Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Abstract

Neutrofiele migratie en chemotaxis zijn cruciaal voor het immuunsysteem van ons lichaam. Microfluidische apparaten worden steeds meer gebruikt om neutrofiele migratie en chemotaxis te onderzoeken vanwege hun voordelen in real-time visualisatie, nauwkeurige controle van de chemische concentratiegradiëntgeneratie en verminderde reagentia en het gebruik van monsters. Onlangs is door de microfluidische onderzoekers een groeiende inspanning gedaan voor het ontwikkelen van geïntegreerde en gemakkelijk geëxploiteerde microfluïdische chemotaxis-analysesystemen, direct uit het gehele bloed. In deze richting werd de eerste all-on-chip methode ontwikkeld voor het integreren van de magnetische negatieve zuivering van neutrofielen en de chemotaxis assay uit kleine bloedvolume monsters. Deze nieuwe methode maakt het mogelijk om in 25 minuten een snelle neutrofiele chemotaxis-test te testen. In dit document bieden we gedetailleerde constructie, werking en data analyse methode voor deze all-on-chip chemotaxis assay met een discussie over probleemoplossing strategieën, limiTations en toekomstige richtingen. Representatieve resultaten van de neutrofiele chemotaxis-test die een gedefinieerde chemoattractant, N- Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) en sputum van een patiënt met chronische obstructieve longziekte (COPD) testen met behulp van deze all-on-chip methode, worden getest. Deze methode is van toepassing op veel cel migratie gerelateerde onderzoeken en klinische toepassingen.

Introduction

Chemotaxis, een proces van gerichte celmigratie naar oplosbaar chemisch concentratiegradiënt, is kritisch betrokken bij vele biologische processen, waaronder immuunrespons 1 , 2 , 3 , weefselontwikkeling 4 en kankermetastase 5 . Neutrofielen zijn de meest voorkomende witte bloedcel subset en spelen cruciale rollen om het lichaam de aangeboren gastheerverdedigingfuncties mogelijk te maken, evenals bij het bemiddelen van adaptieve immuunresponsen 6 , 7 . Neutrofielen zijn uitgerust met sterk gereguleerde chemotactische machines waardoor deze motiele immuuncellen kunnen reageren op zowel pathogeen afgeleide chemoattractanten ( bv. FMLP) en gastheer-afgeleide chemoattractanten ( bijv . Interleukine-8) throughchemotaxis 8 . Neutrofiele migratie en chemotaxis mediëren verschillende fysiologische problemenEn ziekten zoals ontsteking en kanker 1 , 9 . Zo geeft de nauwkeurige beoordeling van neutrofiele chemotaxis een belangrijke functionele uitlezing voor het bestuderen van de neutrofiele biologie en de bijbehorende ziekten.

In vergelijking met de veelgebruikte conventionele chemotaxis assays ( bijv. Transwell assay 10 ) tonen de microfluïdische inrichtingen een grote belofte voor kwantitatieve evaluatie van celmigratie en chemotaxis door de nauwkeurig gecontroleerde chemische gradiëntgeneratie en miniaturisatie 11 , 12 , 13 . In de afgelopen twee decennia of zo zijn diverse microfluïdische apparaten ontwikkeld om de chemotaxis van verschillende biologische celsoorten, vooral neutrofielen 11 , te bestuderen. Er was aanzienlijke inspanning gewijd aan het karakteriseren van neutrofiele migratie in spatiotemporally complex che Mische gradiënten die werden geconfigureerd in de microfluïdische inrichtingen 14 , 15 . Interessante strategieën werden ook ontwikkeld om directionele besluitvorming door neutrofielen te bepalen door gebruik te maken van de microfluïdische inrichtingen 16. Naast biologisch georiënteerd onderzoek zijn de toepassingen van microfluïdische apparaten uitgebreid naar testklinische monsters voor ziekte-evaluatie 17 , 18 , 19 . Het gebruik van veel microfluïdische apparaten is echter beperkt tot gespecialiseerde onderzoekslaboratoria en vereist langdurige neutrofiele isolatie van groot volume bloedmonsters. Daarom is er een groeiende trend geweest voor het ontwikkelen van geïntegreerde microfluïdische apparaten voor snelle neutrofiele chemotaxis-analyse direct vanuit een druppel bloed in het bloed 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Naar deze richting werd een all-on-chip methode ontwikkeld die de magnetische negatieve neutrofielzuivering en de daaropvolgende chemotaxis-analyse op een enkele microfluidische inrichting 25 integreert. Deze all-on-chip methode heeft de volgende nieuwe kenmerken: 1) in tegenstelling tot eerdere on-chip strategieën die neutrofielen van het bloed isoleren door middel van adhesie-gebaseerde celopname of op celgrootte gebaseerde filtering 20 , 22 , maakt deze nieuwe methode hoge Zuiverheid, on-chip magnetische scheiding van de neutrofielen uit kleine volumes van volledig bloed, evenals chemotaxis meting bij chemoattractant stimulatie; 2) de celdockstructuur helpt de initiële posities van de neutrofielen dicht bij het chemische gradiëntkanaal af te stemmen en maakt een eenvoudige chemotaxisanalyse mogelijk zonder enkelvoudige cellen te volgen; 3) de integratie van de neutrofiele isolatie en chemotAs assay op een enkel microfluïdisch apparaat maakt het mogelijk om in 25 minuten een snelle analyse van de chemotaxis op de proef te krijgen, wanneer er geen onderbreking is tussen de experimentele stappen.

Dit papier bevat een gedetailleerd protocol voor de constructie, werking en data analyse methode van deze all-on-chip chemotaxis assay. Het papier toont het effectieve gebruik van de ontwikkelde methode voor het uitvoeren van neutrofiele chemotaxis door een bekende recombinant chemoattractant en complexe chemotactische monsters van patiënten te testen, gevolgd door een discussie over probleemoplossingsstrategieën, beperkingen en toekomstige richtingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protocollen voor het verzamelen van menselijke monsters werden goedgekeurd door de Joint Research Board Ethics Board van de Universiteit van Manitoba, Winnipeg.

1. Fabricage van microfluïdische inrichting ( Figuur 1A )

  1. Ontwerp en print transparantie masker.
    1. Ontwerp het apparaat zoals eerder beschreven 25 . Zie figuur 1A .
      OPMERKING: het apparaat bevat twee lagen. De eerste laag (4 μm hoog) definieert het cel docking barrier kanaal om de cellen naast het gradiëntkanaal vast te vallen. De tweede laag (60 μm hoog) definieert het gradiëntgeneratiekanaal, de poort en het kanaal voor het laden van cellen, de chemische inlaatreservoirs en de afvalafvoer. De uitlijningspunten zijn ontworpen voor de twee lagen. Voor de tweede laag is de lengte en breedte van het stroomopwaartse serpentine ingangskanaal respectievelijk 60 mm en 200 μm; De lengte en breedte van de stroomafwaartseSerpentine ingangskanaal is respectievelijk 6 mm en 280 μm.
    2. Druk de eigenschappen van de eerste en tweede laag op een transparantmasker af met een printer met hoge resolutie.
      OPMERKING: De afdrukresolutie hangt af van de minimale eigenschappen in het ontwerp. In het huidige ontwerp werd 32.000 dpi gekozen voor een minimale functie van 10 μm.
  2. Maak de siliconenwafel schoon.
    1. Plaats een 3 in siliconenwafel in de plasmaschoner. Breng vacuüm gedurende 3 minuten aan.
    2. Zet de plasma power aan en zet het niveau naar HIGH. Gebruik het zuurstofplasma om de siliciumwafel gedurende 30 minuten te behandelen.
    3. Zet de plasmaschuiver uit en haal de siliconenwafel uit; De siliconenwafel is klaar om de apparaatvorm te fabriceren.
  3. Maak de eerste laag door fotolithografie in een cleanroom-faciliteit.
    OPMERKING: De exacte fabricageparameters kunnen variëren afhankelijk van de fabricagefaciliteit.
    1. Verdun 10 ml SU-8 2025 met 10 ml SU-8 2000 in een glazen breker om de ontworpen fotoresist voor te bereiden. Laat het mengsel gedurende 10 minuten in de dampkoker staan ​​totdat de bellen verdwijnen.
    2. Plaats de schoongemaakte siliconenwafer voorzichtig op de spinner met de geschikte chuck en plaats het vacuüm om de siliciumwafel te immobiliseren.
    3. Giet 3 ml van de fotoresistmengsel voorzichtig op het midden van de siliconenwafel. Spin bij 500 rpm gedurende 5 s. Draai dan bij 3 000 rpm gedurende 30 s om een ​​uiteindelijke 4 μm dikte fotoresist coating op de silicium wafer te verkrijgen.
    4. Verwijder de siliconenwafel voorzichtig uit de spinner en bak de siliconenwafel gedurende 4 minuten bij 95 ° C op een kookplaat.
    5. Plaats de siliconenwafel voorzichtig op een maskerbinder en zet de UV-belichtingstijd op 6 s. Bevestig het transparantmasker van de eerste laag voorzichtig op een transparante glazen plaat met plakband.
    6. Plaats de transparante glazen plaat met het bijgevoegde masker voorzichtig op de uitlijning en lig het masker af met de siliconenwafel. Stel de si uitLiconwafel naar de UV om de celdockstructuur te patronen.
    7. Verwijder de glasplaat voorzichtig en verwijder de blootgestelde siliconenwafel. Bak de siliconenwafel op een kookplaat gedurende 4 minuten bij 95 ° C.
    8. Breng de siliconenwafel over op een afzuigkap en plaats deze in een glazen pan met de SU-8-ontwikkelaar. Schud dit voor 30 s voorzichtig.
    9. Reinig de siliconenwafel met behulp van een verse SU-8-ontwikkelaar, gevolgd door isopropylalcohol (IPA) in de dampkap. Droog de siliconenwafel door stikstofgas in de dampkap; De eerste laag is klaar.
  4. Maak de tweede laag op de eerste laag.
    1. Gebruik kleefband om de uitlijningstekens op de eerste laag te bedekken. Plaats de siliconenwafel voorzichtig met de eerste laag op de vacuümklem van de spinner en vacuüm aan om de siliconenwafel te immobiliseren.
    2. Giet 3 ml SU-8 2025 fotoresist op de siliconenwafel. Draai de siliconenwafel bij 500 rpm gedurende 5 s. Draai dan bij 2000 rpm voor 30S om een ​​uiteindelijke 60 μm dikte fotoresist coating op de silicium wafer te verkrijgen.
    3. Verwijder de siliciumwafel voorzichtig uit de spinner en plaats deze op een kookplaat; Bak bij 65 ° C gedurende 2 minuten.
    4. Verwijder de kleefband voorzichtig om de uitlijningsteken op de eerste laag te openen. Leg de siliconenwafel op een kookplaat en bak 6 min bij 95 ° C.
    5. Plaats de siliconenwafel voorzichtig op een maskerbinder en stel de UV-belichtingstijd in op 18 s.
    6. Bevestig het transparantmasker van de tweede laag voorzichtig op een transparante glazen plaat met plakband.
    7. Zet de glazen plaat voorzichtig met het bijgevoegde masker op de uitlijder en lig het masker en de eerste laag op de siliconenwafel uit door de kruisuitlijningstekens te gebruiken met behulp van de inspectiemicroscoop van de uitlijning.
    8. Breng de fotoresistcoated siliconenwafel bloot aan UV om de cellading- en gradiëntkanalen te patronen.
    9. Verwijder de glasplaat voorzichtig en haal de silicium wAfer. Bak de siliconenwafel op een kookplaat bij 65 ° C gedurende 2 minuten en breng de siliciumwafel over naar een andere 95 ° C kookplaat en bak 6 min.
    10. Breng de siliconenwafel naar de dampkap en plaats deze in een glazen pan met de SU-8-ontwikkelaar. Schud dit voor 6 minuten voorzichtig.
    11. Reinig de siliconenwafel met behulp van een nieuwe SU-8-ontwikkelaar, gevolgd door IPA in de dampkap.
    12. Droog de siliconenwafel met stikstofgas in de dampkap. Plaats de siliconenwafel op een kookplaat en bak de mal gedurende 30 minuten bij 150 ° C; De tweede laag is klaar.
  5. Mastervormoppervlakmodificatie.
    OPMERKING: Een silanisatieoppervlakmodificatiestap wordt toegepast op de SU-8 schimmel om polydimethylsiloxaan (PDMS) vrijlating van de mal in zachte lithografie te vergemakkelijken.
    1. Neem 10 μl tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl (trichloorsilaan) oplossing in een micropipette tip. Zet de micropipettaart in een 15 ml plastic buis aLos de kap van de buis los.
    2. Plaats de buis en de SU-8 patroon silicium wafer in een droogmiddel en plaats het vacuüm gedurende 1 uur; De maskervorm is klaar voor het vervaardigen van het PDMS-apparaat.
  6. Fabriceer het PDMS-apparaat.
    1. Bereid de PDMS oplossing door 40 g PDMS base en 4 g verhardingsmiddel in een plastic beker te mengen. Plaats de voorbereide SU-8 meesterschimmel in een Petri-schaal en giet 44 g PDMS-oplossing zorgvuldig op de schimmel.
    2. Plaats de Petri-schotel in een droogmiddel en vacuüm om de PDMS-oplossing gedurende 20 minuten te ontdoen. Plaats de Petri-schotel in een oven en kuur de PDMS bij 80 ° C gedurende 2 uur.
    3. Na het bakken, haal de Petri schotel uit en plaats het op een schone bank. Snijd de PDMS-plaat uit de SU-8 schimmel en snij het af.
    4. Pons de cel laadpoort uit met een puncher met een diameter van 3 mm. Steek de inlaatreservoirs en de afvaluitlaat uit met een puncher met een diameter van 6 mm.
    5. Verwijder het stof op deOppervlak van de PDMS-plaat met plakband. Plaats de PDMS-plaat en een schone glazen glijbaan in de plasma machine. Breng het vacuüm gedurende 3 minuten aan.
    6. Zet de plasma power aan en zet het niveau naar HIGH. Zet de luchtklep voorzichtig aan en plaats de PDMS-plaat en de glasdia voor 3 minuten.
    7. Zet de plasmaschakel uit en laat het vacuüm los. Pak de PDMS-plaat en de glazen glijbaan voorzichtig uit met behulp van een pincet.
    8. Plaats de PDMS-plaat (met kanaalconstructies met de bedrukte zijde) direct op de glazen glijbaan; Druk voorzichtig op de PDMS-plaat om het aan het glas te binden. Vul het microfluïdische kanaal onmiddellijk met gedeïoniseerd water; De fabricage en montage van de microfluidische inrichting zijn voltooid.

2. Bereiding van microfluïdische celmigratieassays

  1. Microfluïdische apparaatvoorbereiding.
    1. Bereid 50 μg / ml fibronectine oplossing door 50 μL voorraad fibronectine oplossing (1 mg / ml) te verdunnen tot 95081; L Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) in een biosafety-kast.
    2. Bereid het migratiemedium op door 9 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640) en 1 mL RPMI-1640 met 4% boviene serumalbumine (BSA) te mengen.
    3. Verwijder het gedeïoniseerd water uit het apparaat.
    4. Voeg 100 μL fibronectinoplossing toe aan het apparaat van de uitlaat. Wacht 3 minuten om ervoor te zorgen dat alle kanalen gevuld zijn met fibronectine oplossing. Plaats het microfluïdische apparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bedekte Petri-schotel.
    5. Verwijder de fibronectine oplossing van het apparaat. Voeg 100 μL migratiemedium toe vanaf de uitlaat. Wacht 3 minuten om ervoor te zorgen dat alle kanalen met migratiemedium zijn gevuld.
    6. Incubeer het apparaat nog eens 1 uur bij kamertemperatuur; Het apparaat is dan klaar voor het chemotaxis experiment.
  2. Chemoattractant oplossing preparaat voor chemotaxis experiment.
    1. Bereid 100 nM fMLP oplossing in tTotaal 1 ml migratie medium. Meng 5 μL voorraad FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) met de fMLP oplossing in een 1,5 ml buis.
      OPMERKING: FITC-Dextran wordt gebruikt voor gradientmeting. Alternatief, gebruik Rhodamine als de gradiënt indicator. De fMLP chemoattractant oplossing is dan klaar voor chemotaxis experiment.
  3. Sputummonstervoorbereiding.
    OPMERKING: Neutrofiele chemotaxis geïnduceerd door een gradiënt van sputummonster van COPD-patiënten werd getest als een klinische diagnostische toepassing van deze all-on-chip methode.
    1. Verkrijg een human ethics protocol om sputummonsters van COPD patiënten te verzamelen.
      OPMERKING: Wij hebben goedkeuringen verkregen om monsters te verzamelen in het Seven Oaks General Hospital in Winnipeg (goedgekeurd door de Universiteit van Manitoba).
    2. Verkrijg de geïnformeerde schriftelijke toestemmingsformulieren van alle vakken.
    3. Verzamel de spontane sputummonsters van COPD-patiënten. Plaats 500 μL sputummonster in een 1,5 ml buis.
    4. Voeg 500 μL 0,1% diThiothreitol in de 1,5 ml buis en meng zachtjes. Plaats de buis gedurende 15 minuten in een waterbad bij 37 ° C.
    5. Centrifugeer het monster bij 753 xg gedurende 10 minuten en verzamel vervolgens het supernatant. Centrifugeer het supernatant bij 865 xg gedurende 5 minuten en verzamel vervolgens het uiteindelijke supernatant. Bewaar de verzamelde supernatant in een -80 ° C vriezer voor gebruik.
    6. Doe de sputumoplossing als u klaar bent voor chemotaxis-experimenten. Overdracht 900 μL migratie medium naar een 1,5 ml buis en meng met 100 μL sputum oplossing in een biosafety kabinet; De sputumoplossing is dan klaar voor chemotaxis-experiment.
  4. Bloedmonsterverzameling.
    1. Verkrijg een human ethics protocol om bloedmonsters te verzamelen van gezonde donoren. Verkrijg de geïnformeerde schriftelijke toestemmingsformulieren van alle bloeddonors.
      OPMERKING: hier werden monsters verkregen bij het Victoria General Hospital in Winnipeg (goedgekeurd door de Joint Research Board Ethics Board van de Universiteit van Manit)oba).
    2. Verzamel het bloedmonster door venipuncture en plaats het monster in een EDTA-beklede buis. Houd de buis voor het experiment in een biosafety-kast.

3. All-on-chip Chemotaxis Assay Operatie

  1. On-chip celisolatie ( Figuur 1B ).
    1. Plaats 10 μL volbloed in een 1,5 ml buis in een biosafety-kast.
      OPMERKING: Details over het verzamelen van bloedmonsters staan ​​in sectie 2.4.
    2. Voeg 2 μL antilichaamcocktail (Ab) en 2 μL magnetische deeltjes (MP) van de neutrofiele isolatiekit (zie de tabel van materialen) in de 1,5 ml buis en meng het voorzichtig; Dit zal cellen in het bloed merken behalve de neutrofielen.
    3. Incubeer het bloed-Ab-MP mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: dit zal de antilichaam gelabelde cellen in bloed magnetisch markeren.
    4. Bevestig twee kleine magnetische schijven aan de twee zijden van de cel laad pPlaats van het apparaat. Aspireer het medium uit alle poorten van het apparaat.
    5. Langzaam pipet 2 μL bloed-Ab-MP mengsel in de microfluïdische inrichting uit de cel laadpoort.
      OPMERKING: De magnetisch gemerkte cellen zijn vastgelegd aan de zijwanden van de cel laadpoort, terwijl neutrofielen in het apparaat stromen en worden vastgeklemd bij de celdockstructuur.
    6. Wacht even tot er genoeg neutrofielen zijn vastgelopen in de cel-docking area.
  2. Chemotaxis-analyse ( Figuur 1C ).
    1. Plaats het microfluïdische apparaat op de temperatuurbeheerde microscoopfase bij 37 ° C.
    2. Voeg 100 μL chemoattractantoplossing (fMLP of sputumoplossing) en 100 μL migratiemedium toe aan hun aangewezen inlaatreservoirs door gebruik te maken van twee pipettors; Dit zal een chemoattractantgradiënt in het gradiëntkanaal genereren door continu chemische mengen op basis van laminair flow, dat wordt ondersteund door een drukE balanseringsstructuur.
      OPMERKING: Details van de sputumcollectie van COPD-patiënten staan ​​in sectie 2.3.
      1. Voor het medium besturingsexperiment voegt u alleen migratiemedium toe aan beide inlaatreservoirs.
    3. Verkrijg het fluorescentiebeeld van FITC-Dextran in het verloopskanaal.
    4. Importeer de afbeelding naar ImageJ-software met het commando "Bestand | Open".
    5. Meet het fluorescentie-intensiteitsprofiel over het gradiëntkanaal met behulp van het commando "Analyse | Plot Profile".
    6. De meetgegevens exporteren naar een spreadsheet voor verder plotten.
    7. Incubeer het apparaat op de temperatuur gestuurde microscoop stadium of in een conventionele celcultuur incubator gedurende 15 minuten.
    8. Beeld het verloopkanaal met behulp van een 10X-doelstelling om de eindposities van de cellen vast te stellen voor data-analyse.
    9. Indien nodig, registreert u de celmigratie in het apparaat door middel van time-lapse microscopie.

4. Cell Migration DAta-analyse ( figuur 1C )

  1. Analyseer de chemotaxis assay door de cel migratie afstand van de docking structuur te berekenen zoals hieronder beschreven. Zie figuur 1C .
  2. Importeer de afbeelding in NIH ImageJ-software (ver 1.45).
  3. Selecteer het midden van elke cel die in het verloopskanaal is verplaatst.
  4. Meet de coördinaten van de geselecteerde cellen voor hun eindposities. Meet de coördinaat van een punt aan de rand van de dockingstructuur als de eerste referentiepositie.
  5. Exporteer de gemeten coördinaatgegevens naar een spreadsheetsoftware ( bijv. Excel). Bereken de migratieafstand van de cellen als het verschil tussen de uiteindelijke positie van een cel en de initiële referentiepositie langs de gradiëntrichting.
  6. Kalibreren de afstand tot een micrometer. Bereken het gemiddelde en de afwijking van de migratieafstand van alle cellen als een maat voor chemotaxis.
  7. Vergelijk het meRantsoort in aanwezigheid van een chemoattractantgradiënt aan het mediumcontrole-experiment met gebruikmaking van de student's t- test.
  8. Als de tijdverloopbeelden van de celmigratie worden opgenomen, kan de celmigratie en chemotaxis verder worden geanalyseerd door celvolganalyse 15 .
    OPMERKING: De materialen die nodig zijn om de all-on-chip chemotaxis-analyse op te stellen en uit te voeren, worden gedetailleerd in de materialenlijst weergegeven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neutrofielen worden negatief gekozen uit een druppel volbloed direct in het microfluïdische apparaat. De zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen werd geverifieerd door on-chip Giemsa-kleuring en de resultaten lieten de typische ringvormige en lobe-vormige kernen van neutrofielen zien ( Figuur 2A ) 25 . Dit duidt op een effectieve on-chip neutrofiele isolatie met een hoge zuiverheid uit een klein volume volbloed. Bovendien kan de dockingstructuur de cellen naast het gradiëntkanaal effectief uitlijnen voordat het chemische gradiënt wordt toegepast ( Figuur 2B ) 25 .

Gradientgeneratie is gebaseerd op het continue chemische mengen van laminair stromen, en de stromingen worden aangedreven door het drukverschil van de verschillende niveaus van de inlaat- en uitlaatoplossingen. Er zijn geen externe pompen nodig. De chemische gradiëntT wordt binnen enkele minuten in het microfluïdische apparaat gevormd, dat wordt gekenmerkt door het fluorescentie-intensiteitsprofiel van FITC-Dextran over het gradiëntkanaal. De gradiënt is stabiel gedurende ten minste 1 uur, wat voldoende tijd is voor het huidige neutrofiele chemotaxis experiment ( Figuur 1C ).

Om het gebruik van de all-on-chip methode voor cel migratie onderzoek te demonstreren, werden de neutrofiele chemotaxis in medium alleen of in een fMLP gradiënt vergeleken. De testresultaten toonden aan dat er weinig cellen door het barrière kanaal in het medium controle experiment werden gecrawld. Daarentegen verhuisden veel neutrofielen snel door het barrière kanaal en migreerden naar de 100 nM fMLP gradiënt ( Figuur 2B ) 25 . De cel migratie test wordt kwantitatief gemeten door de migratie afstand, die significant hoger is voor de fMLP gradiënt dan de medium controle ( 25 .

Bovendien werd de all-on-chip methode aangetoond voor mogelijke klinische toepassingen door de neutrofilemigratie in alleen medium te vergelijken met een gradiënt van sputummonster van COPD-patiënten. De resultaten toonden een sterke celmigratie naar de COPD sputumgradiënt, die kwantitatief wordt aangegeven door de significant hogere migratieruimte in vergelijking met de mediumcontrole ( Figuur 2B - C ) 25 .

Figuur 1
Figuur 1: Illustratie van de all-on-chip methode voor neutrofiele chemotaxis analyse. ( A ) Illustratie van het microfluïdische apparaat. Het apparaat bevat twee lagen. De eerste laag (4 μm hoog) definieert de celIk docking barrier kanaal om de cellen naast het gradiënt kanaal te vallen. De tweede laag (60 μm hoog) definieert het gradiëntgeneratiekanaal, de poort en het kanaal voor het laden van cellen, de chemische inlaatreservoirs en de afvalafvoer. Alignment marks zijn ontworpen voor de twee lagen. Voor de tweede laag is de lengte en breedte van het stroomopwaartse serpentine ingangskanaal respectievelijk 60 mm en 200 μm; De lengte en breedte van het stroomafwaartse serpentine ingangskanaal is respectievelijk 6 mm en 280 μm; ( B ) Illustratie van de all-on-chip cel isolatie methode; ( C ) Illustratie van de chemotaxis test. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Representatieve resultaten vanDe all-on-chip neutrofil chemotaxis analyse 25 . ( A ) Giemsa-kleurenbeeld (met behulp van een 60X-doelstelling) van de all-on-chip geïsoleerde cellen in het microfluïdische kanaal; ( B ) Vergelijking van de celverdeling in de mediumregeling, een 100 nM fMLP gradiënt en een COPD sputumgradiënt; ( C ) De gemiddelde cel migratie afstand in het gradiënt kanaal in de medium control, een fMLP gradiënt en een COPD sputum gradiënt. De foutbalkjes geven de standaardfout van de gemiddelde (SEM) aan. * Geeft p <0,05 aan van de student's t- test. De cijfers werden aangepast aan referentie 25 met toestemming van World Scientific Publishing. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit document is een gedetailleerd protocol beschreven om neutrofielen direct uit het bloed te isoleren, gevolgd door de chemotaxis test, alles op een enkele microfluïdische chip. Deze methode biedt handige functies in zijn gemakkelijke werking, negatieve selectie van neutrofielen met hoge zuiverheid, snelle test van chemotaxis, resultaatvermindering, verminderde reagentia en steekproefverbruik en nauwkeurige analyse van de celmigratie. Als een ruwe schatting heeft tenminste 25% van de neutrofielen van het input-gehele bloedmonster de dockingstructuur in het apparaat effectief ingevoerd en we vonden dat de neutrofielzuiverheid hoog is door on-chip Giemsa-kleuring.

Deze ontwikkelde all-on-chip chemotaxis analyse methode heeft groot potentieel in diverse cel migratie onderzoek en klinische toepassingen. Een onderzoekstoepassing van deze methode werd aangetoond door vergelijking van neutrofiele chemotaxis in medium alleen aan een fMLP gradiënt. Evenzo kan deze methode worden gebruikt om neutrofiele chemotaxis in COPD spu te testenAls voorbeeld van het ontwikkelen van een celfunctionele biomarker voor klinische diagnose. Met deze methode kan een onderzoeker de neutrofiele chemotaxis gemakkelijk aan verschillende chemoattractanten individueel of in combinaties testen. Onderzoekers kunnen ook neutrofiele chemotaxis testen op complexe chemotactische factoren van patiënten of testneutrofielen van zieke patiënten voor het potentieel veranderde chemotaxisrespons met deze methode. Deze geïntegreerde all-on-chip methode is bijzonder nuttig voor het uitvoeren van de test in onderzoeks- of klinische laboratoria die geen gespecialiseerde celcultuur- en livecellenbeelden hebben. De test kan gemakkelijk worden uitgevoerd door onderzoekers of clinici die dit protocol volgen. Voor meer geavanceerde onderzoeksapplicaties kan deze methode met behulp van de tijdlapse microscopie individuele celbeweging bijhouden.

In het algemeen is deze all-on-chip methode makkelijk te bedienen en het resultaat is robuust. Verschillende technische herinneringen zorgen verder voor een succesvol experiment. Ten eerste, thE PDMS replica moet voorzichtig op het klas substraat worden gedrukt tijdens plasma binding om het zeer dunne barrière kanaal te beschadigen. Ten tweede kan de verdamping van het medium in de cel laadpoort het chemische gradiënt verstoren. Het is aan te raden om de cel laadpoort te bedekken met een afdichtingsblad tijdens de chemotaxis test. Ten derde moet het bloedmonster zachtjes op het apparaat worden geladen om hoge druk te voorkomen die de cellen over het barrière kanaal kan duwen voor het chemotaxis-experiment. Ten vierde, in de huidige instelling raden we aan om de magneten vast te houden aan de cel laadpoort tijdens de chemotaxis-analyse om te voorkomen dat ongewenste cellen het kanaal binnendringen. Als alternatief kan een afzonderlijk stuk PDMS met een doorgaande opening en de aangesloten magnetische schijven uitgelijnd worden naar de cel laadpoort van het apparaat. In dit geval kan het bovenste PDMS-deel met de magnetische schijven en de gevangen cellen van de inrichting verwijderd worden na celisolatie.

Dit alles-op-chIp-methode kan verder worden ontwikkeld om de huidige beperkingen te overwinnen en de functionaliteiten ervan te verbeteren en uit te breiden. Ten eerste laat het huidige apparaat alleen een enkele test tegelijk toe, waardoor de doorvoer beperkt wordt. Verdere ontwikkeling van het apparaat met meerdere parallelle testeenheden zal de experimentele doorvoer vereiste verbeteren. Ten tweede beperkt de huidige stroomgebaseerde chemische gradiëntgenerator de gradiëntgeneratie in 1D. Verdere ontwikkeling van 2D- of 3D-stroomloze gradiëntgeneratoren zal de fysiologische gradiëntomstandigheden beter nabootsen. Ten derde, naast neutrofielen, kan deze all-on-chip methode in principe gebruikt worden om andere witte bloedcel typen zoals T-cellen, B-cellen en NK-cellen te testen met behulp van soortgelijke magnetische celisolatiekits. Het zal belangrijk zijn om te onderzoeken of deze methode effectief kan worden gebruikt om bloedcelpopulaties bij lagere frequentie te testen en die cellen die de chip-activatie en cultuur nodig hebben voor de chemotaxistest. Dan is de all-on-chip cel isolatie methode caN verder uitgebreid worden voor sommige andere toepassingen. Verschillende darmkanaaldikte werden getest en de resultaten toonden aan dat 3-4 μm het meest geschikt is voor het neutrofiele migratie experiment; Dat wil zeggen dat het de ongestimuleerde cellen voldoende heeft opgesloten en de cellen door stimulatie door het barrièrescherm doorkruisen. De afmeting van de barrièrekanaal moet worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypes. Tenslotte zal deze geïntegreerde en snelle chemotaxistest onderzoekers toestaan ​​om relevante klinische toepassingen te onderzoeken. Om een ​​praktisch test in klinieken mogelijk te maken, is een draagbaar systeem ontwikkeld dat het microfluïdische apparaat, temperatuur en stadiumcontrole integreert, evenals smartphone-gebaseerde optische beeld- en data-analyse modules. Naast de COPD-gerelateerde studie, zoals aangetoond in dit document, wordt de cel migratie voor andere relevante aandoeningen zoals chronische nierziekte getest met behulp van deze all-on-chip methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad van Canada (NSERC) en de Canadese Instituten voor Gezondheidsonderzoek (CIHR). Wij bedanken het Clinical Institute of Applied Research and Education in het Victoria General Hospital in Winnipeg en Seven Oaks General Hospital in Winnipeg voor het beheer van klinische monsters van mensen. We danken Dr. Hagit Peretz-Soroka voor een goede discussie over de analysestrategieën. We bedanken professor Carolyn Ren en dr. Xiaoming (Cody) Chen van de Universiteit van Waterloo voor hun royale steun in het filmproces.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

Tags

Immunologie Probleem 124 Microfluïdische chip neutrofiel celisolatie chemotaxis bloed microfluidica
Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y.,… More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter