتين الانصهار ectopically بالإضافة إلى الأصلي α تويولين وتضم ~ 20٪ من إجمالي α تويولين في الخلية 9. الأهم من ذلك، الانصهار GFP-Tub1 لا إنقاذ وظيفة α تويولين / Tub1 (JM، نتائج غير منشورة) الأم. هذا صحيح من الانصهار TUB1 الآخرين أيضا يبني 18.

مع الأدوات المتاحة لتصور ميكروتثبول والبروتينات ملزمة لها، في مهدها الخميرة هو نظام مثالي لدراسة الطفرات في tubulins وغيرها من الهيئات التنظيمية أنيبيب. بالإضافة إلى ذلك، عدد محدود من الجينات تويولين يسمح للدراسة مباشرة لتجمع متجانس من تويولين متحولة. بالإضافة إلى حدوث طفرات فيالجينات تويولين، في مهدها الخميرة لديها عدد من البروتينات المرتبطة أنيبيب (خرائط) التي هي مثلي لنظرائهم متعددة الخلايا. هذه الخرائط يمكن دراستها مباشرة، ويمكن أيضا الآثار التي الطفرات لها على خيوط أنيبيب واحدة فحصها. بروتوكول مفصلة هنا يسمح للتحقيق في كل من العمليات الجوهرية وخارجي التي تؤثر على ديناميات أنيبيب.

وباختصار، يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة الديناميكي بشكل صحيح خلال العديد من العمليات الخلوية. فمن الضروري أن نفهم العوامل الجوهرية لتويولين وخارجي يرتبط البروتينات التي تنظم ديناميات أنيبيب. في مهدها الخميرة هو النظام المثالي لدراسة تأثير هذه العوامل عن طريق قياس مباشرة ديناميات أنيبيب واحد. بروتوكول المفصلة أعلاه يصف كيفية دمج مستقر بروتين الانصهار فلوري في الجينوم الخميرة وكيفية اكتساب وتحليل صورة متحد البؤر مداخن لتحديد ديناميات أنيبيب في الجسم الحي

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر كيري بلوم (جامعة نورث كارولينا)، كيونغ لي (NCI)، ستيفن ماركوس (جامعة ولاية كولورادو)، وإلمار شيبيل (UNIVERSITAT هايدلبرغ) لتبادل مختلف البلازميدات FP-TUB1. ونحن ممتنون لميليسا غاردنر (جامعة مينيسوتا) لتدريب لنا في طريقة إعداد غرفة الشرائح. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منح R01GM112893-01A1 (لJKM) وT32GM008730 (م).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOB (dropout bases) Sunrise science  1650
CSM-Leu Sunrise science  1005
Agar Ameresco N833
100 mm polystyrene plates Fisher Scientific FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O Sigma-Aldrich   D7656 resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media  Sunrise science  1459-100
Concanavalin A Sigma-Aldrich  L7647 resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
Microscope Coverslips Fisher Scientific 12-541-B
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) melt at 75 ºC before use
forceps  Fisher Scientific 16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich  202444
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope Nikon Instruments MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective Nikon Instruments MRD01905
Piezo electric stage  Physik Instrumente P-736
Spinning disk scanner Yokogawa CSU10
Laser combiner module Agilent Technologies MCL400B
EMCCD camera Andor Technology iXon Ultra 897 
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elements software Nikon Instruments MQS31100
Microsoft Excel software Microsoft
MATLAB software MathWorks, Inc
ImageJ64 NIH Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in Open Microscopy Environment
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1 pSK1050 reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15, (6), 688-693 (2013).
  2. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10, (14), 865-868 (2000).
  3. Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124, (1), 511-523 (1975).
  4. Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134, (2), 443-454 (1996).
  5. Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134, (2), 429-441 (1996).
  6. Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190, (4), 1197-1224 (2012).
  7. Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13, (8), 2919-2932 (2002).
  8. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21, (3), 283-289 (2010).
  9. Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409, (2), 406-419 (2016).
  10. Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27, (11), 1786-1796 (2016).
  11. Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152, (3), 451-469 (2001).
  12. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15, (10B), 963-972 (1999).
  13. Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12, (9), 2870-2880 (2001).
  14. Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32, (5), 1285-1293 (1993).
  15. Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24, (12), 1295-1303 (2014).
  16. Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277, (5325), 574-578 (1997).
  17. Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177, (6), 981-993 (2007).
  18. Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16, (7), 773-786 (2015).
عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).More

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter