Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

बेसल और एफोस्कोोलिन-उत्तेजित लिपोलिसिस का इनगुइनल ऐडीज वसा पैड में मापन

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55625

Summary

इस प्रोटोकॉल में सामान्य चाउ आहार (एनसीडी) या उच्च वसायुक्त आहार (एचएफडी) से प्राप्त इनगल वैट पैड में बेसल और फोर्स्कोलिन-उत्तेजित लिपोलिसिस का पता लगाने की विधि का वर्णन किया जाता है ± कैप्सैसिकिन खिलाया जंगली प्रकार की चूहों। लिपोलिसिस के लिए एक सूचकांक के रूप में, ग्लिसरॉल रिलीज़ इंजिनियल एडिपोस वेट पैड से मापा गया था।

Abstract

लिपोलिसिस एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा वसा के ऊतकों में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में संग्रहीत लिपिड को ग्लिसरॉल और फैटी एसिड में हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है। यह लेख बेसल और फोर्स्कोलिन (एफएसके) की माप के लिए विधि का वर्णन करता है- जंगली प्रकार की चूहों से अलग इंजेन्गल वसा वाले पैरों में पृथक लिपोलिसिस या तो सामान्य चो आहार (एनसीडी), उच्च वसायुक्त आहार (एचएफडी) या 0.01 युक्त उच्च वसायुक्त आहार 32 सप्ताह के लिए capsaicin का% (कैप; क्षणिक रिसेप्टर संभावित वैनिलाइड सबफ़ैमिली 1 (टीआरपीवी 1) एगोनिस्ट) पूर्व विवो लिपोलिसिस के लिए यहां वर्णित विधि श्विइगर एट अल से अपनाई गई है 1 यूवी-विज़िबल (यूवी / वीआईएस) स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा ग्लिसरॉल स्तर को मापने के लिए हमने एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है यहाँ वर्णित विधि को संगत परिणामों को प्राप्त करने के लिए लिपोलिसिस मापन के लिए इंन्गल वेट पैड को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इनुनालिक वसा पैड के लिए वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से अन्य ऊतकों में lipolysis को मापने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

वसा के ऊतकों को ऊर्जा के रूप में वसा 2 और वसायुक्त एसिड ऑक्सीकरण की आवश्यकता होती है थर्मोनेसिस 3 , 4 के लिए आवश्यक है। आहार के माध्यम से युक्त फैटी एसिड को अपोप्रोटीन के साथ सिलोमििक्रन्स में पैक किया जाता है और रक्त परिसंचरण के माध्यम से शरीर में विभिन्न ऊतकों को दिया जाता है। हालांकि शरीर में अधिकांश कोशिकाओं ऊर्जा की एक आरक्षित भंडार रखते हैं, वसा ऊतक वसा 5 , 6 के रूप में अधिक ऊर्जा भंडार करता है। वसा ऊतकों में लिपोलिसिस जटिल प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित होती है और लिपोलिसिस के आणविक विवरण अभी भी अस्पष्ट 7 हैं

Lipolysis एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा ट्राइग्लिसराइड्स (TGL) वसा ऊतकों में जमा हो जाती ग्लिसरोल और फैटी एसिड (एफए) एंजाइम वसा ट्राइग्लिसराइड lipase (ATGL) 8 से निर्माण करने के लिए हाइड्रोलाइज्ड हो रहा है। बेसल और उत्तेजित लिपोलिसिस में परिवर्तन मोटापा की एक विशेषता है। बीAsal lipolysis को एटीजीएल सक्रियकरण 9 द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो टीजीएल को डायसीलेग्लिसराल (डीएजी) में बदल देता है, जिसे बाद में मोनोएवरल ग्लिसरॉल (एमएजी) के लिए हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है। एडेनइलेल साइक्लेज़ के माध्यम से हार्मोन से संवेदनशील लाइपेस (एचएसएल) की सक्रियता चक्रीय एडेनोसिन मोनोफोस्फेट (सीएएमपी) पर निर्भर प्रोटीन कीनेस ए (पीकेए) उत्तेजना को सक्रिय करती है और लिपोलिसिस का कारण बनती है। इस प्रक्रिया में शामिल प्रोटीनों की गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, लिपिोलिसिस, बेसल और उत्तेजित की मापन, इसलिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, लिपोलिसिस के आणविक विनियमन को उजागर करना मोटापे के खिलाफ उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है 10 । चूंकि, लिपोलिसिस और फैटी एसिड ऑक्सीकरण को प्रोत्साहित करने वाले अणु, डिपो में संग्रहीत वसा कम करने के लिए संभावित उम्मीदवार हैं, प्रजनन क्षमता के लिए एक मजबूत परख लगाने के लिए महत्वपूर्ण है।

पहले प्रकाशित आंकड़ों से पता चलता है कि सीएपी बढ़ाकर बेसल द्वारा सफेद वसा ऊतकों में व्यक्त TRPV1 प्रोटीन की सक्रियणऔर एफएसके (एडेन्यलील साइक्लेज़ एक्टिवेटर) -इन्ग्नल वेट पैड 11 में प्रेरित लिपोलिसिस पिछला शोध यह भी बताता है कि सीएपी द्वारा टीआरपीवी 1 की दीर्घकालिक सक्रियण पीकेए 12 को सक्रिय करता है चूंकि पीकेए के सक्रियण लिपिलाइसीस 13 , 14 को उत्तेजित करता है , इसलिए मूल आहार को खिलाने के 32 सप्ताह के बाद एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) से अलग-थलग ईन्गुनल फैट पैड में बेसल और पीकेए-आश्रित उत्तेजित लिपोलिसिस को मापने के लिए TRPV1 की भूमिका को मान्य किया जाएगा लिपोलिसिस में सक्रियण

यह आलेख बेसल और उत्तेजित लिपिोलिसिस का निर्धारण करने की एक प्रभावी पद्धति का वर्णन करता है। हालांकि , 15 , 16 के माप के लिए ग्लिसरॉल और थकाऊ उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी या गैस क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रेडियोधर्मी आइसोटोप को नियुक्त करने वाले अन्य तरीकों से इस पद्धति में अधिक प्रत्यक्ष, सरल और लागत प्रभावीवसा ऊतकों में लिपिोलिसिस निर्धारित करने के लिए तकनीक

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रोटोकॉल वायोमिंग विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करते हैं।

1. पशु आवास और भोजन

नोट: संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार वयस्क पुरुष जंगली प्रकार की चूहों (सी 57 बीएल / 6) (12 से 24 सप्ताह की आयु) अनुसंधान जानवरों की सुविधा में पैदा हुई थी।

  1. सप्ताह के 6 दिनों से अलग, अलग-अलग पिंजरों में चार समूहों के घर की चूहों और अनियमित रूप से इन्हें एनसीडी या एचएफडी (± 0.01% कैप) के खिलाओ समूहों में सप्ताह 38 की उम्र तक आवंटित करते हैं।
    नोट: कैप एडीपोज के ऊतकों 11 , 17 में व्यक्त TRPV1 चैनल प्रोटीन का एक एंजोनिस्ट है। हूड के अंदर एक ब्लेंडर में एचएफ़डी के साथ सीएपी मिक्स करें और मिश्रित मिश्रण को एक ट्रे में 2 में 1 छोटा करें। एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के अंदर ट्रे रखें। 24 घंटे के बाद फ्रीज़र से HFD + CAP आहार युक्त ट्रे निकालें और कंटेनर में स्टोर -20 औरउपयोग होने तक # 176; सी फ्रीज़र
  2. पर्यावरण-नियंत्रित माहौल (22.8 ± 2.0 डिग्री सेल्सियस, 45 - 50% नमी) में हाउस चूहों को 12/12-प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ नामित आहार और पानी के शौचालय तक पहुंच के साथ।
  3. 38 सप्ताह के अंत में, कमजोर वसा ऊतकों काटना और lipolysis प्रयोगों (वर्गों 2-7) के लिए उपयोग करें।

2. प्रयोगों के लिए चूहे की तैयारी

  1. केटामाइन और जइलाज़ीन मिश्रण (क्रमशः 10 मिलीग्राम / किग्रा और 80 मिलीग्राम / किग्रा के शरीर का वजन) इंजेक्शन द्वारा चूहों को anesthetize करें। मिश्रण का 0.01 एमएल इंजेक्षन / माउस का 10 ग्राम शरीर का वजन।
  2. एक फर्म पैर की अंगुली चुटकी द्वारा गहन संज्ञाहरण की पुष्टि करें यदि कोई पेडल पलटा हुआ है, तो कम से कम 30 एस के बाद फिर से माउस का परीक्षण करें
  3. संज्ञाहरण के दौरान आंखों की सूखापन को रोकने के लिए पशु चिकित्सक नेत्र मरहम का प्रयोग करें। प्रक्रियाओं में से किसी के दौरान चले गए चूहों को न छोड़ें।
  4. केटामाइन और xylazine मिश्रण इंजेक्शन (10 मिलीग्राम / किग्रा और 80 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन, क्रमशः) की एक उच्च खुराक इंजेक्शन द्वारा चूहों euthanize मिक्सरई (0.01 मिलीग्राम / 10 ग्राम शरीर का वजन) ग्रीवा अव्यवस्था के बाद।
    नोट: यूथनेसिया की यह विधि वायोमिंग विश्वविद्यालय के आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित है।

3. इनगैलिनल वसा फैट पैड की अलगाव

  1. प्रक्रिया के लिए बाईं ओर स्थित माउस (32 सप्ताह के लिए एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) के साथ खिलाया) रखें।
    नोट: बाईं तरफ माउस को रखकर, बाएं फोरिलाम्ब और बाएं हिंदलिम्ब विच्छेदन मंच पर होंगे, जबकि सही मंच और सही हिंदलिम्ब मंच से दूर का सामना करेंगे।
  2. त्वचा की सतह को 2 इंच 2 गोज पैड के साथ लगभग 2.5 एमएल 70% इथेनॉल में भिगो दें। अंतर्निहित फैटी परत को प्रकट करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा के माध्यम से एक 2 - 3 मिमी पार्श्व कट करें।
  3. दो पार्श्व शीरों में शामिल होने वाली पृष्ठीय सतह पर रिब पिंजरे के ठीक नीचे एक स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा के माध्यम से एक 1 सेमी काट (माउस के आकार के आधार पर) बनाएं।
  4. इसे ध्यान से खींचकर त्वचा फ्लैप पील करेंबाँझ संदंश का उपयोग कर और चमड़े के नीचे पैड को वसा वाले पैड को काटकर नहीं छोड़ दें। यह वसा पैड त्वचा के नीचे झूठ बोल रहा है।
  5. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके अंतर्निहित मांसपेशियों और प्रावरिक से ध्यान से वसा वाले पैड को काट लें। वसा पैड को खींचें क्योंकि यह अंतर्निहित मांसपेशी से काटा जाता है।
    नोट: वसा पैड का वजन और आकार चूहों के प्रकार पर निर्भर करता है (एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) -फड)।
  6. कमरे के तापमान पर (~ 15 मिनट) lipolysis प्रयोगों तक फॉस्फेट बफ़ेड खारा (पीबीएस) युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरण करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
  7. चरण 3.2-3.6 में वर्णित अनुसार माउस के दाईं ओर से वसा पैड को अलग करें।

4. बेसल ग्लिसरोल इनगुइनल फैट पैड से रिलीज

  1. लगभग 20 मिलीग्राम वसा वाले ऊतकों को 5 से 8 टुकड़ों में काटने के लिए तेज कैंची का उपयोग करें।
  2. ऊष्मायन माध्यम के 200 μL (डुबेबेको के संशोधित ईगल का मध्यम (डीएमईएम) में 2% फैटी एसिड युक्त इनगिनल वसा पैड के कटौती के टुकड़े को सेते हैंफ्री गोजाइन सीरम एल्बूमिन (बीएसए)) 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% आर्द्रता 60 मिनट के लिए
    1. लेपोलिसिस परख के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन माध्यम को इकट्ठा और फ्रीज करें।
      नोट: कटौती के टुकड़े लिपिड निष्कर्षण के बाद प्रोटीन एकाग्रता के निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है।
    2. क्लीयरोफॉर्म: मेथनॉल (2: 1, वी / वी) और 1% ग्लैसियल एसिटिक एसिड) में 1 एमएल एक्सटेक्शन सॉल्यूशंस में चिमटी की मदद से कट वसा वाले टुकड़ों को ट्रांसफर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 से ज़ोरदार झटकों आरपीएम। वसा निकासी समाधान त्यागें
      नोट: यह चरण कटौती के टुकड़ों से वसा निकालेगा। वसा निकासी समाधान को त्याग दें क्योंकि यह प्रोटीन निर्धारण के साथ हस्तक्षेप करेगा।
    3. टीज़्यूज़ (चरण 4.2.2) से स्वेर्यूज़र माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 500 μL के लिसनस समाधान (0.3 एनओओएचएच युक्त 0.1% सोडियम डोडेक्वाइल सल्फेट; एसडीएस युक्त) में 55 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (12 एच) सेवन करें। 100 आरपीएम पर
  3. मानक 18 के रूप में बिकिचोनिनिक एसिड (बीसीए) अभिकर्मक और बीएसए का उपयोग करके ऊतक के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण (चरण 4.2.3)
  4. हिम पर जमे हुए माध्यम (चरण 4.2.1) को पिघलना और प्रोटोकॉल 6 और 7 6 में वर्णित मुक्त ग्लिसरॉल अभिकर्मक का उपयोग करके माध्यम के ग्लिसरॉल सामग्री को निर्धारित करें।
    1. मानक वक्र से नमूने में ग्लिसरॉल की एकाग्रता एक्सट्रपलेशन ग्लिसरॉल मानकों 19 और ज 20 प्रति nanomoles ग्लिसरॉल प्रति मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में एक्सप्रेस lipolysis का उपयोग कर साजिश रची।

5. एफएसके-उत्तेजित लिपिोलिसिस

  1. 200 एमएल डीएमईएम में 2% फैटी एसिड फ्री बीएसए, 10 माइक्रोन एफएसके और 5 माइक्रोन ट्रैक्ससिन सी युक्त एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) से युक्त 20 मिलीग्राम इनगिनल वेट पैड (5 से 8 कट टुकड़ों) से युक्त 60 डिग्री के लिए 5% सीओ 2 और 95% नमी में 37 डिग्री सेल्सियस
  2. एक समान माध्यम के लिए चिमटी का उपयोग करके ऊतक के टुकड़े को स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और 95% आर्द्रता पर एक और 60 मिनट के लिए सेवन करें। ऊष्मायन माध्यम को इकट्ठा करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर लीपोलिसिस परख तक स्टोर करें।
    नोट: लिपोलिसिस की उत्तेजना 15 मिनट के भीतर फैटी एसिड और ग्लिसरॉल की तेजी से रिहाई का कारण बनती है, जो पहले घंटे के दौरान रैखिक है और उसके बाद पठार। के बाद से प्रेरित lipolysis की दर अधिक है और स्थिर FSK उत्तेजना के पहले और दूसरे घंटे के बीच है, प्रेरित राज्य में इस प्रोटोकॉल मापा जाता lipolysis के रूप में पहले से 1 वर्णित दूसरा ऊष्मायन अवधि के बाद। इसलिए, प्रयोगात्मक कदम (5.1 और 5.1.1) दोनों आवश्यक हैं।
  • इनग्निनल वेट पैड से वसा निकालने के लिए, चरण 1 से टीएनडी या एचएफडी (± सीएपी) -पीड चूहों से प्राप्त की गई कटू टुकड़ों को स्थानांतरित करें, चिमटी की निकासी समाधान के 1 एमएल में क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल (2 : 1। वी /V) और 1% ग्लैसियल एसिटिक एसिड) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 आरपीएम पर जोरदार झटकों के तहत 60 मिनट के लिए सेते हैं। निकाले गए वसा को त्यागें
  • टीज़्यू (चरण 5.2 से) टि्वेजर्स का उपयोग एक बाँझ माइक्रॉफ़ेज ट्यूब में 500 μL का विश्लेषण समाधान (0.3 एनओओएचएच 0.1% एसडीएस युक्त) में करें और 55 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (12 घंटे) 100 आरपीएम पर जोरदार झटकों के साथ सेते हैं।
  • क्रमशः 4.3 और 4.4 चरण में बताए अनुसार प्रोटीन एकाग्रता और ऊतक की ग्लिसरॉल सामग्री निर्धारित करें।
  • 6. नि: शुल्क ग्लिसरॉल अभिकर्मक की तैयारी

    1. एक एम्बर रंग का कांच की शीशी में ग्लिसरॉल अभिकर्मक Reconstitute विआयनीकृत जल की 19 40 में एमएल, शीशी पर एक डाट जगह है और 10 बार inverting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण। मिलाते हुए मिश्रण मत करो
    2. एलियामिनियम पन्नी के साथ शीशी को पूरी तरह से कवर करके प्रकाश से सुरक्षित रेफ्रिजरेटर के अंदर 4 डिग्री सेल्सियस पर शीशी को स्टोर करें।
    3. ग्लिसरॉल मानक तैयार करने के लिए आगे बढ़ें (खंड 7)।

      7. ग्लिसरॉल मानक की तैयारी और ग्लिसरॉल सामग्री का निर्धारण

      1. 65 μL विआयनीकृत पानी के साथ आपूर्ति किए गए स्टॉक के 35 μL को कम करके 1 एमएम का स्टॉक बनाएं।
        नोट: निर्माता ग्लिसरॉल मानक स्टॉक की आपूर्ति 2.8 मिमी ग्लिसरॉल है।
      2. पाँच 1-सेमी पथ लंबाई डिस्पोजेबल मेथैक्र्रेलेट क्यूवेट्स लें। 0, 1.25, 2.5, 5 और 10 एनएमएल मानक के रूप में मार्कर का उपयोग करके क्यूवेट लेबल करें।
      3. संबंधित लेबल वाले क्यूवेट्स में 0, 1.25, 2.5, 5 और 10 एमएल 1 एमएम ग्लिसरॉल मानक जोड़ें। प्रत्येक क्युवेट की मात्रा को विआयनीकृत पानी से 10 μL तक बढ़ाएं।
      4. सभी नमूनों (चरण 4.4 या 5.1.1 से) के 1 से 10 कमजोर पड़ने के लिए नमूना के 10 μL को 90 μL डीओनेज्ड पानी से ताजा 500-μL प्रीलैबैटेड सेंटीफ्यूज ट्यूबों में जोड़कर। संबंधित नमूना पहचान संख्या के साथ लेबल cuvettes में पतला नमूनों के 10 μL जोड़ें।
      5. यूवी-वीआईएस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर स्विच करें और लहर सेट करें540 एनएम की लंबाई
      6. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शीशी (चरण 6.2) को रखकर कमरे के तापमान पर मुफ़्त ग्लिसरॉल अभिकर्मक गर्म करें
      7. रिक्त "0" एनएमओएल मानक (चरण 7.3), मानकों (चरण 7.3) और नमूनों (चरण 7.4) के रूप में लेबल क्यूवेट्स की श्रृंखला सेट करें।
      8. संबंधित लेबल क्यूवेट में प्रत्येक मानक और नमूने के 10 μL जोड़ें। "0" एनएमओएल मानक को खाली के रूप में प्रयोग करें
      9. प्रत्येक क्युवेट में 0.8 मिलीलीटर मुफ्त ग्लिसरॉल अभिकर्मक जोड़ें, जिसमें 1 एमएल विंदुक का उपयोग करके ग्लिसरॉल मानकों को शामिल किया गया है।
      10. क्यूवेट को 1.5 सेमी चौराहे प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के साथ कवर करें और क्यूवेट को 3 गुणा के लिए निकालकर और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अलग सेट करें।
      11. यूवी-वीआईएस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्युवेट रखें और शोषक (540 एनएम तरंगलांब) रिकॉर्ड करें।
      12. X- अक्ष में मानकों (एनएमओएल) की सांद्रता और Y- अक्ष में दर्ज अवशोषण का उपयोग करके मानक वक्र को छापें।
      13. जीएल की एकाग्रता की गणना करेंचरण 7.12 में प्लॉट किए गए मानक वक्र का उपयोग करते हुए एक्सट्रपलेशन के नमूने (एनएमओएल) में ycerol।
      14. कमजोर पड़ने वाले कारक 10 (चरण 7.4 का उल्लेख करें) और 20 (कुल मात्रा) के साथ नमूने (एनएमओएल / क्युवेट) की एकाग्रता को गुणा करें
      15. बीसीए विधि द्वारा गणना प्रोटीन मिलीग्राम द्वारा प्रत्येक नमूने में ग्लिसरॉल (चरण 7.13) में एकाग्रता को विभाजित करें।
        नोट: चूंकि इनग्निनल वसा पैड के नमूनों को 60 मिनट के लिए सेवन किया गया है, इसलिए परिणाम ग्लिसरॉल / एमजी प्रोटीन / एच के एनएमएल के रूप में दर्शाते हैं।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    बेसल और उत्तेजित लिपोलिसिस पर कैप के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, इस अनुसंधान ने एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) -फर्ड जंगली प्रकार की चूहों से पृथक इंजनल वसा वाले वसा पैड में लिपोलिसिस को मापा। इनगल वैट पैड के लिए बेसल और एफएसके-उत्तेजित लिपोलिसिस के लिए प्रतिनिधि परिणाम तालिका I में दिए गए हैं। बेसल और एफएसके-उत्तेजित ग्लिसरॉल रिलीज त्रियासीन सी की उपस्थिति में है, जो एसीएल सीएए सिंथेटेस को रोकता है और टीजीएल के पुनर्जन्म को रोकता है। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, एचएफडी ने एफएसके-उत्तेजित लिपोलिसिस को दबा दिया, और कैप ने बेसल और एफएसके-उत्तेजित लिपोलिसिस दोनों में वृद्धि की। त्रिएकसिन सी को ग्लिसरॉल और फैटी एसिड 11 से टीजीएल के पुनर्जन्म को रोकना पड़ा। सभी आंकड़ों के रूप में व्यक्त किया जाता है कि समूह के बीच ± SEM तुलना का एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है और स्टूडेंट टी टेस्ट का उपयोग करने के बाद तमाम विश्लेषण किए गए हैं। नमूना आकार सेट कर रहे हैं यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक समूह में एक परिणाम चर के माध्य मूल्य दूसरे समूह में काफी भिन्न है या नहीं। एक पी मूल्य <0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में माना जाता है

    आकृति 1
    चित्रा 1: सीएपी इनगलिनल फैट पैड में बेसल और एफएसके-उत्तेजित ग्लिसरॉल रिलीज को बढ़ाता है बार ग्राफ़ एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) -फ़र्ड जंगली प्रकार की चूहों से पृथक इनग्नल वेट पैड में बेसल और एफएसके (10 माइक्रोग्राम) का मतलब एसवाईएम (10 माइक्रोन) -स्टिमेटेड ग्लिसरॉल रिलीज (एनएमओएल / एमजी प्रोटीन / एच) का प्रतिनिधित्व करता है। ** पी मूल्य के लिए सांख्यिकीय महत्व का प्रतिनिधित्व करता है <0.05 n = 6। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    5 / 55625fig2.jpg "/>
    चित्रा 2: ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएल) के हाइड्रोलिसिस का परिणाम मुक्त फैटी एसिड (एफएफए) और ग्लिसरॉल के उत्पादन में है। एफएफए मिटोकॉन्ड्रियल β- ऑक्सीकरण से गुजरती है। यह, बिना-प्रोटीन 1 (यूसीपी -1) के अप्रागुलेशन के साथ ही थॉमोजेनेसिस उत्तेजित करता है। ग्लिसरॉल रिलीज अनुच्छेद में वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा मापा जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    lipolysis
    (Nmoles ग्लिसरॉल / मिलीग्राम प्रोटीन / एच)
    एनसीडी
    (एन = 6)
    HFD
    (एन = 6)
    एचएफडी + कैप
    (एन = 6)
    बुनियादी 16.22 ± 1.28 17.16 ± 1.48 52.07 ± 2.66
    एफएसके उत्तेजित
    (त्रैैक्सीसिन सी के साथ)
    54.88 ± 3.27 41.23 ± 4.43 72.04 ± 4.16

    तालिका 1: मूल और एफएसके उत्तेजित लिपोलिस पर इनएनल वसा पैड पर कैप का प्रभाव एनसीडी, एचएफडी या एचएफडी + सीएपी-खिलाया जंगली प्रकार की चूहों से मिली इन बेसल और एफएसके-उत्तेजित ग्लिसरॉल रिलीज ± एसईएम, इनगेंनल वसा वसा ऊतक में मापा गया।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    ग्लिसरॉल और फैटी एसिड में टीजीएल की टूटने की प्रक्रिया बेसल लिपोलिसिस के दौरान एटीजीएल 9 द्वारा उत्प्रेरित होती है और उत्तेजित लिपोलिसिस 21 , 22 , 23 के दौरान एडेन्यलील साइक्लेज़ / पीकेए-आश्रित मार्ग के सक्रियण सहित प्रोटीन की एक श्रृंखला द्वारा चलाया जाता है। लिपोलिसिस की वृद्धि परिवहन और ऊर्जा उपयोग के लिए फैटी एसिड के प्लाज्मा स्तर को बढ़ाता है 24 । फैटी एसिड को एसिटाइल कोए के रूप में मिटोकोंड्रिया द्वारा लिया जाता है, जो ऊर्जा का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

    लिपोलिसिस की डिग्री और हद तक चिकनाई के ऊतकों ( तालिका 1 और चित्रा 1 ) से ग्लिसरॉल रिलीज द्वारा कुशलतापूर्वक मापा जा सकता है। टीजीएल का हाइड्रोलिसिस फैटी एसिड और ग्लिसरॉल का उत्पादन करता है। पिछली अनुसंधान से पता चला है कि सीएपी के आहार अनुपूरण ने बेसल और साथ ही एफएसके-उत्तेजित ग्लिसरॉल रिलीज़ को बढ़ाया हैईन्जिनल और ब्राउन वसा पैड से 11 , 17 बढ़ाया लिपोलिसिस से फैटी एसिड का उत्पादन बढ़ने से गर्मी और थर्मोनेसिस का उत्पादन करने के लिए फीड के रूप में काम किया जा सकता है क्योंकि सीएपी ने इनटिनियल वेट पैड में मिटोकोन्ड्रियल यूसीपी -1 की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि की है। इस धारणा के अनुरूप, पिछले शोध से पता चलता है कि सीएपी ने इनोनल वेट पैड में पेरोक्साइज़ोम प्रोलिफेरेटर सक्रिय रिसेप्टर अल्फा (पीएपीएआरए) की अभिव्यक्ति बढ़ा दी है, जो मिटोचोनड्रियल फैटी एसिड ऑक्सीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और यूसीपी -1 25 , 26 के ट्रांस्क्रिप्शनल रेगुलेशन में , 27 नतीजतन, सीएपी ने एचएफ़डी-फेड चूहों 28 , 2 9 में चयापचय गतिविधि, गर्मी उत्पादन और ऊर्जा व्यय भी बढ़ाया। इसके अलावा, एचएफडी खिला को प्रेरित लिपोलिसिस को दबाया गया जबकि सीएपी ने बेसल और एफएसके से प्रेरित पीकेए-निर्भरटी लिपोलिसिस और इंसुलिन संवेदनशीलता बढ़ाकर 30 इसलिए, जैसा चित्रा 2 में मॉडल द्वारा वर्णित है, यह समझाने के लिए उचित है कि कैप ने बेसल और उत्तेजित लिपोलिस को बिना इंसुलिन प्रतिरोध के कारण बढ़ा दिया क्योंकि अतिरिक्त वसा मिटोकोडायड्रियल यूसीपी -1 अपरियुलेशन द्वारा गर्मी का उत्पादन करने के लिए जला दिया जाता है।

    यह लेख सफेद वसा ऊतकों से ग्लिसरॉल रिलीज को मापने की विधि का वर्णन करता है। हालांकि ग्लिसरॉल के स्थिर आइसोटोप का उपयोग करने के कई तरीके उपलब्ध हैं, हालांकि उन्हें मापने के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी या गैस क्रोमैटोग्राफी / जन स्पेक्ट्रोमेट्री की आवश्यकता होती है , 15 , 16 । इसके अलावा, ग्लिसरॉल रेडियो-ट्रेसर मापन गैर-विशिष्टता 31 के साथ जुड़ा हुआ है वैकल्पिक तरीकों में एमआरएनए और प्रोटीन स्तर की लाइप्स और लिगोलिसिस में शामिल नियामक प्रोटीनों का निर्धारण शामिल है। क्लीरिमेट्रिक तरीके भी डी के लिए उपलब्ध हैंपरिसंचरण में लंबी श्रृंखला फैटी एसिड की एकाग्रता को समझें। यहाँ वर्णित विधि वसा के ऊतकों से ग्लिसरॉल रिलीज के विश्लेषण के लिए बहुत ही कुशल है क्योंकि यह एक प्लेट रीडर का उपयोग करके किया जा सकता है जो प्रतिदीप्ति और शोषक माप में सक्षम है। इसके अलावा, इस लेख में वर्णित ग्लिसरॉल रिलीज़ के लिए सरलीकृत विश्लेषणात्मक पद्धति में सुधार की स्थिरता और शुद्धता 32 है

    मानक परिचालन प्रक्रियाओं का अभ्यास करना चाहिए क्योंकि इस पद्धति में वसा पैड को अलग करने के लिए शल्य चिकित्सा तकनीक शामिल है। यह प्रोटोकॉल वसा मुक्त बीएसए के उपयोग की सिफारिश करता है इससे हवाई बबल गठन हो सकता है, जो अवशोषण पढ़ने में हस्तक्षेप करेगा। इसलिए, हवाई बुलबुले को रोकने के लिए नमूनों को संभालने के दौरान ध्यान रखना चाहिए। बीएसए उपचार के दौरान नमूनों को हिलाकर या उलटना न करने के लिए सावधानी बरतने चाहिए, जब तक प्रोटोकॉल में इस तरह के कदम की सिफारिश नहीं की जाती। इसके अलावा, इनगुनल वसा से वसा निष्कासन कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि वसा की मौजूदगी बुद्धि को दखल देगाएच इन्जिनल वसा ऊतक प्रोटीन निर्धारण इसके अतिरिक्त, ग्लिसरॉल मानकों की तैयारी के दौरान, व्युत्क्रम द्वारा सामग्री को मिश्रण करना महत्वपूर्ण है और शीशी को हिला नहीं।

    यहां वर्णित विधि लिपोलिसिस मापन सहित कई एशेज के लिए इन्गुनल वेट पैड को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लेगोलिसिस प्रोटेंट को इन्गिनल वेट पैड के लिए वर्णित किया जा सकता है अन्य ऊतकों में लिपिोलिसिस के माप को आसानी से बढ़ाया जा सकता है। सभी प्रकार के वसा पैड के साथ-साथ प्रीडिपोसाइट्स भी तरीकों से अनुकूलित हैं।

    संक्षेप में, यह आलेख एनसीडी या एचएफडी (± सीएपी) -पीड चूहों से अलग बेसल और एफएसके-उत्तेजित ग्लिसरॉल को मापने के लिए विधि का वर्णन करता है। प्रस्तुत आंकड़े बताते हैं कि सीएपी द्वारा टीआरपीवी 1 सक्रियण ने बेसल और एफएसके-उत्तेजित लिपोलिसिस में वृद्धि की और वसा के ऊतकों में लिपिड के संचय को रोका। ये आंकड़े विनियमन में टीआरपीवी 1 प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैंसफेद वसा ऊतक में lipolysis के एन।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    इस काम को एएचए अवार्ड नं। 15 बीजीआई 2 25323030, एनआईएच के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज के तहत पुरस्कार संख्या 8 पी 20 जीएम 103432-12 और बीटी से सहायता में वायोमिंग संकाय अनुदान विश्वविद्यालय का समर्थन किया गया था।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Capsaicin Sigma, USA M2028 TRPV1 agonist
    Forskolin Sigma, USA F6886 Adenylyl cyclase activator
    DMEM GE healthcare and life sciences, UT, USA SH30081.01
    High fat diet Research diets, New Brunswick, USA D12492 Abbreviated as HFD
    Tris Amresco, USA O497
    Sodium chloride Thermofisher Scientific BP358-212
    Sodium deoxycholate Sigma, USA D6750
    Dithiothreitol Sigma, USA D9163
    Sodium orthovanadate Sigma, USA S6508
    Protease inhibitor cocktail Sigma, USA P8340
    Free Glycerol reagent Sigma USA F6428
    DMSO Sigma, USA D8779
    Triacsin C Sigma, USA T4540 Acyl CoA transferase inhibitor
    Bovine serum albumin Sigma, USA A7030
    Chloroform Sigma Aldrich 31998-8
    Methanol Thermofisher Scientific, USA A412-1
    Sodium hydroxide Amresco, USA O583
    Sodium dodecyl sulfate Sigma, USA L3371
    Bicinchoninic acid reagent Sigma, USA BCA1-1KT
    UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Biotech, NJ, USA Ultrospec 2000
    Normal chow diet Labdiet.com 500I abreviated as NCD
    C57BL/6 mice Jackson Laboratory, CT, USA Stock number000664 wild type mice
    Parafilm Heathrow Scientific, USA HS 234526A
    Glycerol standard Sigma, USA G7793

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
    2. Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
    3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
    4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
    5. Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
    6. Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
    7. Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
    8. Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
    9. Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
    10. Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
    11. Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
    12. Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
    13. Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
    14. Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
    15. Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
    16. Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
    17. Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
    18. Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
    19. Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
    20. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
    21. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
    22. Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
    23. Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
    24. Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
    25. Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
    26. Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
    27. Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
    28. Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
    29. Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
    30. Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
    31. Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
    32. Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).

    Tags

    बायोकेमेस्ट्री अंक 125 लिपोलिसिस व्हाइट एडिपोज टिशू इनग्नल एडिपोज वेट पैड ग्लिसरॉल रिलीज फोर्स्कोलिन कैप्सिकिन टीआरपीवी 1।
    बेसल और एफोस्कोोलिन-उत्तेजित लिपोलिसिस का इनगुइनल ऐडीज वसा पैड में मापन
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Baskaran, P., Thyagarajan, B.More

    Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads. J. Vis. Exp. (125), e55625, doi:10.3791/55625 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter