Summary
Questo protocollo descrive il metodo di determinazione della lipolisi basale e forskolin-stimolata nei pastelli grassi inguinali ottenuti dalla normale dieta di chow (NCD) o dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) ± capsaicina alimentata da topi selvatici. Come indice per la lipolisi, il rilascio di glicerolo è stato misurato dai placche grasse adipose inguinali.
Abstract
La lipolisi è un processo attraverso il quale il lipide immagazzinato come trigliceridi nei tessuti adiposi viene idrolizzato in glicerolo e acidi grassi. In questo articolo viene descritto il metodo per la misura della lipolisi stimolata da basale e forskolin (FSK) nei placchetti grassi inguinali isolati da topi selvatici alimentati sia alla dieta normale di chow (NCD), alla dieta ad alta percentuale di grassi (HFD) o ad una dieta ad alto contenuto di grassi contenente 0,01 % Di capsaicina (PAC, agonista subfamiglia 1 del vincolo di vanilloide transitorio transitorio (TRPV1)) per 32 settimane. Il metodo descritto qui per l'esecuzione della lipolisi ex vivo è adottato da Schweiger et al. 1 Presentiamo un protocollo dettagliato per misurare i livelli di glicerolo mediante spettrofotometria UV-Visibile (UV / VIS). Il metodo qui descritto può essere utilizzato per isolare con successo i rilievi grassi inguinali per le misurazioni della lipolisi per ottenere risultati coerenti. Il protocollo descritto per i pasticci grassi inguinali può essere facilmente esteso per misurare la lipolisi in altri tessuti.
Introduction
I tessuti adiposi conservano l'energia in quanto il grasso 2 e l'ossidazione dell'acido grasso sono necessari per la termogenesi 3 , 4 . Gli acidi grassi ingeriti attraverso le diete sono confezionati insieme ad apoproteine in chimomicroni e consegnati a diversi tessuti nel corpo attraverso la circolazione del sangue. Anche se la maggior parte delle cellule del corpo conserva una riserva di energia, il tessuto adiposo conserva l'energia in eccesso come grasso 5 , 6 . La lipolisi nel tessuto adiposo è regolata da processi complessi ei dettagli molecolari della lipolisi rimangono ancora vaghi 7 .
La lipolisi è un processo attraverso il quale i trigliceridi (TGL) immagazzinati nel tessuto adiposo vengono idrolizzati per produrre glicerolo e acidi grassi (FA) dall'enzima liposica adiposa triglicerida (ATGL) 8 . Le alterazioni nella lipolisi basale e stimolata sono una caratteristica dell'obesità. Il bLa lipolisi asale è regolata dall'attivazione ATGL 9 , che converte TGL in diacylglycerol (DAG), che viene successivamente idrolizzato in monoacil glicerolo (MAG). L'attivazione della lipasi sensibile all'ormone (HSL) tramite l' adenilil ciclasi attiva la stimolazione della proteina kinasi A (PKA) dipendente dalla adenosina monofosfata (cAMP) e provoca la lipolisi. La misurazione della lipolisi, basale e stimolata, è quindi importante per analizzare l'attività delle proteine coinvolte in questo processo. Inoltre, distruggere la regolazione molecolare della lipolisi può essere utile per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro l'obesità 10 . Poiché le molecole che stimolano la lipolisi e l'ossidazione dell'acido grasso sono potenziali candidati per la riduzione dei grassi conservati nei depositi, è importante impiegare un saggio robusto per la riproducibilità.
I dati precedentemente pubblicati suggeriscono che l'attivazione della proteina TRPV1 espressa in tessuto adiposo bianco per CAP basale miglioratoE FSK (attivazione di adenilil ciclasi) - lipolisi stimolata nei pad grassi inguinali 11 . Precedenti ricerche suggeriscono anche che l'attivazione a lungo termine di TRPV1 da parte della PAC attiva PKA 12 . Dal momento che l'attivazione della PKA stimola la lipolisi 13 , 14 , misurando sia la lipolisi stimolata basale sia PKA-dipendente in placche grasso inguinale isolate da topi NCD o HFD (± CAP) dopo 32 settimane di alimentazione delle rispettive diete convalideranno il ruolo di TRPV1 Attivazione nella lipolisi.
Questo articolo descrive un metodo efficiente per determinare la lipolisi basale e stimolata. Sebbene siano disponibili altri metodi che impiegano isotopi radioattivi di glicerolo e cemente cromatografica a massa ad alta prestazione o gas cromatografia / spettrometria di massa per le misurazioni 15 , 16 , questo metodo offre un metodo più diretto, semplice e convenienteTecnica per determinare la lipolisi nei tessuti adiposi.
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Protocol
Tutti i protocolli seguono le linee guida per l'animale dell'Università del Wyoming.
1. Alloggiamento e alimentazione alimentare
NOTA: I topi selvatici maschi adulti (C57BL / 6) (età da 12 a 24 settimane) sono stati allevati nella struttura degli animali di ricerca secondo i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali (IACUC).
- A partire dalla settimana 6 di età, i topi casa in gruppi di quattro in gabbie separate e assegnarli in modo casuale in gruppi di alimentazione di NCD o HFD (± 0,01% CAP) fino alla 38a settimana di età.
NOTA: CAP è un agonista della proteina del canale TRPV1 espresso nei tessuti adiposi 11 , 17 . Mescolare CAP con HFD in un frullatore all'interno della cappa e trasferire la miscela miscelata su un vassoio contenente piccole partizioni da 1 a 2 . Tenere il vassoio all'interno di un congelatore -20 ° C. Rimuovere il vassoio contenente la dieta HFD + CAP dal congelatore dopo 24 ore e conservare in un contenitore a -20 &# 176; C congelatore fino all'uso. - I topi domestici in un ambiente controllato dal clima (22,8 ± 2,0 ° C, umidità del 45-50%) con ciclo 12/12-luce / scuro con accesso alla dieta e all'acqua ad libitum .
- Alla fine di 38 settimane, si disseccano tessuti adiposi inguinali e si usano per esperimenti di lipolisi (sezioni 2-7).
2. Preparare i topi per gli esperimenti
- Anestetizzare i topi iniettando la miscela ketamina e xilazina (rispettivamente 10 mg / kg e 80 mg / kg di peso corporeo). Iniettare 0,01 ml della miscela / 10 g di peso corporeo del mouse.
- Confermare l'anestesia profonda da un pizzico di punta duro. Se c'è un riflesso a pedale, prova nuovamente il mouse dopo almeno 30 s.
- Utilizzare unguento veterinario per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia. Non lasciare i topi non controllati durante nessuna delle procedure.
- Eutanizzare i topi iniettando una dose elevata di iniezione di miscela di ketamina e xilazina (rispettivamente 10 mg / kg e 80 mg / kg di peso corporeo)E (0,01 ml / 10 g di peso corporeo) seguito da dislocazione cervicale.
NOTA: Questo metodo di eutanasia è approvato dall'IACUC dell'Università del Wyoming.
3. Isolamento dei rilievi grassi adiposi inguinali
- Posizionare il mouse (alimentato con NCD o HFD (± CAP) per 32 settimane) che si trova sulla sua sinistra per la procedura.
NOTA: posizionando il mouse sul lato sinistro, la parte anteriore sinistra e l'indietro posteriore sinistra saranno sulla piattaforma di dissezione, mentre il destro e il dorso posteriore destro si affaccieranno dalla piattaforma. - Sterilizzare la superficie della pelle con un 2 pollici pad 2 garza imbevuta in circa 2,5 ml di etanolo al 70%. Fare un taglio laterale da 2 a 3 mm attraverso la pelle usando un bisturi per rivelare lo strato grasso sottostante.
- Fai un taglio di 1 cm (a seconda della dimensione del mouse) attraverso la pelle usando un bisturi appena sotto la gabbia della cavità attraverso la superficie dorsale che unisce le due incisioni laterali.
- Sbucciate il fodero della pelle trascinandolo con attenzioneUtilizzando pinze sterili e lasciare intatte il tampone sottocutaneo non tagliando i pastiglie grassi. Questo è il tampone di grasso che si trova sotto la pelle.
- Disseccare attentamente il tampone di grasso dal muscolo sottostante e dalla fascia usando un paio di forbici. Tirare il tampone di grasso come è tagliato dal muscolo sottostante.
NOTA: Il peso e la dimensione dei pastiglie grassi dipendono dal tipo di topi (NCD o HFD (± CAP)). - Usate le pinzette per trasferirlo a un piatto di Petri contenente fosfato tamponato salina (PBS) fino all'esperienza di lipolisi, a temperatura ambiente (~ 15 min).
- Isolare i pattini di grasso dal lato destro del mouse come descritto nei passaggi 3.2-3.6.
4. Liberazione di glicerolo basale dai rilievi di grasso inguinale
- Usare forbici affilate per tagliare circa 20 mg di tessuto grasso in 5 a 8 pezzi.
- Incubare i pezzi tagliati di pastiglie grasso inguinale in 200 μl di mezzo di incubazione (DMM) di Dulbecco's Modified Eagel Medium (DMEM) contenente 2% di acido grassoAlbumina bovina serba libera (BSA)) a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità per 60 min.
- Raccogliere il mezzo di incubazione e congelare a -80 ° C per il dosaggio della lipolisi.
NOTA: i pezzi tagliati vengono utilizzati per la determinazione della concentrazione proteica dopo l'estrazione lipidica. - Trasferire i pezzi di grasso tagliato con l'aiuto di pinzette in 1 ml di soluzione di estrazione (cloroformio: metanolo (2: 1, v / v) e acido acetico glaciale 1%) e incubare per 60 minuti a 37 ° C sotto vigorosa agitazione a 100 rpm. Scartare la soluzione di estrazione del grasso.
NOTA: questa fase estrae grassi dai pezzi tagliati. Scartare la soluzione di estrazione del grasso in quanto interferirà con la determinazione della proteina. - Trasferire il tessuto (dal punto 4.2.2) utilizzando le pinzette in un tubo microfugo sterile contenente 500 μL di soluzione di lisi (0,3 N NaOH contenente 0,1% di sodio dodecil solfato SDS) e incubare per una notte (12 h) a 55 ° C sotto vigorosa scossa A 100 giri / min.
- Raccogliere il mezzo di incubazione e congelare a -80 ° C per il dosaggio della lipolisi.
- Determinare la concentrazione proteica del tessuto (punto 4.2.3) utilizzando il reagente acido bicinconico (BCA) e BSA come standard 18 .
- Scongelare il mezzo congelato (punto 4.2.1) sul ghiaccio e determinare il contenuto di glicerolo del mezzo utilizzando un reagente libero di glicole come descritto nelle sezioni del protocollo 6 e 7 6 .
- Estrapolare la concentrazione di glicerolo in campioni dalla curva standard tracciata utilizzando standard di glicerolo 19 e lipolisi espressa come nanomoli glicerolo per mg proteina per h 20 .
5. Lipolisi stimolata da FSK
- Preincubare circa 20 mg di rilievo grasso inguinale (da 5 a 8 pezzi tagliati) ottenuto da un topo selvatico tipo NCD o HFD (± CAP) in 200 μL DMEM contenente 2% BSA libero di grasso, 10 μM FSK e 5 μM Triacsin C 37 ° C in 5% CO 2 e 95% di umidità per 60 min.
- Trasferire i pezzi di tessuto utilizzando le pinzette ad un medesimo medesimo e incubare per altri 60 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità. Raccogliere il mezzo di incubazione e conservare a -80 ° C fino al dosaggio della lipolisi.
NOTA: La stimolazione della lipolisi provoca un rapido rilascio di acidi grassi e glicerolo entro 15 minuti, che è lineare durante la prima ora, e successivamente gli altipiani. Poiché il tasso di lipolisi stimolato è maggiore e stabile tra la prima e la seconda ora della stimolazione FSK, questo protocollo ha misurato la lipolisi nello stato stimolato successivo al secondo periodo di incubazione come descritto in precedenza 1 . Così, entrambi i passaggi sperimentali (5.1 e 5.1.1) sono necessari.
6. Preparazione del Reagente Glicerolo Libero
- Ricostituire il reagente del glicerolo 19 in 40 ml di acqua deionizzata in una fiala di vetro color ambra, mettere un tappo sulla fiala e mescolare bene invertendo 10 volte. Non mescolare agitando.
- Conservare il flaconcino a 4 ° C all'interno di un frigorifero protetto dalla luce coprendo completamente la fiala con la lamina di alluminio.
- Procedere alla preparazione del glicerolo standard (sezione 7).
7. Preparazione del Glicerolo Standard e Determinazione del Contenuto di Glicerolo
- Fare uno stoccaggio di 1 mM diluendo 35 μL del materiale fornito con 65 μL di acqua deionizzata.
NOTA: Il produttore fornito di grezzo standard è 2,8 mM di glicerolo. - Prendere cinque lunghezze di 1 cm di lunghezza monouso delle cuvette metacrilato. Etichettare le cuvette utilizzando un marcatore come standard 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 nmol.
- Aggiungere 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 μL di 1 mM glicerolo standard alle rispettive cuvette etichettate. Compilare il volume di ogni cuvetta a 10 μL con acqua deionizzata.
- Fai da 1 a 10 diluizione di tutti i campioni (dal punto 4.4 o 5.1.1) aggiungendo 10 μL del campione a 90 μL di acqua deionizzata in nuovi tubi di centrifuga prelevati da 500 μl. Aggiungere 10 μL di campioni diluiti nelle cuvette contrassegnate con il rispettivo numero di identificazione del campione.
- Accendere lo spettrofotometro UV-VIS e impostare l'ondaLunghezza a 540 nm.
- Riscaldare il reagente libero di glicerolo a temperatura ambiente mantenendo la fiala (fase 6.2) a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Impostare una serie di cuvettes etichettate come standard blank "0" nmol (passo 7.3), standard (passo 7.3) e campioni (passo 7.4).
- Aggiungere 10 μL di ciascuno degli standard e del campione nella rispettiva cuvetta etichettata. Usare "0" standard nmol come vuoto.
- Aggiungere 0,8 ml di reagente glicerolo libero in ogni cuvetta, contenente gli standard di glicerolo usando una pipetta da 1 ml.
- Coprire la cuvetta con una pellicola di paraffina di plastica quadrata da 1,5 cm e mescolare il contenuto invertendo la cuvetta per 3 volte e mettere da parte a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro UV-VIS e registrare l'assorbanza (lunghezza d'onda 540 nm).
- Tracciare la curva standard utilizzando le concentrazioni degli standard (nmol) nell'asse X e l'assorbanza registrata nell'asse Y.
- Calcolare la concentrazione di glYcerol nei campioni (nmol) mediante estrapolazione utilizzando la curva standard tracciata nel passaggio 7.12.
- Moltiplicare la concentrazione di campioni (nmol / cuvetta) con il fattore di diluizione 10 (vedere la fase 7.4) e 20 (volume totale)
- Dividere la concentrazione di glicerolo in ogni campione (passo 7.13) con la mg di proteina calcolata dal metodo BCA.
NOTA: dal momento che i campioni di grasso inguinale sono incubati per 60 min, rappresentano i risultati come nmol di glicerolo / mg proteine / h.
- Fare uno stoccaggio di 1 mM diluendo 35 μL del materiale fornito con 65 μL di acqua deionizzata.
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Representative Results
Per valutare l'effetto della CAP sulla lipolisi basale e stimolata, questa ricerca ha misurato la lipolisi nei pad grassi adiposi inguinali isolati da topi selvatici NCD o HFD (± CAP). I risultati rappresentativi per la lipolisi basale e FSK stimolata per i pastori grassi inguinali sono riportati nella Tabella I. Basal e FSK-rilascio glicerolo in presenza di Triacsin C, che inibisce la sintetasi acil coA e impedisce la rigenerazione di TGL. Come mostrato nella figura 1 , HFD ha soppresso la lipolisi stimolata da FSK, e la CAP ha aumentato sia la lipolisi basale che FSK stimolata. Triacsin C è stato utilizzato per inibire la rigenerazione di TGL da glicerolo e acidi grassi 11 . Tutti i dati sono espressi come medie ± SEM confronti tra i gruppi vengono analizzati utilizzando ANOVA e post hoc analisi sono state effettuate utilizzando il test t di Student. Sono state impostate le dimensioni dei campioni Per determinare se il valore medio di una variabile di risultato in un gruppo differiva significativamente da quello in un altro gruppo. Un valore p <0,05 è considerato statisticamente significativo.
Figura 1: La CAP aumenta il rilascio di glicerolo stimolato da Basal e FSK nei rilievi grassi inguinali. I grafici a barre rappresentano la media ± SEM di basale e FSK (10 μM) -stimulato rilascio di glicole (nmol / mg proteina / h) nei placchetti grassi inguinali isolati da topi selvatici NCD o HFD (± CAP). ** Rappresenta significatività statistica per p-value <0.05 per n = 6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: Idrolisi dei trigliceridi (TGL) nella generazione di acidi grassi liberi (FFA) e glicerolo. FFA subisce l'ossidazione beta-mitocondriale. Questo, insieme con l'upregulation della proteina di disaccoppiamento 1 (UCP-1) stimola la termogenesi. La liberazione di glicerolo viene misurata con il protocollo descritto nell'articolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| lipolisi (Nmol glicerolo / mg di proteine / h) | NCD (N = 6) | HFD (N = 6) | HFD + CAP (N = 6) |
| Basale | 16,22 ± 1,28 | 17,16 ± 1,48 | 52,07 ± 2,66 |
| FSK stimolato (Con Triacsin C) | 54,88 ± 3,27 | 41,23 ± 4,43 | 72,04 ± 4,16 |
Tabella 1: Effetto della PAC sulla lipolisi stimolata basale e FSK nei fusti grassi inguinali. Il rilascio glicerolo stimolato basale e FSK stimato ± SEM misurato in tessuto adiposo grasso inguinale ottenuto da topi selvatici NCD, HFD o HFD + CAP.
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Discussion
Il processo di rottura di TGL in glicerolo e acidi grassi è catalizzato da ATGL 9 durante la lipolisi basale e orchestrato da una serie di proteine, tra cui l'attivazione del percorso adenilil ciclasi / PKA dipendente durante la lipolisi stimolata 21 , 22 , 23 . L'aumento della lipolisi aumenta i livelli plasmatici degli acidi grassi per il trasporto e l'utilizzo di energia 24 . Gli acidi grassi vengono assorbiti dai mitocondri come acetil CoA, che viene utilizzato per produrre energia.
Il grado e l'estensione della lipolisi possono essere misurati in modo efficace dal rilascio di glicerolo dai tessuti adiposi ( Tabella 1 e Figura 1 ). L'idrolisi di TGL produce acidi grassi e glicerolo. Precedenti ricerche hanno dimostrato che la supplementazione dietetica della PAC ha migliorato notevolmente le basse e le fonti di glicerolo stimolate da FSKE da pastiglie grasso inguinale e marrone 11 , 17 . L'aumento della produzione di acidi grassi dalla lipolisi aumentata potrebbe servire come mangime per produrre calore e termogenesi poiché la CAP ha anche aumentato significativamente l'espressione di UCP-1 mitocondriale nei pastelli grassi inguinali. Coerentemente a questa nozione, la ricerca precedente suggerisce che PAC migliorato l'espressione di proliferazione dei perossisomi recettore attivato alfa (PPAR) in cuscinetti adiposi inguinale, che svolge un ruolo critico nella ossidazione degli acidi grassi mitocondriale e nella sovraregolazione trascrizionale di UCP-1 25, 26 , 27 . Di conseguenza, la CAP ha anche aumentato l'attività metabolica, la produzione di calore e le spese energetiche in topi alimentati da HFD 28 , 29 . Inoltre, l'alimentazione di HFD ha soppresso la lipolisi stimolata mentre la CAP è aumentata a base e FSK stimolata da PKA-dipendentiT lipolisi e una maggiore sensibilità all'insulina 30 . Pertanto, come descritto dal modello di Figura 2 , è ragionevole interpretare che la CAP aumenta la lipolisi basale e stimolata senza causare la resistenza all'insulina in quanto il grasso in eccesso viene bruciato per produrre calore mediante upregulation mitocondriale UCP-1.
Questo articolo descrive il metodo di misurazione del rilascio di glicerolo dai tessuti adiposi bianchi. Sebbene siano disponibili diversi metodi usando isotopi stabili di glicerolo, richiedono cromatografia liquida ad alta prestazione o gas cromatografia / spettrometria di massa per le misurazioni 15 , 16 . Inoltre, le misurazioni del radiometro di glicerolo sono associate a non specificità 31 . Metodi alternativi includono la determinazione dei livelli di mRNA e proteine delle lipasi e delle proteine regolatori coinvolte nella lipolisi. Metodi colorimetrici sono disponibili anche per dDeterminare la concentrazione di acidi grassi a catena lunga in circolazione. Il metodo descritto qui è molto efficace nell'analizzare il rilascio di glicerolo dai tessuti adiposi in quanto può essere fatto utilizzando un lettore di piastre in grado di misurare la fluorescenza e l'assorbanza. Inoltre, il metodo analitico semplificato per il rilascio di glicerolo descritto in questo articolo fornisce una migliore stabilità e precisione 32 .
Le procedure operative standard devono essere praticate in quanto questo metodo prevede tecniche chirurgiche per isolare i pastiglie grasse. Questo protocollo consiglia l'uso di grassi liberi BSA. Ciò può causare formazione di bolle d'aria che interferiscono con la lettura dell'assorbanza. Pertanto, occorre prestare attenzione durante la manipolazione dei campioni per evitare le bolle d'aria. Occorre fare precauzione per non scuotere o invertire i campioni durante il trattamento BSA, a meno che non si consiglia un tale passaggio nel protocollo. Inoltre, la fase di estrazione del grasso da grasso inguinale è fondamentale in quanto la presenza di grasso interferisce witH determinazione della proteina tissutale adiposa inguinale. Inoltre, durante la preparazione di standard di glicerolo, è importante miscelare il contenuto per inversione e non scuotere il flaconcino.
Il metodo descritto qui può essere utilizzato per isolare con successo i rilievi grassi inguinali per varie prove, incluse le misurazioni della lipolisi. Il protocollo di lipolisi descritto per i pasticci grassi inguinali può essere facilmente esteso alla misura della lipolisi in altri tessuti. I metodi sono ottimizzati per tutti i tipi di pastiglie grasso, nonché preadipociti.
In sintesi, in questo articolo viene descritto il metodo per la misurazione di basale e FSK-stimolato rilascio di glicole nei pad grassi inguinali di grasso adiposo isolati da topi NCD o HFD (± CAP). I dati presentati suggeriscono che l'attivazione di TRPV1 per CAP aumenta la lipolisi basale e FSK stimolata e impedisce l'accumulo di lipidi nei tessuti adiposi. Questi dati dimostrano un ruolo fondamentale della proteina TRPV1 nella regolazioneN della lipolisi nel tessuto adiposo bianco.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal premio AHA No. 15BGIA23250030, l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali della NIH sotto il numero di premio 8P20 GM103432-12 e dall'Università del Wyoming Facoltà Grant in Aid to BT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
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