Summary
Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.
Abstract
Ein Protokoll zur Durchführung von hochpräzisen Interdye-Distanzmessungen mit Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) auf der Einzelmolekül-Ebene im Multiplex-Fluoreszenz-Nachweis (MFD) -Modus wird hier vorgestellt. MFD maximiert die Nutzung aller "Dimensionen" der Fluoreszenz, um photophysikalische und experimentelle Artefakte zu reduzieren und ermöglicht die Messung der Interdye-Distanz mit einer Genauigkeit bis zu ~ 1 Å in starren Biomolekülen. Diese Methode wurde verwendet, um drei Konformationszustände der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren, um die Aktivierung des Rezeptors bei der Ligandenbindung zu erklären. Beim Vergleich der bekannten kristallographischen Strukturen mit experimentellen Messungen stimmten sie innerhalb von weniger als 3 Å für mehr dynamische Biomoleküle zu. Das Sammeln eines Satzes von Abstandsbeschränkungen, die die gesamte Dimensionalität der Biomoleküle abdecken, würde es ermöglichen, ein Strukturmodell eines dynamischen Biomoleküls bereitzustellenEs
Introduction
Ein wesentliches Ziel der strukturellen Biologie ist es, die Beziehung zwischen Struktur und Funktion von biomolekularen Maschinen zu entschlüsseln. Der erste visuelle Eindruck von Biomolekülen ( zB Proteine und Nukleinsäuren) trat in den 1950er Jahren durch die Entwicklung der Röntgenkristallographie 1 , 2 auf . Die Röntgenkristallographie liefert hochauflösende, statische Strukturinformationen, die durch die Kristallpackung eingeschränkt werden. Daher scheut die inhärente Unbeweglichkeit von Röntgenstrukturmodellen die dynamische Natur von Biomolekülen, ein Faktor, der die meisten biologischen Funktionen 3 , 4 , 5 beeinflusst. Kernmagnetische Resonanz (NMR) 6 , 7 , 8 lieferte eine alternative Lösung für das Problem durch die Lösung von Strukturmodellen in wässrigen Lösungen. Ein großer VorteilVon NMR ist seine Fähigkeit, die intrinsische Dynamik von Biomolekülen und Konformationsensembles wiederherzustellen, was hilft, die intrinsischen Beziehungen zwischen Struktur, Dynamik und Funktion 3 , 4 , 5 zu klären. Trotzdem erfordert NMR, begrenzt durch Stichprobengröße und große Probenmengen, komplexe Etikettierungsstrategien für größere Systeme. Daher besteht ein dringender Bedarf, alternative Methoden in der Strukturbiologie zu entwickeln.
Historisch gesehen hat die Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 9 in der Strukturbiologie keine wichtige Rolle gehabt, weil das FRÜSSE, dass FRET mit einer geringen Genauigkeitsmessung ausgestattet ist. Es ist der Zweck dieses Protokolls, die Fähigkeit von FRET zu überprüfen, um Entfernungen auf der Nanometer-Skala zu bestimmen, so dass diese Abstände für den Aufbau von Strukturmodellen von Biomolekülen verwendet werden können. Die erste experimentelle VerifikationDie Abweichung von der R - 6 - Abhängigkeit von der FRET - Effizienz wurde von Stryer im Jahre 1967 10 durch Messung von Polyprolinen verschiedener Längen als "spektroskopisches Lineal" durchgeführt. Ein ähnliches Experiment wurde auf der Einzelmolekül-Ebene im Jahr 2005 erreicht 11 . Polyprolin-Moleküle erwiesen sich als nicht-ideal, und so wurden doppelsträngige DNA-Moleküle später verwendet 12 . Dies öffnete das Fenster für präzise Abstandsmessungen und die Idee, FRET zu verwenden, um strukturelle Eigenschaften von Biomolekülen zu identifizieren.
FRET ist optimal, wenn der Interdye-Distanzbereich von ~ 0.6-1.3 R 0 liegt , wobei R 0 der Förster-Abstand ist. Für typische Fluorophore, die in Einzelmolekül-FRET-Experimenten verwendet werden, beträgt R & sub0 ; ~ 50 Å. Typischerweise bietet FRET viele Vorteile gegenüber anderen Methoden in seiner Fähigkeit, die Strukturen und Dynamiken zu lösen und zu differenzierenHeterogene Systeme: (i) Aufgrund der ultimativen Empfindlichkeit der Fluoreszenz können einzelne Molekül-FRET-Experimente 13 , 14 , 15 , 16 heterogene Ensembles durch direktes Zählen und gleichzeitiges Charakterisieren der Strukturen ihrer einzelnen Mitglieder lösen. (Ii) Komplexe Reaktionswege können in Einzelmolekül-FRET-Studien direkt entschlüsselt werden, da keine Synchronisation eines Ensembles erforderlich ist. (Iii) FRET kann auf eine breite Palette von zeitlichen Domänen zugreifen, die sich über 10 Jahrzehnte erstrecken und eine Vielzahl von biologisch relevanten Dynamiken abdecken. (Iv) FRET-Experimente können in beliebigen Lösungsbedingungen sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. Die Kombination von FRET mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Untersuchung molekularer Strukturen und Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , auch mit hoher Präzision 20 . (V) FRET kann auf Systeme von nahezu jeder Grße angewendet werden ( z. B. Polyprolin-Oligomere 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV-Reverse-Transkriptase 26 und Ribosomen 27 ). (Vi) Schließlich könnte ein Netzwerk von Abständen, das alle Dimensionalitäten von Biomolekülen enthält, verwendet werden, um strukturelle Modelle von statischen oder dynamischen Molekülen 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .
Daher kann die Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie verwendet werden, um Abstände abzuleiten, die präzise genug sind, um für die Distanz-zurückhaltende Strukturmodellierung verwendet zu werden 26 . Dies ist möglich, indem man die Multiparameter-Fluoreszenzdetektion (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , die acht Dimensionen von Fluoreszenzinformationen verwendet ( dh Anregungsspektrum, Fluoreszenzspektrum, Anisotropie, Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzquantenausbeute, Makroskopische Zeit, die Fluoreszenzintensitäten und der Abstand zwischen den Fluorophoren), um genau und präzise Abstandsbeschränkungen zu liefern. Zusätzlich wird die gepulste verschachtelte Erregung (PIE) mit MFD kombiniert(PIE-MFD) 42, um die direkte Anregungsakzeptorfluoreszenz zu überwachen und Einzelmolekülereignisse auszuwählen, die aus Proben resultieren, die eine 1: 1-Donor-zu-Akzeptor-Stöchiometrie enthalten. Ein typischer PIE-MFD-Aufbau verwendet zwei gepulste verschachtelte Anregungslaser, die mit einem konfokalen Mikroskopkörper verbunden sind, wobei die Photonendetektion in vier verschiedene Kanäle in verschiedenen Spektralfenstern und Polarisationseigenschaften aufgeteilt wird. Weitere Details finden Sie in Abbildung 1 .
Es ist wichtig zu beachten, dass FRET mit rechnerischen Methoden kombiniert werden muss, um atomistische Strukturmodelle zu erreichen, die mit den FRET-Ergebnissen 26 , 30 übereinstimmen. Es ist nicht das Ziel des vorliegenden Protokolls, über die damit verbundene Methodik zu gehen, um Strukturmodelle mit FRET-abgeleiteten Abständen zu erstellen. Diese Ansätze wurden jedoch in Kombination mit anderen Techniken ( z. B. Kleinwinkel-Röntgenstreuung) angewendetOder Elektronen-paramagnetische Resonanz), die Geburten des Feldes der integrativen Strukturbiologie 43 , 44 , 45 , 46 . Das aktuelle Ziel ist es, den Weg für FRET als quantitatives Werkzeug in der Strukturbiologie zu ebnen. Als Beispiel wurde diese Methode verwendet, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne (LBD) des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Ziel ist es, die vorgenannten Einschränkungen zu überwinden und FRET zu den integrativen Methoden zu bringen, die für die strukturelle Bestimmung von Biomolekülen verwendet werden, indem gemessene Distanzen mit hoher Präzision bereitgestellt werden.
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Protocol
1. PBS-Puffer-Vorbereitung und Kammerbehandlung
HINWEIS: Bei der Durchführung von nasschemischen Experimenten einen Laborkittel und Einweghandschuhe tragen. Verwenden Sie den Augenschutz beim Ausrichten des Lasers.
- PBS-Pufferzubereitung
- Man löst 4,5 g Na 2 HPO 4 , 0,44 g NaH 2 PO 4 und 3,5 g NaCl in 400 ml destilliertem Wasser. Sicherstellen eines pH-Werts von 7,5 und Sterilisieren der Lösung durch Autoklavieren auf einem Flüssigkeitszyklus für 1 h (abhängig vom Autoklaven-System).
- Nehmen Sie 15 ml der PBS-Lösung und mischen Sie sie mit 0,1 g Holzkohle. Filtriere die Mischung unter Verwendung eines regelmäßigen 20-ml-Spritzenfilters mit einer Porengröße von 0,2 μm . Den PBS-Puffer bei Raumtemperatur abdichten und lagern.
- Mikroskop-Kammer-Deckglas-Behandlung
- Fügen Sie 500 μl destilliertes Wasser und 5 μl Polysorbat 20 nichtionisches Tensid hinzu (siehe Materialliste)Zu einem Kammerdeckel-Glas-System (siehe Materialliste) und gut mischen. Lassen Sie es für 30 min einweichen. Entfernen Sie die Polysorbat-20-Lösung und waschen Sie die Kammer zweimal mit destilliertem Wasser. Lass es trocknen.
HINWEIS: Die Kammer ist jetzt gebrauchsfertig.
- Fügen Sie 500 μl destilliertes Wasser und 5 μl Polysorbat 20 nichtionisches Tensid hinzu (siehe Materialliste)Zu einem Kammerdeckel-Glas-System (siehe Materialliste) und gut mischen. Lassen Sie es für 30 min einweichen. Entfernen Sie die Polysorbat-20-Lösung und waschen Sie die Kammer zweimal mit destilliertem Wasser. Lass es trocknen.
2. DNA-Probenvorbereitung
HINWEIS: Für die Erstellung von doppelsträngigen DNA (dsDNA) Standardproben verwenden Sie entworfene markierte DNA-Stränge (siehe Materialliste). Entworfene Oligos dürfen keine Farbstoffe am Ende eines Polymers haben, um Artefakte zu vermeiden, die den bestimmten Abstand beeinträchtigen können. Die DNA-Sequenz sollte so gewählt werden, dass sie sich als starrer Körper verhält.
- Füge 1,5 μl eines Donor-markierten DNA-Strangs und 4,5 μl eines komplementären (Akzeptor-markierten oder nicht markierten) DNA-Strangs in ein Mikrofugenröhrchen ein und vermische sie mit 24 μl nukleasefreiem Wasser.
HINWEIS: Abhängig von der Mischung der ausgewählten Oligonukleotide werden die folgenden Proben erzeugt: no-FRET, loW-FRET oder hoch-FRET dsDNAs. - Hybridisierung der DNA unter Verwendung eines thermischen Mischers und des folgenden Verfahrens: 95 ° C für 10 min, 90 ° C für 10 min, 80 ° C für 10 min, 70 ° C für 10 min, 60 ° C für 10 min, 50 ° C Für 10 min, 40 ° C für 10 min, 30 ° C für 10 min, 20 ° C für 10 min, 10 ° C für 10 min und Halten bei 5 ° C.
HINWEIS: Die erzeugten dsDNA-Standards können in einem -20 ° C Gefrierschrank für Langzeitlagerung gehalten werden oder können sofort verwendet werden.
3. Proteinprobenvorbereitung
Anmerkung: Ausgehend von rekombinanter DNA für die Expression des Proteins von Interesse an bakteriellen Systemen ist es möglich, die Reste zu mutieren, aus denen die Abstände in Cysteine gemessen werden sollen. Um dies zu tun, verwenden Sie standard site-gerichtete Mutagenesetechniken 47 . Um die Proteinreinigung zu erleichtern, klonieren Sie die rekombinante und mutierte DNA in einen Vektor, der ein Reinigungsetikett enthält ( z.Ein His-Tag). Die Glutamat-Untereinheit 1 Ligand-bindende Domäne (LBD) aus dem NMDA-Glutamat-ionotropen Rezeptor (GluN1) LBD ( dh NMDA GluN1 LBD, kloniert in den pET-22b (+) - Vektor) wurde verwendet.
- Proteinausdruck
- Transformieren Sie das Konstrukt-DNA-Plasmid in das Expressions-System der Wahl 48 .
HINWEIS: Die folgenden Schritte gehen davon aus, dass die Expression eines löslichen Proteins in Escherichia coli transformiert wird . Eine Reinigung von beispielsweise transfizierten Säugetierzellen 49 oder transduzierten Insektenzellen 50 ist ebenfalls möglich, und detaillierte Schritte können an anderer Stelle gefunden werden. Stellen Sie sicher, dass der ausgewählte E. coli- Stamm für das interessierende Protein geeignet ist. Zum Beispiel erfordert die Expression von Proteinen, die Disulfidbrücken enthalten, einen Stamm von kompetenten Zellen mit einem weniger reduzierenden intrazellulären Kompartiment (siehe Materialliste). - Inokulieren Sie einen Starter <Em> E Coli Kultur unter Verwendung einer sterilen Pipettenspitze, um eine einzelne umgewandelte Kolonie 48 aufzunehmen. Füllen Sie es in 100 ml selektives LB-Medium (siehe Materialliste) und lassen Sie die Kultur über Nacht bei 37 ° C wachsen.
- LB-Brühe vorbereiten (siehe Materialliste). Autoklav es zu sterilisieren.
- Inokulieren von Großkulturen von transformiertem E. coli durch Zugabe der Übernachtkultur zu 2 l selektivem LB-Medium bei einem Verhältnis von 1: 500
- In den nächsten Stunden beurteilen Sie das Wachstum der Kultur durch die Überwachung der Absorptionswerte (Abs) der Kultur bei 600 nm, die manchmal als optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) bezeichnet werden, oder durch Verwendung eines Zelldichtemessers. Beachten Sie, dass die Messwerte im Laufe der Zeit zunehmen.
- Induzieren Sie die Proteinexpression mit einer Endkonzentration von 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG), wenn die Kultur eine OD 600 von 0,7 erreicht. Shake induzierte E. coli bei 20 ° C für 20-24 h
- Nach der Proteininduktion wird das E. coli durch 20 Minuten lang bei 3000 xg und 4 ° C gepinnt. Verwerfen Sie den Überstand und lagern Sie das E. coli- Pellet, das das intrazelluläre Protein enthält, bei -80 ° C bis zur Verwendung.
- Transformieren Sie das Konstrukt-DNA-Plasmid in das Expressions-System der Wahl 48 .
- Proteinreinigung
- Lyse E. coli mit einer Lyse-Methode der Wahl ( zB Beschallung, französische Presse, Stickstoff-Kavitation, etc. ) 51 .
- Die Membran und den Zelltrümmer abschleudern, indem man das Lysat 1 h bei 185000 xg und 4 ° C zentrifugiert.
- Für ein His-markiertes Protein laden Sie den Überstand auf eine äquilibrierte, nickelgeladene, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) -Säule unter Verwendung eines Fast-Protein-Flüssigchromatographie-Systems (FPLC) (siehe Materialtabelle ) 52 .
HINWEIS: Äquilibrierungspuffer für das NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris und 1 mM Glycin, pH 8. Elutionspuffer für NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glycin und 400 mM Imidazol, pH 8.- Waschen Sie die IMAC-Säule mit Puffer, der eine geringe Menge (~ 12 mM) Imidazol enthält.
- Eluieren Sie das Protein aus der IMAC-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von Imidazol von 12 mM bis 400 mM.
- Dialyse des Proteins über Nacht in Äquilibrierungspuffer ohne Imidazol 53 , indem das Eluat aus Schritt 3.2.3.2 in Dialyseschlauch gegeben und in den Äquilibrierungspuffer unter kontinuierlichem Rühren für 2-3 Stunden untergetaucht wird. Wiederholen Sie mindestens ein weiteres Mal.
HINWEIS: Die Schritte 3.2.3-3.2.6 nehmen die Reinigung eines His-markierten Proteins an. Wenn Sie durch eine andere Methode reinigen, passen Sie das Protokoll entsprechend an. - Quantifizieren Sie die Proteinmenge, indem Sie die Extinktion bei 280 nm des dialysierten Proteins und unter Verwendung des Biergesetzes ( Absorptionseinheit = ε L c , wobei ε Ist der Extinktionskoeffizient (M -1 cm -1), Die hier erhalten werden können 54 ; L ist die Lichtweglänge (cm); Und c die Proteinkonzentration (M) ist).
ANMERKUNG: Verschiedene Proteinquantifizierungsassays sind verfügbar, einschließlich des Bradford-Assays und des Bicinchoninsäure-Tests. Beide liefern genaue Ergebnisse.
- Protein-Etikettierung
- Addieren Sie Spender (Maleinimid reaktive Cyan-Grün-Farbstoff) und Akzeptor (Maleimid reaktive far-red Farbstoff) Fluorophore an das gereinigte Protein bei einem 1: 1: 8-Protein: Donor: Akzeptor-Molverhältnis.
- Inkubieren Sie die Protein- und Fluorophormischung auf Eis für 30 min. Längere Inkubationszeiten sind möglich.
- Packen Sie eine 0,5 ml Ni-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) -Agarose-Säule (siehe Materialliste) und equilibrieren Sie sie mit dem gleichen Äquilibrierungspuffer wie in Schritt 3.2.3, während das Protein inkubiert.
HINWEIS: Halten Sie die Menge des geladenen Proteins entsprechend der Harzbindungskapazität. - Nach 30 minKubation, laden die Protein / Fluorophor-Mischung auf die in Schritt 3.3.3 hergestellte Säule und reinigen durch Schwerkraftströmung.
- Abwässern von überschüssigem Fluorophor mit 5 ml Äquilibrierungspuffer.
- Eluieren Sie das markierte Protein durch Schwerkraft aus der Säule viermal mit 0,5 ml Elutionspuffer. Da das Protein bereits aus anderen Proteinen gereinigt wurde, ist kein Gradient notwendig.
- Überprüfen Sie jedes Eluat mit einem UV-Vis-Spektrometer, um zu identifizieren, welche Fraktion das markierte Protein enthält. Die Absorption von 230-700 nm abtasten, um sicherzustellen, dass die Absorptionsspitzen vom Protein (280 nm) und jedes Fluorophor (493 nm für das Cyan-Green-Fluorophor und 651 nm für den fernen Rot-Fluorophor) sichtbar sind Eluieren
HINWEIS: In der Regel wird das Protein in Fraktion 2 eluieren. - Äquilibrieren Sie eine Entsalzungssäule (siehe Materialtabelle ) mit kohlebehandeltem PBS (Schritt 1.1).
- Das markierte Protein auf die Entsalzungssäule durch Schwerkraft strömen.
HINWEIS: Halten Sie die Menge des geladenen Proteins gemäß der ausgewählten Entsalzungssäule Kapazität 55 . - Eluieren unter Verwendung von 3,5 ml kohlebehandeltem PBS durch Schwerkraftfluss und sammeln 0,5 ml Fraktionen des Eluats.
- Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektrometer, um die Extinktion jedes Eluats von 230-700 nm zu scannen, um zu identifizieren, welche Fraktion markiertes Protein enthält.
HINWEIS: Die Schritte 3.3.8-3.3.11 dienen grundsätzlich als Pufferaustausch. Andere Protokolle, die diesem Zweck dienen, sind auch möglich ( zB umfangreiche Dialyse). Alternativ könnte man ab Schritt 3.3.2 direkt zu Schritt 3.3.8 gehen.
4. Messungen im Ensemble erforderlich (in Küvette)
- Bestimmung der Försterkonstante
- Scan f D , die Fluorophor-Fluoreszenzemission (cps), in einem Fluorimeter durch Anregung des Donors bei 15 nm auf seine maximale Extinktionswellenlänge, um die volle Em zu erhaltenIssionsspektrum Überwachen Sie die Emission beginnend 5 nm nach der Anregungswellenlänge und enden 150 nm später. Verwenden Sie magische Winkelbedingungen, indem Sie den Emissionspolarisator auf 54,7 ° einstellen Und die Anregungspolarisatoren auf 0 ° 56 .
HINWEIS: Für den hier verwendeten Spenderfluorophor liegt das Abs-Maximum bei 490 nm; 475 nm wird als Anregungswellenlänge verwendet und die Emission von 480-650 nm wird überwacht. Für den Akzeptor tritt das Abs-Maximum bei 645 nm auf; 630 nm wird für die Anregungswellenlänge verwendet und die Emission von 635-735 nm wird überwacht. - Verwenden Sie das Fluorimeter, um eine Anregungsabtastung des Akzeptorfluorophors (Abs A ) im Bereich von 400-700 nm durchzuführen und die magischen Winkelbedingungen zu verwenden, indem Sie den Emissionspolarisator auf 54,7 ° einstellen Und die Anregungspolarisatoren auf 0 ° 56 . Setzen Sie den Emissionsmonochromator auf 15 nm nach der maximalen Emissionswellenlänge. Normalisieren bis zum Maximum exciWert.
- Auf veröffentlichten Tabellen finden Sie den Extinktionskoeffizienten des Akzeptors, ε A (M -1 cm -1 ) 56 oder verwenden Sie die vom Hersteller bereitgestellten Werte.
HINWEIS: Der für das in diesem Manuskript verwendete Akzeptorfluorophor veröffentlichte Wert ist ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 . - Berechnen Sie die spektrale Überlappung mit J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , wobei f D , Abs A und ε A oben λ definiert sind und die Wellenlänge (nm) ist. Verwenden Sie ein Arbeitsblatt, um in Spalten alle in den Schritten 4.1.1-4.1.3 erhaltenen wellenlängenabhängigen Werte aufzulisten. Richten Sie sie nach Wellenlänge aus. Führen Sie die Summierung von der minimalen Wellenlänge der Donoremission (λ min ) bis zur maximalen Wellenlänge des Akzeptor-Absorptionsmittels durchE (λ max ).
- Berechnen Sie die Förster-Konstante (R o ) unter Verwendung der folgenden Formel R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , wobei J die spektrale Überlappung ist, die zuvor in Schritt 4.1.4 berechnet wurde, Κ 2 Ist der Orientierungsfaktor Φ F, D Ist die Fluoreszenzquantenausbeute des Donorfluorophors und n ist der Brechungsindex des Mediums, in dem sich das Fluorophor befindet.
HINWEIS: Verwenden Sie n = 1,33 (wenn wässriger Puffer verwendet wird) und κ 2 = 2/3. - Lokalisieren Sie den Quantenausbeutewert des Donorfluorophors (Φ F, D , Umweltabhängig) auf veröffentlichten Tabellen (siehe Referenz 57) und verwenden Sie den Wert der in Schritt 4.1.4 erhaltenen spektralen Überlappung, um den Endwert der Förster-Konstante mit dem GlAus Schritt 4.1.5.
HINWEIS: Wenn die Quantenausbeute nicht verfügbar ist, folgen Sie Schritt 4.2 unten, um sie zu berechnen. In diesem Fall verwenden Sie Φ F, D = 0,8, was einer Spenderlebensdauer τ D entspricht , r = 4,0 ns.
- Scan f D , die Fluorophor-Fluoreszenzemission (cps), in einem Fluorimeter durch Anregung des Donors bei 15 nm auf seine maximale Extinktionswellenlänge, um die volle Em zu erhaltenIssionsspektrum Überwachen Sie die Emission beginnend 5 nm nach der Anregungswellenlänge und enden 150 nm später. Verwenden Sie magische Winkelbedingungen, indem Sie den Emissionspolarisator auf 54,7 ° einstellen Und die Anregungspolarisatoren auf 0 ° 56 .
- Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute
HINWEIS: Das folgende Verfahren setzt nur eine dynamische Abschreckung voraus. Um eine statische Abschreckung zu betrachten, siehe Referenz 56. PIE-MFD-Experimente sind aber auch bei der Bestimmung der Quantenausbeute auch bei statischer Quenchung (siehe Ergebnisse) nützlich.- Wählen Sie einen Referenzfluorophor mit ähnlichen Absorptions- und Emissionsprofilen sowohl für den Akzeptor als auch für die Donorfluorophore, für die die Quantenausbeute (Φ r ) bestimmt wurde.
HINWEIS: Für den Spender gilt Φ r = 0,8 und τ r = 4 ns, während für den Akzeptor Φ r = 0,32 und τ r = 1,17 ns, WDie dem Φ r und τ r für die Cyan-Green-Fluorophor- und die fernroten Fluorophor-markierten Oligonukleotide entsprechen bzw. 57 . - Messen Sie den zeitaufgelösten Fluoreszenzabfall (f (t)) unter Verwendung des zeitkorrelierten Einzelphotonenzählverfahrens (TCSPC) bei magischen Winkelbedingungen.
- Setzen Sie den Fluoreszenzabfall mit einer mono- oder multi-exponentiellen Zerfallsfunktion in Form von f (t) = Σ i x i e -t / τ i , wobei x i ist Ist die Bevölkerungsfraktion und τ i Ist die Fluoreszenz-Lebensdauer der Bevölkerung.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Lebensdauer der Spezies, <τ> x = Σx i τ i , Wobei x i Ist die Bevölkerungsfraktion und τ i Ist die Fluoreszenzlebensdauer der Bevölkerung.
- Benutze thE Formel Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Um die Fluoreszenzquantenausbeute des Donorfluorophors zu berechnen, indem die Fluoreszenzlebensdauer und die Quantenausbeute der Referenz sowie die Fluoreszenzlebensdauer des Donorfluorophors eingesteckt werden.
HINWEIS: Diese Methode setzt eine dynamische Abschreckung voraus. Für andere Φ F, D Bestimmungen, folgen Lakowicz 56 .
- Wählen Sie einen Referenzfluorophor mit ähnlichen Absorptions- und Emissionsprofilen sowohl für den Akzeptor als auch für die Donorfluorophore, für die die Quantenausbeute (Φ r ) bestimmt wurde.
5. Experiment Alignment für PIE-MFD Single-Molekül-Detektion (SMD)
HINWEIS: Es ist besser, die Lichter auszuschalten, wenn Messungen vorgenommen werden.
- Geräteeinstellung (Abbildung 1)
HINWEIS: Für dieses Experiment wird ein in Fig. 1 dargestellter hausgemachter MFD-Aufbau mit zwei gepulsten Lasern und 4 Detektionskanälen in einem invertierten Mikroskopkörper verwendet. Es gibt ähnliche kommerzielle Systeme.- Schalten Sie die 485-nm- und 640-nm-Laser und alle Detektoren des MFD-Setups ein. Öffnen Sie die Software, die die TCSPC-Erfassung und Laser steuert. Stellen Sie sicher, dass die Laserwiederholfrequenz 40 MHz beträgt.
- Setzen Sie die 485-nm-gepulste Laserleistung auf 60 μW an einer Bildebene des 60X 1.2 NA-Wasser-Immersionsobjektivs und der 640-nm-Pulslaserleistung auf 23 μW im gepulsten Interleaved-Erregungsmodus (PIE-MFD) 42 .
HINWEIS: Um PIE-MFD einzustellen, verzögern sich die beiden Laserpulse in der Laser-Controller-Software. Für die 485-nm-Laseranregung sind die Detektions-TCSPC-Kanäle (TAC-Kanäle) 1-12.499 ("prompt" -Kanal). Bei 640 nm Laseranregung sind die TCSPC-Kanäle (TAC-Kanäle) 12.499-50.000 ("Delay" -Kanal). - Fügen Sie eine objektive Immersionsflüssigkeit (ein Tropfen doppelt destilliertes Wasser) zwischen die Mikroskopobjektivlinse und eine Deckglasscheibe ein. Um sicherzustellen, dass die Bildebene innerhalb der Lösung und weit von der Glasoberfläche liegtCe, drehen Sie den Einstellknopf eineinhalb Umdrehungen, nachdem Sie den zweiten hellen Brennpunkt durch die Reflexion der Laser an der Glas-Flüssigkeitsschnittstelle gefunden haben.
- Füge 1 μl 100 nM Rhodamin 110 zu 50 μl destilliertem Wasser in die Mitte des Deckglases. Stellen Sie sicher, dass sich die Lösung auch im Zentrum des Mikroskopobjektivs befindet.
- Stellen Sie die Pinhole (Größe: 70 μm) Positionen (x und y Richtung eins zu einer Zeit) ein, während Sie die Photonenzählrate auf der Erfassungssoftware überwachen, um die Anzahl der erkannten Photonen zu maximieren.
- Standardmessung SMD (Arbeit in einem dunklen Raum)
- Verwenden Sie das Sample aus Schritt 5.1.4 und notieren Sie 120 s der Zählrate, indem Sie auf die Schaltfläche "Start" auf dem zeitgesteckten zeitaufgelösten (TTTR) -Steuerelement im Format "* .ht3" 58 auf der Erfassungssoftware klicken.
- Berechnen Sie die Offline-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( dh FCS-Messung) zur Bestimmung der charakteristischen Zeit der Diffusion, der Anzahl der Moleküle im konfokalen Volumen, der Triplettzustandskinetik und der molekularen Helligkeit 62 .
- Öffnen Sie die Software für FCS (Kristine, MFD Suite). Wählen Sie die experimentellen Einstellungen aus, indem Sie auf "Optionen" -> "Wählen Sie Einrichten" klicken. Wählen Sie eine Datei mit ähnlichen experimentellen Einstellungen und klicken Sie auf "Parameter aus Datei abrufen", um die Header-Informationen in der Datei zu lesen.
- Wählen Sie "Operate" -> "Correlate", um FCS auszuführen.
HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die Kanalnummern ordnungsgemäß angegeben sind und dass die "TAC Gate" (TCSPC Kanäle) so gewählt werden, dass sie die Aufforderung oder die Verzögerungskanäle entsprechend auswählen. - Wählen Sie "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves", um die Passungsroutine zu öffnen. Verwenden Sie "Gleichung # 24" auf dem SoftwarE und klicken Sie auf "Start".
HINWEIS: Gleichung # 24 auf der Software beschreibt die Autokorrelationsfunktion ( G c ) von frei diffundierenden fluoreszierenden Molekülen über ein dreidimensionales Gauß-Beleuchtungsprofil wie 61 :
Wobei N die mittlere Anzahl von Molekülen im Nachweisvolumen ist, x T der Anteil der Moleküle ist, die Triplettzustandskinetiken mit der charakteristischen Zeit t T , t c ausüben, ist die Korrelationszeit t diff die Diffusionszeit, die mit der geometrischen Beziehung zusammenhängt Parameter ω und ω beschreibt das Gaußsche Beleuchtungsprofil. Nach der Passung nehmen Sie die Diffusionszeit und die Anzahl der Moleküle im konfokalen Volumen zur Kenntnis.
- 10 μl 100 nM Rhodamin 101 in 50 μl destilliert gebenWasser und gut mischen Legen Sie diese Mischung auf das Deckglas und stellen Sie sicher, dass sich das Tröpfchen in der Mitte des Objektivs befindet. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" auf dem TTTR-Bedienfeld, um 120 s Daten im TTTR-Format aufzuzeichnen.
- 1 & mgr; l 100 nM weit-rotes Fluorophor in 50 & mgr; l destilliertes Wasser geben und gut vermischen. Legen Sie diese Mischung in die Mitte des Objektivs. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und notieren Sie 120 s Daten im TTTR-Format.
- Legen Sie 50 μl destilliertes Wasser in die Mitte der Objektivlinse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und zeichnen Sie 300 s Daten im TTTR-Format auf.
- Platzieren Sie 50 μl PBS-Puffer in der Mitte der Objektivlinse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und zeichnen Sie 300 s Daten im TTTR-Format auf.
- Nehmen Sie 1 μl der Mischung aus Schritt 5.1.4 und mischen mit 50 μl destilliertem Wasser. Legen Sie diese Mischung auf das Deckglas. Zuerst klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" und sammeln Sie 10 s Daten im TTTR-Modus. Dann analysiere die TTTR-Modus-Datei mit der Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) Analysesoftware (Paris, MFD Suite), wie in Schritt 5.3 beschrieben.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Anzahl der Bursts pro Sekunde aus der Burst-Auswahl- und Analysesoftware 26 , 61 . Wenn der Burst-Level etwa 35 alle 10 s beträgt, ist es für die Einzelmolekülmessung geeignet. - Fortsetzung der Aufzeichnung der Zählrate im TTTR-Format für 1,5 h ( dh TCSPC bei SMD) zur Behandlung als Einzelmolekül-Messstandard.
HINWEIS: Wegen der großen Dateigröße, geteilte rohe "* .ht3" -Dateien in kleinere Dateien zu laden und zu verarbeiten mit BIFL.
- Analyse von Standardproben mit BIFL
- Öffnen Sie die BIFL Software (Paris).
- Wählen Sie das Setup für PIE im automatischen Popup-Fenster "Bestätigen Setup" und lesen Sie den Header, indem Sie die Datei mit ähnlichen experimentellen Einstellungen auswählen. Klicken Sie auf "Parameter holen"M-Datei "Klicken Sie auf" OK ". Beachten Sie, dass das Pop-up-Fenster schließt und in das Pariser Front-End integriert ist. Klicken Sie auf" OK "unter" Weiter ".
- Wählen Sie die zu analysierenden Dateien aus, indem Sie auf "Select" auf "Data Path Array" klicken, um die zu analysierende Messung auszuwählen.
- Klicken Sie auf "Green Scatter" (für eine Wassermessung), "Green BG" (für eine Puffermessung), "Green dick" (für eine 2 nM Rhodamin 110 Messung), "Red Scatter" (für eine Wassermessung), " Red BG "(für eine Puffer- oder Wassermessung)," Red dick "(für eine 20-nM Rhodamin 101 Messung)," Yellow Scatter "(für eine Wassermessung)," Yellow BG "(für eine Puffermessung) und "Yellow Thick" (für eine 2 nM Fernrot-Fluorophor-Messung).
- Klicken Sie auf "OK" unter "Weiter".
HINWEIS: Der "grüne" Kanal entspricht dem Signal der grünen Detektoren in den TPSPC-Kanälen. Das4; Red "-Kanal entspricht dem Signal der roten Detektoren in den TCP-Kanälen" prompt ". Der" Yellow "-Kanal entspricht dem Signal der roten Detektoren in den TCSPC-Kanälen.
- Klicken Sie auf "Anpassen" neben "Datenschnitt Burstwise", um Einzelmolekül-Auswahlparameter einzustellen. Im neuen Pop-up-Fenster wählen Sie Einzelmolekül-Ereignisse mit zwei Standardabweichungen von der mittleren Interphoton-Ankunftszeit ("dt") durch Ändern der Interphoton-Ankunftszeit unter "Threshold" und der minimalen Anzahl von Photonen pro Einzelmolekül-Ereignis unter "min . #. " Klicken Sie auf "Zurück", um das Popup-Fenster zu schließen. Klicken Sie auf "OK" unter "Weiter".
HINWEIS: Die Schwelle in ms-Einheiten hängt von der Hintergrundzählrate ab. Die typische Mindestanzahl der verwendeten Photonen beträgt 60. - Passen Sie die anfängliche Fluoreszenzlebensdauer "Farbanpassungsparameter" ( zB von, zu und und Faltung) für die Erzeugung anD Fluoreszenz-Zerfallsparameter auf den Farben "Grün", "Rot" und "Gelb". Im selben Fenster die "von" und "auf" Werte für "Prompt" und "Delay" einstellen. Klicken Sie auf "Zurück", um das Popup-Fenster zu schließen. Klicken Sie auf "OK" unter "Weiter".
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen 2-Farben-Erregung ausgewählt ist. "From" und "to" entsprechen den Anfangs- und Endbehältern des Fluoreszenz-Zerfalls-Histogramms (TAC-Kanalnummer). Wenn die anfänglichen Anpassungsparameter richtig ausgewählt sind, wird den Fluoreszenzabfällen auf jedem Kanal eine Fit-Funktion hinzugefügt. - Wählen Sie den Speicherort auf der Festplatte aus, auf dem alle verarbeiteten ascii-Dateien in einem übergeordneten Ordner gespeichert werden sollen.
HINWEIS: Paris verarbeitet alle ausgewählten Bursts und erstellt mehrere ascii-Ausgabedateien, die von anderen Programmen zur Visualisierung verwendet werden können ( zB Margarita MFD Suite).
6. dsDNA-Standards und ProbenmehlUrements
- Füge 500 μl PBS-Puffer zu einem Kammerdeckelglas hinzu und lege einen Tropfen destilliertes Wasser zwischen die Kammer und die Objektivlinse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" auf dem Steuerpedal und sammeln Sie 5 min Daten im TTTR-Modus, um für die Analyse zu verwenden.
- Nehmen Sie eine kleine Menge (üblicherweise etwa 0,1 μl, Konzentration von ca. 1 μM) des dsDNA-Standards, fügen Sie sie dem PBS-Puffer hinzu und mischen Sie gut. Zuerst sammeln Sie 10 s Daten, indem Sie auf "Start" klicken. Dann kontrolliere den Burst, um 35 Bursts pro 10 s zu bekommen (wie in den Schritten 5.2.7 und 5.3). Schließlich sammle ich 2 h Daten im TTTR-Format, wie oben beschrieben.
- Analysieren Sie die gesammelten Daten für die dsDNA-Beispiele, wie in Schritt 5.3.3.
- Visualisierung der Burst-Histogramme mit der MFD-Suite (Margarita) und Anzeige der FRET-Effizienz gegenüber <τ D (A) > f oder der F D / F A gegenüber <τ D (A) > f .
- Öffnen tEr Margarita Software und wählen Sie "Datei" -> "Import alle *. ?? 4 und * .mti Dateien." Wählen Sie den übergeordneten Ordner mit verschiedenen Unterordnern aus.
- Wählen Sie die zu visualisierenden Parameter aus, indem Sie neben der "X" (Abszisse) eines der aus Paris abgeleiteten Parameter klicken ( zB tau grün oder <τ D (A) > f ); In ähnlicher Weise wiederholen Sie dies für die Ordinate "Y", um den gewünschten Parameter zu visualisieren ( zB FRET-Effizienz, F D / F A oder S PIE PIE).
HINWEIS: In diesem Fall korrigieren die FRET-Effizienz, F D / F A oder S PIE die korrekte Hintergrundzählrate in den grünen, roten und gelben Kanälen. Für Quantenausbeuten des Donors und Akzeptors; Für das Erfassungseffizienzverhältnis (g G / g R ); Und für Übersprechen (α). Hier gilt g G / g R = 3,7 und α = 0,017, je nach Instrument. HintergrundzählratenAbhängig von dem verwendeten Puffer, und Quantenausbeutewerte werden vorher bestimmt. - Fügen Sie eine FRET-Zeile hinzu, indem Sie das Fenster "Overlay-Gleichung" öffnen, indem Sie auf "Display" -> "Overlay-Gleichung" klicken. Wählen Sie im Popup-Menü die statische FRET-Zeile aus. Wählen Sie die richtigen Spenderlebensdauer und die Quantenausbeute-Parameter, um die richtige FRET-Linie zu erzeugen.
HINWEIS: FRET-Linien zur Korrelation verschiedener FRET-Indikatoren können erzeugt werden.
- Bestimmen Sie den Korrekturfaktor für die Akzeptoranregung durch die Donoranregungsquelle (β) unter Verwendung des Stöchiometrieparameters durch Anzeige der FRET-Effizienz gegenüber der Stöchiometrie (S PIE ) in Margarita (Gleichung 1 unten).
HINWEIS: β wird so gewählt, dass die Spenderprobe bei S PIE = 1,0 in der Stöchiometrie-Skala einen Peak aufweist; Die Akzeptor-Probe sollte eine Stöchiometrie von S PIE = 0,0 haben, und die dsDNA mit beiden Markierungen sollte eine Stöchiometrie von S PIE ~ 0,5 habenBr /> HINWEIS: Das Instrument ist nun fertig und es ist möglich, FRET-markierte Proben zu messen. - Messen und Analysieren von in Abschnitt 3 hergestellten FRET-markierten Proben nach den Schritten 6.3-6.4.
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Representative Results
In typischen smFRET-Experimenten unter Verwendung eines MFD-Aufbaus (Laserlinien: 485 nm bei 60 μW und 640 nm bei 23 μW, Abschnitt 5.1) wird die Fluoreszenzprobe auf eine niedrigpikomolare Konzentration (10 -12 M = 1 pM) verdünnt und platziert In einem konfokalen Mikroskop, bei dem ein Sub-Nanosekunden-Laserpuls markierte Moleküle erregt, die durch ein Erregungsvolumen frei diffundieren. Ein typisches konfokales Volumen ist <4 femtoliter (fL). Bei derart niedrigen Konzentrationen werden nur einzelne Moleküle einzeln nachgewiesen. Die emittierte Fluoreszenz aus den markierten Molekülen wird durch das Objektiv gesammelt und räumlich gefiltert unter Verwendung eines Pinhole. Dieser Schritt definiert ein effektives konfokales Detektionsvolumen. Dann wird das Signal in zwei (oder mehr) verschiedenen Spektralfenstern ( zB "grün" und "rot") in parallele und senkrechte Komponenten aufgeteilt. Jeder Photonendetektorkanal wird dann mit einer zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) gekoppelt) Elektronik für die Datenregistrierung (Abbildung 1 ).
Nach der Kalibrierung des MFD-Setups kann eine in Tabelle 1 (Schritte 5-6) zusammengefasste Prozedur, Messung der dsDNA-Standards, gestartet werden. Dann wird PIE-MFD verwendet, um mehrere Parameter zu analysieren, wie das mittlere Makrotime, die Fluoreszenzlebensdauer, die Burst-integrierte Anisotropie, das Verhältnis des Signals in grün über das Signal in Rot, die Burst-Dauer im Aufforderungskanal (T (G + R) | D ), Burstdauer im verzögerten Kanal (T R | A ) und andere 65 , 66 ( Fig. 2 ). Wichtig in dieser Analyse ist der Stöchiometrie-Parameter ( S PIE ), definiert als:
Wo F G | D = F D , F R | D = F A und F R | EIN Sind hintergrundkorrigierte Fluoreszenzintensitäten 63 . Zum Beispiel F G | D = I G | D - < B G >, Wo ich g | D Ist die erkannte Intensität im grünen Kanal vom Spender und < B G > Ist die mittlere Hintergrundzählrate auf dem grünen Kanal. Ähnliche Korrekturen werden für die Fluoreszenz des Akzeptors durch direkte Anregung des Akzeptors ( F R | A ) und für die sensibilisierte Emission des Akzeptors ( F R | D ) durchgeführt. In Gleichung 1 ist α der Korrekturfaktor für Donor-FluoRescence-Crosstalk in den Akzeptorkanal; Β ist der Korrekturfaktor für die Akzeptoranregung durch die Donoranregungsquelle; Und γ , wo
Ist eine Funktion der Donor- und Akzeptor-Quantenausbeuten, Φ F, D Und Φ F, A , Bzw. der Nachweiswirkungsgrade an den Grün- und Rotdetektoren g g und g R. Mit S PIE ist es möglich, die richtigen instrumentellen Faktoren wie α, β und γ zu kalibrieren, um S PIE = 1 für die Spender-markierte Probe S PIE = 0 für die Akzeptor-Probe und S zu erfüllen PIE = 0,5 für die FRET-Probe. Alternativ dazuIst möglich zu verwenden:
Um die Quantenausbeute einer zweiten Probe abzuleiten, da die Quantenausbeute einer Probe ( 
) Bekannt ist und dass die 
und 
Werden aus dem PIE-MFD-Experiment bestimmt. In diesem Fall wird angenommen, dass die Quantenausbeute der Hoch-FRET-dsDNA 0,32 beträgt und die Quantenausbeute der Niedrig-FRET-dsDNA bestimmt wird. Der Grund für dieses Vorgehen ist, weil man bemerkt hat, dass die S PIE sowohl für Niedrig-FRET- als auch für Hoch-FRET-Proben unterschiedlich ist, obwohl beide einen Spender an der gleichen Stelle und nur einen Akzeptor haben, aber bei diffEreignisse Nach Bestimmung der richtigen Quantenausbeute der Standardproben, wie in Gleichung (3) beschrieben, wird der FRET-Wirkungsgrad ( E ) gegenüber < τ D ( A ) > f Und F D / F A gegenüber < τ D ( A ) > f Darstellungen zur weiteren Auswertung verwendet werden. Die parametrische Beziehung zwischen dem FRET-Wirkungsgrad ( E statisch ), F D / F A und < τ D ( A ) > f Parameter wird durch den folgenden Satz von Gleichungen (Gleichung 4) beschrieben:
Hier, F D | D ist die Spenderfluoreszenz, die im Spender oder Grünkanal nachgewiesen wird; F A | D Ist die Akzeptorsensibilisierte Emission; 
Ist die Donor-Fluoreszenzlebensdauer in Abwesenheit des Akzeptors; Und < τ D ( A ) > x Ist die durchschnittliche Lebensdauer der Spezies, die mit der Fluoreszenz-Durchschnittslebensdauer durch ein empirisches Polynom zusammenhängt 
56 , 57 . Diese Gleichungen sind als die statischen FRET-Linien 57 , 67 bekannt, weil die Linien beide Populationen gleich gut in der Abwesenheit o überqueren solltenF Dynamik ( Abbildung 3 ).
Zuletzt kommt die Analyse der FRET-Effizienz-Histogramme (Abbildung 4 ) mit der Wahrscheinlichkeitsverteilungsanalyse (PDA) für die beiden dsDNA-Proben 68 , 69 . PDA wurde verwendet, um die smFRET Histogramme mit hoher Genauigkeit zu modellieren 57 . Die Information einzelner oder multistatischer Spezies kann aus einem einzigen Histogramm gewonnen werden. Nach dem Anpassen der Form der erwarteten Verteilung auf die erhaltenen experimentellen Daten kann der Abstand zwischen dem Spender und dem Akzeptor aufgedeckt werden. Kurz gesagt werden die FRET-Effizienz- oder FD / FA- Verteilungen berechnet, indem zuerst die Wahrscheinlichkeit [ Gleichung ] der Beobachtung einer bestimmten Kombination von Photonen erhalten wird, die in den "grünen" ( G ) - und "roten" ( R ) -Erkennungskanälen gesammelt wurden Bei einem gewissen zeitwind Ow; Verwenden Sie Gleichung 5:
Hierbei wird aus der Gesamtsignalintensitätsverteilung P ( S ) die Fluoreszenzintensitätsverteilung P ( F ) erhalten, wobei angenommen wird, daß die Hintergrundsignale B G und B R nach Poissonverteilungen P ( B G ) und P ( B R ) mit bekannten mittleren Hintergrundzählratenintensitäten < B G > und < B R >. Die bedingte Wahrscheinlichkeit P ( F G , F R | F ) ist die Wahrscheinlichkeit, eine bestimmte Kombination von grünen und roten Fluoreszenzphotonen F G und F R für einen gegebenen FRET-Zustand zu beobachten.
E_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> PDA-Analyse zeigt, dass der Interdye-Abstand für die Hoch-FRET-dsDNA < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å ist, während für die Niedrig-FRET-dsDNA, Der Abstand < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å Im Vergleich zu den erwarteten Abständen mit dem FRET-Positionierungs- und Screeningsystem (FPS) 26 war ein erwarteter Interdye-Abstand < R DA > E , AV (HFRET) = 44,7 Å Gefunden mit FPS für die High-FRET dsDNA und < R DA > E , AV (LFRET) = 59,1 Å für die Low-FRET dsDNA AV steht für die zugängliche Volumenberechnung, die in das FPS-Toolkit eingebettet ist AV ist ein grob- Körnige Monte-Carlo-Simulation, bei der Fluorophore drei Radii-Hard-Sphäre-Modelle darstellen, die mit einem Befestigungspunkt im Biom verbunden sindOlecule mit einem flexiblen Verbindungsglied 26 , 57 . Für die Quantenausbeute für die Niedrig-FRET-dsDNA ist eine Korrektur erforderlich, bezogen auf die gemessene S PIE . Mit diesen Bedingungen ist es möglich, eine Übereinstimmung von ~ 1 Å zwischen dem experimentellen Wert und dem erwarteten Wert aus den AV-Simulationen zu erhalten.Anschließend wird das NMDA GluN1 LBD gemessen. Der NMDA-Rezeptor (NMDAR) ist ein heteromerer, nichtselektiver Kationenkanal, der die Bindung von Glycin und Glutamat für das Gating 70 erfordert. Die LBD, die eine clamshellartige Struktur aufweist, ist bekannt, eine offene Clamshell und eine geschlossene clamshellartige Konfiguration auf der Ligandenbindung auf der Grundlage der kristallographischen Information 71 , 72 anzunehmen. Für MFD-Experimente wurde das NMDA GluN1 LBD bei Ser507 und Thr701 (Volllängensequenz) auf gegenüberliegenden Seiten vonDie Spalte, wie bisher beschrieben wurde. Es wurde dann unter Verwendung des FRET-Paares eines Cyan-Grün-Fluorophors und eines weit-roten Fluorophors (siehe Materialliste) mit einem R 0 von 52 Å markiert. Dieses Konstrukt wurde verwendet, um die Bewegung der Ligandenbindungsdomäne zu untersuchen, ohne die Komplexität, die mit der Arbeit mit einem solubilisierten Rezeptor verbunden war. Unter Verwendung dieses Konstruktes wurden mindestens drei Konfigurationen des LBD gefunden. Es wurde vorgeschlagen, dass ein Konformationsauswahlmechanismus selektiv eine der identifizierten Populationen an der Ligandenbindung 73 bevölkert hat. In der inaktivierten Form oder in Gegenwart des Antagonisten 5,7-Dichlorokynurensäure (DCKA) werden meist mittel- bis niedrig-FRET-Zustände mit einer längeren Donor-Fluoreszenzlebensdauer und einem größeren Geber-zu-Akzeptor-Fluoreszenzverhältnis erreicht Bei F D / F A = 3,3 ( Fig. 5A ). Dies steht im Einklang mit der Stabilisierung einer offenen Spaltkonformation.PDA und Zeitfensteranalyse wurden verwendet, um drei Konfigurationen zu identifizieren, die der LBD annehmen kann (der Hoch-FRET (HF) (< R DA > E = 33,9 Å), Medium-FRET (MF) (< R DA > E = 45,8 Å ) Und Niedrig-FRET-Zustände (LF) (< R DA > E = 55,8 Å)). Allerdings waren vor allem die Mittel-FRET und die Low-FRET bevölkert. Dies deutet darauf hin, dass der Hoch-FRET der Zustand ist, der zur Aktivierung des NMDAR führt. Es ist bemerkenswert, dass experimentell abgeleitete Abstände und diejenigen, die durch die FPS unter Verwendung von Silico-Markierung und unter Verwendung der kristallographischen Informationen (Protein Data Bank Identification (PDBID): 1PB7 und 1PBQ) verglichen wurden, verglichen wurden. Es wurde festgestellt, dass der Interdye-Abstand für die Mittel-FRET- und Niedrig-FRET-Populationen < R DA > E , AV = 48,7 Å und 54,2 Å für beide Strukturen waren ( 5B). Die größte Abweichung von 2,9 Å wurde im Mittel-FRET-Zustand gefunden. Bei der Betrachtung der Unsicherheit der Verteilung, von der Annahme von κ 2 = 2/3 gibt es einen maximalen Fehler von 2,5% im gemessenen Abstand. Kurz gesagt, man kann feststellen, dass es möglich ist, Angstrom-Genauigkeit auf experimentell bestimmten Abständen zu erreichen.
Abbildung 1: Experimentelle Einrichtung und Datenregistrierung für PIE-MFD. ( A ) Ein typischer Multiparameter-Fluoreszenz-Detektionsaufbau ist dargestellt und besteht aus vier Detektoren, die zwei verschiedene Spektralfenster abdecken. Detektoren sind mit der zeitkorrelierten Einzel-Photonen-Zähl- (TCSPC) -Elektronik verbunden. ( B ) In TCSPC wird jedes Photon durch drei Parameter identifiziert: (i) Mikrozeit oder Zeit nach dem Anregungsimpuls; (Ii) Makro-Zeit oder die ZahlVon Erregungspulsen vom Beginn des Experiments; Und (iii) Kanalnummer. Diese drei Parameter sind für die Offline-Analyse erforderlich. ( C ) Einzelne Moleküle diffundieren frei durch das konfokale Volumen, und Photonen werden emittiert, so dass ein Platzen von Photonen als Funktion der Zeit bleibt. ( D ) Jeder ausgewählte Burst wird entsprechend angepasst und zur Darstellung von mehrdimensionalen Histogrammen verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Burst-Analyse mit verschiedenen Fluoreszenz-Parametern. ( A ) FRET-Effizienz gegenüber Makrotime, ( B ) FRET-Effizienz gegenüber T (G + R) | D - T R | A und ( C ) FRET-Effizienz gegenüber S PIE für dieNiedrig-FRET oder 15 bp dsDNA. T (G + R) | D ist die Burst-Dauer im Aufforderungskanal und T R | A ist die Burst-Dauer im verzögerten Kanal (T R | A ) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur anzuzeigen.
Abbildung 3: F D / F A und Lebensdauer des Spenders gegenüber der FRET-Effizienz. Zweidimensionale Histogramme zur Darstellung der FRET-Effizienz ( A ); Das Verhältnis von Donor über Akzeptorfluoreszenz, F D / F A , ( B ); Und Spenderanisotropie r D ( C ) gegenüber der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des Spenders in Gegenwart von Akzeptor < τ D ( A ) > f . Die entschlossenen KorrekturenFaktoren sind: < B G > = 0,64, < B R > = 0,37, β = 0,08 (der Bruchteil der direkten Anregung des Akzeptors mit dem Spenderanregungslaser), α = 0,017 und g G / g R = 3,7 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: PDA-Vergleiche von High-FRET und Low-FRET dsDNA. Zeitfenster PDA Analyse bei 2 ms, mit einer halben Breite von 6% der mittleren FRET Effizienz Abstand. Jeder Abstand ist Gaussian verteilt mit 6% des < R DA > E als Breite (hw DA ). ( A ) Für die Probe HFRET ist der Interdye-Abstand < R DA > E (HFRET) = 45,7 Å. ( B ) Für die Probe LFRET beträgt der Abstand < R DA > E (LFRET) = 59,7 Å. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: PIE-MFD der Ligandenbindungsdomäne des NMDA-Rezeptors in Gegenwart des Antagonisten DCKA. ( A ) Zweidimensionales Histogramm von F D / F A gegenüber der Lebensdauer des Spenders in Gegenwart des Akzeptors < τ D ( A ) > f und der Anisotropie des Spenders gegenüber < τ D ( A ) > f Für die LBD mit DCKA. EindimensionaleAl Projektionen für F D / F A und werden ebenfalls gezeigt. Die statische FRET-Zeile wird rot dargestellt. Pure Donor- und Akzeptor-Fluoreszenz ( F D und F A ) werden für den Hintergrund korrigiert (< B G > = 0. 940 kHz und < B R > = 0,522 kHz), Spektral-Übersprechen (α = 1,7%) und Detektionseffizienz Verhältnis (g G / g R = 3,7). Bei der Anisotropie gegenüber < τ D ( A ) > f Histogrammen hat die Perrin'sche Gleichung eine Rotationskorrelation von ρ = 2,5 ns. ( B ) PDA bei einem 10-ms-Zeitfenster Δt. Ein einzelner Zustand wird benötigt. Das Modell passt alle Zeitfenster schön. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Aktion | Tor |
| Mittenlaserstrahl. | |
| Ausrichten Pinhole. | FCS-Experiment (Abschnitt 5). |
| Melder ausrichten. | Maximieren Sie CPM. |
| Objektivkorrekturring einstellen | Minimieren Sie t diff und maximieren Sie CPM. |
| Festlegung der Instrumentenreaktionsfunktion (IRF). | TCSPC @ SMD im TTTR-Modus. Meßstreu-Zerfallmuster messen |
| Bestimmen Sie den G-Faktor für jedes Spektralfenster. | TCSPC @ SMD im TTTR-Modus. Vergleiche Intensitäten bilden Zerfallsschwänze passend für Polarisationen. |
| Ermittlung des Erkennungswirkungsgrades in Spektralfenstern (g R / g G ). | (I) Intensitätsmessungen eines Farbstoffs mit breitem Emissionsspektrum (nM-Konzentration). (Ii) Meßreferenz FRET-Lineale (pM-Konzentration)Ation). In MFD sollte die Subpopulation auf die statische FRET-Linie fallen. |
| Führen Sie die Abschlussprüfung (Lebensdauer und Anisotropie) durch. | Kontrollierte Lebensdauer und Anisotropie aus der Einzelmolekülmessung von frei diffundierendem Farbstoff mit einem einzigen exponentiellen Zerfall ( zB Rhodamin 110). |
| Bestimmen Sie das Verhältnis des Akzeptors über die Spenderquantenausbeute. | (I) Stöchiometrie-Plot (S PIE ) Gl. 1. und 4.2. |
| Bestimmen Sie die Hintergrundzählrate. | Intensitätsmessungen des ausgewählten "Puffers". |
| Kreuzgespräch (α) bestimmen. | Intensitätsmessungen von Spenderfarbstoff berücksichtigen das Fluoreszenzemissionsspektrum und die Nachweiswirkungsgrade. |
Tabelle 1: Kalibrierschritte für FRET-Experimente in Einzelmolekülversuchen.
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Discussion
In dieser Arbeit wird das Protokoll zur Ausrichtung, Kalibrierung und Messung von Interdye-Abständen mit hoher Präzision unter Verwendung von PIE-MFD-Einzelmolekül-FRET-Experimenten vorgestellt. Durch sorgfältige Kalibrierung aller Instrumentalparameter kann man die Genauigkeit der gemessenen Distanzen erhöhen und die Angstrom-Genauigkeit erreichen. Dazu werden verschiedene multidimensionale Histogramme verwendet, um Populationen zur weiteren Charakterisierung zu analysieren und zu identifizieren. Unter Verwendung der mittleren Makrozeit, um die Stabilität der gemessenen Proben zu verifizieren, ist es möglich, die Donor- und Akzeptor-Photobleichung zu korrigieren und FRET-Populationen basierend auf dem Stöchiometrieparameter auszuwählen. Allerdings können sich die photophysikalischen Eigenschaften des Akzeptors in Abhängigkeit von der Position des Etiketts ändern. So kann man eine S PIE- Verteilung verwenden, um die Akzeptorquantenausbeute richtig zu korrigieren. Eine korrekte photophysikalische Charakterisierung ist notwendig, um den Gamma-Faktor (ƴ) zu bestimmen, der zusammen mit anderen KorrekturfaktenOrs ( zB α für Übersprechen und β zur Akzeptoranregung mit dem Spenderlaser) verwendet werden, um die Genauigkeit des gemessenen Interdye-Abstandes zu erhöhen. Dieser Ansatz wurde unter Verwendung von zwei entworfenen dsDNA-Standardproben bestätigt, und eine Genauigkeit von & ndash; 1 Å im Vergleich zu den erwarteten Werten wurde bestimmt.
Unterschiedliche Farbstoffselektionen erfordern die Anpassung der optischen Mikroskopelemente, wie die dichroitischen und Bandpassfilter, um das richtige Spektralfenster der ausgewählten Farbstoffe aufzunehmen. Dementsprechend müssen gepulste Laser ausgewählt werden. Noch wichtiger ist, dass die Auswahl der Farbstoffe aufgrund mehrerer möglicher photophysikalischer Artefakte, wie Akzeptor- und Spenderbleiche, Triplet- oder Farbstoffblinkungen oder Farbstoff, der an Proteinoberflächen haftet, entscheidend ist. Diese Artefakte könnten die Interpretation der experimentellen Daten beeinträchtigen. MFD ist ideal in diesem Szenario, weil durch die Prüfung mehrerer Parameter, ist es möglich, die Quellen dieser Artefakte zu identifizieren, richtigFür sie, oder zumindest bewusst sein ihrer Existenz. Der Dipolorientierungsparameter, der meistens als κ 2 angenommen wurde = 2/3, können größere Abweichungen der ermittelten Distanz verursachen, wenn der Farbstoff bevorzugt an der Oberfläche der Biomoleküle haftet. Anisotropie der Spenderprobe, Akzeptorprobe und Spenderakzeptor kann helfen, zu lösen, ob diese Annahme gültig ist oder nicht. In diesem Experiment wurde festgestellt, dass es einen maximalen Fehler von ~ 2,5% auf dem gemessenen Abstand gibt, verglichen mit nicht die richtige Korrektur und das Erhalten eines 10-20% Fehler. Die Quantenausbeute des Akzeptors kann eine größere Fehlerquelle erzeugen. So ist S PIE wichtig für die Beantwortung dieser wichtigen Frage.
Es ist möglich, eine ähnliche Strategie anzuwenden, um die Konformationslandschaft der Ligandenbindungsdomäne des NMDA-Rezeptors zu verstehen, um den Mechanismus des Agonismus auf dem NMDAR zu verstehen. Es wurde festgestellt, dass die LBD in tDie Anwesenheit eines Gegenspielers scheut die Zugänglichkeit eines Hoch-FRET-Zustands, der für die Öffnung des Kanals 73 verantwortlich ist. Beim Vergleich von experimentell abgeleiteten Abständen und den erwarteten Werten auf der Grundlage kristallographischer Informationen wurde eine Vereinbarung innerhalb von 3 Å erreicht. Noch wichtiger ist, dass die neuen, bevölkerten Staaten mit ähnlicher Präzision identifiziert werden können.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Einzelmolekül-FRET-Experimente im MFD-Modus 42 es erlauben, die experimentellen Artefakte richtig zu berücksichtigen und den Interdye-Abstand im Bereich von ~ 30-70 Å abzuleiten. Wenn anstelle eines einzigen gemessenen Abstandes ein Netz von Abständen abgeleitet wird, ist es möglich, diese als Beschränkungen in der Strukturmodellierung zu verwenden, insbesondere für Zustände, die mit mehr Standardmethoden der Strukturbiologie schwer zu charakterisieren sind.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen mit dem Inhalt dieses Artikels haben.
Acknowledgments
VJ und HS bestätigen Unterstützung von NIH R01 GM094246 bis VJ. HS erkennt Start-up-Fonds aus dem Clemson University Creative Anfrage-Programm und dem Zentrum für Optische Materialien Wissenschaft und Technik Technologien an der Clemson University. Dieses Projekt wurde auch von einem Ausbildungsstipendium des Keck-Zentrums für interdisziplinäre Bioscience Training der Golfküstenkonsortien (NIGMS Grant Nr. 1 T32GM089657-05) und der Schissler Stiftungsstipendium für Translationsstudien allgemeiner menschlicher Krankheiten an DD unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| charcoal | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| syringe filter | Fisherbrand | 09-719C | size: 0.20 µm |
| chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | 1.5 borosilicate glass, 8 wells |
| microscope cover glass | Fisher Scientific | 063014-9 | size: 24 x 60-1.5 |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 148859 | nuclease free |
| tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | 10% solution of Polysorbate 20 |
| acceptor DNA strand (High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| acceptor DNA strand (Low FRET) | Integrated DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| donor DNA strand | Integrated DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| DNA strand (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| thermal cycler | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | termed cyan-green fluorophore in the manuscript |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | termed far-red fluorophore in the manuscript |
| Rhodamine 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| Rhodamine 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | For culture of E. coli |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection |
| Tetracyline | Calbiochem | 58346 | Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation |
| Origami B(DE3) Competent Cells | Millipore | 70837-3 | Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | For induction of E. coli protein expression |
| HiTrap Chelating HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 Desalting Column | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | FPLC Instrument |
| Dialysis tubing | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll |
| Dichroics | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 Beam splitter polarizer | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | 10 x 10 film polarizer |
| Green pass filer | Chroma | ET525/50m | ET525/50m 25 mm diameter mount |
| Red pass filter | Chroma | ET720/150m | ET720/150m 25 mm diameter mount |
| Power Meter | ThorLabd | PM200 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 fluorometer | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC electronics for ensemble measurements |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | Blue diode laser |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | Red diode laser |
| Olympus IX73 Microscope | Olympus | IX73P2F | Microscope frame |
| PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Optimized for green detection |
| PMA 50 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Optimized for ed shifter sensitivity |
| 485 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640 nm laser | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 and TTTR acqusition software | PicoQuant | 930021 | Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software |
| SEPIA II SLM 828 and SEPIA software | PicoQuant | 910028 | Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller. |
| computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram:16GB |
| FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
| MFD suite | Heinrich Heine Unviersity | It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
References
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