Summary
Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.
Abstract
De ratinho de células estaminais embrionárias (CES) isolados a partir da massa interna do blastocisto (tipicamente no dia E3.5), pode ser utilizado como sistema modelo in vitro para estudar o desenvolvimento embrionário precoce. Na ausência de factor inibidor de leucemia (LIF), CES diferenciar pelo padrão para as células precursoras neurais. Eles podem ser acumulados num tridimensional (3D) agregado esférico denominado corpo embrióides (EB), devido à sua semelhança com o embrião em fase precoce. EBs podem ser semeadas em lamelas revestidas com fibronectina, onde eles se expandem através do crescimento duas extensões dimensionais (2D), ou implantado em matrizes de colagénio 3D, onde eles continuar a crescer como esferóides, e diferenciam-se em três camadas germinais: endoderme, mesoderme, e ectodérmica. A cultura de colagénio 3D imita o ambiente in vivo mais perto do que a EB 2D. A cultura 2D EB facilita a análise por imunofluorescência e imunotransferência para controlar a diferenciação. Nós desenvolvemos uma diferenciação neural de duas etapasprotocolo ção. No primeiro passo, EBs são gerados pela técnica de suspensão-gota, e, simultaneamente, são induzidos a diferenciar por exposição ao ácido retinóico (RA). No segundo passo, os rendimentos de diferenciação de células neurais em formato 2D ou 3D, na ausência de RA.
Introduction
CES originam a partir da massa celular interior de blastocistos. Estas células são pluripotentes, isto é, têm a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de células do organismo de origem. CES diferenciação in vitro é de grande interesse como um sistema experimental para a investigação de vias e de mecanismos de desenvolvimento. Dispõe de um sistema modelo potente e flexível para testar novas abordagens terapêuticas para a correcção da disfunção de células e tecidos. EBs recapitular diversos aspectos da diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário precoce. Em particular, a EBS pode ser utilizado quando a letalidade embrionária torna difícil determinar a base celular dos defeitos embrionárias 1, 2. EBs pode ser formada quer por as gotas de suspensão ou técnicas de suspensão líquidos 3. A vantagem da primeira é a capacidade de gerar EBs de tamanho e densidade consistente, facilitando assim a reprodutibilidade experimental.
4.
RA é um metabolito lipófilo pequeno de vitamina A que induz a diferenciação neuronal 5, 6. Elevadas concentrações de RA promover a expressão do gene neural e reprime a expressão do gene durante mesodérmica EB formação 7, 8. RA é produzido pela oxidação de vitamina A para Retinaldeído por qualquer álcool ou retinol desidrogenase, seguido por oxidação retinaldeído para o produto final por retinaldeído desidrogenase 9. diferenciação neural requer o transporte de RA a partir do citoplasma para o núcleo através da proteína de ligação celular RA 2 (CRABP2). No núcleo, RA se liga ao seu receptor cognato complexo consistindo de um heterodímero de RAR-RXR 10. Isto resulta em recrutamento de co-activadores da transcrição, e a iniciação da transcrição 9, 11. Além disso, RA promove a degradação de fosforilada (activa) Smad1, antagonizando assim BMP e sinalização SMAD 12. Além destas actividades, AR aumenta a expressão Pax6, um factor de transcrição que suporta diferenciação neural 13. Sinalização RA é modulada por sirtuina-1 (Sirt1), um dinucleótido adenina nicotinamida nuclear (NAD +) - enzima dependente que deacetylates CRABP2, interferindo com a sua translocação para o núcleo e, consequentemente, com a ligação do AR para o heterodímero RAR-RXR 14, 15, 16.
e_content "> A nossa meta na concepção do protocolo EB-tratada RA descrito aqui é para optimizar a diferenciação neuronal, a fim de facilitar a análise in vitro das vias de sinalização que regulam a diferenciação CES em células precursoras neuronais Uma das vantagens deste protocolo. é facilitação de a análise da função das células por imunofluorescência. 3D EB não são bem penetrado por anticorpos e são difíceis de imagem. EB dissociação em uma monocamada 2D em pontos de tempo específicos durante a diferenciação neuronal e facilita a imunomarcação de imagem das células por microscopia confocal.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura de rato embrionárias fibroblastos (MEFs)
- Preparar o meio MEF, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, rico em glicose), suplementado com soro a 15% de bovino fetal (FBS).
- O revestimento 100 mm pratos de cultura de células com solução de gelatina a 0,5% durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
- Contagem MEFs usando um citômetro. Remover a solução de gelatina e verter imediatamente meio MEF pré-aquecido a 37 ° C. Descongelar rapidamente frasquinhos de mitomicina-C MEFs tratada num banho de água a 37 ° C durante 2 min, em seguida, propagar 2,8 x 10 6 por placa MEFs revestido com gelatina de 100 mm. Ajustar em conformidade o número de células se usando pratos de outros tamanhos. Incubar MEFs a noite a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Mudar o meio no dia seguinte. Cultura durante 2-3 dias até a camada MEF é confluente.
2. Rato Cultura ESC
- Preparar o meio CES, meio modificado Iscove da Dulbecco (IMDM) suplementado com 15% de FBS e 103 U / ml de factor inibidor da leucemia (LIF), mM de aminoácidos não essenciais 0,1, 55 mM de 2-mercaptoetanol, penicilina (100 U / mL), estreptomicina (100 ug / ml), gentamicina (200 ug / mL), e 0,2% antibiótico micoplasma.
- Remover o meio MEF do prato preparado no passo 1 e substitua com meio CES 37 ° C pré-aquecido.
- Descongelar um frasco CES e células de sementes no topo da camada de MEF. Incubar a 37 ° C, 5% de CO2, até CES alcançar confluência.
- Prepare novos pratos de cultura de células contendo uma monocamada confluente de MEFs. Para a passagem CES, lavar uma vez com PBS e destacam com 0,25% de tripsina / EDTA durante 2-5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Pare a tripsinização adicionando IMDM fresco com 15% de FBS para as células de extracção transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL e centrifugar a 160 xg durante 5 min à TA.
- Remover o sobrenadante, CES ressuspender com IMDM fresco e passagem de um quinto das culas a cada novo prato MEF-revestidos; incubar até que as célulasalcançar confluência (normalmente 4-5 dias).
3. Retira MEFs e CES cultura em placas revestidas com gelatina-
- Uma vez ECSs atingiram a confluência, destacá-las e MEFs com 0,25% de tripsina / EDTA como no passo 2.4, ressuspender as células em IMDM fresco, transferidos para uma placa de Petri bacteriológicas não-adesiva, e incubar durante 40 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- transferir cuidadosamente CES e MEFs contendo meio para uma nova placa revestida com gelatina usando uma pipeta de 5 ml, evitando pipetagem repetida. As células restantes nas placas de petri são MEFs, já que os CES não aderem.
- Passage os CES cada 3-4 dias. Menos frequente passagem pode reduzir CES pluripotência. Não exceda os 60% de confluência, pois pode favorecer a diferenciação.
- Repita os passos de 3,2-3,3 três vezes ou mais, conforme necessário, até MEFs não detectável são, por um microscópio de cultura de células, usando uma objetiva de 20X, para certificar-se MEFs não estão presentes.
- Verifique ESC pluripotência, verificando ESCcultura para ver se as células formam colónias densas com morfologia típica poligonal CES (Figura 1A). Stemness célula de ensaio por reacção inversa quantitativa em cadeia transcriptase-polimerase (qRT-PCR) 17, 17? Immunoblotting, ou imunofluorescência de transcrição núcleo pluripotência factores 17 (Figura 2).
4. Formação EB
- Prepare all-trans-RA solução estoque a 10 mM em DMSO, e alíquota de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga-protegido da luz. A solução é estável a -80 ° C durante até duas semanas. Proteger da luz.
- Tripsinizar CES como no passo 2.4; replate em IMDM fresco sem LIF, como uma suspensão de célula única.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e preparar uma 5 x 10 5 culas suspensão / mL em IMDM com 0,5 uM RA.
- Placa 100 20-uL-gotas por placa de petri de 100 mm com uma pipeta de 8 canais e pontas 200 ul, invertidoos pratos, e preencher a tampa invertida com PBS para evitar gotas de suspensão de secagem. Proteger os meios de cultura contendo RA de luz.
- Cultura em suspensão EBs gotas a 37 ° C, 5% de CO2, durante 4 dias.
5. Cultura EB 2D
- O revestimento 12 mm lamelas de vidro circular com 30 ug / mL de fibronectina durante 30 min a RT. Colocar cada lamela em um poço de uma placa de 24 poços, e adicionar 1 mL de IMDM por poço.
- Colheita 3 pendurado EBs gota uma por uma com 200 uL pontas de pipetas e semear-los sobre as lamelas revestidas com fibronectina, 20 EBs por poço, utilizando as mesmas pontas de pipetas crescido-dia.
NOTA: 3 dias EBs são preferíveis sobre EBs 4 dias porque eles aderem melhor para as lamelas. - Continuar com a cultura IMDM-FBS a 15% sem LIF. Substitua média a cada 3-4 dias. Recolhe-se o meio utilizado para a análise de secreção de proteínas, conforme necessário.
6. Detecção de proteínas secretadas
- Transferir 500 mL de EB medihm a 10 filtros centrífugos kDa de corte, girar a 20.000 xg durante 60 min a 4 ° C.
- Examinar o meio restante dentro dos filtros centrífugos a cada 15-20 min para evitar o enriquecimento excessiva. Pare centrifugação, quando o volume do meio restante caiu para 25 mL.
- Recolhe-se o meio concentrado restante após a inversão do filtro e girando a 160 xg, a 4 ° C, seguindo as instruções do fabricante.
- Detectar as proteínas segregadas por imunotransferência com anticorpos específicos 17.
7. Cultura EB 3D
- Recolher os CEs cultivadas durante 4 dias na suspensão gotas, tal como descrito no passo 5.2, e colocá-los em tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 EBs por tubo).
- Preparar a soluo de gel de colagénio, seguindo as instruções do kit de cultura 3D colagénio (ver Materiais / Equipamento Tabela). Dilui-se volumes apropriados da solução de colagénio e 5x DMEM (um componente do kit); adicione o nsolução eutralization (um componente do kit) e misturar bem imediatamente, e manter este em gelo.
- Pipetar um volume adequado de solução de colagénio refrigerada para dentro do tubo de 1,5 mL contendo o EBS, e transferir suavemente para os poços de uma placa de 6 poços utilizando uma ponta de uma pipeta mL. Evite fazer bolhas.
- Imediatamente transferir a placa a 37 ° C, 5% de CO 2, durante 60 minutos para iniciar a polimerização do colagénio.
- Sobrepor a placa de EB contendo com IMDM.
- Alterar média a cada 3-4 dias.
8. EB dissociação
- Recolhe-se o dia 4 EB (a partir do passo 4), um por um, com 200 uL pontas de pipetas e transferi-los para um não-adesiva bacteriológica prato de petri contendo IMDM com 15% de FBS; cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 durante mais 4 dias. Verifique a EBs duas vezes todos os dias para se certificar de que eles não dão a baixo; agite o prato para impedir a fixação EB para o fundo.
- Centrifugar os CEs a 185 xg durante 5 min aRT, numa centrífuga de bancada.
- Retire os sobrenadantes. A pelete não deve exceder 100 mL em cada tubo.
- Adicionar a sedimentadas EBs 1 mL de tipo I a 0,25% colagenase por tubo, suplementado com 20% de FBS em PBS.
- Incubar a mistura de EB com colagenase durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2, pipetando-o suavemente a cada 20 min, utilizando 1 mL de pontas de pipetas.
- Lavam-se as culas suavemente 3x com PBS. Se os agregados de células estão presentes, usar um filtro de células com uma malha de 100? M para removê-los.
- Replate as células em um revestidas com gelatina pratos de 60 mm em IMDM. Em seguida, incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2.
9. A transfecção de Dissociated EBs
- Para qRT-PCR e imunotransferência, revestir uma placa de 6 poços com 0,5% de gelatina.
- Para imunofluorescência, lamelas de vidro com revestimento de 30 ug / mL de fibronectina durante 30 minutos à temperatura ambiente. Colocar cada lamela em um poço de uma placa de 24 poços. Adicionar IMDM.
- Semente de 4,75 x 10 5 ou 1 x 10 5
- Crescer as células a 70% de conflucia antes da transfecção.
- Transfectar as células por um reagente de células-tronco-óptima lípido não lipossómicos 17 (ver Materiais / Equipamento Tabela), seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: O reagente foi utilizado tipicamente alcançada uma eficiência de transfecção de 50% (ver Resultados representativos). - Analisar as amostras por qRT-PCR ou por imunotransferência 17 2 ou 3 dias após a transfecção, respectivamente.
10. Análise da EB Diferenciação por imunofluorescência
- Lavagem 2D EBs ou dissociado EBs 3D com PBS e fixar com 4% de paraformaldeo em PBS durante 30 min à TA. Lavam-se as células fixadas 3x com PBS para remover os detritos celulares flutuante.
NOTA: O paraformaldeído é uma pele e dos olhos irritante; tenha cuidado ao manuseá-lo. Adicionar 1% de triton X-100 em PBS para permeabilizar as células durante 20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lavar 3x com PBS. - Remover PBS e bloquear com 5% de BSA em PBS durante 30 min.
- Prepare uma diluição de anticorpo primário em 1% de BSA / PBS suplementado com 0,03% de Triton X-100. Substituir a solução de bloqueio pela solução de anticorpo primário. Incuba-se durante 3 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C, em seguida, lavar as células 3x com PBS.
- Aplicar anticorpo secundário em PBS de acordo com as instruções do fabricante. Incubar durante 1 h à TA, em seguida, lavar as células 3x com PBS.
- Montagem lamelas em lâminas de vidro com um meio anti-desvanecimento para microscopia óptica.
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Representative Results
Oct4, Nanog, e SOX2 são os factores de transcrição nucleares que conferem CES auto-renovação e pluripotência. Aplicou-se o protocolo acima para comparar a diferenciação neuronal de CES de tipo selvagem e de uma estirpe de ratos geneticamente modificados onde Syx, um gene que codifica para o factor de troca específicas de RhoA Syx, é interrompido. Nós tinha implicado Syx na angiogênese 18. Foram observadas diferenças nos comportamentos de EBs agregados a partir de Syx + / + e Syx - / - CES, e começou a testar se a diferenciação neural de Syx - / - CES é mais rápido do que os seus homólogos Syx + / +.
Para comparar o estado inicial de Syx + / + e Syx - / - CES, quantificou-se em cada genótipo as abundâncias de Oct4, Nanog, e SOX2, os factores de transcrição núcleo tchapéu conferir ESC auto-renovação e pluripotência. Tal como descrito no passo 10 do protocolo, CES foram immunolabeled por Oct4, Sox2, e anticorpos nanog. As abundâncias dos factores de transcrição em 3 Syx + / + e - / - Syx CES foram semelhantes, como determinado por imunofluorescência (Figura 2) e imunotransferência 17 (Figura 2).
EBs implantados numa matriz de colagénio 3D (Figura 1B), começa a germinar extensões celulares que são visíveis num microscópio de cultura de células com uma objectiva 10X, 2 dias após a implantação. No dia 6, entre 5 a 10 rebentos de 200? M ou menos pode normalmente ser observados em Syx + / + EBS, enquanto que em Syx - / - EBS, 30-50 brotos são frequentemente observados, a maioria dos quais são mais longos do que 200? M , (Figura 1C).
Syx - / - do que de Syx + / + 2D EBs (Figura 3A). Para comparar a taxa de diferenciação neuronal das células que se estendia desde o Syx + / + e Syx - / - EB, que immunolabeled-los depois de 6 dias de cultura 2D pela nestina marcador de culas estaminais neurais, uma proteína reguladora de filamento intermediário 19. Abundância de nestina foi substancialmente mais elevada em células prolongando-se a partir de Syx - / - EB (Figura 3B). Em seguida, comparou a abundância de nestina e tubulina β3 (Tubβ3), uma proteína do citoesqueleto axonal 20, em células dissociadas a partir de 13-dia 2D EBS. Ambas as proteínas foram mais abundantes em culas dissociadas a partir de SYX - / - EB do que nas suas SYX + / + homólogos (Figura 3C). Foram obtidos resultados semelhantes por quantificação de immunoblotting das mesmas proteínas 17.
A Figura 4 mostra células transfectadas pela proteína fluorescente constitutivamente verde (GFP) -fused RhoA activa (RhoA-Q63L) usando um reagente de transfecção de células-tronco-óptima (ver Materiais / Equipamento Tabela).
Figura 1: Rebento de Surgimento de Syx + / + e Syx - / - EBS em cultura 3D. (A) Syx + / + e Syx - / - CES cresceu em colónias agrupadas antes da indução de diferenciação neuronal. (B e C) imagens de EBs formadas na suspensão gotas com 0,5? M de RA e em seguida, inserido numa matriz de colagénio 3D sem AR, tal como descrito nos passos 7,1-7,4. As imagens foram capturadas no dia 6 pelos objectivos indicados (Escala b ars = 100 um de A e C, 200 um em B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A presença de factores de transcrição pluripotência Core. Imagens representativas que mostram as abundâncias dos marcadores de pluripotência núcleo indicados em Syx + / + e Syx - / - CES (barra de escala = 50? M). Ver Yang et ai. 17 para mais detalhes sobre o método de imunomarcação (Barra de escala = 50 um; DAPI, 2- (4-amidinofenil) -1H-indole-6-carboxamidina). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3: A visualização de marcadores neurais Diferenciação em Células de EB. Imagens (a) Fase de 2D EB bordas mostrando que as células se expandiu mais rápido a partir de Syx - / - do que de Syx + / + EBs (Barra de escala = 200 pm). Imagens (B) de imunofluorescência mostrando que a nestina neural diferenciação marcador era mais abundante nas células de expansão a partir de 6 dias 2D Syx - / - do que de EBs seus homólogos SYX + / + (Barra de escala = 50 m). Imagens (C) de imunofluorescência mostrando que os marcadores de diferenciação neuronais e nestina Tubβ3 foram mais abundantes em culas dissociadas a partir de 13 dias 3D SYX - / - do que de EBs seu (Barra de escala = 50? M) Syx + / + homólogos. Por favor clique aqui para viewa versão maior desta figura.
Figura 4: Visualização da Eficiência do Transfection Reagent. Três réplicas de imagens de imunofluorescência mostrando CES transfectadas pela RhoA activa constitutivamente fundidos a GFP para ilustrar a eficiência de transfecção do reagente usado no passo 9.5 do protocolo (escala bar = 50 pm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, apresentar um método relativamente simples e acessíveis para estudar diferenciação neural dos CES murino. Em protocolos anteriores, RA foi adicionado ao meio no dia 2 ou no dia 4 do EB de gota suspensa de 8 ou por cultura em suspensão de 7, respectivamente, ou imediatamente depois da EB pendurado agregação gota 21. No protocolo que concebeu, RA foi adicionado anteriormente. Apesar da introdução anterior do RA a EBs formado por cultura em suspens, este protocolo produziu maior expressão de marcadores de diferenciação neural 8.
Aqui, nós favoreceu aplicação RA e induzir a diferenciação neural no início da cultura gota suspensa. Esta modificação permite a exposição RA igual para os CES quando eles estão ainda em uma única suspensão de células, antes da agregação EB. Quando RA é adicionado à EBS agregadas, as células da massa interna EB são susceptíveis de detectar uma baixa de RA concentratiem que as células na camada exterior. Aplicação de RA no início da agregação de EB é também vantajoso porque ele suprime endodérmica e germe mesodérmica desenvolvimento camada em favor da diferenciação neuronal da camada ectodérmica 7, 8. Nós confirmamos que o tratamento RA promoveu a diferenciação neural examinando a abundância de perto de 10 marcadores 17.
Existem três considerações fundamentais neste protocolo. A primeira é a remoção máxima de células alimentadoras MEF para alcançar uma população CES alta pureza. A segunda é a sensibilidade à luz da RA: a solução estoque e as gotas de suspensão tem de ser protegida da luz após a aplicação RA. solução estoque RA só é estável durante duas semanas, após o que uma solução fresca deve ser preparados. A terceira consideração é a concentração de AR. Em nossos experimentos-piloto, descobrimos que a uma concentração do crescimento das células 10 M RA retardado e produzido EBs de menor tamanho em comparação com concentrações mais baixas, possivelmente porque a RA pode causar a apoptose em altas conncentrations 22, 23, 24. Observou-se que uma concentração de 0,5 uM RA produzidos um maior número de EBs bem formadas do que em qualquer das mais elevadas concentrações de 25 ou inferior, e que a EB atingiu um diâmetro médio de cerca de 200 um. EBs maiores exceder o tamanho de campo de uma objectiva 10X e foram, consequentemente, mais difícil de imagem. Por isso, nós escolhemos 0,5 pM como a concentração óptima RA.
Análise por imunofluorescência de 3D EBS é problemática porque são demasiado frágeis para seccionamento congelado. Além disso, descobrimos que seções EB congelados não aderem bem ao não revestidos lâminas de vidro tratadas com eletrostaticamente. Preparação da cultura 2D EB exige agregação de gotas de suspensão extras, porque alguns EBs não dão bem ao substrato. EB diSSOCIAÇÃO, que é relativamente lenta, podem ser aceleradas por pipetagem a EBs cima e para baixo, num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml durante a incubação com colagenase.
Neuralmente CES diferenciados podem ser usadas para substituir as células endógenas danificados, por exemplo, perda de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra do cérebro de pacientes que sofrem de doença de Parkinson 26. Embora as técnicas actuais de diferenciação CES humano não requerem formação EB (ibid.), EB são ainda uma ferramenta útil para a análise detalhada de diferenciação neuronal ao nível molecular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou financeiras
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo NIH conceder R01 HL119984 para AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
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