Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att testa förmågan hos ett protein att sedimentera med filamentöst aktin (F-aktin) och, om bindning observeras, för att mäta interaktionens affinitet.
Abstract
Filamentous actin (F-aktin) organisationen inom celler regleras av ett stort antal aktinbindande proteiner som kontrollerar aktin-kärnbildning, tillväxt, tvärbindning och / eller demontering. Detta protokoll beskriver en teknik - aktinsammansättning, eller pelletering, analys - för att bestämma huruvida ett protein eller en proteindomän binder F-aktin och för att mäta interaktionens affinitet ( dvs dissociationsjämviktskonstanten). I denna teknik inkuberas ett protein av intresse först med F-aktin i lösning. Därefter användes differentialcentrifugering för att sedimentera aktinfilamenten, och det pelleterade materialet analyseras med SDS-PAGE. Om proteinet av intresse binder F-aktin kommer det att sedimentera med aktinfilamenten. Produkterna av bindningsreaktionen ( dvs F-aktin och proteinet av intresse) kan kvantifieras för bestämning av interaktionens affinitet. Actinpelleteringsanalysen är en enkel teknik för bestämningOm ett protein av intresse binder F-aktin och för att bedöma hur förändringar i det proteinet, såsom ligandbindning, påverkar dess interaktion med F-aktin.
Introduction
Actin är ett essentiellt cytoskeletalt protein som spelar en viktig roll i flera cellulära processer, inklusive motilitet, sammandragning, vidhäftning och morfologi 1 . Actin finns i två former: monomer globulärt aktin (G-aktin) och polymeriserat filamentöst aktin (F-aktin). Inom celler styrs F-aktinorganisationen av en stor samling proteiner som reglerar kärnbildning, tillväxt, tvärbindning och demontering av aktinfilament 2 , 3 , 4 . Men hur flera aktinbindande proteiner fungerar i samverkan för att reglera aktinätverksorganisationen är fortfarande i stor utsträckning oklart.
Mätningen av protein-protein-interaktioner är ett viktigt tillvägagångssätt för att förstå hur proteiner påverkar cellulärt beteende på den biokemiska nivån. Många olika analyser kan användas för att detektera interaktioner mellan renade proteiner.Vanliga metoder för lösliga proteiner innefattar neddragningar, fluorescenspolarisation, isotermisk titreringskalorimetri och ytplasmonresonans. Viktigt är att alla dessa analyser kräver att proteiner är lösliga och är sålunda svåra att anpassa för användning med ett polymert, trådformigt protein såsom F-aktin. Här beskriver vi en teknik - aktinsammansättning, eller pelletering, analys - för att bestämma om ett protein eller proteinområde binder F-aktin och för att mäta interaktionens affinitet.
Actinpelleteringsanalysen är en relativt enkel teknik som inte kräver specialutrustning, förutom en ultracentrifug. Alla reagenser kan göras, förutsatt kunskap om grundläggande biokemi eller inköp. När bindning till F-aktin är etablerad kan analysen användas för att mäta den uppenbara affiniteten ( dvs dissociationsjämviktskonstanten) 5 . Även när en affinitet är etablerad, är pelleteringsanalysenÄr ett användbart verktyg för att mäta hur förändringar i proteinet av intresse ( dvs. posttranslationella modifieringar, mutationer eller ligandbindning) påverkar dess interaktion med F-aktin 6 . Tekniken har begränsningar (se diskussionen ) som forskaren bör vara medveten om innan försöket görs.
Protocol
1. Förbered materialen
- Rening av proteinet av intresse (se avsnitt 2).
- Förbered eller köp G-actin.
OBS: G-aktin kan isoleras från flera källor 1 ; Alternativt kan det köpas. Rekonstituerad G-aktin (i 5 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP (adenosintrifosfat) och 0,5 mM ditiotreitol (DTT)) bör flashfrysas, lagras vid -80 ° C och> 10 mg / ml I små (10-20 μl) alikvoter och tinas precis före användning. G-aktinalikvoter får inte refrozen. - Förbered eller köp ett kontrollprotein, såsom BSA (se steg 4.4).
- Förbered 10x polymerisationsbuffert (200 mM imidazol pH 7,0, 1 M KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP och 10 mM EGTA (etylenglykol-bis (P-aminoetyleter) -N, N, N ', N'- Tetraättiksyra)). Gör en 10x lager och justera pH efter tillsättning av ATP, om det behövs. Aliquot (25 μL är en användbar volym) och lagras vid -80 & #176; C.
- Förbered 10x reaktionsbuffert (200 mM imidazol pH 7,0, 1,5 M NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM ATP och 10 mM EGTA). Gör en 10x lager och justera pH efter tillsättning av ATP, om det behövs. Aliquot (50-100 | il är en användbar volym) och lagras vid -80 ° C.
ANMÄRKNING: Reaktionsbuffertens sammansättning är flexibel och kan behöva justeras för att minska bakgrundssedimentation, begränsa icke-specifik bindning och / eller förbättra bindning (steg 1.5.1-1.5.3).- Justera reaktionsbuffertens pH mellan 6 och 8 för att optimera proteinstabilitet. Vid ett lägre eller högre pH, ersätt en lämplig buffert för imidazol.
ANMÄRKNING: Använd pH 7,0 som utgångspunkt, om inte ett protein kräver ett lägre eller högre pH för stabilitet. Använd inte buffert med pH under 6,0 eller högre än 8,0, eftersom detta kan störa aktin. Rekommenderade buffertar (slutkoncentration och optimalt pH listat) inkluderar: 20 mM MOPS (3- ( N- morfolino) propansulfonsyra), pH= 6,5; 20 mM imidazol, pH = 7,0; 10 mM HEPES (4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-etansulfonsyra), pH = 7,5; Och 20 mM Tris, pH = 8,0. - Variera saltkoncentrationen av reaktionsbufferten beroende på behoven hos analysen.
OBS: Actin är ett surt protein, och nästan alla aktinbindande proteiner är till viss del beroende av elektrostatiska interaktioner för att associera med aktin. Därför minskar den ökade saltkoncentrationen aktinbindningen i de flesta fall. Reaktionsbufferten använder en fysiologisk saltnivå (150 mM NaCl, arbetskoncentration) och detta är den rekommenderade utgångspunkten. Vid behov kan saltkoncentrationen sänkas ( t.ex. till 100 mM) för att främja bindning eller ökas för att begränsa bindning. - Ändra inte koncentrationerna av MgCl2, ATP eller EGTA i reaktionsbufferten om inte det finns en specifik anledning att göra det.
- Justera reaktionsbuffertens pH mellan 6 och 8 för att optimera proteinstabilitet. Vid ett lägre eller högre pH, ersätt en lämplig buffert för imidazol.
2. Förbered testproteinet för analysen
- FÖRBEREDELSEEa protein av hög renhet med vätskekromatografi för bästa resultat 7 .
OBS! Om man använder rekombinant protein bör stora proteinkoder, såsom glutation-S-transferas (GST), avlägsnas genom proteasklyvning från målproteinet, eftersom de kan störa bindningen. GST orsakar också homodimerisering av fusionsproteiner, som artificiellt kan öka affiniteten för aktinbindning. - Bestäm proteinkoncentrationen genom mätning av absorbansen vid 280 nm. Del av extinktionskoefficienten; Extinktionskoefficienten kan beräknas från proteinsekvensen med hjälp av sekvensanalys eller verktyg på nätet. Alternativt bestämmer proteinkoncentrationen med användning av Bradford eller BCA (bicinchoninsyra) metoder.
OBS: För initiala försök är vanligen 50-100 μl protein vid 20-40 μM vanligtvis tillräcklig. Detta kommer att möjliggöra analys av bindning i det låga mikromolära området, en användbar utgångspunkt för de flesta aktinbindande proteiner. En större quanTity och ofta behövs en högre koncentration av protein för att generera en bindningskurva för att beräkna affiniteten (se avsnitt 5). - Precis före användning, snurra proteinet (50 000-100 000 xg i 10 min vid 4 ° C) för att ta bort aggregaten av olösligt protein. Om löslighet är en oro, mätning av proteinkoncentrationen (steg 2.2) efter centrifugering.
3. Förbered F-aktin
- Ta bort en alikvot av G-aktin från -80 ° C frysen och tina den snabbt.
- Tillsätt 10x polymerisationsbufferten till G-aktin till en slutlig koncentration av 1x. Se till att G-aktinkoncentrationen i 1x polymerisationsbuffert är minst 10-20 μM, långt över den kritiska koncentrationen. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur (RT) för att tillåta aktin att polymerisera.
- Efter polymerisation, lagra F-aktin i lösning vid 4 ° C, där det kommer att vara stabilt i några veckor. Innan du använder F-aktin igen efter lagring, försiktigt inverteraEller flera röret flera gånger för att säkerställa att allt aktin är upplöst och jämnt fördelat i lösning.
OBS: (Valfritt) Lägg till phalloidin för att uppnå ett molförhållande 1: 1 av G-aktin: phalloidin. Inkubera i 30 minuter vid RT för att låta falloidinet binda till F-aktin. Phalloidin stabiliserar F-aktin och uppnår två saker: (i) det minskar mängden aktin som inte sedimenteras under centrifugering och (ii) det tillåter att F-aktin späds under den kritiska koncentrationen (~ 0,5 μM), vilket ofta är Nödvändigt om man varierar mängden F-aktin för att generera en bindningskurva (se avsnitt 5 om mätning av affiniteten).
4. Pelleteringsanalys - Grundprotokoll
OBS! Det grundläggande protokollet som beskrivs i avsnitt 4 används för att bestämma om ett protein av intresse samsediment med F-aktin. När bindningen till F-aktin är etablerad kan affiniteten för denna interaktion mätas enligt protokollet beskrivet i avsnitt 5.
- Förbered reaktionsbufferten dag för användning genom att späda 10x-stammen till 1x och tillsätt DTT till en slutlig koncentration av 1 mM.
OBS: (Valfritt) Lägg till polidokanol till en slutlig arbetskoncentration av 0,02% i reaktionsbufferten. Polidokanol är ett ytaktivt medel som reducerar icke-specifik bakgrundsbindning och hjälper till att förhindra att hydrofoba proteiner håller fast vid ultracentrifugröret. - Späd proteinet av intresse till önskade koncentrationer i 1x reaktionsbuffert i ultracentrifugrör. Håll provvolymerna låga (40-60 μL) för att undvika att använda stora mängder protein genom att använda ultracentrifugrör med små minsta volymer ( t.ex. 7 x 20 mm rör som håller 0,2 ml vardera).
OBS! Eftersom många aktinbindande proteiner har en affinitet för F-aktin i mikromolära området, rekommenderas ett protein av intresse av 2 och 10 μM. Om bindning inte observeras vid 10 μM är det osannolikt att bindning kommer att observeras vid högre koncentrationer. OmTillsatt protein utgör mer än 10-20% av den slutliga reaktionsvolymen kan det vara nödvändigt att dialysera proteinet i reaktionsbufferten innan man utför experimentet. - Tillsätt F-aktin till önskad slutkoncentration.
OBSERVERA: 2 μM är en användbar koncentration för initiala experiment, eftersom den ligger långt över den kritiska koncentrationen och därigenom upprätthåller aktin i det trådformiga tillståndet. Det kommer att producera en synlig pellet när den analyseras med SDS-PAGE (steg 4.10). - Förbered följande kontroller i ultracentrifugrör för att göra analysen informativ.
- Bered prov (er) som innehåller proteinet av intresse utan F-aktin. Se till att koncentrationen av protein i dessa prover matchar koncentrationen i "plus F-aktin" -proverna.
OBS: Dessa prover bestämmer mängden protein som aggregeras eller fastnar på sidorna av ultracentrifugröret i frånvaro av F-aktin. - Förbered negativa kontrollproverVid samma eller liknande koncentration (er) som används för proteinet av intresse. Använd ett kontrollprotein som inte binder till F-aktin, med och utan F-aktin.
OBS! Det här är en viktig kontroll eftersom proteiner kan bli "fångade" i aktinfilament och pellet med F-aktin, även om de inte binder F-aktin. Mängden fångst kan variera beroende på F-aktinkällan, buffertförhållandena, etc. Således bör denna kontroll inkluderas i alla experiment. Optimalt bör kontrollproteinet ha en molekylvikt som liknar proteinet av intresse ( t.ex. för aE-katenin (~ 100 kDa), BSA (66 kDa) är en lämplig kontroll). Kommersiellt tillgängliga gelfiltreringsstandarder gör utmärkta kontrollproteiner, eftersom de täcker en rad storlekar och tenderar att inte innehålla aggregat. - Förbered eventuellt positiva kontrollprover innehållande ett protein som binder till F-aktin, med och utan F-aktin. Se till att koncentrationen (erna) liknar demE protein av intresse.
OBS: Denna kontroll är till hjälp genom att det visar att experimentella förhållanden ( t.ex. beredda F-aktin, reaktionsbuffert och centrifugering) tillåter F-aktinbindning. Eftersom pelleteringsanalysen inte kan detektera svaga F-aktin-interaktioner (se diskussionen), rekommenderas att det kända F-aktinbindande proteinet har en måttlig till svag affinitet för F-aktin ( dvs i det låga mikromolära området ). Renade F-aktinbindande proteiner är kommersiellt tillgängliga.
- Bered prov (er) som innehåller proteinet av intresse utan F-aktin. Se till att koncentrationen av protein i dessa prover matchar koncentrationen i "plus F-aktin" -proverna.
- Inkubera alla prover i 30 minuter vid RT.
OBS: Längre inkubationstider är bra, förutsatt att proteinet av intresse är stabilt, men troligen onödigt. Om proteinet av intresse inte är stabilt vid RT, kan prover inkuberas vid 4 ° C. I detta fall kan längre inkubationstider vara nödvändiga. - Ladda proverna i centrifugrotorn. Placera rören i rotorn för att hjälpa till med resuspendering av pelleten efter centrifugering.Markera därmed alla centrifugrör ( t.ex. med ett provnummer) och placera alla rör i rotorn i samma position ( t.ex. numret vänd ut).
- Centrifugera vid 100 000 xg under 20 min vid 4 ° C i en ultracentrifug.
- Efter centrifugering avlägsnas 3/4 av supernatanten ( t ex 45 μl om startvolymen var 60 μl) från varje rör och blandas med 1/3 volymer 4x provbuffert (15 μl i detta fall) i ett separat mikrocentrifugrör.
- Ta bort resterande supernatanten med en geladdlingsspets, var noga med att inte störa pelleten (som kan vara synlig som en glasig fläck).
OBS! Det är viktigt att ta bort supernatanten från rören så snart som möjligt efter avslutad centrifugdrift för att begränsa proteindissociation efter separation. Tvätta inte pelleten med reaktionsbuffert av samma skäl.
- Ta bort resterande supernatanten med en geladdlingsspets, var noga med att inte störa pelleten (som kan vara synlig som en glasig fläck).
- Tillsätt 4/3 volymer 1x provbuffert till varje pelleT ( t ex 80 | il om utgångsvolymen var 60 | il).
OBS: Detta gör utspädningen densamma som för supernatanten (steg 4,8, 1/3 volymer 4x provbuffert tillsattes), vilket möjliggjorde direkt jämförelse mellan pellets- och supernatantprover och bestämning av procentandelen protein som pelleterades.- Tillsätt provbuffert till alla rör och inkubera i minst 5 minuter vid RT. Låt pelleten sitta i provbufferten för att förbättra provåtervinningen.
- Triturera provet 8-10 gånger med en p200 pipettspets för att resuspendera pelleten genom att kontinuerligt tvätta rörets pelletarea. Skrapa pipettspetsen försiktigt över pelleten under triturationen för att hjälpa till med återuppslamning.
OBSERVERA: Var försiktig så att du inte inför luften i provet under triturationen, eftersom det kommer att orsaka att provbufferten bubblas och kommer att minska provåtervinningen. - Överför de resuspenderade proverna till mikrofiberrör efter finfördelning. </ Ol>
- Analysera supernatanten och pelletsproverna genom SDS-PAGE och Coomassie-färgning 8 genom att ladda 10-15 | il prov per lane; Detta är tillräckligt för att visualisera proteinerna.
ANMÄRKNING: Proteiner som co-sedimenterar med F-aktin kommer att berika i "plus F-aktin" -pelletsproverna över "nej F-aktin" -pelletsproverna ( Figur 1A ). Standard Coomassie-blåfärgning är tillräcklig för detektering om proteinkoncentrationerna ligger i 0,1-10 μM-intervallet. Kolloidal Coomassie 9 eller Western blotting kan användas för att öka känsligheten om lägre proteinkoncentrationer används för att mäta interaktioner med högre affinitet. - Image Coomassie-färgade geler med hjälp av ett scanner- eller avbildningssystem (steg 5.12).
5. Pelleteringsanalys - kvantifiering
Obs! Om specifik bindning till F-aktin observeras kan det vara användbart att mäta affiniteten för tHan interaktion. Detta uppnås genom att göra några ändringar och tillägg till protokollet som beskrivs i avsnitt 4. För en utmärkt guide för att designa och tolka bindningsanalyser, se Pollard 10 . Ett flödesschema ( Figur 2 ) tillhandahålls för hjälp med analys och kvantifiering.
- Bestäm koncentrationsintervallet för att testa.
OBS: Koncentrationsområdet beror på proteinet och bör sträcka sig från en koncentration under den uppenbara Kd ( t.ex. 1 μM) till koncentrationer tillräckligt höga för att mätta bindning. Det är kritiskt att bindningen når mättnad i flera prov vid den höga änden av koncentrationsområdet för att alstra en exakt bindningskurva ( Figur 1C ). Såsom noterats ovan har många aktinbindande proteiner en affinitet för F-aktin i det låga mikromolära intervallet (1-5 uM). För ett protein med en Kd på 0,5-1 uM skulle ett användbart utgångskoncentrationsområde vara 0,1-10 | im. - Hård spin (steg 2.3) proteinet av intresse för att avlägsna aggregat. Späd ut proteinet serievis för att göra en koncentrationsserie innehållande 7-8 prover vid 2x den slutliga koncentrationen som ska testas. Om exempelvis det område som ska testas är 0,1-8 uM, förbereda följande utspädningar i 1x reaktionsbuffert: 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 och 0,2 | im.
OBS! Såsom nämnts i steg 4.2, om det tillsatta proteinet utgör mer än 10% -20% av den första spädningen (16 μM provet i exemplet ovan), kan det vara nödvändigt att antingen koncentrera proteinet ytterligare eller dialysera Protein i 1x reaktionsbuffert. Var noga med att förbereda tillräckligt med varje utspädning för "plus F-aktin" och "nej F-aktin" -prover. - Förbered prov (som i avsnitt 4) genom att späda proteinet av intresse för önskade koncentrationer i 1x reaktionsbuffert i ultracentrifugrör. Håll provvolymerna låga (40-60 μL) för att undvika att använda stora mängder protein genom att använda ultracentRifuge-rör med små minsta volymer ( t.ex. 7 x 20 mm rör som håller 0,2 ml vardera).
- Tillsätt F-aktin till önskad slutkoncentration till lämpliga prov och höj volymen med 1x reaktionsbuffert. Till exempel försäkrar 50 μl reaktioner med användning av 2 μM F-aktin att varje prov har 25 μl 2x protein, 10 μl 10 μM F-aktin och 15 μl 1x reaktionsbuffert. Inkludera kontrollprover (steg 4.4.2 och 4.4.3).
OBS! För negativa och positiva kontroller, använd en koncentration inom det prov som ska testas (steg 5.1), helst nära mitten till den högsta delen av intervallet ( t.ex. 4 μM om koncentrationsområdet är 0,1-10 μM).
- Tillsätt F-aktin till önskad slutkoncentration till lämpliga prov och höj volymen med 1x reaktionsbuffert. Till exempel försäkrar 50 μl reaktioner med användning av 2 μM F-aktin att varje prov har 25 μl 2x protein, 10 μl 10 μM F-aktin och 15 μl 1x reaktionsbuffert. Inkludera kontrollprover (steg 4.4.2 och 4.4.3).
- Inkubera alla prover i 30 minuter vid RT.
- Efter 30 minuter avlägsnas 1/5 av varje prov ( t ex 10 | il av 50-lL-reaktionen) och blandas med 20 | il vatten och 10 | il 4x provbuffert.
OBS: Dessa är "Totalt" sAmplar och kommer att användas för att generera en standardkurva. - Ladda proverna i ultracentrifugrotorn. Centrifugera i 20 min vid 100 000 xg och 4 ° C.
- Eventuellt, efter centrifugering, avlägsna 3/4 av supernatanten ( t ex 30 | il om den centrifugerade volymen var 40 | il) från varje rör och blanda med 4x provbuffert (10 | il i detta fall) i ett separat mikrofuge-rör. Ta bort resterande supernatanten med en geladdlingsspets, var försiktig så att inte pelleten störs.
OBS! Vid mätning av bindningsaffiniteten är det inte nödvändigt att köra supernatanten. Det kan dock vara användbart att spara supernatanten, speciellt när man testar ett nytt protein. - Ta bort supernatanten om den inte analyseras (steg 5.7).
- Resuspendera pelleten i 1 volym 1x provbuffert ( t ex 40 | il om den centrifugerade volymen var 40 | il).
- Tillsätt provbuffert till alla rör och inkubera i minst 5 minuter vid RT.
- TrTorka provet 8-10 gånger med en p200 pipettspets, ständigt tvätta rörets pelletarea. Skrapa pipettspetsen försiktigt över pelleten under triturationen för att hjälpa till med återuppslamning.
- Överför det resuspenderade proteinet till ett mikrocentrifugrör.
OBS! Det här är "Pellet" -proverna. - Analysera total- och pelletsproverna genom SDS-SIDA 8 . Kör alla prov på en gel om möjligt. Om inte, kör pelletsproverna på en gel och de totala proven i en sekund.
OBS: Med tanke på antalet prov rekommenderas ett stort gelsystem för analys. Om du kör prov på två eller flera geler är det viktigt att alla geler färgas identiskt ( dvs samma Coomassie-lösning och samma tid i fläck / destain). - Image Coomassie-färgade geler med hjälp av ett avbildningssystem som mäter proteinbandets intensiteter över ett brett ( dvs. ett två till tre-logg) och linjärt intervall. Se till att bilderna aÅteruppsamlas utan mättade pixlar.
OBS! Laserbaserade bildhanteringssystem erbjuder de bästa känslighets- och signalförhållandena. - Använda ImageJ eller ett liknande analysprogram mäta proteinbandets intensiteter och beräkna mängden bunden protein.
OBS! För alla provmätningar, använd markeringsverktyget i ImageJ för att rita ett intresseområde (ROI) runt varje band och mäta (Analysera> Mät) området och det genomsnittliga gråvärdet. Beräkna bakgrunden för varje gel genom att mäta det genomsnittliga gråvärdet från ett område utan prov. Subtrahera bakgrundsgenomsnittet grått värde från varje ROI-medelvärde grått värde och multiplicera sedan med området för att få det integrerade densitetsvärdet för varje band.- Mät proteinet av intressebandets intensiteter från de totala proven ( Figur 2A ).
- Generera en standardkurva genom att plotta bandintensiteten ( dvs de integrerade densitetsmätningarna) mot proteinmassan ( Figur2B).
- Mäta mängden protein av intresse som co-sedimenteras med F-aktin (sam-sedimenterat protein, Figur 2C ).
- Mäta mängden protein av intresse som sedimenteras i frånvaro av F-aktin (bakgrundssedimentering, Figur 2D ).
- Subtrahera bakgrundssedimenteringen från det samsedimenterade proteinet ( dvs subtrahera värdena från steg 5.13.4 från steg 5.13.3) för bestämning av mängden protein som binds till F-aktin.
- Mät mängden F-aktin i varje pellet ( Figur 2E ). Bestäm medelvärdet av F-aktin per prov och dividera sedan varje prov med medelvärdet för att bestämma förhållandet mellan F-aktin i varje prov i förhållande till medelvärdet ( dvs siffrorna nedanför banden).
- För varje prov dela mängden bunden protein (beräknad i steg 5.13.5) med F-aktin-aktinpelletsförhållandet (steg 5.13.6) för att justera för skillnader i pelleten.
NOTE: Detta värde är det normaliserade bundna proteinet. - Använd standardkurvan (steg 5.13.2) för att beräkna mängden (massa) av normaliserat bunden protein (steg 5.13.7) i varje prov.
ANMÄRKNING: Proteinet avlägsnades initialt ("Total" provet), såväl som den laddade mängden (som, om inte hela pelleten laddades, kommer att vara en viss fraktion av pelleten), måste redovisas vid beräkning av den totala mängden protein Som pelleterade. - Bestäm koncentrationen av bunden protein i varje prov från den totala massan av protein i pelleten (beräknad i steg 5.13.8) och provets volym. Subtrahera detta värde från startkoncentrationen för att bestämma mängden fritt protein. Dela koncentrationen av bunden protein med koncentrationen av aktin (μM / μM aktin) och plot kontra koncentrationen av fritt protein för att alstra en bindningskurva ( Figur 1C ).
OBS! Eftersom F-aktin inte är en enda, enhetlig art är det svårtKult för att extrapolera den molära koncentrationen av F-aktin från G-aktinkoncentrationen. Använd start G-aktinkoncentrationen för att bestämma mängden bunden protein (μM / μM aktin) och uppskatta den uppenbara koncentrationen av bindningsställen i reaktionen. Koncentrationen av bindningsställen är vanligtvis mindre än koncentrationen av aktinmonomerer i reaktionen eftersom inte allt aktin polymeriserar och eftersom en enda aktinbindande proteinmolekyl kan göra kontakt med flera monomerer på aktinfilamentet.
- Med hjälp av ett statistiskt program bestäms affiniteten (Kd) och Bmax från bindningskurvan genom att använda icke-linjär minsta kvadratregression.
OBS: Scatchard-plottar är avskräckta för att analysera bindningsdata, delvis för att de kan dölja om bindning är mättad och eftersom de kan snedvrida experimentfel 10 .
Representative Results
Vi undersökte aE-katenin-homodimerbindning till F-aktin i sam-sedimenteringsassayen. Eftersom tidigare experiment har visat att affiniteten för aE-katenin-homodimer för F-aktin är omkring 1 ^ M och Bmax nära 1 11 , utförde vi analysen med en låg koncentration av F-aktin (0,2 ^ M i stället för 2 ^ M, se diskussionen). Eftersom 0,2 | im ligger under den kritiska koncentrationen tillsattes phalloidin för att stabilisera F-aktin polymeriserad från kaninskelettmuskel G-aktin (steg 3.3). Ökande koncentrationer av aE-katenin-homodimer (0,125-12,0 ^ M) inkuberades i närvaro eller frånvaro av 0,2 ^ M F-aktin. Proven centrifugerades och de resulterande pelletsna analyserades ( Figur 1A ). Som förväntat jämförde aE-katenin-homodimeren sam-sedimenterad med F-aktin ovanför bakgrunden ( Figur 1A , jämför F-aktinpelletsproverna till nej-F-acTennpelletsprover). BSA kördes som en negativ kontroll ( Figur 1B ). Bundet protein kvantifierades och plottades över fritt protein för att beräkna affiniteten för interaktionen ( Figur 1C ). De plottade data passar bäst i en Hill-ekvation. Den beräknade Kd var 2,9 uM, B max var 0,2 och Hill-koefficienten (h) var 4,8. Således binder aE-katenin-homodimer F-aktin kooperativt med en låg mikromolär affinitet, som överensstämmer med tidigare arbete (en Kd på 2,9 μM kontra ~ 1,0 μM) 11 .
Figur 1: Höghastighets-F-aktinsam-sedimenteringsanalys. ( A ) Ökande koncentrationer (0,125-12,0 uM) av aE-katenin-homodimer inkuberades med (vänstra paneler) eller utan (högra paneler) 0,2 | im F-aktin stabiliserat med falloidin. De inkuberades i 30 minuter vid RT och centrifugerades. Totalvärdet (7,5% av utgångsmaterialet) och pelleterat material (50% av det pelleterade materialet) separerades genom SDS-PAGE och färgades med Coomassie-färgämne. ( B ) 4 ^ M BSA kördes som en negativ kontroll. Totalt och pelletprover med (+) eller utan (-) F-aktin separerades med SDS-PAGE och färgades med Coomassie-färgämne. ( C ) Bundet αE-katenin (μM / μM aktin) från A plottades mot fri αE-katenin (μM) och data passar till en Hill-ekvation (röd linje). Kd-, Bmax- och Hill-koefficienten (h) anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Actinpelleterings kvantifiering - flödesdiagram. Denna schema visar viktiga steg i avsnitt 5, med exempel på totalt och pelletprover ( A , CE ) och standardkurvan ( B ) som används för kvantifiering. 5.13 steg: 1 ) Mäta mängden protein av intresse i de totala proverna (A). 2 ) Generera en standardkurva genom att plotta bandintensiteten mot proteinmassan (B). 3 ) Mäta mängden protein av intresse som co-sedimenteras med F-aktin ( C ). 4 ) Mäta mängden protein av intresse som pelleteras i frånvaro av F-aktin ( D ). 5 ) Subtrahera D från C för att bestämma mängden protein bunden till F-aktin. 6 ) Mäta mängden F-aktin i varje pellet (E), beräkna medelvärdet av F-aktin per prov och dela varje prov med medelvärdet (siffrorna nedan visar förhållandet). 7 )För varje prov dela mängden bunden protein (beräknad i steg 5) med F-aktinpelletsförhållandet (beräknat i steg 6) för att justera för skillnader i pelleten. 8 ) Använd standardkurvan ( B ) för att beräkna mängden (massa) normaliserat bunden protein i varje prov (steg 7). 9 ) Bestäm koncentrationen av fritt protein och bunden protein för att skapa en bindningskurva. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Aktinsam-sedimentationsanalysen är en enkel teknik som snabbt kan avgöra om ett protein binder F-aktin. Med vissa modifieringar kan tekniken även användas för att mäta samverkans affinitet. Förutom punkter som uppkommer i protokollet ovan bör följande frågor beaktas vid utformning, genomförande och tolkning av analysen.
Protein av intresse
Färskberedt eller fruset protein kan användas i analysen. Om fruset protein används, rekommenderas det starkt att resultaten jämförs med friskt (aldrig fruset) protein för att säkerställa att frysning inte påverkar F-aktinbindning.
G-actin Källa
Många pelleteringsexperiment använder G-aktin isolerat från muskel på grund av dess relativa överflöd. Det finns tre huvudaktinisotyper i däggdjur - alfa, beta och gamma - som är anmärkningsvärt lika (> 90% sekvensidentifieringty). Ändå finns funktionella skillnader mellan isotyperna 12 , 13 . Om möjligt bör den G-aktinisotyp som används i bindningsanalysen matcha in vivo- isotypen. Om t ex ett protein uttryckt i skelettmuskler är alfa-aktin det bästa valet. Om man undersöker ett protein uttryckt i fibroblaster rekommenderas beta-aktin.
Phalloidin användning
Eftersom phalloidin binder F-aktin, kan det störa eller till och med blockera bindningen av vissa F-aktinbindande proteiner ( t ex phalloidinblock cofilin från bindning till aktinfilament) 14 . Således bör phalloidin användas med försiktighet och resultaten jämförs med icke-falloidinbehandlade prover när det är möjligt.
Hög bakgrund
Det är inte ovanligt för proteiner att sediment i frånvaro av F-aktin ( Figur 1A , inget F-aktinpelletsprovs). Höga nivåer av bakgrunds sedimentering kan emellertid maskera sannaktinsam-sedimentering och göra det svårt, om inte omöjligt, att bestämma om ett protein binder F-aktin eller för att mäta interaktionens affinitet. Att tillsätta polidicanol till reaktionsbufferten (steg 4.1) kan avsevärt minska bakgrunden och är en enkel lösning. Om det inte minskar bakgrunden kan justering av reaktionsbufferten, saltkoncentrationen och / eller inkubationstemperaturen hjälpa.
Bindningskurva
För att generera en bindningskurva är det nödvändigt att variera koncentrationen av antingen protein av intresse eller F-aktin över en serie reaktioner. I praktiken är det lättare och föredraget att bibehålla F-aktin vid en fast koncentration och att variera koncentrationen av proteinet av intresse. Underhåll av F-aktin vid en fast koncentration ( t.ex. 2 μM) i pelleteringsanalysen begränsar ospecifik fångst vid högre koncentrationer av F-aktin och förhindrarDepolymerisation vid lägre (<0,5 ^ M) koncentrationer av F-aktin. Depolymerisation kan förebyggas med användning av phalloidin, även om detta introducerar en potentiell komplicerande faktor i systemet (se steg 3.3 och senare). Underhåll av F-aktin vid en bestämd koncentration gör det också möjligt att jämföra (och normalisera) F-aktinpelleten över prover och identifiera misslyckade experiment ( dvs. där F-aktinpelleten är mycket variabel, vilket förhindrar analys över koncentrationer). Slutligen tillåter upprätthållande av F-aktin vid en fast koncentration att man bestämmer om bindningen till aktinfilamentet är kooperativ ( Figur 1C ).
Mättad bindning
Liksom i alla bindande experiment är det kritiskt att bindningen till F-aktin är mättad och att koncentrationen av protein plus F-aktinplattor ( Figur 1C ). Utan en platå är det inte möjligt att beräkna en exakt dissociationsjämviktskonstant. SåledesDet är viktigt att noggrant planera utspädningsserien som ska testas och att alltid inkludera högre proteinkoncentrationer ( dvs minst 5-10 gånger högre än den förväntade K d ).
Bindningsanalys
För att de uppmätta dissociationskonstanterna ska vara avgörande bör analysen utföras med användning av en F-aktinkoncentration som tillåter koncentrationen av bindningsställen på F-aktin för proteinet av intresse att vara mycket lägre än affiniteten. För att kontrollera om detta kriterium var uppfyllt, uppskatta koncentrationen av bindningsställen från B max . Om exempelvis [F-aktin] var 2 | im och Bmax = 0,5, så [bindningsställen] ≈ 1 | im. Kd bör vara minst 5-10 gånger större än [bindningsställen]. Om den uppmätta Kd är av samma storleksordning som [bindningsställen], är det möjligt att den observerade bindningskurvan representerar en titrering av högaffinitetsbindande siTes snarare än en sann bindande isoterm. Om detta observeras, upprepa analysen med en 10-faldig lägre F-aktinkoncentration för att mäta en exakt affinitet. För interaktioner med hög affinitet kan phalloidin-stabilisering (steg 3.3) vara nödvändigt för att uppnå en F-aktinkoncentration som är tillräckligt låg för att noggrant mäta affinitet.
Slutligen finns det grundläggande begränsningar med den sedimenteringsanalys som forskarna bör vara medvetna om när de utför och utvärderar analysen. Viktigast av allt producerar samsedimenteringsanalysen inte en sann jämviktskonstant. Produkterna av bindning ( dvs protein plus F-aktin) separeras från reaktanterna under centrifugering, varpå produkterna sedan kan dissociera för att skapa en ny jämvikt. Som ett resultat kan samsedimenteringsanalysen felaktigt beräkna eller misslyckas att detektera interaktioner med låg affinitet. Eftersom många aktinbindande proteiner har en låg ( dvs mikromolär) affinitet för F-aktin, är ett negativt resultat (
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant HL127711 till AVK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 | |
| S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 | |
| Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL | ThermoFisher Scientific | 45233 | |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 | |
| Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 | |
| Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 | |
| Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 | |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
References
- Pollard, T. D. Actin and Actin-Binding Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).
- Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins. Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).
- Lappalainen, P. Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks. Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).
- Mullins, R. D., Hansen, S. D. In vitro studies of actin filament and network dynamics. Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).
- Miller, P. W., et al. Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin. J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).
- Wickline, E. D., et al. alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments. J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).
- Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Hansen, S. D., et al. alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).
- Perrin, B. J., Ervasti, J. M. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).
- Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).
- Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments. J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D. Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).
- Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays. Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).
