Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En allt-på-chip-metod för snabb neutrofilkemotaxisanalys direkt från en bloddroppe

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel tillhandahåller den detaljerade metoden för att utföra en snabb neutrofil-kemotaxisanalys genom att integrera den neutrofila isolationen på chip från helblod och kemotaxistestet på en enda mikrofluidisk chip.

Abstract

Neutrofil migration och kemotax är kritiska för vår kropps immunsystem. Mikrofluidiska enheter används alltmer för att undersöka neutrofilmigration och kemotaxor på grund av deras fördelar i realtidsvisualisering, exakt kontroll av kemisk koncentrationsgradientgenerering och minskad reagens- och provförbrukning. Nyligen har mikrofluidiska forskare gjort en ökande insats för att utveckla integrerade och lättanvända mikrofluidiska kemotaxisanalyssystem, direkt från helblod. I denna riktning utvecklades den första all-on-chip-metoden för att integrera den magnetiska negativa reningen av neutrofiler och kemotaxisanalysen från små blodvolymprover. Denna nya metod medger ett snabbt prov-till-resultat neutrofilt kemotaxistest på 25 min. I det här dokumentet tillhandahåller vi detaljerad konstruktion, drift och data analysmetod för denna allt-på-chip kemotaxis analys med en diskussion om felsökningsstrategier, limiTationer och framtida riktningar. Representativa resultat av den neutrofila kemotaxisanalys som testar en definierad kemoattraktant, N- formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) och sputum från en patient med kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD) med användning av denna all-on-chip-metod visas. Denna metod är tillämplig på många cellmigrationsrelaterade undersökningar och kliniska tillämpningar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chemotaxis, en process med riktad cellmigrering till löslig kemisk koncentrationsgradient, är kritiskt inblandad i många biologiska förfaranden inklusive immunsvar 1 , 2 , 3 , vävnadsutveckling 4 och cancermetastas 5 . Neutrofiler är den vanligaste vita blodkroppsuppsättningen och spelar viktiga roller för att möjliggöra kroppens medfödda värdförsvarsfunktioner, samt för att förmedla adaptiva immunsvar 6 , 7 . Neutrofiler är utrustade med högreglerade kemotaktiska maskiner vilket gör att dessa motila immunceller kan reagera på både patogen-härledda kemoattraktanter ( t.ex. fMLP) och värd-härledda kemoattraktanter ( t.ex. interleukin-8) genomkemotaxis 8 . Neutrofil migration och kemotaxi medlar olika fysiologiska problemOch sjukdomar som inflammation och cancer 1 , 9 . Således ger den exakta bedömningen av neutrofilkemotaxis en viktig funktionell avläsning för att studera neutrofilbiologin och de associerade sjukdomarna.

Jämfört med de allmänt använda konventionella kemotaxisanalyserna (t ex transwellanalys 10 ) visar de mikrofluidiska anordningarna ett stort löfte för kvantitativ utvärdering av cellmigration och kemotax på grund av den exakt kontrollerade kemiska gradientgenereringen och miniatyriseringen 11 , 12 , 13 . Under de senaste två decennierna har olika mikrofluidiska anordningar utvecklats för att studera kemotaxis av olika biologiska celltyper, speciellt neutrofiler 11 . Betydande ansträngningar ägnades åt att karakterisera neutrofilmigration i spatiotemporalt komplexa che Mical gradienter som konfigurerades i de mikrofluidiska anordningarna 14 , 15 . Intressanta strategier utvecklades också för att studera riktningsbeslutande av neutrofiler med användning av de mikrofluidiska enheterna 16. Förutom biologisk orienterad forskning har tillämpningarna av mikrofluidiska anordningar utökats till testkliniska prover för utvärdering av sjukdomar 17 , 18 , 19 . Användningen av många mikrofluidiska anordningar är emellertid begränsad till specialiserade forskningslaboratorier och kräver långvarig neutrofilisolering från stor volym blodprover. Därför har det varit en växande trend att utveckla integrerade mikrofluidiska enheter för snabb analys av neutrofilkemotaxier direkt från en helblodsfall 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Mot denna riktning utvecklades en all-on-chip-metod som integrerar den magnetiska negativa neutrofila reningen och den efterföljande kemotaxisanalysen på en enda mikrofluidisk anordning 25 . Denna all-on-chip-metod har följande nya egenskaper: 1) Till skillnad från tidigare strategier på chip som isolerar neutrofiler från blodet genom vidhäftningsbaserad cellinfångning eller cellstorleksbaserad filtrering 20 , 22 tillåter denna nya metod hög Renhet, magnetisk separation på chipet av neutrofilerna från små volymer av helblod, liksom kemotaxismätning vid kemoattraktantstimulering; 2) celldockningsstrukturen hjälper till att justera de ursprungliga positionerna hos neutrofilerna nära kemisk gradientkanal och tillåter enkel kemotaxanalys utan singelcellspårning; 3) integrationen av neutrofilisolering och kemotAxelanalysen på en enda mikrofluidisk anordning tillåter snabb analys till resultat av kemotaxisanalys på 25 minuter när det inte uppstår något avbrott mellan försöksstegen.

Detta papper ger ett detaljerat protokoll för konstruktion, drift och data analysmetod för denna all-on-chip chemotaxis analys. Papperet demonstrerar effektiv användning av den utvecklade metoden för att utföra neutrofilkemotaxi genom att testa ett känt rekombinant kemoattraktant och komplexa kemotaktiska prover från patienter, följt av en diskussion om felsökningsstrategier, begränsningar och framtida riktningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla samlingsprotokoll för mänskliga provtagning godkändes av den gemensamma fakultetsforskningsetikstyrelsen vid University of Manitoba, Winnipeg.

1. Tillverkning av mikrofluidiska anordningar ( figur 1A )

  1. Design och skriva ut transparensmask.
    1. Konstruera enheten enligt detaljerad tidigare 25 . Se figur 1A .
      OBS! Enheten innehåller två lager. Det första lagret (4 μm högt) definierar celldockningsbarriärkanalen för att fälla cellerna bredvid gradientkanalen. Det andra lagret (60 μm högt) definierar gradientgenereringskanalen, porten och kanalen för cellbelastning, kemiska inloppsreservoarer och avloppsutlopp. Anpassningsmärkena är utformade för de två skikten. För det andra lagret är längden och bredden av den uppströms serpentinångskanalen 60 mm respektive 200 | im; Längden och bredden av nedströmsSerpentin ingångskanal är 6 mm respektive 280 μm.
    2. Skriv ut första och andra lagerfunktionerna till en transparentmask med en högupplösta skrivare.
      OBS! Utskriftsupplösningen beror på minsta egenskaper i designen. I den nuvarande designen valdes 32 000 dpi för 10 μm minsta funktion.
  2. Rengör kiselplattan.
    1. Placera en 3 i kiselplatta i plasmaskonan. Applicera vakuum i 3 minuter.
    2. Slå på plasmakraften och sätt nivån till HÖG. Använd syrgasplasma för att behandla kiselplattan i 30 minuter.
    3. Stäng av plasmaskonan och ta ut kiselplattan. Kiselplattan är klar för tillverkning av anordningens form.
  3. Tillverka det första lagret med fotolitografi i en renrumsfacilitet.
    OBS! De exakta tillverkningsparametrarna kan variera beroende på tillverkningsanläggningen.
    1. Späd 10 ml SU-8 2025 med 10 ml SU-8 2000 i en glasbrytare för att förbereda den designade fotoresisten. Låt blandningen stå i avloppsugan i 10 minuter tills bubblorna försvinner.
    2. Placera försiktigt den rengjorda kiselplattan på spinnaren med lämplig chuck och använd vakuumet för att immobilisera kiselplattan.
    3. Häll försiktigt 3 ml fotoresistblandningen på mitten av kiselplattan. Spinn vid 500 rpm i 5 s. Snurra sedan vid 3000 rpm i 30 s för att erhålla en slutlig 4 / im-tjock fotoresistbeläggning på kiselplattan.
    4. Ta försiktigt bort kiselplattan från spinnaren och baka kiselplattan på en kokplatta i 4 minuter vid 95 ° C.
    5. Placera kiselskivan försiktigt på en maskjustering och ställ in UV-exponeringstiden till 6 s. Montera försiktigt maskeringen på det första skiktet på en transparent glasplatta med hjälp av tejp.
    6. Placera försiktigt den transparenta glasplattan med den medföljande masken på justeringsanordningen och rikta in masken med kiselplattan. Exponera siLiconskiva till UV-mönstret för celldockningsstrukturen.
    7. Ta försiktigt bort glasplattan och ta ut den exponerade kiselplattan. Baka kiselplattan på en kokplatta i 4 minuter vid 95 ° C.
    8. Överför kiselplattan till en spishäll och placera den i en glasskiva som innehåller SU-8-utvecklaren. Skaka detta försiktigt i 30 s.
    9. Rengör kiselplattan med en ny SU-8-utvecklare följt av isopropylalkohol (IPA) inuti avloppsugan. Torka kiselplattan med kvävegas inuti avloppsugan; Det första lagret är klart.
  4. Lägg på det andra lagret på det första lagret.
    1. Använd tejp för att täcka inriktningsmärkena på det första lagret. Placera kiselskivan försiktigt med det första skiktet på spinnerens vakuumskakan och applicera vakuum för att immobilisera kiselskivan.
    2. Häll 3 ml SU-8 2025 fotoresist på kiselplattan. Spinn kiselplattan vid 500 rpm i 5 s. Snurra sedan vid 2000 varv per minut för 30S för att erhålla en slutlig fotoresistbeläggning på 60 pm tjocklek på kiselplattan.
    3. Ta försiktigt bort kiselplattan från spinnaren och överför den till en kokplatta. Baka vid 65 ° C i 2 min.
    4. Ta försiktigt bort tejpen för att exponera anpassningsmärkena på det första lagret. Placera kiselskivan på en kokplatta och baka vid 95 ° C i 6 minuter.
    5. Placera kiselskivan försiktigt på en maskjustering och ställ in UV-exponeringstiden för att vara 18 s.
    6. Montera noggrannhetsglaset på det andra lagret på en transparent glasplatta med hjälp av tejp.
    7. Placera försiktigt glasplattan med den medföljande masken på justeringsanordningen, och rikta in masken och det första lagret på kiselplattan genom korsningsjusteringsmarkeringarna med hjälp av inspektionsmikroskopet hos justeraren.
    8. Exponera den fotoresistbelagda kiselplattan till UV för att mönstra cellladdnings- och gradientkanalerna.
    9. Ta försiktigt bort glasplattan och ta ut kisel wafer. Baka kiselplattan på en kokplatta vid 65 ° C i 2 minuter och överför sedan kiselplattan till en annan varmkokare på 95 ° C och baka i 6 minuter.
    10. Överför kiselskivan till spishällen och placera den i en glasskiva som innehåller SU-8-utvecklaren. Skaka detta försiktigt i 6 minuter.
    11. Rengör kiselplattan med en ny SU-8-utvecklare följt av IPA inuti avluftningslocket.
    12. Torka kiselskivan med kvävgas i inloppsugan. Placera kiselskivan på en kokplatta och hårda baka formen vid 150 ° C i 30 minuter; Det andra lagret är klart.
  5. Master mögel yta modifiering.
    OBS: Ett silaniseringsyta modifieringssteg appliceras på SU-8-formen för att underlätta polydimetylsiloxan (PDMS) frisättning från formen i mjuklitografi.
    1. Ta 10 μl tridekafluor-1,1,2,2-tetrahydrooktyl- (triklorosilan) lösning i en mikropipettspets. Sätt mikropipettspetsen i ett 15 ml plaströr aOch lossa locket på röret.
    2. Placera röret och den SU-8 mönstrade kiselskivan i en desikator och applicera vakuumet i 1 timme; Maskformen är klar för tillverkning av PDMS-enheten.
  6. Tillverka PDMS-enheten.
    1. Förbered PDMS-lösningen genom att blanda 40 g PDMS-bas och 4 g härdningsmedel i en plastbägare. Placera den beredda SU-8 mallen i en Petri-skål och häll försiktigt 44 g PDMS-lösning på formen.
    2. Placera petriskålen i en uttorkare och använd vakuum för att avdunna PDMS-lösningen under 20 minuter. Placera sedan Petriskålen i en ugn och härda PDMS vid 80 ° C i 2 timmar.
    3. Efter bakning, ta ut Petriskålen och lägg den på en ren bänk. Skär och skar försiktigt bort PDMS-plattan från SU-8-formen.
    4. Kasta ut celllastningsporten med en 3 mm diameter puncher. Kasta ut kemiska inloppsreservoarer och avfallsuttag med en 6 mm diameter puncher.
    5. Ta bort damm påYtan på PDMS-plattan med hjälp av tejp. Placera PDMS-plattan och en ren glasruta i plasmamaskinen. Applicera vakuum i 3 minuter.
    6. Slå på plasmakraften och sätt nivån till HÖG. Justera luftventilen försiktigt och plasmatreat PDMS-plattan och glasskivan i 3 minuter.
    7. Stäng av plasmakraften och släpp av vakuumet. Ta försiktigt ut PDMS-plattan och glasskivan med pincett.
    8. Placera PDMS-plattan (med kanalkonstruktionerna nedåt) omedelbart ovanpå glasrutschbanan; Tryck försiktigt på PDMS-plattan för att binda den till glaset. Fyll mikrofluidkanalen med avjoniserat vatten omedelbart; Den mikrofluidiska anordningens tillverkning och montering är avslutad.

2. Framställning av mikrofluidcellmigrationsanalys

  1. Microfluidic device preparation.
    1. Förbered 50 μg / ml fibronektinlösning genom att späda 50 μl lager fibronektinlösning (1 mg / ml) till 95081; L Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) inuti ett biosäkerhetsskåp.
    2. Förbered migrationsmediet genom att blanda 9 mL Roswell Park Memorial Institute-medium (RPMI-1640) och 1 mL RPMI-1640 med 4% bovint serumalbumin (BSA).
    3. Avlägsna avjoniserat vatten från enheten.
    4. Tillsätt 100 μL fibronektinlösning till enheten från utloppet. Vänta 3 minuter för att se till att alla kanaler är fyllda med fibronektinlösning. Placera den mikrofluidiska enheten i en täckt petriskål i 1 h vid rumstemperatur.
    5. Ta bort fibronektinlösningen från anordningen. Tillsätt 100 μL migrationsmedium från utloppet. Vänta 3 minuter för att se till att alla kanaler är fyllda med migrationsmedium.
    6. Inkubera enheten i ytterligare 1 h vid rumstemperatur; Anordningen är sedan redo för kemotaxis-experimentet.
  2. Kemoattraktantlösningsberedning för kemotaxis-experiment.
    1. Förbered 100 nM fMLP-lösning i tOtal 1 ml migreringsmedium. Blanda 5 μl lager FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) med fMLP-lösningen i ett 1,5 ml rör.
      OBS: FITC-Dextran används för gradientmätning. Alternativt använd Rhodamine som gradientindikatorn. FMLP-kemoattraktantlösningen är sedan klar för kemotaxis-experiment.
  3. Sputumprovberedning.
    OBS: Neutrofilkemotaxi inducerad av en gradient av sputumprov från COPD-patienter testades som en klinisk diagnostisk tillämpning av denna all-on-chip-metod.
    1. Hämta en human etikprotokoll för att samla sputumprover från COPD-patienter.
      OBS: Vi erhöll godkännanden för att samla prover på Seven Oaks General Hospital i Winnipeg (godkänd av University of Manitoba).
    2. Hämta de informerade skriftliga medgivandena från alla ämnen.
    3. Samla in COPD-patienters spontana sputumprover. Placera 500 μL sputumprov i ett 1,5 ml rör.
    4. Tillsätt 500 μl 0,1% diTiotreitol i 1,5 ml röret och blanda försiktigt. Placera röret i ett vattenbad vid 37 ° C i 15 minuter.
    5. Centrifugera provet vid 753 xg under 10 minuter och uppsamla sedan supernatanten. Centrifugera supernatanten vid 865 xg under 5 minuter och uppsamla sedan den slutliga supernatanten. Förvara den uppsamlade supernatanten inuti en -80 ° C frys innan användningen.
    6. När det är klart för kemotaxis-experiment, tina sputumlösningen; Överför 900 μL migrationsmedium till ett 1,5 ml rör och blanda med 100 μL sputumlösning inuti ett biosäkerhetsskåp; Sputumlösningen är sedan klar för kemotaxis-experiment.
  4. Blodprovsamling.
    1. Hämta ett protokoll för mänskliga etik för att samla blodprover från friska givare. Hämta de informerade skriftliga medgivandena från alla blodgivare.
      OBS: Här erhölls prover på Victoria General Hospital i Winnipeg (godkänd av fakultetsforskningsetikstyrelsen vid University of Manitoba).
    2. Samla blodprovet genom venipunktur och sätt provet i ett EDTA-belagt rör. Håll röret i ett biosäkerhetsskåp före experimentet.

3. All-on-chip Chemotaxis-analysoperation

  1. On-chip cellisolering ( Figur 1B ).
    1. Placera 10 μl helblod i ett 1,5 ml rör inuti ett biosäkerhetsskåp.
      OBS! Detaljer om blodprovtagning finns i avsnitt 2.4.
    2. Tillsätt 2 μL antikroppscocktail (Ab) och 2 μL magnetiska partiklar (MP) från neutrofilisoleringskitet (se tabell över material) i 1,5 ml röret och blanda försiktigt; Detta kommer att märka celler i blodet, med undantag av neutrofilerna.
    3. Inkubera blod-Ab-MP-blandningen under 5 minuter vid rumstemperatur.
      OBS: Detta kommer magnetiskt att märka antikroppsmärkta celler i blod.
    4. Fäst två små magnetiska skivor på de båda sidorna av cellladdningen pOrt av enheten. Aspirera mediet från alla portar på enheten.
    5. Långsamt pipetterar 2 μl blod-Ab-MP-blandning i mikrofluidanordningen från celllastningsporten.
      OBS! De magnetiskt märkta cellerna är fastna till sidoväggarna i celllastningsporten medan neutrofiler kommer att strömma in i enheten och bli fastna vid celldockningsstrukturen.
    6. Vänta några minuter tills tillräckligt med neutrofiler är infångade vid celldockningsområdet.
  2. Chemotaxis-analys ( Figur 1C ).
    1. Placera den mikrofluidiska anordningen på det temperaturstyrda mikroskopsteget vid 37 ° C.
    2. Tillsätt 100 μL kemoattraktantlösning (fMLP eller sputumlösning) och 100 μl migreringsmedium till deras utsedda inloppsreservoarer med användning av två pipetterare; Detta kommer att alstra en kemoattraktantgradient i gradientkanalen genom kontinuerlig laminärflödesbaserad kemisk blandning med hjälp av en tryckningE balanseringsstruktur.
      ANMÄRKNING: Detaljer om sputumuppsamlingen från KOL-patienter finns i avsnitt 2.3.
      1. För mediet kontroll experimentet, tillsätt endast migrationsmedium till båda inloppsreservoarerna.
    3. Skaffa fluorescensbilden av FITC-Dextran i gradientkanalen.
    4. Importera bilden till ImageJ-programmet med kommandot "File | Open".
    5. Mät fluorescensintensitetsprofilen över gradientkanalen med kommandot "Analysera | Plotprofil".
    6. Exportera mätdata till ett kalkylblad för ytterligare plottning.
    7. Inkubera enheten på det temperaturstyrda mikroskopsteget eller i en konventionell cellodlings-inkubator under 15 min.
    8. Bild gradientkanalen med hjälp av ett 10X-objekt att registrera cellernas slutpositioner för dataanalys.
    9. Om det behövs, registrera cellmigrationen i enheten med tidsfördröjningsmikroskopi.

4. Cellmigration DAta-analys ( figur 1C )

  1. Analysera kemotaxisanalysen genom att beräkna cellmigreringsavståndet från dockningsstrukturen som beskrivs nedan. Se figur 1C .
  2. Importera bilden till NIH ImageJ-programvaran (ver. 1.45).
  3. Välj mitten av varje cell som flyttades in i lutningskanalen.
  4. Mäta koordinaterna för de valda cellerna för deras slutliga positioner. Mäta koordinaten för en punkt vid kanten på dockningsstrukturen som den ursprungliga referenspositionen.
  5. Exportera uppmätta koordinatdata till ett kalkylprogram ( t.ex. Excel). Beräkna migrationsavståndet för cellerna som skillnaden mellan en cells slutliga position och det ursprungliga referensläget längs gradientriktningen.
  6. Kalibrera avståndet till en mikrometer. Beräkna medelvärdet och avvikelsen för migrationsavståndet för alla celler som ett mått på kemotaxi.
  7. Jämför migRationsavstånd i närvaro av en kemoattraktantgradient till mediumkontroll-experimentet med användning av studentens t- test.
  8. Om cellmigreringens tidsfördröjningsbilder registreras kan cellmigrationen och kemotaxen analyseras ytterligare genom cellspårningsanalys 15 .
    OBS! De material som krävs för att konstruera och utföra kemotaxisanalysen på allt-i-chip är detaljerad i materialtabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neutrofiler väljs negativt från en droppe helblod direkt i den mikrofluidiska enheten. Renheten hos de isolerade neutrofilerna verifierades genom on-chip Giemsa-färgning och resultaten visade de typiska ringformade och lobeformade kärnorna av neutrofiler ( Figur 2A ) 25 . Detta indikerar en effektiv neutrofilt isolering på chip vid hög renhet från en liten volym helblod. Vidare kan dockningsstrukturen effektivt placera cellerna intill gradientkanalen före applicering av den kemiska gradienten ( Figur 2B ) 25 .

Gradientgenerering bygger på kontinuerlig laminär flödes kemisk blandning, och flödena drivs av tryckskillnaden från de olika nivåerna av inlopps- och utloppslösningarna. Inga externa pumpar krävs. Den kemiska gradienT är etablerad inom några minuter i den mikrofluidiska anordningen, vilken kännetecknas av fluorescensintensitetsprofilen för FITC-Dextran över gradientkanalen. Gradienten är stabil i minst 1 h, vilket är tillräckligt med tid för det nuvarande neutrofila kemotaxis-experimentet ( Figur 1C ).

För att demonstrera användningen av all-on-chip-metoden för cellmigrationsforskning jämfördes neutrofila kemotaxier i medium ensam eller i en fMLP-gradient. Testresultaten visade att få celler krypade genom barriärkanalen i mediumkontroll-experimentet. Däremot rörde sig många neutrofiler snabbt genom barriärkanalen och migrerade mot 100 nM fMLP-gradienten ( Figur 2B ) 25 . Cellmigrationstestet mäts kvantitativt av migrationsavståndet, vilket är signifikant högre för fMLP-gradienten än mediet kontrollen ( 25 .

Vidare demonstrerades all-on-chip-metoden för potentiella kliniska tillämpningar genom att jämföra neutrofilmigreringen i medium enbart till en gradient av sputumprov från COPD-patienter. Resultaten visade en kraftig cellmigrering till COPD-sputumgradienten, vilket kvantitativt indikeras av det signifikant högre migrationsavståndet jämfört med mediumkontrollen ( Figur 2B- C ) 25 .

Figur 1
Figur 1: Illustration av all-on-chip-metoden för analys av neutrofilt kemotaxi. ( A ) Illustration av den mikrofluidiska enheten. Enheten innehåller två lager. Det första lagret (4 μm högt) definierar cellenL dockningsbarriärkanal för att fälla cellerna bredvid gradientkanalen. Det andra lagret (60 μm högt) definierar gradientgenereringskanalen, porten och kanalen för cellbelastning, kemiska inloppsreservoarerna och avloppsutloppet. Riktmärken är utformade för de två skikten. För det andra lagret är längden och bredden av den uppströms serpentinångskanalen 60 mm respektive 200 | im; Längden och bredden av den nedströms serpentinångskanalen är 6 mm respektive 280 μm; ( B ) Illustration av all-on-chip-cellisoleringsmetoden; ( C ) Illustration av kemotaxistestet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Representativa resultat avAll-on-chip neutrofil kemotaxisanalys 25 . ( A ) Giemsa-färgningsbilden (med användning av ett 60X-objektiv) av de isolerade cellerna på allt-i-chip i mikrofluidkanalen; ( B ) Jämförelse av cellfördelningen i mediumkontrollen, en 100 nM fMLP-gradient och en COPD-sputumgradient; ( C ) Den genomsnittliga cellmigrationsavståndet i gradientkanalen i mediumkontrollen, en fMLP-gradient och en COPD-sputumgradient. Felsökningstavlarna indikerar medelvärdet för medelvärdet (SEM). * Anger p <0,05 från studentens t- test. Figurerna anpassades från referens 25 med tillstånd från World Scientific Publishing. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I detta dokument beskrivs ett detaljerat protokoll för direkt isolering av neutrofiler från helblod följt av kemotaxistestet, allt på ett enda mikrofluidiskt chip. Denna metod erbjuder användbara funktioner i sin lätta operation, negativt urval av neutrofiler med hög renhet, snabbt prov-till-resultat-kemotaxistest, reducerade reagenser och provkonsumtion och exakt cellmigrationsdataanalys. Som en grov uppskattning kom minst 25% av neutrofilerna från det ingående helblodprovet effektivt in i dockningsstrukturen i anordningen och vi fann att neutrofilrenheten är hög med Giemsa-färgning på chip.

Denna utvecklade kemotaxisanalysmetod med allt-på-chip har stor potential i olika cellmigrationsforskning och kliniska tillämpningar. En forskningsapplikation av denna metod demonstrerades genom att jämföra neutrofilkemotaxi i medium ensam till en fMLP-gradient. På samma sätt kan denna metod användas för att testa neutrofilkemotaxi i COPD-spuTum som ett exempel på att utveckla en cellfunktionell biomarkör för klinisk diagnos. Med denna metod kan en forskare enkelt testa neutrofila kemotaxier till olika kemoattraktanter individuellt eller i kombinationer. Forskare kan också testa neutrofilkemotaxi mot komplexa kemotaktiska faktorer från patienter eller testneutrofiler från sjuka patienter för det potentiellt förändrade kemotaxis-svaret med denna metod. Denna integrerade all-on-chip-metod är särskilt användbar för att utföra testet i forskning eller kliniska laboratorier som inte har specialcellscultur och levande cellbildningsanläggningar. Testet kan enkelt hanteras av forskare eller kliniker som följer detta protokoll. För mer avancerade forskningsapplikationer tillåter den här metoden tidsfördröjningsmikroskopi att spåra enskild cellrörelse.

I allmänhet är denna all-on-chip-metod enkel att använda och resultatet är robust. Flera tekniska påminnelser kommer ytterligare att säkerställa ett framgångsrikt experiment. Först, thE PDMS-replik bör försiktigt pressas på klasssubstratet under plasmabinding för att undvika att skada den mycket tunna barriärkanalen. För det andra kan förångningen av mediet i celllastningsporten störa den kemiska gradienten. Det rekommenderas att täcka celllastningsporten med en tätningsflik under kemotaxistestet. För det tredje bör blodprovet försiktigt laddas på enheten för att undvika högt tryck som kan trycka cellerna över barriärkanalen före kemotaxis-experimentet. För det fjärde, i den nuvarande inställningen rekommenderar vi att magneterna fästs vid celllastningsporten under kemotaxis-analysen för att förhindra att oönskade celler kommer in i kanalen. Alternativt kan ett separat stycke PDMS med ett genomgående hål och de magnetiska skivorna som är fästa vara inriktade på anordningens laddningsport. I detta fall kan den övre PDMS-delen med magnetdiskarna och de instängda cellerna avlägsnas från anordningen efter cellisolering.

Detta allt-på-chIp-metoden kan vidareutvecklas för att övervinna de nuvarande begränsningarna och förbättra och utöka dess funktionaliteter. För det första tillåter den nuvarande anordningen endast en enda analys i taget och begränsar således genomströmningen. Vidareutveckling av anordningen med flera parallella testenheter förbättrar kravet på experimentell genomströmning. För det andra begränsar den nuvarande flödesbaserade kemiska gradientgeneratorn gradientgenerering i 1D. Ytterligare utveckling av 2D- eller 3D-flödesfria gradientgeneratorer kommer bättre att efterlikna de fysiologiska gradientbetingelserna. För det tredje, förutom neutrofiler, kan denna all-on-chip-metod i princip användas för att testa andra vita blodkroppstyper, såsom T-celler, B-celler och NK-celler med användning av liknande magnetcellsisoleringssatser. Det kommer att vara viktigt att studera om denna metod effektivt kan användas för att testa blodcellspopulationer vid lägre frekvens och de celler som kräver aktivering och kultivering på chip före kemotaxistestet. Sedan är all-on-chip-cellisoleringsmetoden caN förlängas vidare för några andra tillämpningar. Olika barriärkanaltjocklek testades och resultaten visade att 3-4 pm är mest lämpliga för neutrofilmigreringsexperimentet; Det vill säga att den fängslade tillräckligt de ostimulerade cellerna och tillät cellerna att krypa igenom barriärkanalen vid stimulering. Barriärkanalens dimension bör optimeras för olika celltyper. Slutligen kommer detta integrerade och snabba kemotaxistest att tillåta forskare att utforska relevanta kliniska tillämpningar. För att möjliggöra praktisk testning i kliniker har ett bärbart system utvecklats som integrerar mikrofluidisk enhet, temperatur och scenkontroll, samt smartphone-baserade optiska bild- och dataanalysmoduler. Förutom den KOL-relaterade studien, som visas i detta dokument, testas cellmigrationen för andra relevanta sjukdomar som kronisk njursjukdom med hjälp av denna all-on-chip-metod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av bidrag från Canadian Science and Engineering Research Council (NSERC) och de kanadensiska instituten för hälsoforskning (CIHR). Vi tackar det kliniska institutet för tillämpad forskning och utbildning vid Victoria General Hospital i Winnipeg och Seven Oaks General Hospital i Winnipeg för att hantera kliniska prover från mänskliga ämnen. Vi tackar Dr. Hagit Peretz-Soroka för en bra diskussion om analysoperationsstrategierna. Vi tackar professor Carolyn Ren och Dr. Xiaoming (Cody) Chen från University of Waterloo för deras generösa stöd i filmprocessen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)
Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)
Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich
R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit
STEMCELL
Technologies Inc
19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6, (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43, (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3, (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11, (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210, (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139, (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23, (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13, (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2, (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6, (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33, (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2, (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9, (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5, (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10, (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8, (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100, (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111, (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04, (02), 104-109 (2016).
En allt-på-chip-metod för snabb neutrofilkemotaxisanalys direkt från en bloddroppe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter