Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55625

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השיטה של ​​קביעת lipolysis basal ו-forskolin מגורה ב pads שמנים השתן המתקבל דיאטה chow נורמלי (NCD) או דיאטה שומן גבוהה (HFD) ± capesicin מזין עכברים סוג בר. כמדד לליפוליזה, שחרור גליצרול נמדד מתוך רפידות שומן שומניות.

Abstract

Lipolysis הוא תהליך שבו שומנים שומנים כמו טריגליצרידים ברקמות השומן הם hydrolyzed לתוך גליצרול וחומצות שומן. מאמר זה מתאר את השיטה למדידת ליפוליזה מבושלת בסיסית ו- forskolin (FSK) בשומן השומן המבודד המבודד מעכברים מסוג בר, שאוכלו גם דיאטה רגילה של צ'או (NCD), דיאטה עשירה בשומן (HFD) או דיאטה דלת שומן המכילה 0.01 % Capsaicin (CAP; קולטן חולף פוטנציאלי וניליל תת-קרקע 1 (TRPV1) אגוניסט) במשך 32 שבועות. השיטה המתוארת כאן לביצוע lipolysis vivo לשעבר מאומצת Schweiger et al. 1 אנו מציגים פרוטוקול מפורט למדידת רמות גליצרול על ידי UV-Visible (UV / VIS) spectrophotometry. השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש בהצלחה לבודד רפידות שומן השמנה עבור מדידות lipolysis להשיג תוצאות עקביות. פרוטוקול המתואר עבור רפידות שומן השד יכול בקלות להיות מורחבת למדוד ליפוליזה ברקמות אחרות.

Introduction

רקמות שומן שומרות אנרגיה כמו שומן 2 וחומצת שומן חומצה נדרשת עבור thermogenesis 3 , 4 . חומצות שומן שמקורן בדיאטות הן ארוזות יחד עם אפופרוטאינים לתוך chylomicrons ונמסר לרקמות שונות בגוף באמצעות זרימת הדם. למרות שרוב התאים בגוף לאחסן עתודה של אנרגיה, רקמת שומן שומרת עודף אנרגיה כמו שומן 5 , 6 . ליפוליזה ברקמת השומן מוסדר על ידי תהליכים מורכבים הפרטים המולקולריים של ליפוליזה עדיין להישאר מעורפל 7 .

ליפוליזה היא תהליך שבו טריגליצרידים (TGL) מאוחסנים ברקמת השומן הם הידרוליזה לייצר גליצרול וחומצות שומן (FA) על ידי אנזים טריפליצרידים ליפאז (ATGL) 8 . שינויים ב ליפוליזה בסיסית ומעוררת היא תכונה אופיינית להשמנה. בAsal lipolysis הוא מוסדר על ידי הפעלת ATGL 9 , אשר ממיר TGL כדי diacylglycerol (DAG), כי הוא hydrolyzed לאחר מכן כדי monoacyl גליצרול (MAG). הפעלה של ליפז רגיש להורמון (HSL) באמצעות cyclase adenylyl מפעיל מחזורית אדנוזין monophosphate (cAMP) חלבון תלוי קינאז A (PKA) גירוי גורם ליפוליזה. מדידה של ליפוליזה, בסיס ומעוררת, היא, אם כן, חשוב לנתח את הפעילות של חלבונים המעורבים בתהליך זה. כמו כן, unraveling את הרגולציה המולקולרית של lipolysis עשוי להיות מועיל לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נגד השמנה 10 . מאז, מולקולות המעוררות lipolysis וחומצת שומן חומצה הם מועמדים פוטנציאליים עבור שומנים מופחת המאוחסן במחסנים, חשוב להעסיק assay חסון לשחזור.

נתונים שפורסמו בעבר מציעים כי הפעלה של חלבון TRPV1 לידי ביטוי ברקמת השומן הלבנה על ידי CAP משופר הבסיסו FSK (adenylyl cyclase activator) limolysis- מגרה של רפידות שומן המפשעה 11 . מחקרים קודמים גם מציעים כי הפעלה ארוכת טווח של TRPV1 על ידי CAP מפעילה PKA 12 . מאחר והפעלת ה- PKA מגרה ליפוליזה 13 , 14 , מדידת ליפוליזה מגורמת בסיסית ו- PKA תלויות בשומנים שומניים המבודדים מבדיקות NCD או HFD (± CAP) בעכברים לאחר 32 שבועות של הזנת הדיאטות המתאימות יאמת את תפקיד TRPV1 הפעלה בליפוליזה.

מאמר זה מתאר שיטה יעילה לקביעת ליפוליזה בסיסית ומעוררת. למרות שיטות אחרות המעסיקות איזוטופים רדיואקטיביים של גליצרול ומייגע ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית או כרומטוגרפיה גז / ספקטרומטריית מסה עבור מדידות 15 , 16 זמינים, שיטה זו מציעה יותר ישיר, פשוט וחסכוניטכניקה כדי לקבוע lipolysis ברקמות השומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים עוקבים אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ויומינג.

1. בעלי חיים דיור האכלה

הערה: עכברים סוג בר המין הזכר (C57BL / 6) (בגיל 12 עד 24 שבועות) היו bred במתקן החיות מחקר לפי הפרוטוקול מאושרים טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC).

  1. החל משבוע 6 של גיל, עכברי הבית בקבוצות של ארבעה בכלובים נפרדים באופן אקראי להקצות אותם לקבוצות האכלה של NCD או HFD (± 0.01% CAP) עד שבוע 38 של גיל.
    הערה: CAP הוא אגוניסט של חלבון ערוץ TRPV1 לידי ביטוי ברקמות השומן 11 , 17 . מערבבים CAP עם HFD בבלנדר בתוך מכסה המנוע ומעבירים את התערובת המעורבת למגש המכיל 1 מתוך 2 מחיצות. שמור את המגש בתוך מקפיא -20 ° C. הסר את המגש המכיל את הדיאטה HFD + CAP מן המקפיא לאחר 24 שעות ו לאחסן במיכל ב -20 &# 176; מקפיא C עד לשימוש.
  2. עכברי הבית בסביבה מבוקרת אקלים (22.8 ± 2.0 ° C, לחות של 45% -50%) עם מחזור של 12/12-Light / Dark עם גישה לתזונה ייעודית וליביטום למים.
  3. בסוף 38 שבועות, לנתח רקמות השומן המפשעה ולהשתמש עבור ניסויים lipolysis (סעיפים 2-7).

2. הכנת עכברים עבור הניסויים

  1. להרדים עכברים על ידי הזרקת תערובת קטמין ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג ו 80 מ"ג / ק"ג משקל גוף, בהתאמה). להזריק 0.01 מ"ל של תערובת / 10 גרם משקל הגוף של העכבר.
  2. אישור הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן המשרד. אם יש רפלקס פדלים, לבדוק את העכבר שוב לאחר לפחות 30 s.
  3. השתמש משחה עין וטרינר כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הרדמה. אין להשאיר עכברים ללא השגחה במהלך כל ההליכים.
  4. להרדים עכברים על ידי הזרקת מנה גבוהה של קטמין ו xylazine הזרקה תערובת (10 מ"ג / ק"ג ו 80 מ"ג / ק"ג משקל הגוף, בהתאמה) mixturE (0.01 מ"ל / 10 גרם משקל גוף) ואחריו נקע צוואר הרחם.
    הערה: שיטה זו של המתת חסד מאושרת על ידי IACUC של אוניברסיטת ויומינג.

3. בידוד של שומן שומנים שומן

  1. מניחים את העכבר (fed עם NCD או HFD (± CAP) במשך 32 שבועות) שוכב על שמאל עבור ההליך.
    הערה: על ידי הנחת העכבר בצד שמאל, שמאל forelimb ו hindlimb שמאל יהיה על פלטפורמת לנתיחה, בעוד forelimb הנכון hindlimb הנכון יהיה פונה מן הפלטפורמה.
  2. לעקר את פני העור עם 2 אינץ ' 2 כרית גזה ספוגה ב 2.5 מ"ל של 70% אתנול. לעשות חתך לרוחב 2 - 3 מ"מ דרך העור באמצעות איזמל לחשוף את שכבת השומן הבסיסית.
  3. לעשות חתך 1 ס"מ (בהתאם לגודל של העכבר) דרך העור באמצעות אזמל ממש מתחת לכלוב הצלעות על פני השטח הגבי שהצטרף שתי חתכים לרוחב.
  4. לקלף את דש העור על ידי גרירתו בזהירותבאמצעות מלקחיים סטרילית ולהשאיר את כרית תת עורית שלם על ידי לא לחתוך את רפידות שומן. זהו משטח השומן המוטל מתחת לעור.
  5. לנתח את פנקס השומן בזהירות מן השריר הבסיסי ו fascia באמצעות זוג מספריים. משוך את משטח השומן כפי שהוא חתך מן השריר הבסיסית.
    הערה: המשקל והגודל של רפידות השומן תלוי בסוג העכברים (NCD או HFD (± CAP) - fed).
  6. השתמש פינצטה להעביר אותו צלחת פטרי המכיל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד הניסויים lipolysis, בטמפרטורת החדר (~ 15 דקות).
  7. לבודד את רפידות שומן מהצד הימני של העכבר כמתואר בשלבים 3.2-3.6.

4. בסל גליצרול שחרור מן השומן pads

  1. השתמש במספריים חדים לחתוך על 20 מ"ג של רקמת שומן ל 5 עד 8 חתיכות.
  2. דגירה חתיכות לחתוך של כריות שומן במפשעה μL 200 של המדיום דגירה (Dulbecco השתנה Eagel של בינונית (DMEM) המכיל 2% חומצת שומןללא תשלום אלבומין בסרום (BSA)) ב 37 ° C, 5% CO 2 ו לחות 95% עבור 60 דקות.
    1. אסוף את המדיום דגירה להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס עבור assay lipolysis.
      הערה: חתיכות לחתוך משמשים לקביעת ריכוז חלבון לאחר מיצוי השומנים.
    2. מעבירים את חתיכות שומן לחתוך בעזרת מלקחיים לתוך 1 מ"ל של תמיסת מיצוי (כלורופורם: מתנול (2: 1, V / V) ו 1% חומצה אצטית קרחוני) ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב 100 סל"ד. מחק את פתרון מיצוי השומן.
      הערה: שלב זה יהיה לחלץ שומן מן חתיכות לחתוך. מחק את פתרון מיצוי השומן כפי שהוא יפריע לקביעת חלבון.
    3. מעבירים את הרקמה (משלב 4.2.2) באמצעות פינצטה לתוך צינור microfuge סטרילי המכיל 500 μL של פתרון תמוגה (0.3 N NaOH המכיל 0.1% נתרן dodecyl סולפט, SDS) ו דגירה לילה (12 שעות) ב 55 מעלות צלזיוס תחת רעידה נמרצת ב 100 סל"ד.
  3. קביעת ריכוז החלבון של הרקמה (שלב 4.2.3) באמצעות bicinchoninic חומצה (BCA) מגיב BSA כסטנדרט 18 .
  4. להפשיר את המדיום קפוא (שלב 4.2.1) על הקרח ולקבוע את התוכן גליצרול של המדיום באמצעות מגיב גליצרול חינם כמתואר בסעיפים פרוטוקול 6 ו 7 6 .
    1. אקסטרפולציה של ריכוז גליצרול בדגימות מן עקומת תקן זממו באמצעות תקנים גליצרול 19 וליפוליזה מפורשת כמו nlyomoles גליצרול לכל חלבון מ"ג לכל ח 20 .

5. FSK מגורה lipolysis

  1. Preincubate על 20 מ"ג של כרית שומן השומן (5 עד 8 חתיכות) המתקבל NCD או HFD (± CAP) - עכבר סוג בר fed ב 200 DML μL המכיל 2% חומצת שומן BSA חינם BSA, FSM 10 מיקרומטר ו 5 מיקרומטר Triacsin C ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו לחות 95% עבור 60 דקות.
  2. מעבירים את חתיכות רקמות באמצעות פינצטה בינוני זהה דגירה של 60 דקות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ו לחות 95%. איסוף בינוני הדגירה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד assay lipolysis.
    הערה: גירוי של ליפוליזה גורם לשחרור מהיר של חומצות שומן וגליצרול בתוך 15 דקות, שהוא ליניארי במהלך השעה הראשונה, ו plateaus לאחר מכן. מאז שיעור lipolysis מגורה הוא גבוה ויציב בין השעה הראשונה והשנייה של גירוי FSK, פרוטוקול זה נמדד lipolysis במצב מגורה לאחר תקופת הדגירה השני כמתואר קודם לכן 1 . לכן, שני הצעדים הניסיוניים (5.1 ו 5.1.1) נחוצים.
  • כדי לחלץ את השומן משכבות השומן המפשעות, מעבירים את החלקים החתוכים של כריות השומן במפרק (המתקבלים מ- NCD או HFD (± CAP) בעכברים ממקור 5) בעזרת שלב פינצטה, בעזרת מלקחיים לתוך 1 מ"ל של תמיסת מיצוי (כלורופורם: מתנול (2) : 1. v /V) ו 1% חומצה אצטית קרחוני) ו דגירה של 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב -100 סל"ד. מחק את השומן החילוץ.
  • העברת הרקמה (משלב 5.2) באמצעות פינצטה לתוך צינור microfuge סטרילי המכיל 500 μL של פתרון תמוגה (0.3 N NaOH המכיל 0.1% SDS) ו דגירה לילה (12 שעות) ב 55 מעלות צלזיוס תחת רועד נמרץ ב -100 סל"ד.
  • קביעת ריכוז החלבון תוכן גליצרול של הרקמה כמתואר בשלבים 4.3 ו -4.4, בהתאמה.
  • 6. הכנת מגיב גליצרול חינם

    1. לשחזר את מגיב גליצרול 19 ב 40 מ"ל של מים deionized ב בקבוק זכוכית בצבע ענבר, במקום פקק על הבקבוקון ומערבבים היטב על ידי היפוך 10 פעמים. אין לערבב על ידי רועד.
    2. חנות בקבוקון ב 4 ° C בתוך מקרר מוגן מפני האור על ידי כיסוי הבקבוקון לחלוטין עם רדיד אלומיניום.
    3. המשך להכנת הכנת גליצרול (סעיף 7).

      7. הכנת גליצרול תקן וקביעת תוכן גליצרול

      1. הפוך מלאי של 1 מ"מ על ידי דילול 35 μL של מלאי שסופק עם 65 μL של מים deionized.
        הערה: היצרן סיפק מלאי גליצרול רגיל הוא 2.8 מ"מ גליצרול.
      2. קח 5 אורך 1 ס"מ אורך cuvettes methacrylate חד פעמיות. תווית cuvettes באמצעות סמן כמו 0, 1.25, 2.5, 5 ו 10 תקן nmol.
      3. הוסף 0, 1.25, 2.5, 5 ו 10 μL של תקן 1 מ"מ גליצרול את cuvettes שכותרתו. להמציא את עוצמת הקול של כל קובט 10 μL עם מים deionized.
      4. הפוך 1 עד 10 דילול של כל הדגימות (משלב 4.4 או 5.1.1) על ידי הוספת 10 μL של המדגם ל 90 μL של מים deionized לתוך צנטריפוגות טריים צנטריפוגות טריים 500 μL טרי. הוסף 10 μL של דגימות מדולל לתוך cuvettes שכותרתו עם מספר זיהוי מדגם בהתאמה.
      5. הפעל את ספקטרופוטומטר UV-VIS ולהגדיר את הגלאורך ל 540 ננומטר.
      6. חם מגיב גליצרול חינם לטמפרטורת החדר על ידי שמירה על בקבוקון (שלב 6.2) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
      7. הגדר סדרה של cuvettes שכותרתו כמו ריק "0" תקן nmol (שלב 7.3), סטנדרטים (שלב 7.3) ודגימות (שלב 7.4).
      8. הוסף 10 μL של כל אחד מדגם רגיל לתוך קובט שכותרתו בהתאמה. השתמש "0" תקן nmol כמו ריק.
      9. הוסף 0.8 מ"ל של מגיב גליצרול חינם לתוך כל קובט, המכיל את הסטנדרטים גליצרול באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
      10. מכסים את קובט עם 1.5 ס"מ מרובע הסרט פלסטיק פרפין לערבב את התוכן על ידי הפיכת קובט במשך 3 פעמים ולהניח בצד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      11. מניחים את קובט ב ספקטרופוטומטר UV-VIS ו להקליט את ספיגת (540 ננומטר גל).
      12. מגרש את עקומת תקן באמצעות ריכוזים של סטנדרטים (nmol) ב X- ציר ואת absorbance נרשם על ציר Y.
      13. חישוב הריכוז של גליסרול בדגימות (nmol) על ידי אקסטרפולציה באמצעות עקומת סטנדרטי מנוסח בשלב 7.12.
      14. הכפל את ריכוז הדגימות (nmol / cuvette) עם גורם הדילול 10 (עיין בשלב 7.4) ו -20 (נפח כולל)
      15. מחלקים את הריכוז של גליצרול בכל מדגם (שלב 7.13) על ידי מ"ג של חלבון מחושב על ידי שיטת BCA.
        הערה: מאז הדגימה משטח השומן בדגימה מודגרת במשך 60 דקות, מייצגים את התוצאות כמו nmol של גליצרול / מ"ג חלבון / ח.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    כדי להעריך את ההשפעה של CAP על ליפוליזה בסיסית ומעוררת, מחקר זה נמדד lipolysis בשומנים שומן השומן המבודד מבודדים NCD או HFD (± CAP) - עכברים מסוג בר פראי. התוצאות המייצגות עבור הליפוליזה הבסיסית ו- FSK מגורה עבור כריתות השומן במעי הגס ניתנות בטבלה I. Basal ו FSK מגורה שחרור גליצרול בנוכחות Triacsin C, אשר מעכבת acyl coA synthetase ומונע התחדשות של TGL. כפי שמוצג באיור 1 , HFD דיכא את הלייפוליזה המושרה על ידי FSK, ו- CAP הגביר את הליפוליזה הבסיסית וגם את ה- FSK. Triacsin C שימש כדי לעכב את התחדשות של TGL מ גליצרול וחומצות שומן 11 . כל הנתונים הם הביעו כאמצעי השוואות SEM ± בין קבוצות מנותחים באמצעות ANOVA חד סיטרי פוסט הוק הניתוחים בוצעו באמצעות מבחן t של סטודנט. גודל המדגם נקבע כדי לקבוע האם הערך הממוצע של משתנה התוצאה בקבוצה אחת שונה משמעותית מזה שבקבוצה אחרת. ערך p <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

    איור 1
    איור 1: הגדלת CAP מגביר את גליצרול בסל ו- FSK מגורה שחרור של רפידות שומן איברים. גרפים בר מייצגים את הממוצע ± SEM של basal ו FSK (10 מיקרומטר) -stimulated גליצרול שחרור (nmol / מ"ג חלבון / שעה) של רפידות שומן המפשעה מבודדים NCD או HFD (± CAP) - עכברים מסוג בר פראי. ** מייצג מובהקות סטטיסטית עבור p-value <0.05 עבור n = 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

    5 / 55625fig2.jpg "/>
    איור 2: הידרוליזה של טריגליצרידים (TGL) תוצאות בדור של חומצות שומן חינם (FFA) וגליצרול. FFA עובר מיטוכונדריה β חמצון. זה, יחד עם upregulation של חלבון unoupling 1 (UCP-1) מגרה thermogenesis. שחרור גליצרול נמדד על ידי פרוטוקול המתואר במאמר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

    ליפוליזה
    (Nmoles גליצרול / מ"ג של חלבון / ח)
    NCD
    (N = 6)
    HFD
    (N = 6)
    HFD + CAP
    (N = 6)
    בסל 16.22 ± 1.28 17.16 ± 1.48 52.07 ± 2.66
    FSK מגורה
    (עם Triacsin C)
    54.88 ± 3.27 41.23 ± 4.43 72.04 ± 4.16

    טבלה 1: ההשפעה של CAP על Basal ו FSK Lipolysis מגרה של רפידות שומן מינית. ממוצע גליצריול בסל ו FSK שחרור ± SEM נמדד ברקמת שומן השומן המעיין המתקבל NCD, HFD או HFD + CAP-fed עכברי סוג בר.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    תהליך התמוטטות של TGL לתוך גליצרול וחומצות שומן הוא מזרז על ידי ATGL 9 במהלך ליפוליזה בסיסית מתוזמר על ידי מערך של חלבונים כולל הפעלת adenylyl cyclase / PKA תלוי מסלול במהלך ליפוליזה מגורה 21 , 22 , 23 . שיפור הליפוליזה מגביר את רמות הפלסמה של חומצות השומן לתחבורה ולשימוש באנרגיה 24 . חומצות שומן נלקחים על ידי המיטוכונדריה כמו CoA אצטיל, אשר משמש לייצור אנרגיה.

    מידת והיקף ליפוליזה יכול להיות יעיל נמדד על ידי שחרור גליצרול מ רקמות השומן ( טבלה 1 ואיור 1 ). הידרוליזה של TGL מייצרת חומצות שומן וגליצרול. מחקרים קודמים הראו שתוספי התזונה של ה- CAP שיפרו באופן משמעותי את הבסיס הבסיסי, כמו גם את ה- FSKE מ pads משומן חום חום 11 , 17 . ייצור מוגבר של חומצות שומן מ lipolysis משופר יכול לשמש להאכיל לייצר חום thermogenesis מאז CAP גם הגדילה באופן משמעותי את הביטוי של המיטוכונדריאלי UCP-1 של רפידות שומן הארקה. עולה בקנה אחד עם רעיון זה, מחקר קודמות עולה כי CAP שיפרה את הביטוי של peroxisome proliferator מופעל קולטן אלפא (PPARα) ב pads בשומן המפשעה, אשר ממלא תפקיד קריטי החמצון חומצת השומן המיטוכונדריאלי ו upregulation תעתיק של UCP-1 25 , 26 , 27 . כתוצאה מכך, CAP גם פעילות מטבולית מוגברת, ייצור חום והוצאות האנרגיה בעכברי HFD-fed 28 , 29 . יתר על כן, האכלה HFD דיכא ליפוליזה מגורה בעוד CAP גדל הבסיס ו FSK- מגורה PKA- תלויT lipolysis וכן רגישות משופרת לאינסולין 30 . לכן, כמתואר על ידי המודל בתרשים 2 , סביר לפרש כי CAP מגביר ליפוליזה בסיסית ומעוררת בלי לגרום לירידה באינסולין כמו עודף שומן נשרף לייצר חום על ידי upregulation המיטוכונדריה UCP-1.

    מאמר זה מתאר את השיטה של ​​מדידת גליצרול שחרור מ רקמות שומן לבן. למרות מספר שיטות באמצעות איזוטופים יציבים של גליצרול זמינים, הם דורשים גם כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים או כרומטוגרפיה גז / ספקטרומטריית מסה עבור מדידות 15 , 16 . כמו כן, גליצרול רדיו-נותב מדידות קשורות לא ספציפיות 31 . שיטות חלופיות כוללות קביעת רמות mRNA וחלבון של ליפאזים וחלבונים רגולטוריים המעורבים בליפוליזה. שיטות Colorimetric זמינים גם דEtermine את הריכוז של חומצות שומן שרשרת ארוכות במחזור. השיטה המתוארת כאן הוא מאוד יעיל בניתוח שחרור גליצרול מ רקמות השומן כפי שניתן לעשות באמצעות קורא צלחת מסוגל פלואורסצנטי המדידה absorbance. כמו כן, השיטה האנליטית פשוטה עבור שחרור גליצרול המתואר במאמר זה מספק יציבות משופרת דיוק 32 .

    נהלי עבודה סטנדרטיים צריך להיות מתורגל כמו שיטה זו כוללת טכניקות כירורגיות לבודד רפידות שומן. פרוטוקול זה ממליץ על שימוש BSA חינם שומן. זה עלול לגרום ליצירת בועות אוויר, אשר יפריע לקריאה absorbance. לכן, יש להקפיד תוך טיפול דגימות כדי למנוע בועות אוויר. יש לנקוט זהירות לא לנער או להפוך דגימות במהלך הטיפול BSA, אלא אם כן צעד כזה מומלץ בפרוטוקול. כמו כן, השלב מיצוי השומן משומן המעי הוא קריטי מאז נוכחות שומן יפריעו שנינות- קביעת חלבון רקמת השומן. בנוסף, במהלך הכנת הסטנדרטים גליצרול, חשוב לערבב את התוכן על ידי היפוך ולא לנער את הבקבוקון.

    השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש בהצלחה לבודד רפידות שומן השמנה עבור מספר מבחני כולל מדידות lipolysis. פרוטוקול lipolysis המתואר עבור רפידות שומן השד יכול בקלות להיות מורחבת למדידת ליפוליזה ברקמות אחרות. השיטות מותאמות לכל מיני סוגים של רפידות שומן, כמו גם preadipocytes.

    לסיכום, מאמר זה מתאר את השיטה למדידת שחרור גליצריול בסיסית ו- FSK במפרקים שמנים של שומן השומן המבודדים מ- NCD או HFD (± CAP) - עכברים. הנתונים המוצגים מציעים כי TRPV1 ההפעלה על ידי CAP הגביר את הלייזיזה הבסיסית FSK מגורה ומנע הצטברות של שומנים ברקמות השומן. נתונים אלה מראים תפקיד קריטי של חלבון TRPV1 ב regulatioN של ליפוליזה ברקמת השומן הלבנה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    למחברים אין מה לגלות.

    Acknowledgments

    עבודה זו נתמכה על ידי AHA פרס מס '15BGIA23250030, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של NIH תחת מספר הפרס 8P20 GM103432-12 ואת האוניברסיטה של ​​ויומינג סגל גרנט בסיוע BT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Capsaicin Sigma, USA M2028 TRPV1 agonist
    Forskolin Sigma, USA F6886 Adenylyl cyclase activator
    DMEM GE healthcare and life sciences, UT, USA SH30081.01
    High fat diet Research diets, New Brunswick, USA D12492 Abbreviated as HFD
    Tris Amresco, USA O497
    Sodium chloride Thermofisher Scientific BP358-212
    Sodium deoxycholate Sigma, USA D6750
    Dithiothreitol Sigma, USA D9163
    Sodium orthovanadate Sigma, USA S6508
    Protease inhibitor cocktail Sigma, USA P8340
    Free Glycerol reagent Sigma USA F6428
    DMSO Sigma, USA D8779
    Triacsin C Sigma, USA T4540 Acyl CoA transferase inhibitor
    Bovine serum albumin Sigma, USA A7030
    Chloroform Sigma Aldrich 31998-8
    Methanol Thermofisher Scientific, USA A412-1
    Sodium hydroxide Amresco, USA O583
    Sodium dodecyl sulfate Sigma, USA L3371
    Bicinchoninic acid reagent Sigma, USA BCA1-1KT
    UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Biotech, NJ, USA Ultrospec 2000
    Normal chow diet Labdiet.com 500I abreviated as NCD
    C57BL/6 mice Jackson Laboratory, CT, USA Stock number000664 wild type mice
    Parafilm Heathrow Scientific, USA HS 234526A
    Glycerol standard Sigma, USA G7793

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
    2. Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
    3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
    4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
    5. Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
    6. Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
    7. Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
    8. Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
    9. Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
    10. Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
    11. Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
    12. Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
    13. Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
    14. Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
    15. Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
    16. Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
    17. Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
    18. Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
    19. Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
    20. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
    21. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
    22. Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
    23. Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
    24. Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
    25. Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
    26. Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
    27. Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
    28. Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
    29. Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
    30. Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
    31. Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
    32. Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).

    Tags

    ביוכימיה גליון 125 ליפוליזה רקמות שומן אדומות משמנים שומן השומן שחרור גליצרול forskolin capsaicin TRPV1.
    מדידה של ליפוליזה מגורה של Basal ו- Forskolin במרפאות שומן אדיפוז
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Baskaran, P., Thyagarajan, B.More

    Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads. J. Vis. Exp. (125), e55625, doi:10.3791/55625 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter