Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

Published: May 13, 2017 doi: 10.3791/55623
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 2
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

Summary

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

Abstract

פרוטוקול על איך לבצע דיוק גבוהה מדידות מרחק interdye באמצעות העברת אנרגיה תהודה Förster (סריג) ברמת מולקולה אחת במצב multifarameter פלואורסצנטי (MFD) מוצג כאן. MFD ממקסם את השימוש של כל "ממדים" של הקרינה כדי להפחית חפצים מלאכותיים photophysical ומאפשר למדידת המרחק interdye עם דיוק עד ~ 1 ב ביומולקולות נוקשה. שיטה זו שימשה לזיהוי שלושה מצבי קונפורמציה של תחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA) כדי להסביר את הפעלת הקולטן על ליגנד מחייב. כאשר משווים את מבנים קריסטלוגרפיים ידוע עם מדידות ניסיוני, הם הסכימו בתוך פחות מ 3 עבור ביומולקולות דינמי יותר. איסוף קבוצה של מעצורים המרחק המכסה את כל ממדי של biomolecules יאפשר לספק מודל מבני של biomolecul דינמיEs.

Introduction

המטרה הבסיסית של מחקרים ביולוגיים מבניים היא לפענח את הקשר בין המבנה לתפקוד של מכונות biomolecular. הרושם החזותי הראשון של ביומולקולות ( למשל, חלבונים וחומצות גרעין) התרחש בשנות החמישים באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן של פיתוח רנטגן 1 , 2 . קריסטלוגרפיה רנטגן מספק ברזולוציה גבוהה, מידע מבניים סטטי מוגבל על ידי האריזה גביש. לכן, חוסר הקיום הטמון של מודלים מבניים רנטגן shuns את הטבע הדינמי של biomolecules, גורם המשפיע על פונקציות ביולוגיות ביותר 3 , 4 , 5 . תהודה מגנטית גרעינית (תמ"ג) 6 , 7 , 8 סיפק פתרון חלופי לבעיה על ידי פתרון מודלים מבניים בתמיסות מימיות. יתרון גדולשל תמ"ג היא היכולת שלו לשחזר את הטבע הדינמי הפנימי של biomolecules והרכבים קונפורמציה, אשר מסייע להבהיר את היחסים המהותיים בין המבנה, הדינמיקה, ואת הפונקציה 3 , 4 , 5 . עם זאת, תמ"ג, המוגבל על ידי גודל המדגם וכמויות גדולות של מדגם, דורש אסטרטגיות תיוג מורכבות עבור מערכות גדולות יותר. לכן, יש צורך דחוף לפתח שיטות חלופיות בביולוגיה מבנית.

מבחינה היסטורית, Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) 9 לא לקח תפקיד חשוב בביולוגיה מבנית בגלל misconception כי סריג מספק דיוק נמוך מדידות המרחק. זוהי המטרה של פרוטוקול זה כדי לבקר את היכולת של סריג כדי לקבוע מרחקים בסולם ננומטר, כך מרחקים אלה יכולים לשמש לבניית מודלים מבניים של biomolecules. הראשון ניסיוני verificAtion של תלות R - 6 על יעילות סריג נעשה על ידי Stryer ב -1967 10 על ידי מדידת polyprolines באורך שונים כמו "השליט ספקטרוסקופית". ניסוי דומה הושג ברמת מולקולה אחת בשנת 2005 11 . מולקולות פוליפרו-ליין התגלו כאי-אידיאליות, ולכן, מולקולות דנ"א בעלות גדילה כפולה שימשו מאוחר יותר 12 . זה פתח את החלון למדידות המרחק המדויק ואת הרעיון של שימוש FRET לזהות מאפיינים מבניים של ביומולקולות.

FRET הוא אופטימלי כאשר טווח המרחק interdye הוא מ ~ 0.6-1.3 R 0 , כאשר R 0 הוא המרחק Förster. עבור fluorophores טיפוסית המשמשים יחיד מולקולה ניסויים סריג, R 0 הוא ~ 50 Å. בדרך כלל, FRET מציע יתרונות רבים על פני שיטות אחרות ביכולתה לפתור ולהבדיל את המבנים ואת הדינמיקה במערכות הטרוגניות: (i) בשל הרגישות האולטימטיבית של הקרינה, יחיד מולקולה ניסויים סריג 13 , 14 , 15 , 16 יכול לפתור הרכבים הטרוגניים על ידי ספירה ישירה ובו זמנית אפיון המבנים של חבריו הפרט. (Ii) מסלולי תגובה מורכבים ניתן לפענח ישירות במחקרים מולקולה בודדת, משום שאין צורך בסנכרון של אנסמבל. (Iii) סריג יכול לגשת למגוון רחב של תחומים הזמניים כי טווח מעל 10 שנים בזמן, כיסוי מגוון רחב של דינמיקה רלוונטית ביולוגית. (IV) ניסויים סריג ניתן לבצע בכל תנאי פתרון, במבחנה, כמו גם in vivo . השילוב של סריג עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר לימוד של מבנים מולקולרית אינטראקציות ישירות תאים חיים 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , אפילו עם דיוק גבוה 20 . (V) סריג ניתן ליישם מערכות כמעט בכל גודל ( למשל, olipomers polyproline 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV transcriptase 26 , ו ribosomes 27 ). (Vi) לבסוף, רשת של מרחקים המכיל את כל ממדי biomolecules יכול לשמש כדי להפיק מודלים מבניים של מולקולות סטטי או דינמי 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

לכן, ספקטרוסקופית יחיד מולקולה סריג ניתן להשתמש כדי להפיק מרחקים כי הם מדויקים מספיק כדי לשמש מודלים מבודדים מבודדים מרחוק 26 . זה אפשרי על ידי ניצול של multiparameter פלואורסצנטי איתור (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , אשר מנצל שמונה מימדים של מידע הקרינה ( כלומר, ספקטרום עירור, ספקטרום הקרינה, אניזוטרופיה, חיים הקרינה, התשואה הקוונטית פלואורסצנטי, זמן macroscopic, את עוצמות הקרינה, ואת המרחק בין fluorophores) כדי במדויק ומדויק לספק מגבלות מרחק. בנוסף, פעימה interleaved עירור (PIE) משולב עם MFD(PIE-MFD) 42 לפקח ישיר עירור ישיר פלואורסצנטי ולבחור אירועים מולקולה אחת הנובעת דגימות המכיל 1: 1 התורם ל-סטואיצ'יומטרי. התקנה טיפוסית PIE-MFD משתמשת בשני פעמי לייזרים מעורבים interleaved המחוברים לגוף מיקרוסקופ confocal, שבו זיהוי פוטון מחולק לארבעה ערוצים שונים בחלונות ספקטראליים שונים תכונות קיטוב. פרטים נוספים ניתן למצוא באיור 1 .

חשוב לציין כי סריג חייב להיות משולב עם שיטות חישוביות להשיג מודלים דמויי מבנה אטומיסטי כי הם בקנה אחד עם תוצאות סריג 26 , 30 . זה לא המטרה של הפרוטוקול הנוכחי ללכת על המתודולוגיה המשויך לבנות מודלים מבניים עם מרחקים נגזר סריג. עם זאת, גישות אלה יושמו בשילוב עם טכניקות אחרות ( למשל, זווית קטנה פיזור רנטגןIng או תהודה פרמגנטית אלקטרונים), הלידה לתחום הביולוגיה המבנית האינטגרטיבית 43 , 44 , 45 , 46 . המטרה הנוכחית היא לסלול את הדרך עבור סריג ככלי כמותי בביולוגיה מבנית. לדוגמה, מתודולוגיה זו שימשה לזיהוי שלושה מצבי קונפורמציה בתחום LigD של LDD של קולטן N-Methyl-D-aspartate (NMDA). המטרה הסופית היא להתגבר על המגבלות הנ"ל ולהביא FRET בין השיטות האינטגרטיביות המשמשים לקביעת המבנים של ביומולקולות על ידי מתן מרחקים נמדדים בדייקנות גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת PBS הכנת טיפול הקאמרית

הערה: ללבוש מעיל מעבדה כפפות חד פעמיות בעת ביצוע ניסויים כימיים רטובים. השתמש בהגנה על העין בעת ​​יישור הלייזר.

  1. הכנת PBS חיץ
    1. ממיסים 4.5 גרם של Na 2 HPO 4 , 0.44 גרם NaH 2 PO 4 , ו -3.5 גרם של NaCl ב 400 מ"ל של מים מזוקקים. ודא pH של 7.5 ו לעקר את הפתרון על ידי מעוקר על מחזור נוזלי עבור 1 שעות (בהתאם למערכת החיטוי).
    2. קח 15 מ"ל של פתרון PBS ומערבבים אותו עם 0.1 גרם של פחם. סינון תערובת באמצעות מסנן מזרק רגיל 20 מ"ל עם 0.2 נקבוביות מיקרומטר גודל. חותם ולאחסן את חיץ PBS בטמפרטורת החדר.
  2. מיקרוסקופ מכוסה זכוכית זכוכית טיפול
    1. הוסף 500 μL של מים מזוקקים 5 μL של polysorbate 20 פעילי שטח nonionic (ראה את רשימת החומרים)כדי לכסות זכוכית camber מערכת (ראה את רשימת החומרים) ומערבבים היטב. תן לזה להשרות 30 דקות. הסר את הפתרון polysorbate 20 לשטוף את החדר עם מים מזוקקים פעמיים. תן לזה להתייבש.
      הערה: החדר מוכן כעת לשימוש.

2. הכנת דנ"א לדוגמא

הערה: השתמש מעוצב דנ"א מתויג גדילי (ראה את רשימת חומרים) ליצירת דגימות כפול גדילי דנ"א (dsDNA) סטנדרטיים. אוליגוס מעוצב לא צריך צבעים בסוף פולימר על מנת למנוע חפצים שיכולים לסכן את המרחק שנקבע. רצף ה- DNA צריך להיות נבחר להתנהג כמו גוף נוקשה.

  1. הוסף 1.5 μL של התורם שכותרתו דנ"א גדיל ו 4.5 μL של מחרוזת DNA חינם (acceptor שכותרתו או לא שכותרת) לתוך צינור microfuge ומערבבים אותם עם 24 μL של מים nuclease ללא.
    הערה: בהתאם לערבוב של oligonucleotides שנבחרו, הדגימות הבאות ייווצר: לא- FRET, loW-FRET, או גבוה DREDNAs סריג.
  2. הכלאה של ה- DNA באמצעות מערבל תרמי התהליך הבא: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 50 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, 40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 30 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והחזקה ב 5 מעלות צלזיוס.
    הערה: תקני dsDNA שנוצרו ניתן לשמור במקפיא 20 ° C לאחסון לטווח ארוך או ניתן להשתמש בהם באופן מיידי.

3. הכנת חלבון לדוגמא

הערה: החל מ- DNA רקומביננטי עבור הביטוי של חלבון של עניין במערכות חיידקים, ניתן לשנות את שאריות שמהם המרחקים הם להיות נמדד לתוך ציסטאין. לשם כך, השתמשו בטכניקות mutagenesis סטנדרטיות המכוונות לאתר 47 . כדי להקל על טיהור חלבונים, לשכפל את DNA רקומביננטי ומוטציה לתוך וקטור המכיל תג טיהור ( למשל,התג שלו). גלוטמט תת יחידה 1 ליגנד מחייב תחום (LBD) מ NMDA גלוטמט קולטן ionotropic (GluN1) LBD ( כלומר, NMDA GluN1 LBD משובטים לתוך וקטור pET-22b (+) שימש.

  1. ביטוי חלבון
    1. להפוך את ה- DNA פלסמיד לתוך מערכת הביטוי של בחירה 48 .
      הערה: השלבים הבאים יניחו כי הביטוי של חלבון מסיס הוא השתנה Escherichia coli . טיהור, למשל, תאים יונקים transfected 49 או transduced תאים חרקים 50 , הוא גם אפשרי, צעדים מפורטים ניתן למצוא במקום אחר. ודא כי זן E. coli שנבחר מתאים חלבון של עניין. לדוגמה, הביטוי של חלבונים המכילים גשרים דיסולפידים דורש זן של תאים המוסמכות עם תא פחות תאיים הפחתת פחות (ראה את רשימת החומרים).
    2. לחסן סטרטר <Em> E. Coli תרבות באמצעות טיפ פיפטה סטרילית להרים מושבה אחת שינתה 48 . זרוק אותו 100 מ"ל של מדיום LB סלקטיבי (ראה את רשימת החומרים) ולאפשר לתרבות לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    3. הכינו מרק LB (ראה את רשימת החומרים). Autoclave אותו לעקר.
    4. לחסן תרבויות בקנה מידה גדול של השתנה E. coli על ידי הוספת תרבות לילה ל 2 L של בינוני LB סלקטיבי ב 1: 500 יחס.
    5. במהלך השעות הקרובות, להעריך את הצמיחה של התרבות על ידי ניטור הקריאות ספיגה (ABS) של התרבות ב 600 ננומטר, המכונה לעתים קרובות צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ), או באמצעות צפיפות תאים מטר. שים לב שהריבוי גדל עם הזמן.
    6. לעורר ביטוי חלבון עם ריכוז סופי של 0.5 מ"מ isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כאשר התרבות מגיע OD 600 של 0.7. לנער המושרה E. coli ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות.
    7. לאחר אינדוקציה חלבון, גלולה E. coli ידי ספינינג במשך 20 דקות ב 3000 xg ו 4 ° C. מחק supernatant ולאחסן את גלולה E. coli המכיל את חלבון תאיים ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. טיהור חלבונים
    1. Lyse E. coli באמצעות שיטת תמוגה של בחירה ( למשל, sonication, העיתונות הצרפתית, cavitation חנקן, וכו ' ) 51 .
    2. ספין במורד הממברנה ופסולת התא על ידי centrifuging lysate עבור 1 שעות ב 185,000 XG ו 4 ° C.
    3. עבור חלבון מתויג שלו, לטעון את supernatant על מוטה equilibant, ניקל, טעון, משותק מתכת כרונית (IMAC) באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) המערכת (ראה טבלת חומרים ) 52 .
      הערה: חיץ איזון עבור NMDA GluN1 LBD: 200 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס, ו 1 מ"מ גליצין, pH 8. חיץ אלוטיון עבור NMDA GluN1 LBD: 200 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס, 1 מ"מ גליצין, ו 400 מ"מ Imidazole, pH 8.
      1. שטפו את העמודה IMAC עם המאגר המכיל כמות נמוכה (~ 12 מ"מ) של imidazole.
      2. Elute את החלבון מהעמודה IMAC באמצעות שיפוע ליניארי של imidazole מ 12 מ"מ ל 400 מ"מ.
    4. Dialyze חלבון לילה במאזן equilibration ללא imidazole 53 על ידי הנחת eluate מ 3.2.3.2 שלב לתוך צינור דיאליזה ו שקוע אותו במאגר איזון תחת ערבוב מתמשך במשך 2-3 שעות. חזור שוב לפחות פעם אחת.
      הערה: צעדים 3.2.3-3.2.6 מניחים את הטיהור של חלבון מתויג שלו. אם טיהור באמצעות שיטה אחרת, להתאים את הפרוטוקול בהתאם.
    5. לכמת את כמות החלבון על ידי לקיחת ספיגת ב 280 ננומטר של חלבון dialyzed ושימוש חוק הבירה ( ספיגת יחידת = ε L C , שבו ε הוא מקדם ההכחדה (M -1 ס"מ -1), אשר ניתן להשיג כאן 54 ; L הוא אורך הנתיב האור (ס"מ); ו- C הוא ריכוז החלבון (M)).
      הערה: מבחני כימות חלבון שונים זמינים, כולל assay בראדפורד assay חומצה bicinchoninic. שניהם מספקים תוצאות מדויקות.
  3. תיוג חלבון
    1. הוסף תורם (maleimide תגובתי צבע ירוק ציאן) ו acceptor (maleimide תגובתי צבע אדום רחוק) fluorophores לחלבון מטוהרים בשעה 1: 1: 8 חלבון: התורם: acceptor טוחנת יחס.
    2. דגירה החלבון תערובת fluorophore על קרח במשך 30 דקות. פעמים הדגירה ארוכה אפשריים.
    3. Pack 0.5 מ"ל Ni-Nitrilotriacetic חומצה (Ni-NTA) עמוד agarose (ראה את רשימת החומרים) ו equilibrate אותו באמצעות חיץ איזון אותו כמו בשלב 3.2.3 בעוד החלבון הוא incubating.
      הערה: שמור את כמות החלבון טעון בהתאם קיבולת שרף מחייב.
    4. לאחר 30 דקות בCubation, לטעון את תערובת החלבון / fluorophore על עמודה מוכן בשלב 3.3.3 ו לטהר על ידי זרימת הכבידה.
    5. לשטוף את fluorophore עודף עם 5 מ"ל של חיץ equilibration.
    6. Elute את החלבון שכותרתו על ידי כוח הכבידה מהטור ארבע פעמים עם 0.5 מ"ל של חיץ elution. מכיוון שהחלבון כבר טוהר מחלבונים אחרים, אין צורך בשיפוע.
    7. בדוק כל eluate עם ספקטרומטר UV-Vis כדי לזהות איזה חלק מכיל את החלבון שכותרתו. סרוק את ספיגת מ 230-700 ננומטר כדי להיות מסוגל להבטיח את peaks absorbance מן החלבון (280 ננומטר) וכל fluorophore (493 ננומטר עבור fluorophore ירוק ציאן ו 651 ננומטר עבור fluorophore אדום רחוק) גלויים ב .
      הערה: בדרך כלל, חלבון יהיה elute בחלק 2.
    8. לאזן את עמודה desalting (ראה את לוח החומרים ) עם פחם שטופלו PBS (שלב 1.1).
    9. טען את החלבון שכותרתו על הטור desalting על ידי זרימת הכבידה.
      הערה: יש לשמור על כמות החלבון הטעונה בהתאם לקיבולת העמודה הנבחרת.
    10. Elute באמצעות 3.5 מ"ל של פחם שטופלו PBS על ידי זרימת הכבידה ולאסוף 0.5 מ"ל שברים של eluate.
    11. השתמש ספקטרומטר UV-Vis כדי לסרוק את absorbance של כל eluate מ 230-700 ננומטר כדי לזהות איזה חלק מכיל חלבון שכותרתו.
      הערה: שלבים 3.3.8-3.3.11 משמשים למעשה צעד חילופי חיץ. פרוטוקולים אחרים המשמשים מטרה זו הם גם אפשריים ( למשל, דיאליזה נרחב). לחלופין, אפשר ללכת ישר לשלב 3.3.8 משלב 3.3.2.

4. מדידות דרושות בתנאי אנסמבל (בקובט)

  1. קביעת קבוע פורסטר
    1. סריקה F, פלואורסצנטי fluorophore פליטה (cps), ב fluorimeter על ידי מרגש את התורם ב 15 ננומטר עד אורך הגל המקסימלי שלה absorbance כדי לקבל את מלוא האנשיםספקטרום. צג פליטה החל 5 ננומטר אחרי אורך גל עירור ומסתיים 150 ננומטר מאוחר יותר. השתמש בתנאים זווית קסם על ידי הגדרת מקטב פליטה ל 54.7 מעלות ואת מקטבי עירור ל 0 ° 56 .
      הערה: עבור fluorophore התורם בשימוש כאן, מקסימום ABS מתרחשת ב 490 ננומטר; 475 ננומטר משמש גל של עירור, ואת פליטת 480-650 ננומטר הוא פיקוח. עבור acceptor, מקסימום ABS מתרחשת ב 645 ננומטר; 630 ננומטר משמש אורך גל עירור, ואת פליטת מ 635-735 ננומטר הוא פיקוח.
    2. השתמש fluorimeter לבצע סריקה עירור של fluorophore acceptor (ABS A ) הנעים בין 400-700 ננומטר ולהשתמש בתנאים זווית קסם על ידי הגדרת מקטב פליטה ל 54.7 ° ואת מקטבי עירור ל 0 ° 56 . הגדר את monochromator פליטה ל -15 ננומטר לאחר אורך גל פליטה מקסימלית. לנרמל את מקסימום אקסי- ערך.
    3. בטבלאות שפורסמו, אתר את מקדם ההכחדה של המקבל, ε A (M -1 ס"מ -1 ) 56 , או השתמש בערכים שסופקו על ידי היצרן.
      הערה: הערך שפורסם עבור fluorophore acceptor המשמשים כתב היד הזה הוא ε A647 = 270,000 ס"מ -1 M -156 .
    4. חישוב החפיפה הספקטראלית באמצעות J = Σf D (ABS A ε A ) λ 4 , כאשר f D , ABS A , ε A הוגדרו לעיל λ והוא אורך הגל (nm). השתמש בגליון עבודה כדי לרשום בעמודות את כל הערכים התלויים באורך גל המתקבלים בשלבים 4.1.1-4.1.3. ליישר אותם לפי אורך גל. בצע את הסיכום מאורך הגל המינימלי של פליטת התורם (λ min ) לאורך הגל המרבי של absorbanc acceptorE ( מקסימום λ).
    5. לחשב את קבוע Förster (R o ) תוך שימוש בנוסחה הבאה R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J ← κ 2 · Φ F, D = n -4 , כאשר J הוא חפיפה ספקטרלית שחושבה קודם לכן בשלב 4.1.4, ² הוא גורם האוריינטציה, F F, D הוא התשואה הקוונטית פלואורסצנטי של fluorophore התורם, ו N הוא המדד השבירה של המדיום שבו fluorophore ממוקם.
      הערה: השתמש ב- n = 1.33 (אם נעשה שימוש במאגר מימי) ו- κ 2 = 2/3.
    6. אתר את ערך התשואה הקוונטית של fluorophore התורם (Φ F, D , (ראה סימוכין 57) והשתמשו בערך החפיפה הספקטראלית המתקבלת בשלב 4.1.4 כדי לחשב את הערך הסופי של קבוע Förster באמצעות eqמשלב 4.1.5.
      הערה: אם התשואה הקוונטית אינה זמינה, בצע את שלב 4.2, להלן, כדי לחשב אותה. במקרה זה, השתמש Φ F, D = 0.8, אשר תואמת את החיים התורם τ D, r = 4.0 ns.
  2. קביעת תשואה קוונטית פלואורסצנטי
    הערה: ההליך הבא מניח רק מרווה דינמית. כדי לשקול את מרווה סטטי, עיין התייחסות 56. עם זאת, ניסויים PIE-MFD שימושיים גם בקביעת התשואה הקוונטית, גם במקרה של מרווה סטטי (ראה את התוצאות).
    1. בחר fluorophore התייחסות עם פרופילים absorbance דומים פליטה הן acceptor ואת fluorophores התורם שעבורו התשואה הקוונטית (Φ r ) נקבע.
      הערה: עבור התורם, Φ r = 0.8 ו- τ r = 4 ns, ואילו עבור המקבל, Φ r = 0.32 ו- τ r = 1.17 ns, WHich תואמים את Φ r ו τ r עבור fluorophore ירוק ציאן - ואת oligonucleotides אדום רחוק fluorophore שכותרתו, בהתאמה 57 .
    2. למדוד את הזמן נפתרה זמן ריקבון (f (t)) באמצעות הזמן מתואמת יחיד פוטון ספירה (TCSPC) בשיטה בתנאים זווית הקסם.
    3. להתאים את הקרינה הקרינה עם פונקציה ריקבון מונו או רב מעריכי בצורה של f (t) = Σ i x i e -t / τ i , כאשר x i הוא חלק האוכלוסייה ו τ i הוא חיים הקרינה האוכלוסייה.
    4. חישוב תקופות חיים ממוצעת של מינים, <τ> x = Σx i τ i , שם x i הוא חלק האוכלוסייה ו τ i הוא חיים הקרינה האוכלוסייה.
    5. השתמש הנוסחת דואר Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r כדי לחשב את התשואה הקוונטית פלואורסצנטי של fluorophore התורם על ידי חיבור בחיי פלואורסצנטי התשואה הקוונטית של ההפניה, כמו גם את החיים הקרינה של fluorophore התורם.
      הערה: שיטה זו מניחה מרווה דינמית. עבור קביעות אחרות F, D , בצע Lakowicz 56 .

5. ניסוי יישור עבור PIE-MFD יחיד מולקולה איתור (SMD)

הערה: עדיף לכבות את האורות בעת לקיחת מדידות.

  1. התאמת ציוד (איור 1)
    הערה: הבית נבנה MFD ההתקנה מתואר באיור 1 , עם שני לייזרים פועם ו 4 ערוצי זיהוי בגוף מיקרוסקופ הפוכה, משמש לניסוי זה. יש מערכות מסחריות דומות.
    1. הפעל את לייזרים 485-nm ו 640 ננומטר וכל הגלאים של ההתקנה MFD. פתח את התוכנה השולטת ברכישת לייזרים ובספקים. ודא כי קצב החזרה בלייזר הוא 40 MHz.
    2. הגדר את 485 ננומטר כוח לייזר פעמו ל 60 μW במישור תמונה של המטרה 60X 1.2 NA מים טבילה ואת 640 ננומטר כוח לייזר פועם ל 23 μW במצב עירור interleaved פעמו (PIE-MFD) 42 .
      הערה: כדי להגדיר PIE-MFD, שתי פעימות הלייזר מתעכבות בתוכנת בקר הלייזר. עבור עירור לייזר 485 ננומטר, ערוצי TCSPC זיהוי (ערוצי TAC) הם 1-12,499 (ערוץ "מהיר"). עבור 640 ננומטר לייזר עירור, ערוצי TCSPC זיהוי (ערוצי TAC) הם 12,499-50,000 ("עיכוב" ערוץ).
    3. הוסף נוזל טבילה אובייקטיבי (ירידה של מים מזוקקים) בין העדשה מיקרוסקופ אובייקטיבי שקופיות זכוכית כיסוי. כדי להבטיח את המטוס התמונה בתוך הפתרון רחוק surfa זכוכיתלסה"נ, סובב את כפתור ההתאמה אחד וחצי פונה לאחר מציאת נקודת המוקד השנייה בהירות עקב השתקפות של לייזרים על ממשק זכוכית נוזלי.
    4. הוסף 1 μL של 100 ננו Rhodamine 110 ל 50 μL של מים מזוקקים למרכז זכוכית לכסות. ודא כי הפתרון הוא גם במרכז המטרה מיקרוסקופ.
    5. להתאים את חריר (גודל: 70 מיקרומטר) עמדות (x ו- y לכיוון אחד בכל פעם) תוך ניטור קצב ספירת הפוטון על תוכנת הרכישה כדי למקסם את מספר הפוטונים שזוהו.
  2. מדידה סטנדרטית SMD (עבודה בחדר חשוך)
    1. השתמש מדגם משלב 5.1.4 ו רשומה 120 שניות של שיעור לספור על ידי לחיצה על כפתור "התחל" על הזמן מתויג זמן נפתרה (TTTR) בלוח הבקרה בפורמט ". Ht3" 58 על רכישת התוכנה.
    2. חישוב מנותק ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנטי (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( כלומר, מדידת FCS) כדי לקבוע את הזמן האופייני של דיפוזיה, מספר המולקולות בנפח confocal, קינטיקה שלישיות המדינה, ואת הבהירות המולקולרית 62 .
      1. פתח את התוכנה עבור FCS (קריסטין, MFD Suite). בחר בהגדרות הניסוי על ידי לחיצה על "אפשרויות" -> "בחר הגדר". בחר קובץ עם הגדרות ניסיוניות דומות ולחץ על "קבל פרמטרים מקובץ" כדי לקרוא את פרטי הכותרת בקובץ.
      2. בחר "הפעלה" -> "קורלציה" כדי לבצע FCS.
        הערה: ודא שמספרי הערוץ צוינו כהלכה וכי "שער TAC" (ערוצי TCSPC) נבדק כדי לבחור בהתאם לערוצים הנחוצים או לעיכובים.
      3. בחר "הפעלה" -> "גלובל פיט של קורלציה קורבס" כדי לפתוח את שגרת הכושר. השתמש "משוואה # 24" על softwarE ולחץ על "התחל".
        הערה: משוואה # 24 על התוכנה מתארת ​​את הפונקציה אוטוקורלציה ( G ) של מולקולות ניאון מפוזרות באופן חופשי על פני פרופיל תאורת גאוס תלת מימדי, כגון 61 :
        משוואה 36
        כאשר N הוא המספר הממוצע של המולקולות בנפח האיתור, x T הוא החלק של המולקולות המפעילות קינטיקה של מדינה משולשת עם הזמן האופייני t t , t c , הוא זמן הקורלציה, t diff הוא זמן הדיפוזיה הקשור לגיאומטריה פרמטר ω , ו- ω מתאר את פרופיל התאורה הגאוסית. לאחר ההתאמה, שימו לב לזמן דיפוזיה ומספר המולקולות בנפח confocal.
    3. הוסף 10 μL של 100 ננומטר Rhodamine 101 לתוך 50 μL של מזוקקיםמים ומערבבים היטב. מניחים את התמהיל על גבי מכסה הזכוכית וודאו שהטיפה נמצאת במרכז העדשה האובייקטיבית. לחץ על כפתור "התחל" בלוח הבקרה TTTR כדי להקליט 120 s של נתונים בפורמט TTTR.
    4. הוסף 1 μL של 100 ננומטר fluorophore אדום עד 50 μL של מים מזוקקים ומערבבים היטב. מקום זה לערבב במרכז העדשה אובייקטיבי. לחץ על "התחל" כפתור ולהקליט 120 s של נתונים בפורמט TTTR.
    5. מקום 50 μL של מים מזוקקים במרכז העדשה אובייקטיבי. לחץ על כפתור "התחל" ורשום 300 s של נתונים בפורמט TTTR.
    6. מקום 50 μL של חיץ PBS במרכז העדשה אובייקטיבי. לחץ על כפתור "התחל" ורשום 300 s של נתונים בפורמט TTTR.
    7. קח 1 μL של תערובת משלב 5.1.4 ומערבבים עם 50 μL של מים מזוקקים. מניחים את התמהיל על משטח הזכוכית. ראשית, לחץ על כפתור "התחל" ולאסוף 10 s של נתונים במצב TTTR. לאחר מכן, לנתח את TTTR מצב הקובץ באמצעות פרץ אינטגרציה הקרינה Lifetime (BIFL) ניתוח תוכנה (פריז, חבילת MFD), כמתואר בשלב 5.3.
      הערה: אמת את מספר ההתפרצויות לשנייה מתוך בחירת ההתפוצצות ותוכנת הניתוח 26 , 61 . אם רמת פרץ היא סביב 35 כל 10 s, זה מתאים למדידת מולקולה אחת.
    8. המשך להקליט את קצב הספירה בפורמט TTTR עבור 1.5 שעות ( כלומר TCSPC ב SMD) להתייחס כסטנדרט מדידה מולקולה אחת.
      הערה: בשל גודל הקובץ הגדול, פיצול גלם "*. 3" קבצים לתוך קבצים בגודל קטן יותר לטעון ולטפל באמצעות BIFL.
  3. ניתוח של דגימות סטנדרטיות באמצעות BIFL
    1. פתח את תוכנת BIFL (פריז).
    2. בחר את ההגדרה עבור PIE בחלון המוקפץ "אישור הגדרת" אוטומטית וקרא את הכותרת על ידי בחירת הקובץ עם הגדרות ניסיוניות דומות. לחץ על "קבל פרמטרים הלוך ושוב"לחץ על" אישור ". שים לב שהחלון הקופץ נסגר ומשולב בחזית פריס לחץ על" אישור "תחת" הבא ".
    3. בחר את הקבצים כדי לנתח על ידי לחיצה על "בחר" על "Data Path Array" כדי לבחור את המדידה לנתח.
      1. לחץ על "פיזור ירוק" (עבור מדידת מים), "ירוק BG" (עבור מדידת חיץ), "ירוק עבה" (עבור מדידה 2 nod Rhodamine 110), "פיזור אדום" (עבור מדידת מים), " אדום ("BGER אדום" (עבור מדידת חום או מים), "עבה אדומה" (עבור מדידת 20 nm Rhodamine 101), "פיזור צהוב" (עבור מדידת מים), "צהוב BG" (עבור מדידת חיץ), ו "צהוב עבה" (עבור מדידת פלואורופור אדום 2 ננומטר אדום).
      2. לחץ על "אישור" תחת "הבא".
        הערה: ערוץ "ירוק" מתאים את האות של גלאי ירוק בערוצים "הנחיה" TCSPC. ה4, אדום "ערוץ מתאים האות של גלאי אדום בערוצים" הנחיה "TCSCP.ערוץ" צהוב "מתאים האות של גלאים אדומים בעכבות TCSPC עיכוב.
    4. לחץ על "התאם" לצד "Data cut Burstwise" כדי להתאים פרמטרים לבחירת מולקולה אחת. בחלון הקופץ החדש, בחר באירועים של מולקולה אחת עם שתי סטיות תקן מתקופת ההגעה הממוצעת של interphoton ("dt") על ידי שינוי זמן ההגעה interfhoton תחת "סף" ומספר הפוטונים המינימלי לאירוע מולקולה בודדת תחת "min #. " לחץ על "Return" כדי לסגור את החלון המוקפץ. לחץ על "אישור" תחת "הבא".
      הערה: הסף, ביחידות ms, תלוי בשיעור ספירת הרקע. מספר מינימלי של פוטונים המשמשים הוא 60.
    5. התאם את החיים הקרינה הראשונית "צבע להתאים פרמטרים" ( למשל , מ, אל, ו - convolution) עבור ליצורD פרמטרים הקרינה ריקבון על "ירוק", "אדום", ו "צהוב" צבעים. באותו חלון, להתאים את "מ" ו "אל" ערכים עבור "הפקודה" ו "עיכוב". לחץ על "Return" כדי לסגור את החלון המוקפץ. לחץ על "אישור" תחת "הבא".
      הערה: ודא שתיבת הסימון עירור 2 צבעים נבחרה. "מ" ו "ל" תואמים את הסלים הראשוני והסוף על ההיסטוגרמה עששת הקרינה (מספר ערוץ TAC). אם הפרמטרים ההתאמה הראשונית נבחרים כראוי, פונקציה בכושר מתווסף עששת הקרינה על כל ערוץ.
    6. בחר את המיקום בכונן הקשיח שאליו יש לשמור את כל קובצי ה- ascii המעובדים בתיקיית אב.
      הערה: פריז מעבדת את כל ההתפרצויות הנבחרות ויוצרת מספר קבצי פלט מסוג ascii מאשר ניתן להשתמש בהם על ידי תוכניות אחרות להדמיה ( לדוגמה, חבילת מרגריטה MFD).

6. dsDNA תקנים מדגם לדוגמאUrements

  1. הוסף 500 μL של חיץ PBS כדי לכסות זכוכית לכסות מקום טיפה של מים מזוקקים בין החדר העדשה אובייקטיבי. לחץ על כפתור "התחל" על דוושת השליטה ולאסוף 5 דקות של נתונים במצב TTTR להשתמש לניתוח.
  2. קח כמות קטנה (בדרך כלל סביב 0.1 μL, ריכוז של כ 1 מיקרומטר) של תקן dsDNA, להוסיף אותו למאגר PBS, ומערבבים היטב. ראשית, אוספים 10 שניות של נתונים על ידי לחיצה על "התחל". לאחר מכן, לבדוק את פרץ כדי לקבל 35 התפרצויות לכל 10 s (כמו צעדים 5.2.7 ו 5.3). לבסוף, לאסוף> 2 שעות של נתונים בפורמט TTTR, כמתואר לעיל.
  3. לנתח את הנתונים שנאספו עבור דגימות dsDNA, כמו בשלב 5.3.3.
  4. דמיינו את ההיסטוגרמות המתפרצות באמצעות חבילת MFD (Margarita) והציגו את יעילות ה- FRET לעומת <τ D (A) > f או F D / F לעומת <τ D (A) > f .
    1. פתח את tהוא מרגריטה תוכנה ובחר "קובץ" -> "ייבוא ​​הכל *. 4 ו *. קבצי mti." בחר את תיקיית האב המכילה תיקיות משנה שונות.
    2. בחר את הפרמטרים כדי לדמיין על ידי לחיצה ליד "X" (abscissa) של אחד הפרמטרים נגזר מפריז ( למשל, ירוק טאו או <τ D (A) > f ); באופן דומה, לחזור על זה כדי לתאם "Y" כדי לבחור את הפרמטר הרצוי לדמיין ( למשל, יעילות סריג, F D / F, או Pie עוגה S).
      הערה: במקרה זה, יעילות FRET, F D / F A , או S PIE נכונה עבור שיעור ספירת הרקע הנכון בערוצים הירוקים, האדומים והצהובים; עבור תשואות קוונטיות של התורם ומקבל; עבור יחס יעילות האיתור (g / g r ); ו crosstalk (α). כאן, G G / G R = 3.7 ו α = 0.017, תלוי רק במכשיר. שיעורי ספירת רקעתלוי במאגר בשימוש, ערכי התשואה הקוונטית נקבעו בעבר.
    3. הוספת קו סריג על ידי פתיחת חלון "משוואת שכבת" על ידי לחיצה על "תצוגה" -> "משוואת שכבת". בחר את שורת FRET הסטטית מהתפריט המוקפץ. בחר את תוחלת החיים תקינה ופרמטרים תשואה קוונטית כדי ליצור את הקו הנכון סריג.
      הערה: ניתן ליצור קווי סריג לקישור מחווני FRET שונים.
  5. קביעת גורם התיקון עבור עירור acceptor על ידי מקור עירור התורם (β) באמצעות פרמטר stoichiometry ידי הצגת יעילות סריג לעומת stoichiometry (S PIE ) במרגריטה (משוואה 1, להלן).
    הערה: β נבחר כך מדגם התורם יש שיא ב S PIE = 1.0 בסולם stoichiometry; המדגם acceptor בלבד צריך stoichiometry של P P = 0.0, ואת dsDNA עם שתי תוויות צריך stoichiometry של P P ~ 0.5 <Br /> הערה: מכשיר מוכן כעת, וניתן למדוד דגימות שכותרתו.
  6. למדוד ולנתח FRET שכותרתו דגימות מוכן בסעיף 3 על ידי ביצוע השלבים 6.3-6.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניסויים SMFRET טיפוסי באמצעות הגדרת MFD (קווי לייזר: 485 ננומטר ב 60 μW ו 640 ננומטר ב 23 μW, סעיף 5.1), מדגם הקרינה הוא מדולל לריכוז נמוך picomolar (10 -12 M = 1 pM) והניח ב מיקרוסקופ confocal, שבו דופק לייזר sub-nanosecond מרגש שכותרתו מולקולות חופשי מתפזר דרך נפח עירור. נפח confocal טיפוסי הוא <4 femtoliters (FL). בריכוזים נמוכים כאלה, רק מולקולות בודדות מזוהות אחת בכל פעם. הקרינה הנפלטת מן המולקולות שכותרתו נאספת דרך המטרה והיא מסוננת במרחב באמצעות חור המנעול. שלב זה מגדיר נפח זיהוי יעיל confocal. לאחר מכן, האות מחולק למרכיבים מקבילים וניצבים בשני חלונות ספקטראליים שונים (או יותר) ( למשל, "ירוק" ו"אדום "). כל ערוץ גלאי פוטון הוא מצמידים מכן לספור זמן יחיד פוטון יחיד (TCSPC) אלקטרוניקה עבור רישום נתונים ( איור 1 ).

לאחר ביצוע הכיול של הגדרת MFD, ניתן להתחיל בהליך המתואר בטבלה 1 (שלבים 5-6), המדידה של תקני dsDNA. לאחר מכן, PIE-MFD משמש כדי לנתח מספר פרמטרים, כגון מאקרוטיים ממוצע, חיים הקרינה, אנאיזוטרופיה משולבת פרץ, היחס של האות בירוק מעל האות אדום, פרץ משך בערוץ מהיר (T (G + R) | D ), משך פרץ בערוץ מתעכב (T R | A ), ואחרים 65 , 66 ( איור 2 ). חשוב בניתוח זה הוא הפרמטר stoichiometry ( S PIE ), המוגדר כ:

משוואה 45

שם F G D = F D , F R | D = F A , ו- F R | א הם ברקע תיקון עוצמות הקרינה 63 . לדוגמה, F G D = I G | D - < B G > שבו אני G ד היא העוצמה המזוהה בערוץ הירוק מהתורם ו < B G > הוא ממוצע שיעור ספירת רקע על הערוץ הירוק. תיקונים דומים נעשים עבור הקרינה של acceptor מן עירור ישיר של acceptor ( F R | A ) ועל פליטה רגיש של acceptor ( F R | D ). במשוואה 1, α הוא גורם התיקון של התורם-פלואCrosstalk rescence לתוך ערוץ acceptor; Β הוא גורם התיקון עבור עירור excor על ידי מקור עירור התורם; ו γ , היכן

משוואה 56

הוא פונקציה של התורם ו acceptor היבול הקוונטי, Φ F, D Φ F, A , בהתאמה, ואת יעילות איתור על גלאי ירוק ואדום, G G ו- G R. באמצעות P S , ניתן לכייל את הגורמים האינסטרומנטליים הנכונים, כגון α, β ו- γ , כדי לספק את S = PIE = 1 עבור המדגם שכותרתו התורם בלבד, S Pie = 0 עבור המדגם בלבד, ו- S 0.5 = 0.5 PIE למדגם FRET. לחלופין, זהניתן להשתמש:

משוואה 59

כדי להפיק את התשואה הקוונטית של מדגם שני, בהתחשב בכך התשואה הקוונטית של מדגם אחד ( משוואה 60 ) ידוע וכי משוואה 61 ו משוואה 62 נקבעים מניסוי ה- PIE-MFD. במקרה זה, ההנחה היא כי התשואה הקוונטית של DREDNA סריג גבוה הוא 0.32 ואת התשואה הקוונטית של dsDNA סריג נמוך נקבע. הסיבה לביצוע פעולה זו היא כי זה כבר ציין כי S PIE שונה הן נמוך סריג ו גבוה סריג דוגמאות, למרות ששניהם יש אחד התורם על אותו מיקום ורק acceptor אחד, אבל על הבדלמיקומים. לאחר קביעת התוצר הקוונטי הנכון של הדגימות התקניות, כפי שמתואר במשוואה 3, יעילות ה- FRET ( E ) לעומת < τ D ( A ) > f ו- F F / A לעומת < τ D ( A ) > ייצוגים f משמשים להערכה נוספת. הקשר הפרמטרי בין יעילות ה- FRET ( E סטטי ), F D / F A , ו- < τ D ( A ) > f הפרמטרים מתוארים על ידי קבוצת המשוואות הבאה (משוואה 4):

משוואה 63

משוואה 64

הנה, F ד | D הוא הקרינה התורם זוהה התורם או ערוץ ירוק; F ד הוא פליטה רגיש- acceptor; משוואה 67 הוא התורם חיים הקרינה בהעדר acceptor; ו < τ D ( A ) > x הוא החיים הממוצע של המינים, אשר קשורה החיים הקרינה בממוצע על ידי פולינום אמפירי משוואה 69 56 , 57 . משוואות אלה ידועות כסטטית קווים 57 , 67 כי הקווים צריכים לחצות שתי אוכלוסיות גם טוב, בהיעדר oF דינמיקה ( איור 3 ).

אחרון מגיע ניתוח היסטוגרמות סריג יעילות ( איור 4 ) באמצעות ניתוח הסתברות הסתברות (PDA) עבור שתי דגימות dsDNA 68 , 69 . מחשבי כף יד שימשו למידול היסטוגרמות smFRET בדייקנות גבוהה. המידע של יחיד או רב מינים סטטיים ניתן להשיג היסטוגרמה אחת. לאחר התאמת צורת ההתפלגות הצפויה לנתוני הניסוי המתקבלים, ניתן לגלות את המרחק בין התורם לבין המקבל. בקיצור, יעילות ה- FRET, או F F / F A , מחושבת על ידי קבלת ההסתברות [משוואה] של התבוננות בצירוף מסוים של פוטונים שנאספו בערוצי זיהוי "ירוק" ( G ) ו- "אדום" ( R ) בהתחשב ברוח זמן מסוימת בח השתמש במשוואה 5:

משוואה 71

כאן, ההתפלגות בעוצמת הקרינה, P ( F ), מתקבלת מחלוקת עוצמת האות P ( S ), בהנחה שסימני הרקע B G ו- B R מופצים על פי התפלגות פואסון, P ( B G ) ו- P ( B R ), עם עוצמות ידועות של רמות ספירת רקע, < B G > ו- < B R >. ההסתברות המותנית P ( F G , F R F = F ) היא ההסתברות להתבוננות בצירוף מסוים של פוטונים פוטואדנטיים ירוקים ואדומים, F G ו- F R , עבור מצב סריג נתון.

EDcontent "עבור: לשמור יחד.בעוד הדף =" 1 "> ניתוח PDA מראה כי המרחק interdye עבור DREDNA סריג גבוהה היא < R DA > E (HFRET) = 45.7 Å, ואילו עבור נמוך DREDNA סריג, המרחק בין R = DA E > (LFRET) = 59.7 בהשוואה למרחקים הצפוי ים באמצעות מערכת סריקת ה - FRET ( 26 ), המרחק הצפוי interdye < R DA > E , AV (HFRET) = 44.7 Å כפי שנמצא באמצעות FPS עבור dsDNA גבוה סריג ו < R DA > E , AV (LFRET) = 59.1 Å עבור נמוך DREDNA סריג. AV מייצג את החישוב נפח נגיש מוטבע ערכת כלים FPS. AV הוא גס- גרגר מונטה קרלו סימולציה, שבו fluorophores מייצגים שלושה רדיוס מודלים כדור קשה מחובר לנקודת מצורף בביוםOlecule עם מקשר חיבור גמיש 26 , 57 . תיקון עבור התשואה הקוונטית עבור נמוך DREDNA סריג נדרש, על בסיס S PIE נמדד. עם תנאים אלה, ניתן להשיג הסכם של ~ 1 בין הערך הניסיוני לבין הערך הצפוי של סימולציות AV.

הבא, NMDA GluN1 LBD נמדדת. הקולטן NMDA (NMDA) הוא ערוץ hetomeric, שאינו סלקטיבי קטיון הדורש את הכריכה של גליצין וגלוטמט עבור gating 70 . LBD, שיש לו מבנה דמוי צדפה, ידוע לאמץ צדפה פתוחה ותצורה סגורה דמויית צדפה על ליגנד מחייב מבוסס על מידע קריסטלוגרפי 71 , 72 . עבור ניסויים MFD, NMDA GluN1 LBD היה מוטציה ב Ser507 ו Thr701 (באורך מלא ברצף) משני צידיאת הסדק, כפי שתואר בעבר. זה היה אז שכותרתו באמצעות זוג סריג של fluorophore ירוק ציאן fluorophore אדום רחוק (ראה את רשימת החומרים), עם R 0 של 52 Å. מבנה זה שימש כדי ללמוד את התנועה של תחום מחייב ליגנד, ללא המורכבות הקשורים לעבוד עם קולטן solubilized. באמצעות המבנה הזה, נמצאו לפחות שלוש תצורות של LBD. הוצע כי מנגנון בחירה קונפורמיטיבי מאכלס באופן סלקטיבי את אחת האוכלוסיות המזוהות עם ליגנד מחייב 73 . ב טופס מומתק, או בנוכחות של היריב 5,7-dichlorokynurenic חומצה (DCKA), בעיקר בינוני עד נמוך מדינות סריג נבדקים, עם תוחלת חיים ארוכים יותר התורם גבוה יותר התורם ל- acceptor יחס הקרינה peaking F F / F A = 3.3 ( איור 5 א ). זה עולה בקנה אחד עם ייצוב של קונפורמציה פתוח שסוע.מחשבי כף יד וניתוח חלון זמן שימשו לזיהוי שלוש תצורות שה- LBD יכול לאמץ (High-FRET (HF) (< R DA > E = 33.9 Å), בינוני-סריג (MF) (< R DA > E = 45.8 Å ), נמוך מדינות סריג (LF) (< R DA > E = 55.8 Å)). עם זאת, בעיקר בינוני- FRET ואת נמוך סריג היו מאוכלסים. זה מצביע על כך גבוהה- FRET היא המדינה שמוביל ההפעלה של NMDAR. ראוי לציין כי המרחקים הנגזרים בניסוי ואלו הנגזרים על ידי FPS באמצעות תיוג סיליקון באמצעות מידע קריסטלוגרפי (חלבון נתונים בנקאית זיהוי (PDBID): 1PB7 ו 1PBQ) הושוו. נמצא כי המרחק interdye עבור בינוני- FRET ואוכלוסיות סריג נמוך היו < R DA > E , AV = 48.7 Å ו 54.2 Å עבור שני המבנים, בהתאמה ( איור 5 ב). החריגה הגדולה ביותר של 2.9 Å נמצאה במצב בינוני- FRET. כאשר בוחנים את אי הוודאות של ההתפלגות, מתוך הנחה של κ 2 = 2/3, יש טעות מקסימלית של 2.5% במרחק הנמדד. בקיצור, ניתן להסיק כי ניתן להגיע דיוק אנגסטרום במרחקים נקבע ניסויי.

איור 1
איור 1: הגדרה ניסיונית רישום נתונים עבור PIE-MFD. ( A ) טיפוסית multiparameter פלואורסצנטי הגדרת ההתקנה מוצג ומורכב ארבעה גלאים המכסים שני חלונות רפאים שונים. גלאים מחוברים לספירת הפוטון החד-פעמי (TCSPC). ( ב ) ב TCSPC, כל פוטון מזוהה על ידי שלושה פרמטרים: (i) מיקרו זמן, או זמן לאחר הדופק עירור; (Ii) זמן מאקרו, או מספרשל פולסים עירור מתחילת הניסוי; (Iii) מספר הערוץ. שלושה פרמטרים אלה נדרשים לניתוח לא מקוון. ( ג ) מולקולות בודדות מפוזרות באופן חופשי דרך נפח confocal, ו פוטונים נפלט, משאיר פרץ של פוטונים כפונקציה של הזמן. ( D ) כל פרץ נבחר מותאם בהתאם ומשמש להצגת היסטוגרמות רב מימדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: ניתוח פרץ באמצעות פרמטרים הקרינה שונים. ( A ) יעילות סריג לעומת macrotime, ( B ) יעילות סריג לעומת T (G + R) | D - T R | A , ו ( ג ) יעילות סריג לעומת S PIE עבורנמוך סריג או 15 bp dsDNA. T (G + R) D הוא משך ההתפוצצות בערוץ המהיר, ו- T R | A הוא משך ההתפוצצות בערוץ המושהה (T R | A ) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3
איור 3: F D / F A וחיים של התורם לעומת יעילות סריג. היסטוגרמה דו מימדי לייצג יעילות סריג ( A ); היחס בין התורם על פלואורסצנציה acceptor, F D / F A , ( B ); ותרומת אניסוטרופיה r D ( C ) לעומת החיים הקרינה הממוצע של התורם בנוכחות acceptor < τ D ( A ) > f . התיקון הנכוןעל גורמים הם: < B G > = 0.64, < B R > = 0.37, β = 0.08 (השבר של עירור ישיר של המקבל עם לייזר עירור התורם), α = 0.017, ו G / G R = 3.7 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: השוואות PDA של גבוהה סריג נמוך detsdNA. זמן בחלון PDA ניתוח ב 2 אלפיות השנייה, עם רוחב חצי של 6% בממוצע ממוצע מרחק יעילות. כל מרחק הוא גאוס מופץ עם 6% של < R DA > E כמו רוחב (HW DA ). ( A ) עבור HFRET המדגם, המרחק interdye הוא < R DA > E (HFRET) = 45.7 Å. ( ב ) עבור המדגם LFRET, המרחק הוא < R DA > E (LFRET) = 59.7 Å. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: PIE-MFD של תחום ליגנד מחייב של קולטן NMDA בנוכחות היריב, DCKA. ( א ) היסטוגרמה דו מימדית של F D / F A לעומת חייו של התורם בנוכחות מקבל < τ D ( A ) > f והאניזוטרופיה של התורם לעומת < τ D ( A ) > f עבור LBD עם DCKA. ממד אחד אל תחזיות עבור F D / F A והם מוצגים גם. קו ה- FRET הסטטי מוצג באדום. (P = G = = 940 kHz ו- < B R > = 0.522 KHz), צולבות צולבת (α = 1.7%) ויעילות איתור ( G / g R = 3.7). על האנזיוטרופיה לעומת היסטוגרמות < τ D ( A ) >, למשוואת פרין יש מתאם סיבוב של ρ = 2.5 ns. ( B ) PDA בחלון זמן של 10 מילישניות Δt. נדרשת מדינה אחת. המודל מתאים לכל חלונות הזמן יפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

"תמיד">
פעולה מטרה
קרן לייזר מרכזית.
יישור חור המנעול. ניסוי FCS (סעיף 5).
יישר גלאים. מקסם את העלות לאלף הופעות.
התאמת טבעת תיקון אובייקטיבית. מזער את הבדל לאלף הופעות ומקסם את המחיר לאלף הופעות.
קביעת פונקציית התגובה מכשיר (IRF). TCSPC @ SMD במצב TTTR. מדוד תבנית ריקבון פיזור.
קביעת גורם G לכל חלון ספקטרלי. TCSPC @ SMD במצב TTTR. השווה עוצמות טופס זנבות ריקבון מתאים קיטובים.
קביעת יחס יעילות איתור בחלונות רפאים (G r / g G ). (I) מדידות אינטנסיביות של צבע עם ספקטרום פליטה רחב (ריכוז nM). (Ii) למדוד התייחסות סרגלי סריג (pM concentrAtion). ב MFD תת subpopulation צריך ליפול על קו FRET סטטי.
בצע בדיקה סופית (חיים ואנאיזוטרופיה). שליטה חיים חיים ו anisotropy ממדידת מולקולה אחת של צבע diffusing חופשי עם ריקבון מעריכי יחיד ( למשל Rhodamine 110).
קביעת יחס של acceptor מעל תשואה קוונטית התורם. (I) Stoichiometry העלילה (S PIE ) Eq. 1. 4.2.
קביעת שיעור לספור רקע. מדידות אינטנסיביות של "מאגר" שנבחר.
קביעת צולבות (α). מדידות אינטנסיביות של צבע התורם בחשבון את ספקטרום פליטת הקרינה ואת יעילות זיהוי.

טבלה 1: צעדים כיול עבור ניסויים סריג בניסויים מולקולה אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו, פרוטוקול ליישר, לכייל, ולמדוד interdye מרחקים עם דיוק גבוהה באמצעות PIE-MFD יחיד מולקולה ניסויים סריג מוצג. על ידי כיול קפדני של כל הפרמטרים האינסטרומנטליים, ניתן להגדיל את הדיוק של המרחקים הנמדדים ולהגיע לדיוק אנגסטרום. לשם כך, היסטוגרמות רב-ממדיות שונות משמשות לניתוח ולזיהוי אוכלוסיות לצורך אפיון נוסף. באמצעות זמן מאקרו ממוצע כדי לאמת את היציבות של דגימות נמדד, ניתן לתקן עבור התורם photobleaching acceptor ולבחור אוכלוסיות FRET מבוסס על הפרמטר stoichiometry. עם זאת, המאפיינים photophysical של acceptor יכול להשתנות בהתאם למיקום של התווית. לכן, ניתן להשתמש התפלגות S PIE כראוי לתקן את התשואה הקוונטית acceptor. אפיון photophysical תקין יש צורך לקבוע את גורם gamma (ƴ), אשר, יחד עם עובדה תיקון אחרים( למשל, α עבור crosstalk ו β עבור עירור acceptor עם לייזר התורם), ניתן להשתמש כדי להגדיל את הדיוק של המרחק interdye נמדד. גישה זו אומתה באמצעות שני דגימות תקן dsDNA מעוצב, ודיוק של ~ 1 Å בהשוואה לערכים הצפוי נקבע.

בחירות צבע שונות דורשות התאמת אלמנטים אופטיים מיקרוסקופ, כגון מסננים dichroic ו bandpass, כדי להתאים את חלון רפאים הנכון של צבעים שנבחרו. לפיכך, לייזרים פועם צריך להיות נבחר. חשוב יותר, הבחירה של צבעים הוא מכריע בגלל כמה artophacts photophysical אפשרי, כגון acceptor ו התורם הלבנה, שלישיה או לצבוע מהבהב, או לצבוע דביק משטחים חלבון. ממצאים אלה עלולים לסכן את הפרשנות של נתונים ניסיוניים. MFD הוא אידיאלי בתרחיש זה כי, על ידי בדיקת פרמטרים מרובים, ניתן לזהות את המקורות של חפצים אלה, לתקןעבורם, או לפחות להיות מודעים לקיומם. הפרמטר אוריינטציה dipole, רוב הזמן להניח כמו κ 2 = 2/3, יכול לגרום חריגות גדולות יותר של המרחק נקבע אם מקלות צבע מעדיפים על פני השטח של biomolecules. Anisotropy של המדגם התורם, מדגם acceptor, ו acceptor התורם יכול לעזור כדי לפתור אם הנחה זו תקפה או לא. בניסוי זה, נמצא כי יש טעות מקסימלית של ~ 2.5% על המרחק נמדד, לעומת לא עושה את התיקון הנכון וקבלת 10-20% שגיאה. התשואה הקוונטית של המקבל יכולה ליצור מקור גדול יותר של שגיאה. לכן, S PIE חשוב להתייחס לנושא חשוב זה.

ניתן ליישם אסטרטגיה דומה כדי להבין את הנוף קונפורמיוני של תחום ליגנד מחייב של קולטן NMDA להבין את מנגנון האגוניזם על NMDAR. נמצא כי LBD ב tנוכחותו של אנטגוניסט מתנערת מן הנגישות של מדינה בעלת דרגה גבוהה, שנוהגת להיות אחראית לפתיחת הערוץ. כאשר משווים מרחקים נגזרים הניסוי ואת הערכים הצפוי מבוסס על מידע קריסטלוגרפי, הסכם בתוך 3 Å הושגה. חשוב יותר, המדינות החדשות המאוכלסות החדשות יכולות להיות מזוהות בדיוק דומה.

לסיכום, יחיד מולקולה ניסויים סריג במצב MFD 42 לאפשר אחד כראוי עבור חפצי ניסיוני כדי לגזור המרחק interdye בטווח של ~ 30-70 Å. אם, במקום מרחק מדוד אחד, נגזרת רשת של מרחקים, ניתן להשתמש בהם כאיפוק במידול מבני, במיוחד עבור מדינות שקשה לאפיין אותן בשיטות סטנדרטיות יותר של ביולוגיה מבנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים עם התוכן של מאמר זה.

Acknowledgments

VJ ו- HS מאשרים תמיכה מ- NIH R01 GM094246 ל- VJ. HS מכיר בכספי סטארט-אפ מתכנית המחקר של אוניברסיטת קלמסון, והמרכז לחומרים אופטיים במדע וטכנולוגיות הנדסיות באוניברסיטת קלמסון. פרויקט זה נתמך גם על ידי הכשרה הכשרה של מרכז קק עבור בינתחומי ביו-הכשרה של קונסורציוני חוף המפרץ (מענק NIGMS מס '1 T32GM089657-05) ואת קרן מלגות Schissler עבור מחקרים תירגוליים של מחלות נפש נפוצות ל DD. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20 µm
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24 x 60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 µg/mL final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25x36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10 x 10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640 nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838 (2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121 (2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791 (2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256 (2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792 (2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206 (2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432 (2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104 (2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

Tags

ביוכימיה גיליון 123 סריג מולקולה אחת מרחק interdye DNA fluorophore multiparameter פלואורסצנטי זיהוי עירור interleaved פעמו תיוג חלבון
דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei… More

Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter