Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Un metodo integrato per l'analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Questo articolo fornisce il metodo dettagliato per eseguire un rapido dosaggio della chemotaxis neutrofile integrando l'isolamento neutrofilo a circuito integrato dal sangue intero e il test di chemotaxis su un singolo chip microfluidico.

Abstract

La migrazione di neutrofili e la chemiotassi sono fondamentali per il sistema immunitario del nostro corpo. I dispositivi microfluidici sono sempre più utilizzati per indagare la migrazione dei neutrofili e la chemiotassi a causa dei loro vantaggi nella visualizzazione in tempo reale, controllo preciso della generazione di gradiente di concentrazione chimica e riduzione del reagente e del consumo di campioni. Recentemente, i ricercatori microfluidici hanno intrapreso uno sforzo crescente verso lo sviluppo di sistemi di analisi chimotassi microfluidici integrati e facili da usare, direttamente dal sangue intero. In questa direzione, è stato sviluppato il primo metodo integrale per integrare la purificazione neutra magnetica dei neutrofili e il test di chemotaxis da campioni di piccole quantità di sangue. Questo nuovo metodo consente una rapida prova chimotassi neutrofila del campione per risultato in 25 min. In questo documento, forniamo metodi dettagliati per la costruzione, l'operazione e l'analisi dei dati per questo test di chimotaxis a chip completo con una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, limiLe direzioni future. Sono mostrati i risultati rappresentativi del test di neutotossido neutrofile che hanno dimostrato un esperto di chemoattractant, N -Formil-Met-Leu-Phe (fMLP) e l'espettorato di un paziente con malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) utilizzando questo metodo su tutti i chip. Questo metodo è applicabile a molte ricerche correlate alla migrazione cellulare e alle applicazioni cliniche.

Introduction

Chemotaxis, un processo di migrazione diretta delle cellule a gradiente di concentrazione chimica solubile, è criticamente coinvolto in molti processi biologici, tra cui la risposta immunitaria 1 , 2 , 3 , lo sviluppo del tessuto 4 e la metastasi del cancro 5 . Neutrofili sono il più ricco sottocategoria delle cellule del sangue bianco e svolgono un ruolo cruciale nel permettere le funzioni di difesa innata dell'organismo del corpo, nonché nel mediare le risposte immunitarie adattative 6 , 7 . Neutrofili sono dotati di macchine chemotattiche altamente regolamentate che consentono a queste cellule immunitarie motile di rispondere sia a chemoattractants derivanti da patogeni ( ad es. FMLP) che ai chemoattractants derivanti da host ( ad esempio, interleukin-8) throughchemotaxis 8 . La migrazione di neutrofili e la chemiotassi mediano vari problemi fisiologiciE malattie come infiammazione e tumori 1 , 9 . Pertanto, la valutazione accurata della chemotaxide dei neutrofili fornisce una lettura funzionale importante per lo studio della biologia dei neutrofili e delle malattie associate.

Rispetto ai campioni di chimotaxis tradizionali ( es. Test di transwell 10 ), i dispositivi microfluidici mostrano grande promessa per la valutazione quantitativa della migrazione cellulare e della chemiotassi a causa della generazione chimica precisa e della miniaturizzazione dei gradienti 11 , 12 e 13 . Negli ultimi due decenni o giù di lì, sono stati sviluppati diversi dispositivi microfluidici per studiare la chemotaxia di diversi tipi di cellule biologiche, in particolare neutrofili 11 . Uno sforzo significativo è stato dedicato a caratterizzare la migrazione di neutrofili in un complesso spatiotemporalmente complesso Gradienti micali configurati nei dispositivi microfluidici 14 , 15 . Sono state sviluppate anche strategie interessanti per studiare decisioni direzionali da parte dei neutrofili usando i dispositivi microfluidici 16. All'interno della ricerca biologica, le applicazioni dei dispositivi microfluidici sono state estese per testare campioni clinici per la valutazione delle malattie 17 , 18 e 19 . Tuttavia, l'uso di molti dispositivi microfluidici è limitato a laboratori di ricerca specializzati e richiede un lungo isolamento dei neutrofili da un ampio volume di campioni di sangue. Pertanto, vi è stato un trend crescente di sviluppo di dispositivi microfluidici integrati per l'analisi rapida della chimotassi neutrofila direttamente da una goccia di sangue intero 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Verso questa direzione, è stato sviluppato un metodo integrale che integra la depurazione neutrofila negativa magnetica e il successivo dosaggio della chemotaxis su un unico dispositivo microfluidico 25 . Questo metodo a tutto vantaggio del chip ha le seguenti caratteristiche: 1) in contrasto con le strategie precedenti su chip che isolano neutrofili dal sangue mediante bloccaggio delle cellule adesione o filtri basati sulla dimensione cellulare 20 , 22 , questo nuovo metodo consente elevati La purezza, la separazione magnetica su chip dei neutrofili da piccoli volumi di sangue intero, nonché la misurazione della chemotaxia sulla stimolazione del chemoattractant; 2) la struttura di ancoraggio delle cellule aiuta a allineare le posizioni iniziali dei neutrofili vicino al canale di gradiente chimico e consente un'analisi semplice di chemiotassi senza tracciamento di singole celle; 3) l'integrazione dell'isolamento neutrofilo e del chemotL'analisi dell'asse su un unico dispositivo microfluidico consente un'analisi rapida del chimotassi da campione a risultato in 25 minuti quando non vi è interruzione tra i passaggi sperimentali.

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione, l'operazione e il metodo di analisi dei dati di questo test di chimotassi su tutti i chip. La carta dimostra l'efficace utilizzo del metodo sviluppato per l'esecuzione della chemotaxide dei neutrofili mediante la sperimentazione di un esperto chemoattractant ricombinante e campioni chemotattici complessi dai pazienti, seguito da una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, le limitazioni e le direzioni future.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutti i protocolli per la raccolta di campioni umani sono stati approvati dal Board of Ethics per la Ricerca congiunta presso l'Università di Manitoba, Winnipeg.

1. Fabbricazione del dispositivo microfluidico ( Figura 1A )

  1. Maschera di trasparenza di progettazione e stampa.
    1. Disegnare il dispositivo come descritto in precedenza 25 . Vedere la Figura 1A .
      NOTA: Il dispositivo include due livelli. Il primo strato (alto 4 μm) definisce il canale della barriera di ancoraggio cellulare per intrappolare le cellule accanto al canale di gradiente. Il secondo strato (alto 60 μm) definisce il canale di generazione del gradiente, la porta e il canale per il caricamento delle celle, i serbatoi di ingresso chimico e la presa di scarico. I segni di allineamento sono progettati per i due strati. Per il secondo strato, la lunghezza e la larghezza del canale d'ingresso serpentino a monte sono rispettivamente di 60 mm e 200 μm; La lunghezza e la larghezza della valleIl canale di ingresso serpentino è rispettivamente di 6 mm e 280 μm.
    2. Stampare le funzioni di primo e secondo livello a una maschera di trasparenza utilizzando una stampante ad alta risoluzione.
      NOTA: la risoluzione di stampa dipende dalle caratteristiche minime del disegno. Nell'attuale disegno, 32.000 dpi è stato scelto per la funzionalità minima di 10 μm.
  2. Pulire il wafer di silicio.
    1. Mettere un wafer in silicone da 3 pollici nel pulitore al plasma. Applicare vuoto per 3 min.
    2. Accendere la potenza del plasma e impostare il livello su HIGH. Utilizzare il plasma ad ossigeno per trattare il wafer di silicio per 30 min.
    3. Spegnere il pulitore del plasma e togliere il wafer di silicio; Il wafer di silicio è pronto per la fabbricazione dello stampo del dispositivo.
  3. Fabbricare il primo strato con fotolitografia in un impianto di stanza pulita.
    NOTA: i parametri di fabbricazione esatti possono variare a seconda della struttura di fabbricazione.
    1. Diluire 10 mL SU-8 2025 con 10 mL SU-8 2000 in un interruttore di vetro per preparare il fotoresist progettato. Lasciare la miscela nel cappuccio per 10 minuti fino a scomparire le bolle.
    2. Posizionare con cautela il wafer di silicio pulito sul filatore con l'apposito mandrino e applicare il vuoto per immobilizzare il wafer di silicio.
    3. Spalmare con cautela 3 ml della miscela fotoresistiva al centro del wafer di silicio. Spin a 500 rpm per 5 s. Poi ruotare a 3.000 giri / min per 30 s per ottenere un rivestimento fotoresistivo di spessore finale di 4 μm sul wafer di silicio.
    4. Rimuovere con cautela il wafer di silicio dal filatore e cuocere la cialda di silicio su una piastra per 4 minuti a 95 ° C.
    5. Posizionare con cautela il wafer di silicio su un allineatore di maschera e impostare il tempo di esposizione UV a 6 s. Attaccare con cautela la maschera trasparente del primo strato su una lastra di vetro trasparente con nastro adesivo.
    6. Posizionare delicatamente la lastra di vetro trasparente con la maschera allegata all'allineatore e allineare la maschera con il wafer di silicio. Esporre il siWafer wafer al UV per modellare la struttura di docking cellulare.
    7. Rimuovere con cautela la lastra di vetro e togliere il wafer di silicio esposto. Cuocere la cialda di silicio su una piastra per 4 minuti a 95 ° C.
    8. Trasferire il wafer di silicio ad un cappuccio e collocarlo in una padella contenente lo sviluppatore SU-8. Scuotere delicatamente questo per 30 s.
    9. Pulire la cialda di silicio usando lo sviluppatore SU-8 fresco seguito da alcool isopropilico (IPA) all'interno della cappa aspirante. Asciugare il wafer di silicio con il gas di azoto all'interno del cappuccio; Il primo strato è pronto.
  4. Fabbricare il secondo strato sul primo strato.
    1. Utilizzare nastro adesivo per coprire i segni di allineamento sul primo strato. Posizionare con cautela il wafer di silicio con il primo strato sul mandrino a vuoto del filatore e applicare il vuoto per immobilizzare il wafer di silicio.
    2. Versare 3 mL di fotoresistore SU-8 2025 sul wafer di silicio. Spin la fetta di silicio a 500 rpm per 5 s. Poi ruotare a 2000 giri / min per 30S per ottenere un finale di 60 μm di spessore del fotoresist sul wafer di silicio.
    3. Rimuovere con cautela il wafer di silicio dal filatore e trasferirlo in una piastra di cottura; Cuocere a 65 ° C per 2 min.
    4. Rimuovere delicatamente il nastro adesivo per esporre i contrassegni di allineamento sul primo strato. Mettere il wafer di silicio su una piastra di cottura e cuocere a 95 ° C per 6 minuti.
    5. Posizionare con cautela il wafer di silicio su un allineatore di maschera e impostare il tempo di esposizione UV a 18 s.
    6. Attaccare con cautela la maschera trasparente del secondo strato su una lastra di vetro trasparente con nastro adesivo.
    7. Posizionare con cura la lastra di vetro con la maschera allegata all'allineatore e allineare la maschera e il primo strato sul wafer di silicio dai contrassegni di allineamento utilizzando il microscopio di ispezione dell'allineatore.
    8. Esporre il wafer di silicio rivestito con fotoresist a UV per modellare i canali di caricamento e canale di gradiente.
    9. Rimuovere con cautela la lastra di vetro e togliere il silicio wafer. Cuocere il wafer di silicio su una piastra a 65 ° C per 2 minuti e trasferire il wafer di silicio ad un'altra piastra calda di 95 ° C e cuocere per 6 minuti.
    10. Trasferire il wafer di silicio alla cappa e metterlo in una padella contenente lo sviluppatore SU-8. Scuotere delicatamente questo per 6 min.
    11. Pulire la fetta di silicio usando lo sviluppatore SU-8 fresco seguito da IPA all'interno della cappa.
    12. Asciugare il wafer di silicio usando gas di azoto all'interno della cappa di fumo. Posizionare il wafer di silicio su una piastra di cottura e cuocere a forno il muffa a 150 ° C per 30 minuti; Il secondo livello è pronto.
  5. Modifica della superficie della muffa.
    NOTA: Una fase di modifica della superficie di silanizzazione viene applicata allo stampo SU-8 per facilitare lo rilascio di polidimetilsilossano (PDMS) dallo stampo in soft litografia.
    1. Prendere 10 μl di soluzione di tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroctil (trichlorosilano) in una punta di micropipetta. Mettere la punta della micropipetta in un tubo di plastica da 15 ml aLo allentare il tappo del tubo.
    2. Posizionare il tubo e il wafer di silicio modellato SU-8 all'interno di un essiccatore e applicare il vuoto per 1 h; Lo stampo per maschere è pronto per la fabbricazione del dispositivo PDMS.
  6. Fabbricare il dispositivo PDMS.
    1. Preparare la soluzione PDMS mescolando 40 g di base PDMS e 4 g di agente di tintura in un bicchiere di plastica. Posizionare lo stampo masterizzato SU-8 in un piatto di Petri e versare accuratamente 44 g di soluzione PDMS sulla muffa.
    2. Posizionare il piatto di Petri in un essiccatore e applicare il vuoto per degas la soluzione PDMS per 20 minuti. Quindi posizionare il piatto di Petri in un forno e curare il PDMS a 80 ° C per 2 ore.
    3. Dopo la cottura, togliere il piatto di Petri e metterlo su una panca pulita. Tagliare con cura e scollegare la lastra PDMS dallo stampo SU-8.
    4. Estrarre la porta di carico della cella usando un puncher di diametro di 3 mm. Estrarre i serbatoi di raccolta chimica e la presa di scarico utilizzando un punzone di diametro di 6 mm.
    5. Rimuovere la polvere sullaSuperficie della lastra PDMS con nastro adesivo. Posizionare la lastra PDMS e una lastra di vetro pulita nella macchina al plasma. Applicare il vuoto per 3 minuti.
    6. Accendere la potenza del plasma e impostare il livello su HIGH. Regolare delicatamente la valvola d'aria e plasmatreat la lastra PDMS e la lastra di vetro per 3 min.
    7. Spegnere il plasma e rilasciare il vuoto. Estrarre attentamente la lastra PDMS e il vetrino in vetro utilizzando le pinzette.
    8. Posizionare immediatamente la lastra PDMS (con strutture di canale a faccia in giù) in cima alla vetrata; Premere delicatamente la lastra PDMS per legare al vetro. Riempire subito il canale microfluidico con acqua deionizzata; La fabbricazione e l'assemblaggio del dispositivo microfluidico sono completati.

2. Preparazione del saggio di migrazione microfluidica cellulare

  1. Preparazione del dispositivo microfluidico.
    1. Preparare una soluzione di fibronectina da 50 μg / mL diluendo 50 μL di soluzione di fibronectina di riserva (1 mg / ml) a 95081; L Dulbecco's fosfato-tamponato salina (DPBS) all'interno di un armadio di biosicurezza.
    2. Preparare il mezzo di migrazione mescolando 9 ml di media Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e 1 ml di RPMI-1640 con 4% di albumina bovina del siero (BSA).
    3. Rimuovere l'acqua deionizzata dal dispositivo.
    4. Aggiungere 100 μL di soluzione fibronectina al dispositivo dalla presa. Attendere 3 min per assicurare che tutti i canali siano riempiti di soluzione fibronectina. Mettere il dispositivo microfluidico in un piatto di Petri coperto per 1 h a temperatura ambiente.
    5. Rimuovere la soluzione fibronectina dal dispositivo. Aggiungere 100 μL di media di migrazione dalla presa. Attendere 3 min per assicurarsi che tutti i canali siano pieni di supporto di migrazione.
    6. Incubare il dispositivo per altri 1 h a temperatura ambiente; Il dispositivo è quindi pronto per l'esperimento di chemotaxis.
  2. Preparazione della soluzione di chemoattractant per l'esperimento di chemotaxis.
    1. Preparare la soluzione fMLP da 100 nM in t1 ml di media di migrazione. Mescolare 5 μL di FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) con la soluzione fMLP in un tubo da 1,5 ml.
      NOTA: FITC-Dextran viene utilizzato per la misurazione del gradiente. In alternativa, utilizzare Rhodamine come indicatore di gradiente. La soluzione chemoattractant di fMLP è quindi pronta per l'esperimento di chemotaxis.
  3. Preparazione del campione di sputum.
    NOTA: La chimotassi neutrofila indotta da un gradiente di campioni di sputum provenienti da pazienti affetti da BPCO è stata testata come un'applicazione diagnostica clinica di questo metodo completo su chip.
    1. Ottenere un protocollo di etica umana per raccogliere campioni di espettorato dai pazienti con BPCO.
      NOTA: Abbiamo ottenuto le approvazioni per raccogliere campioni presso il Seven Oaks General Hospital di Winnipeg (approvato dall'Università di Manitoba).
    2. Ottieni i moduli informativi di consenso scritti da tutti i soggetti.
    3. Raccogli i campioni spontanei dello spiedo dei pazienti con BPCO. Posizionare 500 μl di campione di sputo in un tubo da 1,5 ml.
    4. Aggiungere 500 μL di 0,1% diTiotreitolo nel tubo da 1,5 ml e mescolare delicatamente. Mettere il tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 minuti.
    5. Centrifugare il campione a 753 xg per 10 minuti e quindi raccogliere il surnatante. Centrifugare il supernatante a 865 xg per 5 minuti e quindi raccogliere il supernatante finale. Conservare il supernatante raccolto all'interno di un congelatore da -80 ° C prima dell'uso.
    6. Quando è pronto per l'esperimento di chimotassi, scongelare la soluzione di espettorato; Trasferire il campione di migrazione di 900 μL in un tubo da 1,5 ml e mescolare con 100 μl di sputtino all'interno di un armadio di biosicurezza; La soluzione per l'espettorato è quindi pronta per l'esperimento della chimotassi.
  4. Raccolta di campioni di sangue.
    1. Ottenere un protocollo etico umano per raccogliere campioni di sangue da donatori sani. Ottieni i moduli informativi di consenso scritti da tutti i donatori di sangue.
      NOTA: qui i campioni sono stati ottenuti presso l'Ospedale Generale Victoria di Winnipeg (approvato dal Joint Board-Ethics Board all'Università di Manitoba).
    2. Raccogliere il campione di sangue per venipuncture e mettere il campione in un tubo rivestito con EDTA. Tenere il tubo in un armadio di biosicurezza prima dell'esperimento.

3. Operazione di analisi chimotassi su chip completa

  1. Isolamento delle celle su chip ( figura 1B ).
    1. Mettere 10 μL di sangue intero in un tubo da 1,5 ml all'interno di un armadio di biosicurezza.
      NOTA: i dettagli della raccolta dei campioni di sangue sono riportati nella sezione 2.4.
    2. Aggiungere 2 μL di anticorpi (Ab) e 2 μL di particelle magnetiche (MP) dal kit di isolamento dei neutrofili (vedere tabella dei materiali) nel tubo da 1,5 ml e mescolare delicatamente; Questo etichetta le cellule nel sangue tranne i neutrofili.
    3. Incubare la miscela sangue-Ab-MP per 5 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Questo taglierà magneticamente le cellule contrassegnate con anticorpi nel sangue.
    4. Collegare due piccoli dischi magnetici ai due lati del caricamento della cella pOrt del dispositivo. Aspirare il supporto da tutte le porte del dispositivo.
    5. Lentamente pipettare 2 μL di sangue-Ab-MP miscela nel dispositivo microfluidico dalla porta di carico della cella.
      NOTA: le celle con etichetta magnetica sono intrappolate alle pareti laterali della porta di caricamento delle celle mentre i neutrofili entreranno nel dispositivo e saranno intrappolati nella struttura di ancoraggio delle celle.
    6. Attendere qualche minuto fino a quando i neutrofili abbastanza sono intrappolati nell'area di ancoraggio della cella.
  2. Analisi chimotaxis ( Figura 1C ).
    1. Posizionare il dispositivo microfluidico sulla fase a microscopio a temperatura controllata a 37 ° C.
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione di chemoattractant (fMLP o soluzione di espettorato) e 100 μL di mezzi di migrazione ai loro serbatoi d'ingresso designati utilizzando due pipettatori; Questo genera un gradiente chemoattrattante nel canale di gradiente mediante miscela chimica continua a flusso laminare assistita da un pressurStruttura di equilibratura.
      NOTA: i dettagli della raccolta dello sputo da pazienti con BPCO sono riportati nella sezione 2.3.
      1. Per l'esperimento di controllo medio, aggiungere solo il mezzo di migrazione a entrambi i serbatoi d'ingresso.
    3. Acquisire l'immagine di fluorescenza di FITC-Dextran nel canale di gradiente.
    4. Importare l'immagine al software ImageJ utilizzando il comando "File | Apri".
    5. Misurare il profilo di intensità della fluorescenza attraverso il canale di gradiente utilizzando il comando "Analizza | Profilo di trama".
    6. Esportare i dati di misurazione in un foglio di calcolo per ulteriori tracciamenti.
    7. Incubare il dispositivo sul microscopio a temperatura controllata o in un incubatore di coltura convenzionale per 15 minuti.
    8. Immagine il canale di gradiente utilizzando un obiettivo 10x per registrare le posizioni finali delle celle per l'analisi dei dati.
    9. Se necessario, registrare la migrazione della cella nel dispositivo tramite la microscopia a tempo intervallato.

4. Migrazione cellulare DAnalisi dei dati ( figura 1C )

  1. Analizzare il test di chemotaxis calcolando la distanza di migrazione cellulare dalla struttura di docking come descritto di seguito. Vedere la Figura 1C .
  2. Importa l'immagine nel software NIH ImageJ (versione 1.45).
  3. Seleziona il centro di ogni cella che si è spostata nel canale di gradiente.
  4. Misura le coordinate delle celle selezionate per le posizioni finali. Misurare la coordinata di un punto sul bordo della struttura di ancoraggio come posizione di riferimento iniziale.
  5. Esportare i dati di coordinate misurati in un software di fogli di calcolo ( es. Excel). Calcolare la distanza di migrazione delle cellule come la differenza tra la posizione finale di una cellula e la posizione di riferimento iniziale lungo la direzione del gradiente.
  6. Calibrare la distanza di un micrometro. Calcolare la media e la deviazione della distanza di migrazione di tutte le cellule come misura della chemotaxis.
  7. Confronta la migDistanza in presenza di un gradiente chemoattrattante all'esperimento di controllo medio usando la t- test di Student.
  8. Se vengono registrate le immagini di migrazione della cella, la migrazione delle cellule e la chemiotassi possono essere ulteriormente analizzate mediante l'analisi di tracciamento delle cellule 15 .
    NOTA: I materiali necessari per la costruzione e l'esecuzione del test di chimotaxis su chip sono dettagliati nella tabella dei materiali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neutrofili sono selezionati negativamente da una goccia di sangue intero direttamente nel dispositivo microfluidico. La purezza dei neutrofili isolati è stata verificata con la colorazione Giemsa su chip e i risultati mostrarono i nuclei tipici a forma di anello e a forma di lobo di neutrofili ( Figura 2A ) 25 . Ciò indica un efficace isolamento neutrofilo a chip in alta purezza da un piccolo volume di sangue intero. Inoltre, la struttura di ancoraggio può effettivamente allineare le cellule accanto al canale di gradiente prima di applicare il gradiente chimico ( figura 2B ) 25 .

La generazione di gradiente si basa sulla miscelazione chimica a flusso laminare continua ei flussi vengono guidati dalla differenza di pressione dai diversi livelli delle soluzioni di ingresso e uscita. Non sono necessarie pompe esterne. La gradita chimicaT si stabilisce entro pochi minuti nel dispositivo microfluidico, caratterizzato dal profilo di intensità della fluorescenza di FITC-Dextran attraverso il canale di gradiente. Il gradiente è stabile per almeno 1 h, che è tempo sufficiente per l'esperimento di chemotaxia neutrofile corrente ( Figura 1C ).

Per dimostrare l'utilizzo del metodo completo per la ricerca di migrazione cellulare, è stata confrontata la chemotaxide neutrofila in mezzo solo o in un gradiente fMLP. I risultati della prova hanno mostrato che alcune cellule sono state scansionate attraverso il canale barriera nell'esperimento di controllo medio. Al contrario, molti neutrofili si muovevano rapidamente attraverso il canale barriera e migrarono verso il gradiente fMLP di 100 nM ( Figura 2B ) 25 . Il test di migrazione cellulare viene misurato quantitativamente dalla distanza di migrazione, che è significativamente più elevata per il gradiente fMLP rispetto al controllo medio ( 25 .

Inoltre, è stato dimostrato il metodo completo su chip per potenziali applicazioni cliniche confrontando la migrazione di neutrofili in mezzo solo a un gradiente di campione di sputum da pazienti con BPCO. I risultati hanno mostrato una forte migrazione delle cellule al gradiente dello sputum da COPD, indicato quantitativamente dalla distanza di migrazione significativamente maggiore rispetto al controllo medio ( Figura 2B - C ) 25 .

Figura 1
Figura 1: Illustrazione del metodo integrato per l'analisi della chimotassi neutrofila. ( A ) Illustrazione del dispositivo microfluidico. Il dispositivo include due strati. Il primo strato (alto 4 μm) definisce il celL canale di barriera di ancoraggio per bloccare le celle accanto al canale di gradiente. Il secondo strato (60 μm di altezza) definisce il canale di generazione del gradiente, la porta e il canale per il caricamento delle celle, i serbatoi di ingresso chimico e la presa di scarico. I segni di allineamento sono progettati per i due strati. Per il secondo strato, la lunghezza e la larghezza del canale d'ingresso serpentino a monte sono rispettivamente di 60 mm e 200 μm; La lunghezza e la larghezza del canale d'ingresso serpentino a valle rispettivamente di 6 mm e 280 μm; ( B ) Illustrazione del metodo di isolamento delle cellule a circuito integrato; ( C ) Illustrazione della prova di chemotaxis. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Risultati rappresentativi diL'analisi chimotassi neutrofila a circuito integrato 25 . ( A ) l'immagine di colorazione di Giemsa (utilizzando un obiettivo di 60X) delle cellule isolate sul chip nel canale microfluidico; ( B ) confronto della distribuzione cellulare nel controllo medio, un gradiente fMLP di 100 nM e un gradiente di espettorato di COPD; ( C ) La distanza media di migrazione delle cellule nel canale di gradiente nel controllo medio, un gradiente fMLP e un gradiente di sputum di COPD. Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). * Indica p <0,05 dal test t dello Studente. Le cifre sono state adattate dal riferimento 25 con l'autorizzazione di World Scientific Publishing. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo articolo, è stato descritto un protocollo dettagliato per isolare direttamente neutrofili dal sangue intero seguito dal test di chemotaxis, tutti su un singolo chip microfluidico. Questo metodo offre funzionalità utili nel suo facile utilizzo, selezione negativa di neutrofili ad alta purezza, test rapido di chimotaxis da campione a risultato, reagenti ridotti e consumo di campioni e analisi accurate di dati di migrazione delle cellule. Come una stima approssimativa, almeno il 25% dei neutrofili dal campione di sangue intero di input è entrato efficace nella struttura di ancoraggio nel dispositivo e abbiamo scoperto che la purezza della neutrofila è alta con la colorazione Giemsa su chip.

Questo metodo di analisi chemotaxico basato su chip ha un grande potenziale nelle varie ricerche di migrazione cellulare e nelle applicazioni cliniche. Un'applicazione di ricerca di questo metodo è stata dimostrata confrontando la chemiotassi neutrofila in mezzo a un gradiente fMLP. Allo stesso modo, questo metodo può essere usato per testare la chimotassi neutrofila in COPD spuUn esempio di sviluppo di un biomarker funzionale cellulare per la diagnosi clinica. Con questo metodo, un ricercatore può testare facilmente la chemiotassi neutrofile a diversi chemoattractants singolarmente o in combinazioni. I ricercatori possono anche testare la chemotaxa dei neutrofili a fattori chemotattici complessi da parte dei pazienti oa testare i neutrofili da pazienti affetti da malati per la risposta chimotassiale potenzialmente alterata utilizzando questo metodo. Questo metodo integrato integrato è particolarmente utile per eseguire il test in laboratori di ricerca o clinici che non dispongono di colture cellulari specializzate e impianti di imaging a cellule vive. Il test può essere facilmente gestito da ricercatori o clinici seguendo questo protocollo. Per applicazioni di ricerca più avanzate, questo metodo consente una microscopia a tempo trascorso per tenere traccia di un movimento cellulare singolo.

In generale, questo metodo completo su chip è facile da usare e il risultato è robusto. Diversi promemoria tecnici garantiranno ulteriormente un esperimento di successo. In primo luogo, thLa replica di PDMS deve essere premuta delicatamente sul substrato di classe durante l'adesione al plasma per evitare di danneggiare il canale di barriera molto sottile. In secondo luogo, l'evaporazione del mezzo nella porta di carico della cella può disturbare il gradiente chimico. Si raccomanda di coprire la porta di caricamento della cella con una linguetta di tenuta durante il test di chemotaxis. In terzo luogo, il campione di sangue dovrebbe essere caricato delicatamente sul dispositivo per evitare l'alta pressione che può spingere le cellule sopra il canale di barriera prima dell'esperimento di chemotaxis. Quarto, nell'impostazione corrente, si consiglia di mantenere i magneti collegati alla porta di caricamento delle celle durante il test di chemotaxis per evitare che le cellule indesiderate entrino nel canale. In alternativa, un pezzo separato di PDMS con foro passante e dischi magnetici collegati può essere allineato alla porta di caricamento della cella del dispositivo. In questo caso, la parte superiore PDMS con i dischi magnetici e le celle intrappolate può essere rimossa dal dispositivo dopo l'isolamento cellulare.

Questo all-on-chIp può essere ulteriormente sviluppato per superare le sue limitazioni attuali e migliorare e ampliare le sue funzionalità. In primo luogo, l'attuale dispositivo consente solo un singolo dosaggio alla volta, limitando così il throughput. L'ulteriore sviluppo del dispositivo con più unità di test parallele migliorerà il requisito di throughput sperimentale. In secondo luogo, l'attuale generatore di gradiente chimico a flusso limita la generazione di gradienti in 1D. Un ulteriore sviluppo di generatori di gradiente a flusso privo di 2D o 3D meglio imiterebbe le condizioni di gradiente fisiologico. In terzo luogo, in aggiunta ai neutrofili, questo principio può essere utilizzato per testare altri tipi di cellule bianche come le cellule T, le cellule B e le cellule NK usando simili kit di isolamento delle cellule magnetiche. Sarà importante studiare se questo metodo può essere efficacemente utilizzato per testare le popolazioni di cellule del sangue a frequenza più bassa e quelle cellule che richiedono l'attivazione e la cultura su chip prima della prova di chemotaxis. Quindi il metodo di isolamento delle cellule tutto-a-cca caN essere ulteriormente esteso per altre applicazioni. Sono stati testati diversi spessori del canale barriera e i risultati hanno mostrato che 3-4 μm è più adatto per l'esperimento di migrazione dei neutrofili; Cioè abbastanza intrappolato le cellule non stimolate e ha permesso alle cellule di strisciare attraverso il canale barriera dopo la stimolazione. La dimensione del canale barriera dovrebbe essere ottimizzata per diversi tipi di celle. Infine, questo test di chimotassi integrato e rapido consentirà ai ricercatori di esplorare le applicazioni cliniche rilevanti. Per consentire prove pratiche in cliniche, è stato sviluppato un sistema portatile che integra il dispositivo microfluidico, la temperatura e il controllo di fase, nonché moduli ottici e di analisi dati per l'imaging ottico. Oltre allo studio relativo alla BPCO come dimostrato in questo documento, la migrazione cellulare per altre malattie rilevanti come la malattia renale cronica viene sottoposta a test utilizzando questo metodo completo su chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è in parte sostenuto da sovvenzioni del Consiglio scientifico delle scienze naturali e ingegneria del Canada (NSERC) e dell'Istituto canadese di ricerca sulla salute (CIHR). Ringraziamo l'Istituto Clinico per la Ricerca Applicata e l'Educazione presso l'Ospedale Generale Victoria di Winnipeg e il Sette Oaks General Hospital di Winnipeg per la gestione di campioni clinici da soggetti umani. Ringraziamo il dottor Hagit Peretz-Soroka per una utile discussione sulle strategie di funzionamento del dosaggio. Ringraziamo il professor Carolyn Ren e il dottor Xiaoming (Cody) Chen dell'università di Waterloo per il loro generoso sostegno nel processo di ripresa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

Tags

Immunologia Numero 124 Microfluidico chip neutrofilo isolamento cellulare chemotaxis sangue microfluidici
Un metodo integrato per l&#39;analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y.,… More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter