Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling av proteinbinding til F-aktin ved co-sedimentering

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55613
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å teste evnen til et protein til å sedimentere med filamentøs aktin (F-aktin) og, hvis bindingen observeres, for å måle affiniteten til interaksjonen.

Abstract

Filamentøs actin (F-aktin) organisering i celler reguleres av et stort antall aktinbindende proteiner som styrer actin-nukleering, vekst, kryssbinding og / eller demontering. Denne protokollen beskriver en teknikk - aktinsam-sedimentering, eller pelletering, analyse - for å bestemme om et protein- eller protein-domene binder F-aktin og for å måle affiniteten til interaksjonen ( dvs. dissosiasjon likevektskonstanten). I denne teknikken blir et protein av interesse først inkubert med F-aktin i oppløsning. Derefter brukes differensiell sentrifugering til sedimentering av actinfilamenter, og det pelleterte materiale analyseres ved SDS-PAGE. Hvis protein av interesse binder F-aktin, vil det sam-sedimentere med actinfilamenter. Produktene av bindingsreaksjonen ( dvs. F-aktin og protein av interesse) kan kvantifiseres for å bestemme samspillets affinitet. Aktinpelleteringsanalysen er en enkel teknikk for å bestemmeHvis et protein av interesse binder F-aktin og for å vurdere hvordan endringer i det proteinet, slik som ligandbinding, påvirker dets interaksjon med F-aktin.

Introduction

Actin er et essensielt cytoskeletalt protein som spiller en kritisk rolle i flere cellulære prosesser, inkludert motilitet, sammentrekning, adhesjon og morfologi 1 . Actin finnes i to former: monomer globulær actin (G-aktin) og polymerisert filamentøs actin (F-aktin). Innenfor celler styres F-aktin organisasjonen av en stor samling proteiner som regulerer kjernefølge, vekst, tverrbinding og demontering av aktinfilamenter 2 , 3 , 4 . Men hvordan flere aktinbindende proteiner fungerer sammen for å regulere actin-nettverksorganisasjonen er fortsatt stort sett uklart.

Måling av protein-protein-interaksjoner er en viktig tilnærming for å forstå hvordan proteiner påvirker cellens adferd på det biokjemiske nivået. Mange forskjellige analyser kan brukes til å oppdage interaksjoner mellom rensede proteiner.Vanlige tilnærminger for løselige proteiner inkluderer nedtrekk, fluorescenspolarisasjon, isotermisk titreringskalorimetri og overflateplasmonresonans. Viktig er at alle disse analysene krever at proteiner er oppløselige, og er således vanskelige å tilpasse for bruk med et polymert, filamentøst protein, slik som F-aktin. Her beskriver vi en teknikk - aktinsam-sedimentering, eller pelletering, analyse - for å avgjøre om et protein- eller protein-domene binder F-aktin og for å måle samspillets affinitet.

Actin pelleteringsanalysen er en relativt enkel teknikk som ikke krever spesialisert utstyr, bortsett fra en ultracentrifuge. Alle reagenser kan gjøres, forutsatt kunnskap om grunnleggende biokjemi, eller kjøpt. Når bindingen til F-actin er etablert, kan analysen brukes til å måle den tilsynelatende affinitet ( dvs. dissosiasjon likevektskonstanten) 5 . Også, når en affinitet er etablert, blir pelleteringsanalysenEr et nyttig verktøy for å måle hvordan endringer i protein av interesse ( dvs. posttranslasjonelle modifikasjoner, mutasjoner eller ligandbinding) påvirker dets interaksjon med F-aktin 6 . Teknikken har begrensninger (se diskusjonen ) som forskeren bør være oppmerksom på før forsøk på analysen.

Protocol

1. Forbered materialene

  1. Rens proteinet av interesse (se avsnitt 2).
  2. Forbered eller kjøp G-actin.
    MERK: G-aktin kan isoleres fra flere kilder 1 ; Alternativt kan den kjøpes. Rekonstituert G-aktin (i 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP (adenosintrifosfat) og 0,5 mM ditiotreitol (DTT)) skal bli frosset, lagret ved -80 ° C og> 10 mg / ml I små (10-20 μl) alikvoter, og opptining rett før bruk. G-aktin-alikvoter bør ikke refrozen.
  3. Forbered eller kjøp et kontrollprotein, for eksempel BSA (se trinn 4.4).
  4. Tilbered 10x polymeriseringsbuffer (200 mM imidazol pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP og 10 mM EGTA (etylenglykol-bis (P-aminoetyleter) -N, N, N ', N'- Tetraeddiksyre)). Lag en 10x lager og juster pH etter tillegg av ATP, om nødvendig. Aliquot (25 μL er et nyttig volum) og lagre ved -80 & #176; C.
  5. Forbered 10x reaksjonsbuffer (200 mM imidazol pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP og 10 mM EGTA). Lag en 10x lager og juster pH etter tillegg av ATP, om nødvendig. Aliquot (50-100 μL er et nyttig volum) og lagres ved -80 ° C.
    MERK: Sammensetningen av reaksjonsbufferen er fleksibel og må kanskje justeres for å redusere bakgrunns sedimentering, begrense ikke-spesifikk binding og / eller forbedre binding (trinn 1.5.1-1.5.3).
    1. Juster pH i reaksjonsbufferen mellom 6 og 8 for å optimalisere proteinstabiliteten. Ved lavere eller høyere pH, erstatt en passende buffer for imidazol.
      MERK: Bruk pH 7,0 som utgangspunkt, med mindre et protein krever en lavere eller høyere pH for stabilitet. Ikke bruk en buffer med en pH under 6,0 eller høyere enn 8,0, da dette kan forstyrre actin. Anbefalte buffere (sluttkonsentrasjon og optimal pH listet) inkluderer: 20 mM MOPS (3- ( N- morfolin) propansulfonsyre), pH= 6,5; 20 mM imidazol, pH = 7,0; 10 mM HEPES (4- (2-hydroksyetyl) piperazin-1-etansulfonsyre), pH = 7,5; Og 20 mM Tris, pH = 8,0.
    2. Varier saltkoncentrasjonen av reaksjonsbufferen, avhengig av behovene til analysen.
      MERK: Actin er et surt protein, og nesten alle actinbindende proteiner stammer til en viss grad på elektrostatiske interaksjoner for å knytte seg til aktin. Derfor øker saltkonsentrasjonen aktinbindingen i de fleste tilfeller. Reaksjonsbufferen bruker et fysiologisk saltnivå (150 mM NaCl, arbeidskonsentrasjon), og dette er det anbefalte utgangspunktet. Om nødvendig kan saltkonsentrasjonen senkes ( f.eks. Til 100 mM) for å fremme binding eller økning for å begrense bindingen.
    3. Ikke endre konsentrasjonene av MgCl2, ATP eller EGTA i reaksjonsbufferen med mindre det er en spesifikk grunn til å gjøre det.

2. Forbered testproteinet for analysen

  1. FORBEREDELSEREa høy renhetsprotein ved bruk av væskekromatografi for de beste resultatene 7 .
    MERK: Hvis du bruker rekombinant protein, bør store proteinkoder, for eksempel glutation-S-transferase (GST), fjernes ved protease spalting fra målproteinet, da de kan forstyrre bindingen. GST forårsaker også homodimerisering av fusjonsproteiner, som kunstig kan øke aktinbindingsaffiniteten.
  2. Bestem proteinkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 280 nm. Del med utryddelseskoeffisienten; Utryddelseskoeffisienten kan beregnes ut fra proteinsekvensen ved hjelp av sekvensanalyse eller elektroniske verktøy. Alternativt bestemmer du proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford eller BCA (bicinchoninsyre) metoder.
    MERK: For første forsøk er vanligvis 50-100 μl protein ved 20-40 μM vanligvis tilstrekkelig. Dette vil tillate analyse av binding i det lave mikromolære området, et nyttig utgangspunkt for de fleste aktinbindende proteiner. En større quanTity, og ofte er det nødvendig med en høyere konsentrasjon av protein for å generere en bindende kurve for å beregne affiniteten (se avsnitt 5).
  3. Like før bruk, roter proteinet hardt (50 000-100 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C) for å fjerne aggregatene av uoppløselig protein. Hvis løseligheten er en bekymring, måler du proteinkonsentrasjonen (trinn 2.2) etter sentrifugering.

3. Forbered F-actin

  1. Fjern en alikvot av G-aktin fra -80 ° C fryseren og tine den raskt.
  2. Tilsett 10x polymeriseringsbufferen til G-actin til en endelig konsentrasjon på 1x. Sørg for at G-aktinkonsentrasjonen i 1x polymeriseringsbuffer er minst 10-20 μM, godt over den kritiske konsentrasjonen. Inkubér i 1 time ved romtemperatur (RT) for å tillate aktin å polymerisere.
  3. Etter polymerisering, lagre F-aktin i oppløsning ved 4 ° C, der det vil være stabilt i noen uker. Før du bruker F-actin igjen etter lagring, forsiktig forsiktigEller flett røret flere ganger for å sikre at all actin er oppløst og jevnt fordelt i oppløsning.
    MERK: (Valgfritt) Tilsett phalloidin for å oppnå et molforhold på 1: 1 av G-aktin: phalloidin. Inkubér i 30 minutter ved RT for å la phalloidin binde seg til F-actin. Phalloidin stabiliserer F-aktin og oppnår to ting: (i) det reduserer mengden aktin som ikke sedimenteres under sentrifugering og (ii) det tillater at F-aktin fortynnes under den kritiske konsentrasjonen (~ 0,5 μM), som ofte Nødvendig hvis man varierer mengden F-aktin for å generere en bindende kurve (se avsnitt 5 om måling av affiniteten).

4. Pelleteringsanalyse - Grunnprotokoll

MERK: Basisprotokollen beskrevet i avsnitt 4 brukes til å bestemme om et protein av interesse med sedimenter med F-aktin. Når bindingen til F-actin er etablert, kan affiniteten til denne interaksjonen bli målt etter protokollen beskrevet i avsnitt 5.

  1. Klargjør reaksjonsbufferen dagen for bruk ved å fortynne 10x lager til 1x og tilsett DTT til en sluttkonsentrasjon på 1 mM.
    MERK: (Valgfritt) Tilsett polidokanol til en endelig arbeidskonsentrasjon på 0,02% i reaksjonsbufferen. Polidokanol er et overflateaktivt middel som reduserer ikke-spesifikk bakgrunnsbinding og bidrar til å forhindre hydrofobe proteiner i å stikke til ultracentrifugerøret.
  2. Fortynn proteinet av interesse for ønskede konsentrasjoner i 1x reaksjonsbuffer i ultracentrifugerør. Hold prøvevolumene lave (40-60 μL) for å unngå å bruke store mengder protein ved hjelp av ultracentrifugerør med små minimumsvolum ( f.eks . 7 x 20 mm rør som holder 0,2 ml hver).
    MERK: Siden mange aktinbindende proteiner har en affinitet for F-aktin i mikromolarområdet, anbefales det å teste et protein av interesse ved 2 og 10 μM. Hvis binding ikke observeres ved 10 μM, er det usannsynlig at binding vil bli observert ved høyere konsentrasjoner. HvisTilsatt protein utgjør mer enn 10-20% av det endelige reaksjonsvolumet, kan det være nødvendig å dialysere proteinet i reaksjonsbufferen før utførelse av eksperimentet.
  3. Tilsett F-aktin til ønsket sluttkonsentrasjon.
    MERK: 2 μM er en nyttig konsentrasjon for innledende eksperimenter fordi den ligger godt over den kritiske konsentrasjonen, og opprettholder således actin i trådformet tilstand. Det vil produsere en synlig pellet når den analyseres ved SDS-PAGE (trinn 4.10).
  4. Klargjør følgende kontroller i ultracentrifugerør for å gjøre analysen informativ.
    1. Forbered prøve (r) som inneholder proteinet av interesse uten F-aktin. Sørg for at konsentrasjonen av protein i disse prøvene stemmer overens med konsentrasjonen i "plus F-actin" -prøver.
      MERK: Disse prøvene bestemmer mengden protein som aggregeres eller sitter fast på sidene av ultracentrifugerøret i fravær av F-aktin.
    2. Forbered negative kontrollprøverVed den samme eller lignende konsentrasjon (er) som brukes for proteinet av interesse. Bruk et kontrollprotein som ikke binder til F-aktin, med og uten F-aktin.
      MERK: Dette er en viktig kontroll fordi proteiner kan bli "fanget" i aktinfilamenter og pellet med F-aktin, selv om de ikke binder F-aktin. Mengden fangst kan variere avhengig av F-aktin-kilden, bufferbetingelser, etc. Således bør denne kontrollen inkluderes i alle eksperimenter. Ideelt sett bør kontrollproteinet ha en molekylvekt som ligner protein av interesse ( f.eks . For aE-katenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) er en passende kontroll). Kommersielt tilgjengelige gelfiltreringsstandarder gir gode kontrollproteiner, siden de dekker en rekke størrelser og har en tendens til ikke å inneholde aggregater.
    3. Eventuelt, lag positive kontrollprøver som inneholder et protein som binder til F-aktin, med og uten F-aktin. Sørg for at konsentrasjonen (e) er lik den som er iE protein av interesse.
      MERK: Denne kontrollen er nyttig ved at den demonstrerer at eksperimentelle forhold ( f . Eks. Forberedt F-aktin, reaksjonsbuffer og sentrifugering) tillater F-aktin binding. Siden pelleteringsanalysen ikke kan oppdage svake F-aktin-interaksjoner (se diskusjonen), anbefales det at det kjente F-aktinbindende protein har en moderat til svak affinitet for F-aktin ( dvs. i det lave mikromolarområdet ). Rensede F-aktinbindende proteiner er kommersielt tilgjengelige.
  5. Inkuber alle prøver i 30 minutter ved RT.
    MERK: Lengre inkubasjonstider er fine, forutsatt at proteinet av interesse er stabilt, men trolig unødvendig. Hvis proteinet av interesse ikke er stabilt ved RT, kan prøver inkuberes ved 4 ° C. I dette tilfellet kan lengre inkubasjonstider være nødvendig.
  6. Legg prøvene i sentrifugeringsrotoren. Plasser rørene i rotoren for å hjelpe til med resuspensjon av pellet etter sentrifugering.Merk dette for alle sentrifugerørene ( f.eks. Med et prøvenummer) og plasser alle rørene i rotoren i samme posisjon ( f.eks . Tallet vendt ut).
  7. Sentrifuger ved 100 000 xg i 20 minutter ved 4 ° C i en ultracentrifuge.
  8. Etter sentrifugering, fjern 3/4 av supernatanten ( f.eks . 45 μl hvis startvolumet var 60 μl) fra hvert rør og bland med 1/3 volum av 4x prøvebuffer (15 μl i dette tilfellet) i et separat mikrocentrifugerør.
    1. Fjern gjenstående supernatant med gelopplastingstip, pass på at du ikke forstyrrer pellet (som kan være synlig som et glassaktig flekk).
      MERK: Det er viktig å fjerne supernatanten fra rørene så snart som mulig etter ferdigstillelse av sentrifugen, for å begrense proteindissociasjon etter separasjon. Ikke vask pelleten med reaksjonsbuffer av samme grunn.
  9. Tilsett 4/3 volum av 1x prøvebuffer til hver pelleT ( f.eks . 80 μl hvis startvolumet var 60 μl).
    MERK: Dette gjør fortynningen den samme som for supernatanten (trinn 4,8, 1/3 volum av 4x prøvebuffer ble tilsatt), hvilket muliggjør direkte sammenligning mellom pellet og supernatantprøver og bestemmelse av prosentandelen protein som ble pelletert.
    1. Tilsett prøvebuffer til alle rør og inkuber i minst 5 min ved RT. La pellet settes i prøvebufferen for å forbedre prøveutvinningen.
    2. Triturate prøven 8-10 ganger med en p200 pipettespiss for å resuspendere pelleten ved kontinuerlig å vaske pelletområdet av røret. Skrap forsiktig pipettespissen over pelleten under tritureringen for å hjelpe til med resuspensjon.
      MERK: Pass på å unngå å innføre luft i prøven under tritureringen, da dette vil føre til at prøvebufferen bobler og vil redusere prøveutvinningen.
    3. Overfør resuspenderte prøver til mikrofugerør etter triturering.
      4. </ Ol>
    4. Analyser supernatanten og pelletprøvene ved SDS-PAGE og Coomassie-farging 8 ved å legge 10-15 ul prøve per bane; Dette er tilstrekkelig til å visualisere proteinene.
      MERK: Proteiner som samesett med F-aktin vil bli beriket i "pluss F-aktin" pelletsprøver over "nei F-aktin" pelletprøver ( Figur 1A ). Standard Coomassie blå farging er tilstrekkelig til deteksjon hvis proteinkonsentrasjonene er i 0,1-10 μM rekkevidde. Kolloidal Coomassie 9 eller Western blotting kan brukes til å øke sensitiviteten hvis lavere proteinkonsentrasjoner brukes til å måle interaksjoner med høyere affinitet.
    5. Image Coomassie-farget geler ved hjelp av et skanner- eller bildebehandlingssystem (trinn 5.12).

    5. Pelleteringsanalyse - kvantifisering

    Merk: Hvis spesifikk binding til F-aktin er observert, kan det være nyttig å måle affiniteten til tHan interaksjon. Dette oppnås ved å gjøre noen få endringer og tillegg til protokollen som er skissert i avsnitt 4. For en utmerket guide til å designe og tolke bindingsanalyser, se Pollard 10 . Et flytskjema ( figur 2 ) er gitt for hjelp med analyse og kvantifisering.

    1. Bestem konsentrasjonsområdet for å teste.
      MERK: Konsentrasjonsområdet vil avhenge av proteinet og skal spenne fra en konsentrasjon under den tilsynelatende K d ( f.eks. 1 μM) til konsentrasjoner høyt nok til å mette bindingen. Det er kritisk at bindingen når metning i flere prøver ved den høye enden av konsentrasjonsområdet for å generere en nøyaktig bindingskurve ( figur 1C ). Som nevnt ovenfor har mange aktinbindende proteiner en affinitet for F-aktin i det lave mikromolære området (1-5 μM). For et protein med en Kd på 0,5-1 uM, ville et anvendelig utgangskonsentrasjonsområde være 0,1-10 μM.
    2. Hard spin (trinn 2.3) proteinet av interesse for å fjerne aggregater. Fortynn proteinet i serie for å lage en konsentrasjonsserie som inneholder 7-8 prøver ved 2x den endelige konsentrasjonen som skal testes. Hvis for eksempel testområdet er 0,1-8 μM, forbereder du følgende fortynninger i 1x reaksjonsbuffer: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 og 0,2 μM.
      MERK: Hvis det tilsatte proteinet utgjør mer enn 10% -20% av den første fortynningen (16 μM prøven i eksemplet ovenfor), som nevnt i trinn 4.2, kan det være nødvendig å enten konsentrere proteinet ytterligere eller dialysere Protein i 1x reaksjonsbuffer. Pass på å forberede nok av hver fortynning for "pluss F-aktin" og "nei F-aktin" -prøver.
    3. Klargjør prøver (som i avsnitt 4) ved å fortynne proteinet av interesse for ønskede konsentrasjoner i 1x reaksjonsbuffer i ultracentrifugerør. Hold prøvevolumene lave (40-60 μL) for å unngå å bruke store mengder protein ved å bruke ultracentRifuge rør med små minimumsvolumer ( f.eks . 7 x 20 mm rør som holder 0,2 ml hver).
      1. Tilsett F-aktin til den ønskede sluttkonsentrasjonen til de riktige prøvene og ta opp volumet ved hjelp av 1x reaksjonsbuffer. For eksempel sikrer 50 μl reaksjoner ved bruk av 2 μM F-aktin at hver prøve har 25 μl 2 x protein, 10 μl 10 μM F-aktin og 15 μl 1 x reaksjonsbuffer. Inkluder kontrollprøver (trinn 4.4.2 og 4.4.3).
        MERK: For negative og positive kontroller, bruk en konsentrasjon innenfor området som skal testes (trinn 5.1), ideelt nær midten til den høye enden av området ( f.eks. 4 μM hvis konsentrasjonsområdet er 0,1-10 μM).
    4. Inkuber alle prøver i 30 minutter ved RT.
    5. Etter 30 minutter fjern 1/5 av hver prøve ( f.eks. 10 μL av 50 μl reaksjonen) og bland med 20 μl vann og 10 μl 4x prøvebuffer.
      MERK: Dette er "Total" sRikelig og vil bli brukt til å generere en standardkurve.
    6. Last prøvene inn i ultracentrifugrotoren. Sentrifuger i 20 minutter ved 100.000 xg og 4 ° C.
    7. Eventuelt fjerner 3/4 av supernatanten ( f.eks. 30 μl hvis sentrifugert volum var 40 μL) fra hvert rør etter sentrifugering og blandes med 4 x prøvebuffer (10 μl i dette tilfellet) i et separat mikrofukterør. Fjern gjenstående supernatant med gelopplastingstips, pass på at du ikke forstyrrer pelleten.
      MERK: Ved måling av bindingsaffinitet er det ikke nødvendig å kjøre supernatanten. Ikke desto mindre kan det være nyttig å lagre supernatanten, spesielt når du tester et nytt protein.
    8. Fjern supernatanten hvis ikke analyseres (trinn 5.7).
    9. Resuspender pelleten i 1 volum 1x prøvebuffer ( f.eks. 40 μl hvis sentrifugert volum var 40 μL).
      1. Tilsett prøvebuffer til alle rør og inkuber i minst 5 min ved RT.
      2. trRør prøven 8-10 ganger med en p200 pipettespiss, og vasker kontinuerlig pelletområdet på røret. Skrap forsiktig pipettespissen over pelleten under tritureringen for å hjelpe til med resuspensjon.
    10. Overfør resuspendert protein til et mikrocentrifugerør.
      MERK: Dette er "Pellet" -prøver.
    11. Analyser total- og pelletprøver ved hjelp av SDS-SIDE 8 . Kjør alle prøver på en gel hvis det er mulig; Hvis ikke, kjør pelletprøver på en gel og de totale prøvene i et sekund.
      MERK: Gitt antall prøver, anbefales et stort gelsystem for analyse. Hvis du løper prøver på to eller flere geler, er det viktig at alle geler blir fargede identisk ( dvs. den samme Coomassie-løsningen og en identisk tid i flekk / destinasjon).
    12. Image Coomassie-farget geler ved hjelp av et bildesystem som måler proteinbåndintensiteter over et bredt ( dvs. to-tre-logg) og lineært område. Kontroller at bildene aGjenoppsamles uten mettede piksler.
      MERK: Laserbaserte bildesystemer tilbyr de beste følsomhets- og signal-støyforholdene.
    13. Bruk ImageJ eller et lignende analyseprogram, måle proteinbåndintensiteter og beregne mengden bundet protein.
      MERK: Bruk alle utvalgsmålinger ved å bruke markeringsverktøyet i ImageJ for å tegne en region av interesse (ROI) rundt hvert bånd og måle (Analyse> Mål) området og gjennomsnittlig grå verdi. Beregn bakgrunnen for hver gel ved å måle den gjennomsnittlige gråverdien fra et område uten prøve. Trekk bakgrunnsverdien gråttverdi fra hver avkastning, gjennomsnittlig grå verdi, og multipliser deretter med området for å oppnå den integrerte tetthetsverdien for hvert bånd.
      1. Mål proteinet av interessebåndsintensiteter fra Total-prøvene ( Figur 2A ).
      2. Generer en standardkurve ved å plotte båndintensiteten ( dvs. de integrerte tetthetsmålinger) mot proteinmasse ( Figur2B).
      3. Mål mengden protein av interesse som sam-sedimenteres med F-aktin (co-sedimentert protein, Figur 2C ).
      4. Mål mengden protein av interesse som sedimenteres i fravær av F-aktin (bakgrunns sedimentering, Figur 2D ).
      5. Subtrahere bakgrunns sedimenteringen fra det co-sedimenterte proteinet ( dvs. trekke verdiene fra trinn 5.13.4 fra trinn 5.13.3) for å bestemme mengden protein som binder til F-actin.
      6. Mål mengden av F-aktin i hver pellet ( Figur 2E ). Bestem gjennomsnittlig mengde F-aktin per prøve og del deretter hver prøve av gjennomsnittet for å bestemme forholdet mellom F-aktin i hver prøve i forhold til gjennomsnittet ( dvs. tallene under båndene).
      7. For hver prøve deles mengden av bundet protein (beregnet i trinn 5.13.5) ved F-aktin-aktin-pelletforholdet (trinn 5.13.6) for å justere for forskjeller i pelleten.
        NOTE: Denne verdien er det normaliserte bundet protein.
      8. Bruk standardkurven (trinn 5.13.2) for å beregne mengden (massen) av normalisert bundet protein (trinn 5.13.7) i hver prøve.
        MERK: Proteinet fjernet i utgangspunktet ("Total" -prøven), samt mengden som er lastet (som, med mindre hele pelleten ble lastet, vil være en del brøkdel av pelleten), må regnskapsføres ved beregning av total mengde protein Som pelleterte.
      9. Bestem konsentrasjonen av bundet protein i hver prøve fra den totale massen av protein i pelleten (beregnet i trinn 5.13.8) og volumet av prøven. Trekk denne verdien fra startkonsentrasjonen for å bestemme mengden av frie proteiner. Del konsentrasjonen av bundet protein med konsentrasjonen av actin (μM / μM actin) og plot versus konsentrasjonen av fritt protein for å generere en bindende kurve ( figur 1C ).
        MERK: Siden F-aktin ikke er en ensartet art, er det vanskeligKult å ekstrapolere den molare konsentrasjonen av F-aktin fra G-aktinkonsentrasjonen. Bruk start G-aktinkonsentrasjonen for å bestemme mengden av bundet protein (μM / μM actin) og anslå den tilsynelatende konsentrasjonen av bindingssteder i reaksjonen. Konsentrasjonen av bindingssteder er vanligvis mindre enn konsentrasjonen av aktinmonomerer i reaksjonen fordi ikke alt aktinet polymeriserer og fordi et enkeltaktinbindende proteinmolekyl kan bringe i kontakt med flere monomerer på aktinfilamentet.
    14. Ved hjelp av et statistisk program bestemmer du affiniteten (Kd) og Bmax fra bindekurven ved å bruke ikke-lineær minst-kvadratisk regresjon.
      MERK: Scatchard-plottene er motet for å analysere bindingsdata, delvis fordi de kan skjule om bindingen er mettet og fordi de kan forvride eksperimentelle feil 10 .

Representative Results

Vi undersøkte aE-katenin-homodimerbinding til F-aktin i sam-sedimenteringsassayet. Siden tidligere eksperimenter har vist at affiniteten til aE-katenin homodimer for F-aktin er rundt 1 μM og B max nær 1 11 , utførte vi analysen med en lav konsentrasjon av F-aktin (0,2 μM i stedet for 2 μM, se Diskusjonen). Siden 0,2 μM er under den kritiske konsentrasjonen ble phalloidin tilsatt for å stabilisere F-aktin polymerisert fra kaninskjelettmuskel G-aktin (trinn 3.3). Økende konsentrasjoner av aE-katenin homodimer (0,125-12,0 μM) ble inkubert i nærvær eller fravær av 0,2 μM F-aktin. Prøvene ble sentrifugert, og de resulterende pellets ble analysert ( figur 1A ). Som forventet, sammenligner aE-katenin-homodimeren med sedimentert F-aktin over bakgrunnen ( Figur 1A , F-aktin-pelletprøver til nei-F-acTinnpelletsprøver). BSA ble kjørt som en negativ kontroll ( figur 1B ). Bundet protein ble kvantifisert og plottet over fritt protein for å beregne samspillets affinitet ( figur 1C ). De plottede dataene passer best til en Hill-ligning. Den beregnede Kd var 2,9 μM, B max var 0,2, og Hill-koeffisienten (h) var 4,8. Således binder aE-katenin homodimer F-aktin sammen med en lav mikromolar affinitet, i samsvar med tidligere arbeid (en Kd på 2,9 μM versus ~ 1,0 μM) 11 .

Figur 1
Figur 1: F-aktin med høy hastighet med sedimenteringsassay. ( A ) Økende konsentrasjoner (0,125-12,0 μM) aE-katenin homodimer ble inkubert med (venstre panel) eller uten (høyre paneler) 0,2 μM F-aktin stabilisert med phalloidin. De ble inkubert i 30 minutter ved RT og sentrifugert. Totalt (7,5% av utgangsmaterialet) og pelletert materiale (50% av det pelleterte materiale) ble separert med SDS-PAGE og farget med Coomassie-fargestoff. ( B ) 4 μM BSA ble kjørt som en negativ kontroll. Totalt og pelletprøver med (+) eller uten (-) F-aktin ble separert med SDS-PAGE og farget med Coomassie-fargestoff. ( C ) Bundet αE-katenin (μM / μM actin) fra A ble plottet mot fri αE-katenin (μM), og dataene passer til en Hill-ligning (rød linje). Kd, Bmax og Hill-koeffisienten (h) er oppført. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Actin-pelleteringskvantifisering - flytskjema . Dette skjematisk beskriver hovedtrinnene i kapittel 5, med eksempler på totalt og pelletprøver ( A , CE ) og standardkurven ( B ) som brukes til kvantifisering. 5.13 trinn: 1 ) Mål mengden protein av interesse i Totalprøver (A). 2 ) Generer en standardkurve ved å tegne båndintensiteten mot proteinmasse (B). 3 ) Mål mengden protein av interesse som co-sedimentert med F-actin ( C ). 4 ) Mål mengden protein av interesse som pelleterte i fravær av F-actin ( D ). 5 ) Subtrahere D fra C for å bestemme mengden protein bundet til F-aktin. 6 ) Mål mengden av F-aktin i hver pellet (E), beregne gjennomsnittlig mengde F-aktin per prøve, og del hver prøve av gjennomsnittet (tallene under viser forholdet). 7 )For hver prøve deles mengden av bundet protein (beregnet i trinn 5) med F-aktinpelletforholdet (beregnet i trinn 6) for å justere for forskjeller i pelleten. 8 ) Bruk standardkurven ( B ) til å beregne mengden av normalisert bundet protein i hver prøve (trinn 7). 9 ) Bestem konsentrasjonen av fritt protein og bundet protein for å lage en bindende kurve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Actin-co-sedimentasjonsanalysen er en enkel teknikk som raskt kan bestemme om et protein binder F-aktin. Med noen modifikasjoner kan teknikken også brukes til å måle samspillets affinitet. I tillegg til punkter som er reist i protokollen over, bør følgende problemer vurderes ved utforming, gjennomføring og tolkning av analysen.

Protein av interesse

Ferskt tilberedt eller frosset protein kan brukes i analysen. Hvis frosset protein brukes, anbefales det sterkt at resultatene sammenlignes med friskt (aldri frosset) protein for å sikre at frysing ikke påvirker F-aktinbindingen.

G-actin Kilde

Mange pelleteringsforsøk bruker G-aktin isolert fra muskel på grunn av dens relative overflod. Det finnes tre hovedaktinisotyper i pattedyr - alfa, beta og gamma - som er bemerkelsesverdig like (> 90% sekvensidentifikasjonty). Likevel er det funksjonelle forskjeller mellom isotypene 12 , 13 . Hvis det er mulig, bør G-actin isotypen som brukes i bindingsanalysen, stemme overens med in vivo isotypen. For eksempel, hvis du tester et protein uttrykt i skjelettmuskulatur, er alpha-actin det beste valget; Hvis man undersøker et protein uttrykt i fibroblaster, anbefales beta-aktin.

Phalloidin Bruk

Siden phalloidin binder F-aktin, kan det forstyrre eller blokkere bindingen av enkelte F-aktinbindende proteiner ( f.eks. Phalloidin blokker cofilin fra binding til actinfilamenter) 14 . Således bør phalloidin brukes med forsiktighet og resultatene sammenlignet med ikke-falloidinbehandlede prøver når det er mulig.

Høy bakgrunn

Det er ikke uvanlig for proteiner å sedimentere i fravær av F-aktin ( Figur 1A , ingen F-aktin pelletsprøves). Imidlertid kan høye nivåer av bakgrunns sedimentering maskere sann aktinsam-sedimentering og gjøre det vanskelig, om ikke umulig å avgjøre om et protein binder F-aktin eller for å måle samspillets affinitet. Tilsetning av polidicanol til reaksjonsbufferen (trinn 4.1) kan redusere bakgrunnen betydelig og er en enkel løsning. Hvis det ikke reduserer bakgrunnen, kan justering av reaksjonsbufferen, saltkonsentrasjonen og / eller inkubasjonstemperaturen hjelpe.

Bindende kurve

For å generere en bindende kurve, er det nødvendig å variere konsentrasjonen av enten protein av interesse eller F-aktin over en rekke reaksjoner. I praksis er det lettere og foretrukket å opprettholde F-aktin ved en fast konsentrasjon og å variere konsentrasjonen av proteinet av interesse. Vedlikehold av F-aktin ved en fast konsentrasjon ( f.eks. 2 μM) i pelleteringsanalysen begrenser ikke-spesifikk fangst ved høyere konsentrasjoner av F-aktin og forhindrerDepolymerisering ved lavere (<0,5 μM) konsentrasjoner av F-aktin. Depolymerisering kan forebygges ved bruk av phalloidin, selv om dette introduserer en potensiell kompliserende faktor i systemet (se trinn 3.3 og høyere). Ved å opprettholde F-actin ved en fast konsentrasjon kan man også sammenligne (og normalisere) F-aktin-pelleten over prøver og identifisere mislykkede eksperimenter ( dvs. hvor F-aktin-pellet er svært variabel, forhindrer analyse på tvers av konsentrasjoner). Til slutt, ved å opprettholde F-aktin ved en fast konsentrasjon, kan man bestemme om bindingen til actinfilamentet er kooperativ ( figur 1C ).

Mettet bindende

Som i alle bindende eksperimenter er det kritisk at bindingen til F-aktin er mettet og at konsentrasjonen av protein pluss F-aktinplater ( Figur 1C ). Uten et platå er det ikke mulig å beregne en nøyaktig dissosiasjon likevektskonstant. Dermed er detDet er viktig å nøye planlegge fortynningsserien som skal testes, og å alltid inkludere høyere konsentrasjoner av protein ( dvs. minst 5-10 ganger høyere enn forventet K d ).

Bindingsanalyse

For at de målte dissosiasjonskonstanter skal være avgjørende, bør analysen utføres ved bruk av en F-aktinkonsentrasjon som tillater konsentrasjonen av bindingssteder på F-aktin for proteinet av interesse å være mye lavere enn affiniteten. For å kontrollere om dette kriteriet var oppfylt, anslår konsentrasjonen av bindingssteder fra B max . For eksempel, hvis [F-actin] var 2 μM og Bmax = 0,5, så [bindingssteder] ≈ 1 μM. K d bør være minst 5-10 ganger større enn [bindingssteder]. Hvis den målte Kd er av samme størrelsesorden som [bindingssteder], er det mulig at den observerte bindingskurven representerer en titrering av høy affinitetsbindende siTes heller enn en ekte bindende isoterm. Hvis dette observeres, gjenta analysen ved å bruke en 10-ganger lavere F-aktinkonsentrasjon for å måle en nøyaktig affinitet. For interaksjoner med høy affinitet kan phalloidin-stabilisering (trinn 3.3) være nødvendig for å oppnå en F-aktinkonsentrasjon som er lav nok til nøyaktig måling av affinitet.

Endelig er det grunnleggende begrensninger med samesettingsanalysen som forskere bør være oppmerksomme på når de utfører og evaluerer analysen. Viktigst av alt produserer co-sedimentasjonsanalysen ikke en ekte likevektskonstant. Produktene av binding ( dvs. protein pluss F-aktin) separeres fra reaktantene under sentrifugering, hvoretter produktene deretter kan dissosiere for å skape en ny likevekt. Som et resultat kan co-sedimenteringsassayet feilberegne eller mislykkes i å oppdage lavaffinitetsinteraksjoner. Siden mange aktinbindende proteiner har lav ( dvs. mikromolær) affinitet for F-aktin, et negativt resultat ( 15,16 ). Til tross for disse begrensningene er pelleteringsanalysen innenfor de fleste forskere og er et effektivt verktøy for å bestemme om et protein binder F-aktin og for å måle samspillets affinitet.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant HL127711 til AVK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher Scientific 46960
S100-AT3 rotor ThermoFisher Scientific 45585
Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL ThermoFisher Scientific 45233
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Bovine Serum Albumin Sigma A8531
Polidicanol (Thesit)  Sigma 88315
Phalloidin ThermoFisher Scientific P3457
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0862
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma A2383
Imidazole Fisher Scientific O3196
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific M33
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific P217
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma 3779
Odyssey CLx Imaging System LI-COR
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Colloidal Blue Staining Kit ThermoFisher Scientific LC6025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D. Actin and Actin-Binding Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).
  2. Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins. Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).
  3. Lappalainen, P. Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks. Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).
  4. Mullins, R. D., Hansen, S. D. In vitro studies of actin filament and network dynamics. Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).
  5. Miller, P. W., et al. Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin. J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).
  6. Wickline, E. D., et al. alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments. J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).
  7. Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).
  8. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  9. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  10. Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  11. Hansen, S. D., et al. alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).
  12. Perrin, B. J., Ervasti, J. M. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).
  13. Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).
  14. Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments. J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).
  15. Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).
  16. Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays. Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).

Tags

Biochemistry actin filamentous actin F-actin actin-bindende protein co-sedimentering pelleteringsanalyse bindingskurve
Måling av proteinbinding til F-aktin ved co-sedimentering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heier, J. A., Dickinson, D. J.,… More

Heier, J. A., Dickinson, D. J., Kwiatkowski, A. V. Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation. J. Vis. Exp. (123), e55613, doi:10.3791/55613 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter