Summary
Denne protokol beskriver en metode til at teste proteinets evne til at co-sedimentere med filamentous actin (F-actin) og, hvis binding observeres, for at måle affiniteten af interaktionen.
Abstract
Filamentous actin (F-actin) organisering inden for celler reguleres af et stort antal actinbindende proteiner, der styrer actin-nucleering, vækst, tværbinding og / eller adskillelse. Denne protokol beskriver en teknik - aktinsam-sedimentering eller pelletering, analyse - for at bestemme, hvorvidt et protein eller protein domæne binder F-actin og for at måle interaktionens affinitet ( dvs. dissociation-ligevægtskonstanten). Ved denne teknik inkuberes først et protein af interesse med F-actin i opløsning. Derefter anvendes differentialcentrifugering til sedimentering af actinfilamenterne, og det pelleterede materiale analyseres ved SDS-PAGE. Hvis proteinet af interesse binder F-actin, vil det co-sedimentere med actinfilamenterne. Produkterne af bindingsreaktionen ( dvs. F-actin og proteinet af interesse) kan kvantificeres for at bestemme affiniteten af interaktionen. Actinpelleteringsassayet er en retfærdig teknik til bestemmelseHvis et protein af interesse binder F-actin og til vurdering af, hvordan ændringer i proteinet, såsom ligandbinding, påvirker dets interaktion med F-actin.
Introduction
Actin er et essentielt cytoskeletisk protein, der spiller en kritisk rolle i flere cellulære processer, herunder bevægelighed, sammentrækning, adhæsion og morfologi 1 . Actin eksisterer i to former: monomer globulært actin (G-actin) og polymeriseret filamentous actin (F-actin). Inden for celler styres F-actin-organisationen af en stor samling proteiner, der regulerer kernen, vækst, tværbinding og demontering af actinfilamenter 2 , 3 , 4 . Men hvordan flere aktinbindende proteiner fungerer sammen for at regulere actin-netværksorganisationen er stadig stort set uklart.
Måling af protein-protein-interaktioner er en vigtig tilgang til forståelse for, hvordan proteiner udøver deres virkninger på cellulær adfærd på det biokemiske niveau. Mange forskellige analyser kan anvendes til at detektere interaktioner mellem oprensede proteiner.Fælles fremgangsmåder for opløselige proteiner indbefatter pull-downs, fluorescenspolarisation, isotermisk titreringskalorimetri og overfladeplasmonresonans. Det er vigtigt, at alle disse analyser kræver proteiner, der er opløselige og er således vanskelige at tilpasse til anvendelse med et polymert, filamentøst protein, såsom F-actin. Her beskriver vi en teknik - actin co-sedimentering, eller pelletering, analyse - for at bestemme, om et protein eller protein domæne binder F-actin og for at måle affiniteten af interaktionen.
Actinpelleteringsassayet er en forholdsvis simpel teknik, der ikke kræver specialiseret udstyr, bortset fra en ultracentrifuge. Alle reagenser kan laves, forudsat viden om grundlæggende biokemi, eller købt. Når først binding til F-actin er etableret, kan analysen anvendes til at måle den tilsyneladende affinitet ( dvs. dissociation-ligevægtskonstanten) 5 . Også, når en affinitet er etableret, er pelleteringsassayetEr et nyttigt værktøj til måling af, hvordan ændringer i proteinet af interesse ( dvs. posttranslationelle modifikationer, mutationer eller ligandbindinger) påvirker dets interaktion med F-actin 6 . Teknikken har begrænsninger (se diskussionen ), som forskeren bør være opmærksom på, før forsøget udføres.
Protocol
1. Forbered materialerne
- Rens proteinet af interesse (se afsnit 2).
- Forbered eller køb G-actin.
BEMÆRK: G-actin kan isoleres fra flere kilder 1 ; Alternativt kan den købes. Rekonstitueret G-actin (i 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP (adenosintrifosfat) og 0,5 mM dithiothreitol (DTT)) skal flashfryses, opbevares ved -80 ° C og> 10 mg / ml I små (10-20 μl) alikvoter og optøes lige før brug. G-actin-alikvoter bør ikke refrozen. - Forbered eller køb et kontrolprotein, såsom BSA (se trin 4.4).
- Forbered 10x polymeriseringsbuffer (200 mM imidazol pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP og 10 mM EGTA (ethylenglycol-bis (P-aminoethylether) -N, N, N ', N'- Tetraeddikesyre)). Lav en 10x lager og juster pH efter tilsætning af ATP, hvis det er nødvendigt. Aliquot (25 μL er et nyttigt volumen) og opbevares ved -80 & #176; C.
- Forbered 10x reaktionsbuffer (200 mM imidazol pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP og 10 mM EGTA). Lav en 10x lager og juster pH efter tilsætning af ATP, hvis det er nødvendigt. Aliquot (50-100 μL er et nyttigt volumen) og opbevares ved -80 ° C.
BEMÆRK: Reaktionsbufferens sammensætning er fleksibel og kan muligvis indstilles for at reducere baggrundssedimentering, begrænse ikke-specifik binding og / eller forbedre binding (trin 1.5.1-1.5.3).- Juster reaktionsbufferens pH mellem 6 og 8 for at optimere proteinstabilitet. Ved en lavere eller højere pH, erstat en passende buffer til imidazol.
BEMÆRK: Brug pH 7,0 som udgangspunkt, medmindre et protein kræver en lavere eller højere pH for stabilitet. Brug ikke en buffer med en pH under 6,0 eller højere end 8,0, da dette kan forstyrre actin. Anbefalede buffere (slutkoncentration og optimale pH-værdier) indbefatter: 20 mM MOPS (3- ( N- morpholino) propansulfonsyre), pH= 6,5; 20 mM imidazol, pH = 7,0; 10 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre), pH = 7,5; Og 20 mM Tris, pH = 8,0. - Varier saltopkoncentrationen af reaktionsbufferen afhængigt af analysens behov.
BEMÆRK: Actin er et surt protein, og næsten alle actinbindende proteiner er i nogen grad afhængige af elektrostatiske interaktioner for at associere sig med actin. Derfor øger saltkoncentrationen actinbindingen i de fleste tilfælde. Reaktionsbufferen anvender et fysiologisk saltniveau (150 mM NaCl, arbejdskoncentration), og dette er det anbefalede udgangspunkt. Om nødvendigt kan saltkoncentrationen sænkes ( fx til 100 mM) for at fremme binding eller forøges for at begrænse binding. - Ændre ikke koncentrationerne af MgCl2, ATP eller EGTA i reaktionsbufferen, medmindre der er en særlig grund til at gøre det.
- Juster reaktionsbufferens pH mellem 6 og 8 for at optimere proteinstabilitet. Ved en lavere eller højere pH, erstat en passende buffer til imidazol.
2. Forbered testproteinet til analysen
- preparEa høj renhedsprotein ved anvendelse af væskekromatografi for de bedste resultater 7 .
BEMÆRK: Hvis der anvendes rekombinant protein, skal store proteinkoder, såsom glutathion-S-transferase (GST), fjernes ved proteaseklevning fra målproteinet, da de kan forstyrre bindingen. GST forårsager også homodimerisering af fusionsproteiner, der kunstigt kan forøge bindingsaffiniteten af actinbindingen. - Bestem proteinkoncentrationen ved at måle absorbansen ved 280 nm. Opdel ved udryddelseskoefficienten; Udryddelseskoefficienten kan beregnes ud fra proteinsekvensen ved hjælp af sekvensanalyse eller onlineværktøjer. Alternativt bestemmer proteinkoncentrationen ved anvendelse af Bradford eller BCA (bicinchoninsyre) metoder.
BEMÆRK: Ved indledende forsøg er normalt 50-100 μl protein ved 20-40 μM normalt tilstrækkeligt. Dette vil muliggøre analysen af binding i det lave mikromolære område, et nyttigt udgangspunkt for de fleste actinbindende proteiner. En større quanOg ofte er der brug for en højere koncentration af protein for at danne en bindende kurve for at beregne affiniteten (se afsnit 5). - Lige før brug, drej proteinet hårdt (50.000-100.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C) for at fjerne aggregaterne af uopløseligt protein. Hvis opløselighed er en bekymring, måles proteinkoncentrationen igen (trin 2.2) efter centrifugering.
3. Forbered F-actin
- Fjern en alikvot af G-actin fra -80 ° C fryseren og optø det hurtigt.
- Tilsæt 10x polymerisationsbufferen til G-actin til en slutkoncentration på 1x. Sørg for, at G-actinkoncentrationen i 1x polymeriseringsbuffer er mindst 10-20 μM, langt over den kritiske koncentration. Inkubér i 1 time ved stuetemperatur (RT) for at lade actinet polymerisere.
- Efter polymerisering opbevares F-actin i opløsning ved 4 ° C, hvor det vil være stabilt i nogle få uger. Før du bruger F-actin igen efter opbevaring, skal du forsigtigt vende omEller flad røret flere gange for at sikre, at all actin er opløst og ensartet fordelt i opløsning.
BEMÆRK: (Valgfrit) Tilsæt phalloidin for at opnå et molforhold på 1: 1 af G-actin: phalloidin. Inkubér i 30 minutter ved stuetemperatur for at tillade phalloidin at binde til F-actin. Phalloidin stabiliserer F-actin og opnår to ting: (i) det reducerer mængden af actin, som ikke sedimenteres under centrifugering, og (ii) det tillader, at F-actin fortyndes under den kritiske koncentration (~ 0,5 μM), hvilket ofte Nødvendigt, hvis man varierer mængden af F-actin for at danne en bindende kurve (se afsnit 5 om måling af affiniteten).
4. Pelleteringsassay - Grundprotokol
BEMÆRK: Basisprotokollen beskrevet i afsnit 4 anvendes til at bestemme, om et protein af interesse co-sedimenter med F-actin. Når bindingen til F-actin er etableret, kan affiniteten af denne interaktion måles efter protokollen beskrevet i afsnit 5.
- Forbered reaktionsbufferen på anvendelsesdagen ved fortynding af 10x stammen til 1x og tilsætning af DTT til en slutkoncentration på 1 mM.
BEMÆRK: (Valgfrit) Tilsæt polidocanol til en endelig arbejdskoncentration på 0,02% i reaktionsbufferen. Polidocanol er et overfladeaktivt middel, der reducerer ikke-specifik baggrundsbinding og hjælper med at forhindre hydrofobe proteiner i at klæbe til ultracentrifugerøret. - Fortynd proteinet af interesse for de ønskede koncentrationer i 1x reaktionsbuffer i ultracentrifugerør. Hold prøvestykkerne lave (40-60 μL) for at undgå at bruge store mængder protein ved hjælp af ultracentrifugerør med små minimumsvolumener ( fx 7 x 20 mm rør, der holder 0,2 ml hver).
BEMÆRK: Da mange actinbindende proteiner har en affinitet for F-actin i mikromolarområdet, anbefales det at teste et protein af interesse ved 2 og 10 μM. Hvis binding ikke observeres ved 10 μM, er det usandsynligt, at bindingen vil blive observeret ved højere koncentrationer. HvisTilsat protein udgør mere end 10-20% af det endelige reaktionsvolumen, kan det være nødvendigt at dialysere proteinet i reaktionsbufferen før udførelse af eksperimentet. - Tilsæt F-actin til den ønskede slutkoncentration.
BEMÆRK: 2 μM er en nyttig koncentration til indledende eksperimenter, fordi den ligger langt over den kritiske koncentration og således opretholder actin i filamentøs tilstand. Det vil frembringe en synlig pille, når den analyseres ved SDS-PAGE (trin 4.10). - Forbered de følgende kontroller i ultracentrifugerør for at gøre analysen informativ.
- Forbered prøve (r), der indeholder proteinet af interesse uden F-actin. Sørg for, at koncentrationen af protein i disse prøver matcher koncentrationen i "plus F-actin" -prøverne.
BEMÆRK: Disse prøver bestemmer mængden af protein, som aggregeres eller fastgøres til siderne af ultracentrifugerøret i fravær af F-actin. - Forbered negative kontrolprøverVed den samme eller tilsvarende koncentration (er) anvendt til proteinet af interesse. Brug et kontrolprotein, der ikke binder til F-actin, med og uden F-actin.
BEMÆRK: Dette er en vigtig kontrol, fordi proteiner kan blive "fanget" i actinfilamenter og piller med F-actin, selvom de ikke binder F-actin. Mængden af fældefangst kan variere afhængigt af F-actinkilden, bufferbetingelserne osv. Således bør denne kontrol inddrages i alle eksperimenter. Ideelt set bør kontrolproteinet have en molekylvægt svarende til proteinet af interesse ( f.eks . For aE-catenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) er en passende kontrol). Kommercielt tilgængelige gelfiltreringsstandarder gør fremragende kontrolproteiner, da de dækker en række størrelser og har tendens til ikke at indeholde aggregater. - Eventuelt fremstille positive kontrolprøver, der indeholder et protein, der binder til F-actin, med og uden F-actin. Sørg for, at koncentrationen (erne) ligner demE protein af interesse.
BEMÆRK: Denne kontrol er nyttig, idet den viser, at forsøgsbetingelserne ( fx forberedt F-actin, reaktionsbuffer og centrifugering) tillader F-actin-binding. Da pelleteringsassayet ikke kan påvise svage F-actin-interaktioner (se diskussionen), anbefales det at det kendte F-actinbindende protein har en moderat til svag affinitet for F-actin ( dvs. i det lave mikromolarområde ). Oprensede F-actinbindende proteiner er kommercielt tilgængelige.
- Forbered prøve (r), der indeholder proteinet af interesse uden F-actin. Sørg for, at koncentrationen af protein i disse prøver matcher koncentrationen i "plus F-actin" -prøverne.
- Inkubér alle prøver i 30 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Længere inkubationstider er fine, forudsat at proteinet af interesse er stabilt, men sandsynligvis unødvendigt. Hvis proteinet af interesse ikke er stabilt ved stuetemperatur, kan prøver inkuberes ved 4 ° C. I dette tilfælde kan længere inkubationstider være nødvendige. - Indlæs prøverne i centrifugrotoren. Placer rørene inden i rotoren for at hjælpe med at resuspendere pelleten efter centrifugering.Marker derfor alle centrifugerørene ( f.eks. Med et prøveantal) og placer alle rørene i rotoren i samme position ( fx nummeret vendt ud).
- Centrifuge ved 100.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C i en ultracentrifuge.
- Efter centrifugering fjernes 3/4 af supernatanten ( f.eks . 45 μl hvis startvolumenet var 60 μl) fra hvert rør og blandes med 1/3 volumener 4x prøvebuffer (15 μl i dette tilfælde) i et separat mikrocentrifugerør.
- Fjern den resterende supernatant med en gelindlæsningstip, pas på at ikke forstyrre pelleten (som kan være synlig som en glasagtig plet).
BEMÆRK: Det er vigtigt at fjerne supernatanten fra rørene så hurtigt som muligt efter færdiggørelsen af centrifugen for at begrænse proteindissociation efter separation. Vask heller ikke pelleten med reaktionsbuffer af samme grund.
- Fjern den resterende supernatant med en gelindlæsningstip, pas på at ikke forstyrre pelleten (som kan være synlig som en glasagtig plet).
- Tilsæt 4/3 volumener 1x prøvebuffer til hver pelleT ( fx 80 μl hvis startvolumenet var 60 μl).
BEMÆRK: Dette gør fortyndingen det samme som for supernatanten (trin 4,8, 1/3 volumener 4x prøvebuffer blev tilsat), hvilket tillod den direkte sammenligning mellem pellet- og supernatantprøver og bestemmelsen af procentdelen af protein, som blev pelleteret.- Tilsæt prøvebuffer til alle rør og inkuber i mindst 5 minutter ved stuetemperatur. Lad pelleten sidde i prøvebufferen for at forbedre prøvegendannelsen.
- Triturat prøven 8-10 gange med en p200 pipettespids til resuspenderet pelleten ved kontinuerligt at vaske rørets pelletareal. Skub forsigtigt pipettespidsen over pelleten under triturationen for at hjælpe med resuspension.
BEMÆRK: Pas på at undgå at indføre luft i prøven under triturering, da dette vil medføre, at prøvebufferen bobler og vil reducere prøveudvinningen. - Overfør de resuspenderede prøver til mikrofugerør efter triturering. </ Ol>
- Analysér supernatanten og pelletprøverne ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning 8 ved at indlæse 10-15 μl prøve pr. Bane; Dette er tilstrækkeligt til at visualisere proteinerne.
BEMÆRK: Proteiner, der sam-sedimenterer med F-actin, vil blive beriget i "plus F-actin" pelletprøverne over "nej F-actin" pelletprøverne ( Figur 1A ). Standard Coomassie blå farvning er tilstrækkelig til påvisning, hvis proteinkoncentrationerne ligger i 0,1-10 μM området. Colloidal Coomassie 9 eller Western blotting kan bruges til at øge følsomheden, hvis lavere proteinkoncentrationer anvendes til at måle interaktioner med højere affinitet. - Image Coomassie-farvede geler ved hjælp af et scanner- eller billeddannelsessystem (trin 5.12).
5. Pelleteringsassay - kvantificering
Bemærk: Hvis der observeres specifik binding til F-actin, kan det være nyttigt at måle affiniteten af tHan interaktion. Dette opnås ved at lave et par ændringer og tilføjelser til protokollen skitseret i afsnit 4. For en fremragende vejledning til udformning og tolkning af bindingsanalyser, se Pollard 10 . Et flowdiagram ( figur 2 ) er tilvejebragt til hjælp til analyse og kvantificering.
- Bestem koncentrationsområdet for at teste.
BEMÆRK: Koncentrationsområdet afhænger af proteinet og skal spænde fra en koncentration under den tilsyneladende K d ( fx 1 μM) til koncentrationer, der er tilstrækkelige til at mætte bindingen. Det er kritisk, at bindingen når mætning i flere prøver ved den høje ende af koncentrationsområdet for at danne en nøjagtig bindings kurve ( figur 1C ). Som nævnt ovenfor har mange actinbindende proteiner en affinitet for F-actin i det lave mikromolære område (1-5 μM). For et protein med en Kd på 0,5-1 μM ville et nyttigt udgangskoncentrationsområde være 0,1-10 μM. - Hard spin (trin 2.3) proteinet af interesse for at fjerne aggregater. Fortynd proteinet serielt for at lave en koncentrationsserie indeholdende 7-8 prøver ved 2x den endelige koncentration, der skal testes. Hvis for eksempel testområdet er 0,1-8 μM, fremstilles følgende fortyndinger i 1x reaktionsbuffer: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 og 0,2 μM.
BEMÆRK: Hvis det tilsatte protein udgør mere end 10% -20% af den første fortynding (16 μM prøven i eksemplet ovenfor) som nævnt i trin 4.2, kan det være nødvendigt at enten koncentrere proteinet yderligere eller dialysere Protein i 1x reaktionsbuffer. Sørg for at forberede nok af hver fortynding til "plus F-actin" og "nej F-actin" prøver. - Klargør prøver (som i afsnit 4) ved at fortynde proteinet af interesse for de ønskede koncentrationer i 1x reaktionsbuffer i ultracentrifugerør. Hold prøvevolumenet lavt (40-60 μL) for at undgå at bruge store mængder protein ved hjælp af ultracentRifuge rør med små minimum volumener ( fx 7 x 20 mm rør, der holder 0,2 ml hver).
- Tilsæt F-actin til den ønskede endelige koncentration til de relevante prøver og opsaml volumenet ved anvendelse af 1x reaktionsbuffer. For eksempel skal 50 μl reaktioner ved anvendelse af 2 μM F-aktin sikre, at hver prøve har 25 μl 2x protein, 10 μl 10 μM F-actin og 15 μl 1x reaktionsbuffer. Inkluder kontrolprøver (trin 4.4.2 og 4.4.3).
BEMÆRK: Ved negative og positive kontroller skal der anvendes en koncentration inden for det område, der skal testes (trin 5.1), ideelt tæt på midten til den høje ende af området ( fx 4 μM hvis koncentrationsområdet er 0,1-10 μM).
- Tilsæt F-actin til den ønskede endelige koncentration til de relevante prøver og opsaml volumenet ved anvendelse af 1x reaktionsbuffer. For eksempel skal 50 μl reaktioner ved anvendelse af 2 μM F-aktin sikre, at hver prøve har 25 μl 2x protein, 10 μl 10 μM F-actin og 15 μl 1x reaktionsbuffer. Inkluder kontrolprøver (trin 4.4.2 og 4.4.3).
- Inkubér alle prøver i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 30 minutter fjernes 1/5 af hver prøve ( fx 10 μl af 50 μl reaktionen) og blandes med 20 μl vand og 10 μl 4x prøvebuffer.
BEMÆRK: Dette er "Total" sAmple og vil blive brugt til at generere en standardkurve. - Indlæs prøverne i ultracentrifugrotoren. Centrifuge i 20 minutter ved 100.000 xg og 4 ° C.
- Eventuelt fjernes 3/4 af supernatanten ( f.eks. 30 μl, hvis centrifugeret volumen var 40 μL) fra hvert rør efter centrifugering og blandes med 4x prøvebuffer (10 μl i dette tilfælde) i et separat mikrofugerør. Fjern den resterende supernatant med en gelindlæsningstip, pas på at ikke forstyrre pelleten.
BEMÆRK: Ved måling af bindingsaffiniteten er det ikke nødvendigt at køre supernatanten. Ikke desto mindre kan det være nyttigt at gemme supernatanten, især når der testes et nyt protein. - Fjern supernatanten, hvis ikke analyseres (trin 5.7).
- Resuspender pelleten i 1 volumen 1x prøvebuffer ( fx 40 μl hvis det centrifugerede volumen var 40 μl).
- Tilsæt prøvebuffer til alle rør og inkuber i mindst 5 minutter ved stuetemperatur.
- trRør prøven 8-10 gange med en p200 pipettespids, der kontinuerligt vasker rørets pelletareal. Skub forsigtigt pipettespidsen over pelleten under triturationen for at hjælpe med resuspension.
- Overfør det resuspenderede protein til et mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Dette er "Pellet" -prøverne. - Analyser total- og pelletprøverne ved hjælp af SDS-SIDE 8 . Kør alle prøver på en gel, hvis det er muligt; Hvis ikke, kør pelletprøverne på en gel og de samlede prøver i et sekund.
BEMÆRK: I betragtning af antallet af prøver anbefales et stort gelsystem til analyse. Hvis der køres prøver på to eller flere geler, er det vigtigt, at alle geler farves identisk ( dvs. den samme Coomassie-opløsning og en identisk tid i plet / destain). - Image Coomassie-farvede geler ved hjælp af et billeddannelsessystem, der måler proteinbåndets intensiteter over et bredt ( dvs. et to-tre-log) og lineært interval. Sørg for at billederne aGenopsamles uden mættede pixels.
BEMÆRK: Laserbaserede billeddannelsessystemer giver de bedste følsomhed og signal-til-støjforhold. - Ved hjælp af ImageJ eller et lignende analyseprogram måles proteinbåndintensiteter og beregnes mængden af bundet protein.
BEMÆRK: Brug alle markeringsmålinger ved at bruge markeringsværktøjet i ImageJ til at tegne et område af interesse (ROI) omkring hvert bånd og måle (Analyse> Mål) området og den gennemsnitlige gråværdi. Beregn baggrunden for hver gel ved at måle den gennemsnitlige grå værdi fra et område uden prøve. Træk baggrundsværdien for gråværdien fra hver ROI-gennemsnitlig grå værdi og multiplicer derefter med området for at opnå den integrerede densitetsværdi for hvert bånd.- Mål proteinet af interessebåndsintensiteter fra de samlede prøver ( figur 2A ).
- Generer en standardkurve ved at plotte båndintensiteten ( dvs. de integrerede densitetsmålinger) i forhold til proteinmassen ( Figur2B).
- Mål mængden af protein af interesse, der co-sedimenteres med F-actin (co-sedimenteret protein, Figur 2C ).
- Mål mængden af protein af interesse, der sedimenteres i fravær af F-actin (baggrundssedimentering, Figur 2D ).
- Subtrahere baggrundssedimenteringen fra det co-sedimenterede protein ( dvs. trække værdierne fra trin 5.13.4 fra trin 5.13.3) for at bestemme mængden af protein, der binder til F-actin.
- Mål mængden af F-actin i hver pellet ( Figur 2E ). Bestem den gennemsnitlige mængde F-actin pr. Prøve og divider derefter hver prøve med gennemsnittet for at bestemme forholdet mellem F-actin i hver prøve i forhold til gennemsnittet ( dvs. tallene under båndene).
- For hver prøve opdele mængden af bundet protein (beregnet i trin 5.13.5) ved hjælp af F-actin-aktin-pelletforholdet (trin 5.13.6) for at justere for forskelle i pelleten.
NOTE: Denne værdi er det normaliserede bundne protein. - Brug standardkurven (trin 5.13.2) til at beregne mængden af normaliseret bundet protein (trin 5.13.7) i hver prøve.
BEMÆRK: Proteinet fjernet oprindeligt ("Total" -prøven), såvel som den lastede mængde (som medmindre hele pelleten blev lastet, vil være en del fra pellet), skal tages i betragtning ved beregning af den totale mængde protein Der pelleterede. - Bestem koncentrationen af bundet protein i hver prøve fra den samlede masse af protein i pellet (beregnet i trin 5.13.8) og prøveens volumen. Subtrahere denne værdi fra startkoncentrationen for at bestemme mængden af frit protein. Opdel koncentrationen af bundet protein ved koncentrationen af actin (μM / μM actin) og plot versus koncentrationen af frit protein for at danne en bindingskurve ( figur 1C ).
BEMÆRK: Da F-actin ikke er en enkelt ensartet art, er det vanskeligKult for at ekstrapolere den molære koncentration af F-actin fra G-actinkoncentrationen. Brug start G-actinkoncentrationen til at bestemme mængden af bundet protein (μM / μM actin) og estimere den tilsyneladende koncentration af bindingssteder i reaktionen. Koncentrationen af bindingssteder er sædvanligvis mindre end koncentrationen af actinmonomerer i reaktionen, fordi ikke alle actinpolymeriserer, og fordi et enkeltaktinbindende proteinmolekyle kan bringe i kontakt med flere monomerer på actinfilamentet.
- Ved hjælp af et statistisk program bestemme affiniteten (Kd) og Bmax fra bindekurven ved at anvende ikke-lineær mindst kvadratisk regression.
BEMÆRK: Scatchard-plot er modløs til at analysere bindingsdata, dels fordi de kan skjule, om bindingen er mættet, og fordi de kan fordreje eksperimentelle fejl 10 .
Representative Results
Vi undersøgte aE-catenin-homodimerbinding til F-actin i co-sedimentationsassayet. Siden tidligere eksperimenter har vist, at α-catenin homodimers affinitet for F-actin er omkring 1 μM og B max nær 1 11 , gennemførte vi analysen med en lav koncentration af F-actin (0,2 μM i stedet for 2 μM; Diskussionen). Da 0,2 μM er under den kritiske koncentration blev phalloidin tilsat for at stabilisere F-actin polymeriseret fra kaninskeletmuskel G-actin (trin 3.3). Stigende koncentrationer af aE-catenin-homodimer (0,125-12,0 μM) blev inkuberet i nærvær eller fravær af 0,2 μM F-actin. Prøverne blev centrifugeret, og de resulterende pellets blev analyseret ( figur 1A ). Som forventet sammenligner aE-catenin-homodimeren co-sedimenteret med F-actin over baggrunden ( Figur 1A , F-aktinpelletprøverne til no-F-acTin pellet prøver). BSA blev kørt som en negativ kontrol ( Figur 1B ). Bundet protein blev kvantificeret og plottet over frit protein for at beregne affiniteten af interaktionen ( figur 1C ). De plottede data passer bedst til en Hill-ligning. Den beregnede Kd var 2,9 μM, B max var 0,2, og Hill-koefficienten (h) var 4,8. Således binder aE-catenin-homodimer F-actin kooperativt med en lav mikromolær affinitet, der er i overensstemmelse med tidligere arbejde (en Kd på 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 .
Figur 1: High-speed F-actin co-sedimentation assay. ( A ) Øgede koncentrationer (0,125-12,0 μM) aE-catenin-homodimer blev inkuberet med (venstre panel) eller uden (højre paneler) 0,2 μM F-actin stabiliseret med phalloidin. De blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeret. Totalværdien (7,5% af udgangsmaterialet) og pelleteret materiale (50% af det pelleterede materiale) blev adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie-farvestof. ( B ) 4 μM BSA blev kørt som en negativ kontrol. Samlede og pelletprøver med (+) eller uden (-) F-actin blev adskilt ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie-farvestof. ( C ) Bundet αE-catenin (μM / μM actin) fra A blev plottet mod fri αE-catenin (μM), og dataene passer til en Hill-ligning (rød linje). Kd, Bmax og Hill-koefficienten (h) er angivet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Actin-pelleteringskvantificering - flow diagram. Denne skitse beskriver hovedtrin i afsnit 5 med eksempler på total- og pelletprøver ( A , CE ) og standardkurven ( B ) anvendt til kvantificering. 5.13 trin: 1 ) Mål mængden af protein af interesse i de samlede prøver (A). 2 ) Generer en standardkurve ved at tegne båndintensiteten versus proteinmassen (B). 3 ) Mål mængden af protein af interesse, der co-sedimenteres med F-actin ( C ). 4 ) Mål mængden af protein af interesse, der pelleteres i fravær af F-actin ( D ). 5 ) Subtraher D fra C for at bestemme mængden af protein bundet til F-actin. 6 ) Mål mængden af F-actin i hver pellet (E), bereg den gennemsnitlige mængde F-actin pr. Prøve, og divider hver prøve med gennemsnittet (tallene nedenfor viser forholdet). 7 )For hver prøve opdele mængden af bundet protein (beregnet i trin 5) ved F-aktin-pelletforholdet (beregnet i trin 6) for at justere for forskelle i pelleten. 8 ) Brug standardkurven ( B ) til at beregne mængden af normaliseret bundet protein i hver prøve (trin 7). 9 ) Bestem koncentrationen af frit protein og bundet protein for at skabe en bindende kurve. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Actin-co-sedimentationsassayet er en simpel teknik, der hurtigt kan bestemme, om et protein binder F-actin. Med nogle ændringer kan teknikken også bruges til at måle interaktionens affinitet. Ud over de punkter, der er rejst i protokollen ovenfor, bør følgende spørgsmål overvejes ved udformning, gennemførelse og tolkning af analysen.
Protein af interesse
Frisklavet eller frosset protein kan anvendes i analysen. Hvis der anvendes frosset protein, anbefales det stærkt, at resultaterne sammenlignes med frisk (aldrig frosset) protein for at sikre, at frysning ikke påvirker F-actinbindingen.
G-actin Kilde
Mange pelleteringsforsøg bruger G-actin isoleret fra muskel på grund af dets relative overflod. Der er tre hovedaktinisotyper hos pattedyr - alpha, beta og gamma - der er bemærkelsesværdigt ens (> 90% sekvensidentifikatorty). Ikke desto mindre er der funktionelle forskelle mellem isotyperne 12 , 13 . Hvis det er muligt, bør G-actin-isotypen anvendt i bindingsassayet matche in vivo- isotypen. For eksempel, hvis man tester et protein udtrykt i skeletmuskulatur, er alpha-actin det bedste valg; Hvis man undersøger et protein udtrykt i fibroblaster, anbefales beta-actin.
Phalloidin anvendelse
Da phalloidin binder F-actin, kan det forstyrre eller endog blokere bindingen af nogle F-actinbindende proteiner (fxoidoidin blokker cofilin fra binding til actinfilamenter) 14 . Phalloidin bør således anvendes med forsigtighed, og resultaterne sammenlignes med ikke-phalloidin-behandlede prøver, når det er muligt.
Høj baggrund
Det er ikke ualmindeligt for proteiner at sedimentere i fravær af F-actin ( Figur 1A , ingen F-aktin pellet prøves). Imidlertid kan høje niveauer af baggrundssedimentering maskere ægte aktinsam-sedimentering og gøre det vanskeligt, om ikke umuligt at bestemme, om et protein binder F-actin eller for at måle interaktionens affinitet. Tilsætning af polidicanol til reaktionsbufferen (trin 4.1) kan reducere baggrunden væsentligt og er en nem løsning. Hvis det ikke reducerer baggrunden, kan justering af reaktionsbufferen, saltkoncentrationen og / eller inkubationstemperaturen hjælpe.
Bindende kurve
For at generere en bindende kurve er det nødvendigt at variere koncentrationen af enten proteinet af interesse eller F-actin over en række reaktioner. I praksis er det lettere og foretrukket at opretholde F-actin ved en fast koncentration og for at variere koncentrationen af proteinet af interesse. Vedligeholdelse af F-actin ved en fast koncentration ( fx 2 μM) i pelleteringsassayet begrænser ikke-specifik fangst ved højere koncentrationer af F-actin og forhindrerDepolymerisering ved lavere (<0,5 μM) koncentrationer af F-actin. Depolymerisering kan forhindres under anvendelse af phalloidin, selv om dette introducerer en potentiel komplicerende faktor i systemet (se trin 3.3 og derover). Vedligeholdelse af F-actin ved en fast koncentration gør det også muligt at sammenligne (og normalisere) F-actin-pelleten på tværs af prøver og for at identificere mislykkede forsøg ( dvs. hvor F-actin-pellet er stærkt variabel, hvilket forhindrer analyse på tværs af koncentrationer). Endelig tillader vedligeholdelse af F-actin ved en fast koncentration at bestemme, om bindingen til actinfilamentet er kooperativ ( figur 1C ).
Mættet binding
Som i alle bindende eksperimenter er det kritisk, at bindingen til F-actin er mættet, og at koncentrationen af protein plus F-actinplader ( Figur 1C ). Uden et plateau er det ikke muligt at beregne en nøjagtig dissociation-ligevægtskonstant. Således detDet er vigtigt at omhyggeligt planlægge fortyndingsserien, som skal testes, og altid medtage højere koncentrationer af protein ( dvs. mindst 5-10 gange højere end den forventede K d ).
Bindingsanalyse
For at de målte dissociationskonstanter skal være afgørende skal analysen udføres ved anvendelse af en F-actinkoncentration, der tillader koncentrationen af bindingssteder på F-actin for proteinet af interesse at være meget lavere end affiniteten. For at kontrollere om dette kriterium var opfyldt, estimerer koncentrationen af bindingssteder fra B max . For eksempel, hvis [F-actin] var 2 μM og Bmax = 0,5, så [bindingssteder] ≈ 1 μM. K d bør være mindst 5- til 10 gange større end [bindingssteder]. Hvis den målte Kd er af samme størrelsesorden som [bindingssteder], er det muligt, at den observerede bindings kurve repræsenterer en titrering af højaffinitetsbindende siTes snarere end en sand bindende isotherm. Hvis dette observeres, gentag analysen ved hjælp af en 10 gange lavere F-actinkoncentration for at måle en nøjagtig affinitet. Til højaffinitetsinteraktioner kan phalloidin-stabilisering (trin 3.3) være nødvendig for at opnå en F-actinkoncentration, der er lav nok til nøjagtigt at måle affinitet.
Endelig er der grundlæggende begrænsninger med co-sedimentationsassayet, som forskere bør være opmærksomme på, når de udfører og evaluerer analysen. Vigtigst af alt producerer co-sedimentationsassayet ikke en sand ligevægtskonstant. Produkterne af binding ( dvs. protein plus F-actin) adskilles fra reaktanterne under centrifugering, hvorefter produkterne derefter kan dissociere for at skabe en ny ligevægt. Som et resultat kan co-sedimentationsassayet fejlberegne eller undlade at detektere lavaffinitetsinteraktioner. Da mange actinbindende proteiner har en lav ( dvs. mikromolær) affinitet for F-actin, er et negativt resultat (
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant HL127711 til AVK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 | |
| S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 | |
| Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL | ThermoFisher Scientific | 45233 | |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 | |
| Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 | |
| Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 | |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
References
- Pollard, T. D. Actin and Actin-Binding Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).
- Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins. Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).
- Lappalainen, P. Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks. Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).
- Mullins, R. D., Hansen, S. D. In vitro studies of actin filament and network dynamics. Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).
- Miller, P. W., et al. Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin. J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).
- Wickline, E. D., et al. alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments. J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).
- Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Hansen, S. D., et al. alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).
- Perrin, B. J., Ervasti, J. M. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).
- Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).
- Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments. J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays. Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).
