Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Published: April 20, 2017 doi: 10.3791/55610
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine

Summary

Баддинги дрожжей является выгодной моделью для изучения динамики микротрубочек в естественных условиях из - за свою мощную генетику и простоту его микротрубочки цитоскелета. Следующий протокол описывает, как преобразовать и культуру дрожжевых клеток, приобретают конфокальной микроскопии изображений и количественного анализа динамики микротрубочек в живых дрожжевых клеток.

Abstract

Динамические микротрубочки являются основой для многих клеточных процессов, а также точные измерения динамики микротрубочек могут дать представление о том, как клетки регулируют эти процессы и как генетические мутации регулирования воздействия. Количественные динамики микротрубочек в многоклеточных моделях имеют целый ряд связанные с этим проблемами, в том числе с высокой плотностью микротрубочек и ограничения на генетических манипуляциях. В отличие от этого, начинающая модель дрожжей обеспечивает преимущества, которые позволяют преодолеть эти трудности. Этот протокол описывает метод измерения динамики одиночных микротрубочек в живых дрожжевых клеток. Клетки, экспрессирующие флуоресцентно меченый тубулин приклеивают к собранным камерам скольжения, что позволяет для стабильного получения изображения в заданном промежутке времени. Подробное руководство для высокоскоростных, приобретение четырехмерного изображения также обеспечивается, а также в качестве протокола для количественной оценки свойств динамических микротрубочек в конфокальной стеке изображения. Этот метод, в сочетании с обычной дрожжевой генетикой, прыIDES подход, который уникально подходит для количественного оценки влияния регуляторов микротрубочек или мутаций, которые изменяют активность тубулина субъединиц.

Introduction

Микротрубочки цитоскелета полимеры, изготовленные из ар-тубулина белковых субъединиц и используются в самых разнообразных клеточных контекстах, в том числе внутриклеточного транспорта, деление клеток, морфогенез и моторики. Для построения микротрубочек сетей для этих разнообразных ролей, клетки должны тщательно регулировать, где и когда микротрубочки формы. Это регулирование осуществляется путем регулирования реакции, которые либо собрать ар-тубулин микротрубочек субъединиц в полимеры или разбирать микротрубочки в свободные субъединицы; это известно как динамики микротрубочек.

Основная цель поля микротрубочек является выяснение молекулярных механизмов, которые регулируют динамику микротрубочек, в том числе исследования в ае-тубулина подразделений и внешних регуляторов, которые связываются с тубулина и / или микротрубочек. Хорошо установленный экспериментальный подход является воссоздать эту систему в пробирке с использованием очищенного тубулина-аром белка, часто в комание с очищенными внешними регуляторами. Несмотря на то, что это полезный подход, очевидно, что динамика микротрубочек в реконструированных системах сильно отличается от наблюдаемой в живых клетках. Например, микротрубочки растут быстрее и медленнее сокращаться в естественных условиях , чем в пробирке. Эти различия могут быть отнесены к доступности известных внешних регуляторов 1, а также пока-неопределенных факторов в клетках. Поэтому крайне важно, чтобы определить деятельность регуляторов микротрубочек и мутантов, которые нарушают динамику нативную сотовой связи.

Хотя многоклеточных модели оказались преобладающими системами для исследования функции микротрубочек и организаций высшего порядка, несколько практических проблем серьезно ограничивают полезность этих моделей для точного измерения динамики микротрубочек. Во-первых, большое число микротрубочек, начиная от десятков до тысяч на клетку, затрудняет уверенноотслеживать отдельные микротрубочки в течение долгого времени. Во многих исследованиях решить эту проблему с помощью визуализации белков, которые селективно локализовать с микротрубочками концов, такие как белки в семействе конечного связывания (EB). Тем не менее, эти белки , как известно, только локализовать на концах растущих микротрубочек в многоклеточных 2. Таким образом, полезность этих белков ограничивается непосредственным измерением темпов роста, в то время как только косвенно измерения других аспектов динамики, такие как частота катастрофы. Во-вторых, несмотря на успехи в редактирования генома технологии, создание клеток, которые стабильно экспрессируют флуоресцентно меченого тубулина или введения мутации избирательно манипулировать тубулина микротрубочек или регуляторов остается серьезной проблемой. Кроме того, наличие многих тубулина изотипов в многоклеточных путает исследование того, как мутации влияют на отдельные гены тубулина.

Почкованием система дрожжей обеспечивает несколько важных преимуществ для измерения в естественных условиях microtubuДинамика ля. Дрожжи имеет упрощенные микротрубочки сеть, которая позволяет визуализировать отдельные микротрубочки. В дрожжах, микротрубочки исходят из организации центров , известные как веретена полюсных тел (SPBS), которые встроены в ядерной оболочке 3. В SPBS служит в качестве каркасов для гаммы-тубулина небольших комплексов , которые пузырьковых микротрубочкой 4, 5. SPBS зарождаются два класса микротрубочек, микротрубочки веретена и астральных микротрубочек. Шпиндельные микротрубочки проект в нуклеоплазму и имеет важное значение для крепления к хромосомам с помощью кинетохорных микротрубочек и для стабилизации шпинделя с помощью перекрывающегося межполюснома микротрубочки 6. В противоположность этому, астральные микротрубочки проект наружу в цитозоле и относительно редко по сравнению с плотной сетью микротрубочек веретена. Во время митоза, предварительно анафаза клетка имеет только 1-2 астральных микротрубочки, исходящие от любого SPB; они существуют, как яndividual микротрубочки , а не как пучки 7. Ролью астральных микротрубочек во время митоза является перемещение ядра и шпинделя в стык между матерью и бутоном отсеками, известными как бутон шея. Это движение предполагает четко определенные пути , которые генерируют силы на астральных микротрубочках, натягивая ядро и шпиндель в направлении и в конечном счете в шейку почки 8.

Еще одним преимуществом системы дрожжей является полезность его генетики, которые могут быть использованы для исследования регуляторов микротрубочек и тубулина субъединицы с беспрецедентной точностью. Дрожжи также обладают упрощенным репертуаром тубулина изотипов: один β-тубулином гена (TUB2) и два альфа-тубулином генов (TUB1 и TUB3). Мутации могут быть легко введены в эти гены , и , таким образом , исследовались в гомогенной популяции тубулина 9, 10. Есть целый ряд широкоимеющиеся конструкции для маркировки микротрубочек, и они могут быть направлены на интеграцию в хромосомных локусах для стабильной экспрессии (см Обсуждения).

Общая цель этого метода состоит в изображения одиночных микротрубочек в живых дрожжевых клеток в четырех измерениях (X, Y, Z и T) для измерений с высокой разрешающей способностью динамики микротрубочек. Способы интеграции конструкций для конститутивной, низкого уровня экспрессии флуоресцентно-меченного тубулина в клетках дрожжей описаны. До начала обработки изображений, живые клетки смонтированы в слайде-камеры, покрытых лектин Конканавалин A, чтобы стабилизировать клетки для долгосрочной визуализации. Оптимальные параметры для получения изображения, а также рабочий процесс для анализа данных, также описаны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка Тарелки-Leu отсева

  1. Добавить 800 мл стерильной деионизированной воды (DIH 2 O) в 2 - литровую колбу. Добавить 26,71 г порошка основы отсев (DOB), 0,69 г CSM-Leu, и 20 г агара. Смешать с магнитной мешалкой. Довести до 1 л с DIH 2 O.
  2. Автоклаве при 121 ° C и 19 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 мин.
  3. Удалить колбу из автоклава и дать ему остыть до ~ 65 ° С при осторожном перемешивании.
  4. Налейте 30 мл / планшет в пластинах диаметром 100 мм. Пусть они сидят при комнатной температуре в течение 36-48 ч перед хранением при 4 ° С.

2. Интеграция GFP-Tub1 для конститутивной экспрессии GFP-меченых тубулина

  1. Отварить запас концентрация 10 мг / мл одноцепочечной ДНК (оцДНК) в течение 3 мин.
  2. Смешайте 2 мкл вареного оцДНК с 400 нг очищенного GFP-Tub1 плазмидной ДНК 11.
    Примечание: Существует различные плазмиды, которые могут быть использованы для стабильного, флуоресцентного мечениямикротрубочек у дрожжей, которые используют альтернативные флуорофоры и селективные маркеры. Некоторые из этих альтернатив описаны в разделе обсуждения.
  3. Добавьте смесь ДНК в 50 мкл аликвоты компетентных клеток дрожжей.
    Примечание: Подготовка компетентных клеток дрожжей с раствором сорбита (Сорб; 100 мМ LiOAc, 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТА, рН 8, и 1 М сорбита, доводили разбавленной уксусной кислотой до рН 8). Подробное описание создания компетентных клеток дрожжей, см ссылку 12.
  4. Vortex тщательно.
  5. Добавить 6x общего объема полиэтиленгликоль (ПЭГ) раствора (100 мМ LiOAc, 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЭДТА / NaOH, рН 8, и 40% PEG3350) к смеси ДНК-клеток.
  6. Vortex тщательно.
  7. Инкубировать в течение по крайней мере 1 ч при 30 ° С при легком помешивании.
  8. Добавить диметилсульфоксид (ДМСО) до 10% от общего объема и вихря.
  9. Инкубируют при 42 ° С в течение 15 мин.
  10. Центрифуга при 2500 мкг в течение 5 мин.
    11. 2 O.
  11. Пластина клеток на качестве -Leu выбывания пластины.
    Примечание: Конструкция GFP-Tub1 содержит лейцин ауксотрофного маркера, в то время как другие конструкции могут использовать альтернативный маркер. Отсев среда должна быть специфической для ауксотрофных маркеров конструкции.
  12. Разрешить трансформированные клетки расти в течение 3-5 дней при 30 ° С.
  13. Re-полоски трансформация отдельные колонии на свежей -Leu отсева пластины путем переноса колоний с использованием автоклавной зубочистки. Инкубируйте планшет в течение ночи при 30 ° C.
  14. Визуально экран каждый трансформант для сигнала GFP суспендированием приблизительно 1 мкл клеток из одной колонии от пластины на этапе 2.14 в 2 мкл воды на чистую слайд. Накройте приостановленные клетки с покровным и наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии.
    1. Возбуждают трансформантов с 488 нм света и посмотреть на наличие сигнала GFP.

3. Выращивание Жидкое дрожжевая культура

  1. Инокулируйте ~ 1 мкл клеток дрожжей из одной колонии на пластине в 3 мл синтетической полной среды. Разрешить клеткам расти в течение ночи при 30 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
  2. Развести насыщенную культуру на следующий день до OD 600 <0,1 в среде. Возвращение разбавленных культур в 30 ° C шейкер в течение 3-4 ч или до OD 600 составляет от 0,4 до 0,8, когда клетки готовы к загрузке в камеры для обработки изображений.

4. Подготовка потока Камерный Слайды

  1. Порезлист парафиновой пленки в часть 4 в ширину и 7 в длину.
  2. Поместите стандартный микроскоп в продольном направлении по ширине на 4 дюйма из парафиновой пленки и обернуть пленку вокруг слайда в 3-4 раза, так что ползун покрыта пленкой, которая имеет толщину 3-4 слоя. Нажмите слои вместе, чтобы обеспечить там разумное уплотнение; это будет сделать легче резать. Не нажимайте слишком сильно, в результате чего фильм морщин.
  3. Вырезать парафиновую пленку вдоль внешних краев слайда, используя чистую коробку резак бритву. Используйте другой слайд, чтобы обеспечить прямой край для резки.
  4. Пил излишки пленки от рабочего ползуна и выбросить. Остальные стопки пленки будет охватывать одну поверхность слайда и будет использоваться, чтобы сделать стены между камерами формирования изображения.
  5. Использование второго слайда в качестве прямого края, разрезать сложенные слои пленки вдоль длинной оси ползуна в приблизительно десять полос, каждая 2-4 мм в ширину.
  6. Нарезать сложенные слои парафиновой пленки перпендикулярноразрезы, сделанные в шаге 4.5, вдоль короткой оси ползуна, чтобы создать полоски 2-4 мм шириной, 23-24 мм в длину и 3-4 слоев толщиной.
  7. Пил нарезанные полоски с помощью бритвы под углом 45 °. Использование щипцов, равномерно распределить полоски отрезанные пленочные на чистом предметном стекле микроскопа, чтобы создать требуемые количества камер. До 3 камеры (сделанная с 4-парафиновой пленкой полосок) может быть создана на одном слайде.
  8. Поместите один покровный поверх полоски пленки и переместить его в нужном положение при помощи щипцов.
  9. Поместите подготовленный слайд, покровный вверх, на плите, установленной при ~ 95 ° C (это примерно низкая средней установка на большую часть конфорок). Нагреть слайд, пока полоска пленки не являются прозрачными (приблизительно 3 мин), а затем запечатать слайд и покровный вместе, слегка нажав на покровном с помощью пинцета.
    Примечание: Важно только прессы по регионам покровных, которые непосредственно над полосками парафиновой пленки, как и царапать регионы выше сhambers может снизить качество изображения. Позаботьтесь, чтобы не перегреть слайд; испаренный пленка будет покрывать внутри камеры с гидрофобной пленкой, которая предотвращает клетки от присоединения.
  10. Используйте пинцет, чтобы удалить слайд из конфорки (слайд будет жарко) и установить ее в стороне, чтобы охладить с боковым покровным лицевой стороны вверх; как слайд охлаждается, пленка будет возвращаться к белой непрозрачной окраске.
    Примечание: На данный момент, слайды будут готовы к загрузке с культивируемыми клетками дрожжей. Дополнительные слайды могут быть сделаны в эту точку и хранить в чистом и сухом месте в течение неопределенного периода времени.

5. Загрузка дрожжевых клеток в Подготовили Flow камерных Слайды

  1. Оттепель замороженный, 200 мкл аликвоты конконовалина А (2 мг / мл в стерильном DIH 2 O).
  2. Добавьте примерно 100 мкл размороженного конконовалина А в каждой камере подготовленного слайд с помощью пипетки в один из открытых концов. Добавьте достаточно конканавалин А чтобы заполнить камеру. Для этого SТЭФ, то конканавалин А будет извлечены через камеру через капиллярное действие.
  3. Повесьте слайд, покровные вниз, между двумя стойками микрофужных трубок или ручками в течение 5 мин , чтобы позволить конканавалин A присоединиться к покровному (т.е. камеры).
  4. Верните бегунок в положение покровного вверх. Промыть камеру с 2x объем камеры (определено на этапе 5.2, выше; приблизительно 200 мкл) синтетического полной среде , чтобы удалить конканавалин A.
    1. Поток среды через камеру, используя либо угол бумажного полотенца или фильтровальную бумагу, сложенную пополам, чтобы привлечь жидкости из одного конца камеры, одновременно пипетки свежей жидкости в другую. В качестве альтернативы, использовать вакуумный аспиратор тщательно засасывать жидкость из одного конца в то время как жидкость пипетки свежей в другую.
  5. Тензодатчики пропусканием 2x объема камеры (приблизительно 200 мкл) клеточной суспензии (со стадии 3.4) с помощью направленного потока Method описано в шаге 5.4.1.
    Примечание: Цель состоит в том, чтобы изображение один слой клеток на покровном. Поэтому важно, чтобы загрузить концентрацию клеток достаточно малы, что они не складывают друг на друга, но достаточно большой, что достаточные клетки присутствуют в поле, чтобы собрать максимальное количество данных на приобретение изображения. Оптимальная концентрация клеток в камере может варьироваться и должны быть определены эмпирически. Для того, чтобы повысить концентрацию клеток в проточной камере, осторожно осадить культуры клеток при 1000 х г в течение 2 мин и удалить некоторые из надосадочной жидкости. Для того, чтобы уменьшить концентрацию клеток, добавить свежую синтетическую полную среду к клеточной суспензии. Концентрация клеток может быть оценена после шага 5.7 (ниже) путем проверки камеры на фазово-контрастного микроскопа. На данный момент, дополнительные элементы могут быть добавлены к камере путем пропускания более клеточной суспензии. Однако уменьшение плотности клеток в данный момент не представляется возможным, и лучше всего достигаетсяпутем загрузки новой камеры с разбавленной клеточной суспензии.
  6. Повесьте слайд покровные вниз, как описано на стадии 5.3, в течение 10 мин, чтобы позволить клеткам придерживаться покровного.
  7. Промыть любую прилипшую клетку, протекающими через 4x объем камеры (приблизительно 400 мкла) синтетическую полную среду. Это позволит устранить свободно плавающие клетки в камере, которые могут загрязнять получение изображения.
  8. Тщательно высушить каждый конец камеры с чистым углом бумажного полотенца, в результате чего мениска к краю покровного стекла.
  9. Уплотнение каждого конца камеры с теплой (75 ° С) герметикой (например, VALAP; равные части вазелина, шерсть воск и парафин).
    Примечание: На данный момент, слайд готов к изображению. Камеры могут быть отображены до 9 ч, в зависимости от плотности клеток в каждой камере. Клетки будут производить углекислый газ (CO 2) в течение долгого времени, который будет постепенно создавать пузырьки , которые вытесняют клетки.

  1. Доведите слайд инвертированного микроскопа, оснащенного 1,45 цели Н.А. 100X CFI Plan Apo, пьезоэлектрического стадии, вращающийся диск конфокальной блок сканера, осветительной лазера и камерой EMCCD. Поддерживать температуру стадии при комнатной температуре (25 ° C) во время приобретения.
    Примечание: Высокая числовая апертура позволяет получить более высокое разрешение изображения, и пьезоэлектрический этап обеспечивает высокую скорость приобретение г-стеку. Минимальные требования микроскопа цель 100X, освещение лазер, и камера EMCCD.
  2. Принесите клетки в фокусе. Убедитесь в том, что поле приобретения имеет по крайней мере 5-6 клеток, собранных вместе, ища слайд для клеток, сгруппированных вместе.
    Примечание: Несмотря на то, что нет необходимости изображения более чем одной ячейки в то время, визуализации несколько ячеек в том же поле повышает эффективность сбора данных без ухудшения качества данных. Тем не менее, это очень важно, чтобыклетки находятся на одной и той же фокальной плоскости, а не сложено на верхней части друг друга.
  3. Программирование многомерного приобретения собрать несколько Z-серию с течением времени.
    1. Настройка параметров в пределах текущих параметров сбора к следующему: общая Z-глубина = 6 мкм, чтобы охватить всю дрожжевую клетку; Z-размер шага = 300 нм, чтобы максимизировать свет коллекцию без передискретизации; Общая продолжительность времени = 10 мин; интервалы времени = Z-серии каждые 4 с; и время экспозиции = 90 мс для каждой плоскости г.
      Примечание: Оптимальное время экспозиции будет варьироваться в зависимости от камеры, источника света возбуждения, и других факторов. В целом, оптимальное время экспозиции будет минимальное время, необходимое для достижения соотношения 3: 1 сигнала от GFP-меченого астральных микротрубочек, чтобы сигнал от цитоплазмы на основе значений пикселов, измеренных с помощью EMCCD.
  4. Начало приобретения, нажав кнопку «Выполнить». Позвольте ему работать в течение всего периода 10 мин. Сохраните данные в виде изображенияряд (.tiff или .nd2).
  5. Выберите новое поле для изображения в камере и повторите шаги 6.2-6.4.
    Примечание: Одна камера должна давать между 15 и 20 полей клеток, в зависимости от плотности клеток в камере. Более высокая плотность клеток будет давать более низкие суммарные поля, как СО 2 в камере будет накапливаться быстрее.

Анализ 7. Изображение

  1. Открыть файл изображения в ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) в качестве HyperStack с использованием био-форматы импортер плагин.
    1. Открытое ImageJ и перетащить полученные стек изображения из секции 6 непосредственно на панели управления. Био-форматы импортер будет запускаться автоматически. Выберите «Ok», чтобы загрузить стек изображения в качестве HyperStack.
      Примечание: «Био-форматы Импорт Опции» подсказки будут открывать и гарантировать, что под «Stack Просмотр», раздел «Просмотр стека с:» установлен в положение «HyperStack»; и "Stack Order:" установлен в положение "XYCZT."
  2. Collapse каждого Z-серию в максимальную интенсивность, 2-мерная проекция с помощью функции Z-проекта.
    1. Выберите меню «Изображение», подменю «Стек» и функцию «Z-проект». Выберите «Максимальную проекцию» из выпадающего списка и нажмите кнопку «Ok».
  3. Применяют медианный фильтр в стек изображения для уменьшения шума зернистость путем выбора меню «Process», «Фильтры» подменю, и «Median» функцию. Введите 2,0 пикселей в поле радиуса и нажмите кнопку «Ok».
  4. Определение предварительно анафазе клеток в этой области.
    Примечание: Они характеризуются средним бутонов и короткой митотического веретена, 1-1,5 мкм в длину (фиг.1; стрелку указывает на короткий митотического веретена). Клетки на данном этапе являются идеальными для анализа динамики микротрубочек, потому что они обычно имеют только Feж астральные микротрубочки , исходящие полюса шпинделя 7. Астральные микротрубочки могут быть идентифицированы в виде линейных волокон, которые демонстрируют равномерную интенсивность сигнала GFP от минус конца, в СПБ, в конце плюс, в цитоплазме.
  5. Начиная с первой временной точкой в ​​серии изображений, с помощью инструмента сегментированных линий, чтобы нарисовать линию вдоль одной астральной микротрубочки, от минус конца, расположенном на стыке между астральной микротрубочкой и более интенсивно меченым шпинделем микротрубочками, к положительному концу , который находится в цитоплазме (см красные линии на рисунке 1). Дважды щелкните на конце микротрубочки, чтобы завершить сегментированную линию.
  6. Запишите измерения в таблице результатов, используя «меру» функцию, нажав на кнопку «M» на клавиатуре.
    Примечание: Дополнительные функции, такие как серые интенсивности, может быть записано путем установки измерения в меню «Анализ» и «Set измерение» подменит.
  7. Переход к следующей временной точке либо нажав правую стрелку в строке Z-слайдер или нажав кнопку «./>» клавишу на клавиатуре. Повторите шаги 7.5 и 7.6 для всех временных точек в последовательности изображений.
  8. Скопируйте данные из таблицы результатов и вставить их в таблицу. Сохраните данные, выбрав пункт «Сохранить как».
    Примечание: Эти измерения будут включать несколько значений, но наиболее важных значения срез, который указует временную точку в серии, и длину, что указует на длину линии (то есть, астральные микротрубочки). Столбцы , содержащие другие измерения (например, область, среднее значение пикселя, угол, и т.д.) могут быть либо сохранить или выбросить.
  9. Создайте новый столбец в таблицу, щелкнув правой кнопкой мыши и с помощью функции «Вставить». Ввод времени (ов) каждой временной точке.
  10. Создание XY график рассеяния длины микротрубочек (мкм) в зависимости от времени (ы) с помощью «Вставить линиюДиаграмма»особенность, выберите измерение длины, как„Y“и столбец время как„X“
    1. Определение области полимеризации, деполимеризации, и паузы, глядя на положительные и отрицательные изменения длины с течением времени на график рассеяния с шагом 7.10.
      Примечание: Полимеризация события увеличивают длину микротрубочек , по меньшей мере , 0,5 мкм , через минимум 3 временных точек и соответствуют линейной регрессии с R 2 ≥ 0,9 и R-значение> 0 (фиг.1В и D, зеленые точки). Деполимеризации событие уменьшает длину микротрубочек , по меньшей мере , 0,5 мкм , через минимум 3 временных точек и соответствует линейной регрессии с R 2 ≥ 0,9 и R-значением <0 (фиг. и D, розовые точками). Пауза событие отделено от полимеризации и деполимеризации. Паузы определяются как чистые изменения в длине микротрубочек менее чем 0,5 мкм через минимум 3 моментов времени;соответствовать линейной регрессии с R-значение между -0.4 и 0.4; и имеют наклон, что статистически не отличается от нуля, как определено с помощью F-теста.
    2. Используя график рассеяния в качестве руководства, определить участки времени, когда изменение длины положительно и выделить их в зеленом цвете. Выделите области времени, когда изменение длины отрицательно в розовом цвете.
    3. Расчет линейная регрессии каждого выделенная раздел и запись R- и R 2 -значения для каждого раздела в столбцах проксимальнее регионы. Классифицировать каждый цветной регион либо как событие полимеризации или событие деполимеризации.
  11. Вычислить скорость полимеризации пути деления чистого изменения длиной изменения во время для каждого события роста. Запишите эти результаты в колонке рядом с линейными значениями регрессии с шага 7.10.3.
  12. Расчет ставки деполимеризации пути деления чистого изменения длиной изменение во время для каждого shrinkinг событие. Записать эти результаты в столбце, прилегающие к значениям скорости полимеризации со стадии 7.11.
  13. Вычислить частоту катастроф путем деления числа полимеризации-к-деполимеризации переходов на общее время всех событий роста 13. Записать эти результаты в колонке рядом значений скорости деполимеризации с шага 7.12.
  14. Вычислить частоту спасательного путем деления числа деполимеризации-к-полимеризации переходов на общее время всех событий усадки 13. Записать эти результаты в столбце, прилегающих к значениям частоты катастрофы с шага 7.13.
  15. Вычислить динамичность путем деления суммы абсолютной величины всех изменений длины по общей продолжительности получения изображения, вычисленных на этапе 7.10.1, и умножения на 27.0833 , чтобы получить тубулин субъединиц в секунду 14. Запишите эти результаты в столбец, примыкающие к спасательной частоте ВалуЕЭС от этапа 7.14 и сохранить таблицу результатов.
    Примечание: Можно автоматизировать процесс анализа , описанный в шагах 7,10-7,15 с использованием заказной программы (. Estrem и др рукопись представлена). Программа предназначена для определения периодов полимеризации и деполимеризации в измерениях длины, следуя параметры, подробно описанные выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Измерение динамики микротрубочек в живых клетки дрожжей предоставляет убедительный инструмент для оценки, как мутации в генах, кодирующих регуляторы микротрубочек или тубулин субъединицы полимеризации удара и скорость деполимеризации, а также частоте перехода между этими состояниями. Рисунок 1 отображает временные ряды астральных динамиков микротрубочек в клетке дикого типа и мутантный клеток с мутацией в бета-тубулине (tub2- 430Δ). Микротрубочки помечены GFP-меченый альфа-тубулина, чтобы визуализировать длину микротрубочек. Красные стрелки проследить длину астральных микротрубочек в каждом изображении (Figure1A и 1 C). Длина микротрубочек были измерена в каждой временной точке в течение 8 мин, и эти скомпилированные длины изображены на участках жизни (фиг. и 1 D). Эти данные были использованы для определения скорости полимеризации, скорость деполимеризации, полимеризации duratiна, продолжительность деполимеризации, частота спасения, частоты катастроф и динамичности.

Рисунок 1
Рисунок 1. Покадровый Визуализация GFP-меченых микротрубочек и Измерения Астральных микротрубочек Dynamics. (А и С) Первые пять последовательных изображений изображений в заданный промежуток времени для дикого типа и tub2 -430Δ мутантных клеток. Микротрубочки помечены GFP-Tub1 визуализировали в пре-анафазы клеточного цикла. Каждое изображение является максимальной интенсивности проекции из конфокальной Z-серии. Шкала баров: 1 мкм. Timestamps показывает общее время на каждом приобретении кадра. Красные стрелки следуют вдоль общей длиной астральных микротрубочек, причем стрелки, обозначающих концов плюса. (В и D) микротрубочки жизни участки отображение длины отдельных астральных микротрубочек с течением времени. Зеленая точкаs обозначают полимеризации и розовые точки обозначают деполимеризации. Стрелки указывают на катастрофических событий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 1 демонстрирует измененные динамики микротрубочек между штамма дикого типа и мутантного штамма не хватает на 27 аминокислот бета-тубулина на C-конце, мутанта , который был ранее показано, имеют более стабильные микротрубочки 15. Как показано в микротрубочек жизни участков, микротрубочек в tub2 -430Δ мутанта длиннее и проявляет меньше , чем катастрофы дикого типа микротрубочек (рис 1B и D; наконечники стрел Таблица 1). Кроме того, скорость полимеризации и деполимеризации, определяется со склонов восходящих и нисходящими микротрубочками Ленгатыс, уменьшаются в мутанте по сравнению с диким типом (фиг.1В и 1D; таблица 1). И, наконец, микротрубочки в мутантных клетках tub2 -430Δ проводит больше времени в состояниях полимеризации и деполимеризации и уменьшилась динамичность по сравнению с диким типом (таблица 1).

Напряжение Динамичность (субъединицы / с) Скорость полимеризации (мкм / мин) % Время полимеризации Скорость Depolym (мкм / мин) % Время в деполимеризации
певших 		% Время паузы Частота спасения (события / мин) Частота катастроф (эвЭнты / мин)
Дикого типа п = 1 54 1,8 ± 0,5 48 3,0 ± 0,3 29 3 1,8 1.4
tub2-430Δ п = 1 40 1,4 ± 0,1 41 1,5 ± 0,2 32 0 0.8 0.7
Сокращения заключаются в следующем: мкм, мкм; мин, мин; с, второй; п, одного микротрубочек проанализированы с микротрубочками жизни участка (Fig1B, D). Значения представляют собой среднее ± стандартная ошибка среднего.

Таблица 1: Динамика микротрубочек Измерения для ячеек на рисунке 1. Значения представляют собой среднее ± стандартная ошибка среднего из измерений одиночных микротрубочек , показанных на фиг.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Почкование модель дрожжей предлагает значительные преимущества для сбора измерений с высоким разрешением динамики микротрубочек в обстановке в естественных условиях, в том числе способности к изображению одиночным микротрубочкам с течением времени и способностью манипулировать тубулин и регуляторы микротрубочек с помощью инструментов дрожжей генетики.

Камеры конканавалин A-покрытие обеспечивают ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными аппаратами, в том числе расплавленного агара колодки. Слайды с камерами могут быть предварительно сделаны и сохранены на долгий срок или могут быть использованы немедленно. Кроме того, камеры конканавалин A-покрытие способны культивирования клеток дрожжей в течение> 6 ч в той же среде, в которой клетки были первоначально культивировала. Важно отметить, что число клеток в камере будет диктовать, как долго камера может быть отображена. Камеры с покрытием гарантирует, что только один слой клеток дрожжей прилипает к покровным. И, наконец, создание нескольких камер позволяетнесколько различных штаммов дрожжей, которые будут отображены на одном слайде.

Существуют серьезные проблемы с визуализацией динамики микротрубочек у почкующихся дрожжей, в том числе относительно низких уровней сигнала и весьма динамичный характер процесса. Широкопольные микроскопы являются достаточными для захвата одной временной точке изображения меченых микротрубочек. Однако широкопольная микроскопия вызывает быстрее фотообесцвечивание за счет увеличения времени экспозиции и бомбардировку образца с вне фокуса света. Кроме того, лазерный сканирующий конфокальный микроскоп неадекватны из-за быстрее фотообесцвечивание. Спиннинг диска конфокальной микроскопии уникально подходит для визуализации динамики микротрубочек у почкующихся дрожжей. Система конфокальный микроскоп вращающийся диск, используемый здесь, был разработан с учетом этих требований.

Микроскопическая система должна быть рассчитана на высокой скорости и высокой чувствительности. Хотя различные системы микроскопа могут оказаться подходящими, некоторые компоненты имеют важное значение. 100Xобъектив с высокой числовой апертурой (1.45NA) необходимо решить отдельные микротрубочки и изменения длины от порядка 100 нм. Сканер вращающийся диск конфокальной необходимо минимизировать фотообесцвечивания и токсичность, блокируя из фокуса света, и для получения максимального разрешения и чувствительности, путем сбора только в фокусе света. Камера EMCCD должна быть быстрой и чувствительной, чтобы собрать достаточное количество сигнала GFP-Tub1 в течение каждого 90-мса приобретения покадрового. В настоящее время, EMCCD камеры являются лучшим выбором для данного применения. Датчик тока камеры CMOS отсутствие чувствительности высокого класса EMCCDs; Однако, эта технология значительно улучшается, и в скором времени может быть подходящим. Наконец, пьезоэлектрический этап необходим для быстрого и точного движения в Z, который может являться лимитирующей стадией в четырехмерном получении изображения.

Конкретная система микроскопа описан в данном протоколе может представлять собой барьер, если подобное оборудование не легко доступно. Переоборудование сбыть сделано, чтобы приспособить различные системы обработки изображений, но эти модификации могут происходить за счет временного и / или пространственного разрешения. Двигатель ступени шпинделя с приводом может быть использован вместо пьезоэлектрической стадии. Тем не менее, эти двигатели работают медленнее, менее точны, и склонны к дрейфу. После захвата изображений стабилизирующего подключаемые модули могут быть использованы для минимизации дрейфа в размерах XY, связанные с этими электроприводными этапами. Кроме того, могут быть использованы альтернативные камеры с замедленной скоростью считывания. Для размещения более медленную скорость сбора, Z-серии могут быть собраны реже (то есть, чем больше времени между Z-серии). Тем не менее, увеличение времени между Z-серией риски отсутствует переходы, которые могут возникнуть между временными точками. Альтернативно, расстояние между Z-плоскостями может быть увеличено, как способ уменьшения количества изображений, собранных в Z-серии. Однако, увеличение этого расстояния риски потери информации изображения между плоскостями, которые будут ухудшать способность экспериментатора к accurately идентифицировать микротрубочки концов. Очевидно, что изменения могут быть сделаны, чтобы приспособить альтернативные системы визуализации, но эти изменения должны оцениваться с потенциальной потерей информации об изображении.

Другим ограничением этого протокола является потеря пространственной информации, когда трехмерные изображения стеки преобразуются в двумерных проекций изображения. Отдельные астральные микротрубочки в предварительно анафазе дрожжевой клетки, как правило, составляет от 0,5 до 2,0 мкм в длине и проектах на трехмерное пространстве цитоплазмы. Поэтому крайне важно, чтобы получить изображения из серии Z-позиции, чтобы собрать всю пространственную информацию индивидуальных микротрубочек в. В приобретении покадрового, это может привести к сложному набору данных, с 20-Z-ломтиками в каждом из 150 временных точек, в общей сложности 3000 изображений. Для решения этой проблемы и упростить анализ изображения, пространственная информация из Z-стеки сжимается во время анализа. Хотя этот benefего анализ, это происходит за счет пространственной информации от Z-измерения. Сколько информации теряется, когда Z-размер сжимается? Чтобы оценить эту потерю, эксперименты были проведены для измерения расстояния между SPBS в предварительно анафазе клеток, которые относительно легко измерить, так как Spc110-GFP-меченых SPBS обладают сферической фокусы с высокими значениями отношения сигнал-шум. Несмотря на то, шпиндель может проявлять различное смещение в Z, чем астральные микротрубочки, средняя длина аналогична (~ 1,5 мкм) и, следовательно, обеспечивает полезный прокси-сервер. Шпиндельные длины, в среднем, 15% больше, при измерении в полных трехмерных изображений стеки, чем когда одни и те же шпиндели измеряются в двумерных проекций (JM, неопубликованные результаты). Таким образом, преимущество упрощенного набора данных и измерений должно быть взвешено против стоимости отбрасывали Z информации.

Дрожжи клеточной биологии сообщество разработало универсальный инструментарий для визуализации микротрубочек Networкс. Это включает в себя множество флуоресцентных белков, слитых с альфа-тубулина / Tub1 и обозначен различными ауксотрофными маркерами. Эти конструкции включают в себя LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11, который интегрирует в хромосомной LEU2 локусе, и несколько слитых к GFP и другим флуорофорам, которые интегрируют в локусе URA3, в том числе URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16, URA3 :: КФП-TUB1 (pAFS125-КФП), и URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. Кроме того, набор Tub1 слитых с различными флуоресцентными белками недавно был создан , что целевая интеграция либо в хромосомном URA3 локус или к локусу , примыкающему к нативному TUB1 локусу 18. Эта обширная палитра флуорофоров и маркеров является очень полезным для совместной локализации экспериментов с дифференциально меченных белков. Слияние GFP-Tub1 остается лучшим инструментом для покадровой визуализации microtuBule динамика благодаря своей яркости и светостойкости. Слитый GFP-Tub1 создатель Song & Lee (pSK1050) 11 содержит сплав GFP с амино-концом α-тубулина / Tub1 и интегрирует в LEU2 локусе , чтобы спасти лейцин ауксотрофию. Таким образом, слитый белок экспрессируется эктопически в дополнение к нативной альфа-тубулина и содержит ~ 20% от общего альфа-тубулина в клетке 9. Важно отметить, что синтез GFP-Tub1 не спасает функцию нативных α-тубулина / Tub1 (JM, неопубликованные результаты). Это также относится и к другим фьюжн TUB1 конструкции 18.

С доступными инструментами для визуализации микротрубочек и их связывающих белков, многообещающий дрожжей является идеальной системой для изучения мутаций в тубулине и других регуляторах микротрубочек. Кроме того, ограниченное число генов тубулина позволяет непосредственного изучения однородного пула мутантного тубулина. В дополнение к мутациям вгенов тубулина, многообещающий дрожжей имеет ряд ассоциированных с микротрубочками белки (MAPS), которые гомологичны многоклеточных аналоги. Эти карты могут быть изучены непосредственно, и эффекты, что мутации имеют на отдельных микротрубочек нитей также могут быть рассмотрены. Протокол подробно описаны здесь позволяет исследовать обоих внутренних и внешних процессов, которые влияют на динамику микротрубочек.

Таким образом, микротрубочки должны быть динамичными, чтобы правильно функционировать во многих клеточных процессах. Необходимо понимать факторы, присущие тубулина и примесные, связанные белки, которые регулируют динамику микротрубочек. Баддинги дрожжей является идеальной системой для изучения влияния этих факторов непосредственно количественной оценки динамики одного микротрубочек. Протокол подробно описан выше описан , как стабильно интегрировать флуоресцентный слитый белок в геном дрожжей и как получать и анализировать конфокальные изображения стеки для количественной оценки динамики микротрубочек в естественных условиях

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Керри Блум (Университет Северной Каролины), Кайунг Ли (NCI), Стивен Маркус (Colorado State University) и Эльмар Шибел (Universität Heidelberg) для совместного использования различных FP-TUB1 плазмид. Мы благодарны Мелисса Гарднер (Университет Миннесоты) для обучения нас в способе подготовки слайд-камеры. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH) грант R01GM112893-01A1 (до Jkm) и T32GM008730 (до н.э.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOB (dropout bases) Sunrise science  1650
CSM-Leu Sunrise science  1005
Agar Ameresco N833
100 mm polystyrene plates Fisher Scientific FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O Sigma-Aldrich   D7656 resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media  Sunrise science  1459-100
Concanavalin A Sigma-Aldrich  L7647 resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
Microscope Coverslips Fisher Scientific 12-541-B
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) melt at 75 ºC before use
forceps  Fisher Scientific 16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich  202444
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope Nikon Instruments MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective Nikon Instruments MRD01905
Piezo electric stage  Physik Instrumente P-736
Spinning disk scanner Yokogawa CSU10
Laser combiner module Agilent Technologies MCL400B
EMCCD camera Andor Technology iXon Ultra 897 
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elements software Nikon Instruments MQS31100
Microsoft Excel software Microsoft
MATLAB software MathWorks, Inc
ImageJ64 NIH Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in Open Microscopy Environment
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1 pSK1050 reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
  2. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
  3. Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
  4. Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
  5. Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
  6. Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
  7. Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
  8. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  9. Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
  10. Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
  11. Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
  12. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
  13. Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
  14. Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
  15. Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
  16. Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
  17. Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
  18. Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).

Tags

Клеточная биология выпуск 122 цитоскелет динамика микротрубочек Баддинг дрожжи Микроскопия Live-ячейка изображение
Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J.… More

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter