Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling av basal og forskolinstimulert lipolyse i fettputer

Published: July 21, 2017 doi: 10.3791/55625
Automatic Translation
1, 1
1School of Pharmacy, University of Wyoming

Summary

Denne protokollen beskriver metoden for å bestemme basal og forskolinstimulert lipolyse i inguinal fettputer oppnådd fra normal chow diett (NCD) eller høyt fett diett (HFD) ± capsaicin matet villtype mus. Som en indeks for lipolyse ble glyserolfrigivelsen målt fra inguinal adipose fettputer.

Abstract

Lipolyse er en prosess hvorved lipidet lagret som triglyserider i fettvev hydrolyseres til glycerol og fettsyrer. Denne artikkelen beskriver metoden for måling av basal og forskolin (FSK) -stimulert lipolyse i inguinal fettputer isolert fra villtype mus som er matet enten normal chow diett (NCD), høyt fett diett (HFD) eller en høy fett diett som inneholder 0,01 % Av capsaicin (CAP; transient reseptor potensiell vanilloid subfamily 1 (TRPV1) agonist) i 32 uker. Fremgangsmåten beskrevet her for å utføre ex vivo lipolyse er vedtatt fra Schweiger et al. 1 Vi presenterer en detaljert protokoll for måling av glycerol nivåer ved UV-synlig (UV / VIS) spektrofotometri. Metoden beskrevet her kan brukes til å isolere fettpudder for lipolyse for å oppnå konsistente resultater. Protokollen beskrevet for inguinal fettputer kan lett bli utvidet til å måle lipolyse i andre vev.

Introduction

Fettvev lagrer energi som fett 2 og fettsyreoksydasjon er nødvendig for termogenese 3 , 4 . Fettsyrer inntatt gjennom dietter pakkes sammen med apoproteiner i chylomikroner og leveres til forskjellige vev i kroppen via blodsirkulasjon. Selv om de fleste celler i kroppen lagrer et reserve av energi, beholder fettvev overflødig energi som fett 5 , 6 . Lipolyse i fettvev reguleres av komplekse prosesser, og molekylære detaljer av lipolyse forblir fortsatt vage 7 .

Lipolyse er en prosess hvor triglyserider (TGL) lagret i fettvev hydrolyseres for å produsere glyserol og fettsyrer (FA) av enzymet adipose triglycerid lipase (ATGL) 8 . Endringer i basal og stimulert lipolyse er et karakteristisk trekk ved fedme. BAsal lipolyse er regulert av ATGL-aktivering 9 , som omdanner TGL til diacylglycerol (DAG), som deretter hydrolyseres til monoacylglycerol (MAG). Aktivering av hormonfølsom lipase (HSL) via adenylylcyklase aktiverer stimulering av cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) avhengig av proteinkinase A (PKA) og forårsaker lipolyse. Måling av lipolyse, basal og stimulert, er derfor viktig for å analysere aktiviteten til proteiner involvert i denne prosessen. Også unraveling molekylær regulering av lipolyse kan være gunstig for å utvikle nye terapeutiske strategier mot fedme 10 . Siden molekyler som stimulerer lipolyse og fettsyreoksidasjon er potensielle kandidater for å redusere fett lagret i depoter, er det viktig å anvende et robust assay for reproduserbarhet.

Tidligere publiserte data antyder at aktivering av TRPV1 protein uttrykt i hvitt fettvev ved CAP forbedret basalOg FSK (adenylyl-syklaseaktivator) -stimulert lipolyse i inngangsfettputer 11 . Tidligere forskning tyder også på at langsiktig aktivering av TRPV1 ved CAP aktiverer PKA 12 . Siden aktiveringen av PKA stimulerer lipolyse 13 , 14 , som måler både basal og PKA-avhengig stimulert lipolyse i inguinal fettputer isolert fra NCD eller HFD (± CAP) -fedmus etter 32 ukers føding av de respektive dietter, vil valideringen av rollen som TRPV1 Aktivering i lipolyse.

Denne artikkelen beskriver en effektiv metode for å bestemme basal og stimulert lipolyse. Selv om andre metoder som benytter radioaktive isotoper av glycerol og kjedelig høyytelsesvæskekromatografi eller gasskromatografi / massespektrometri for målinger 15 , 16 er tilgjengelige, gir denne metoden en mer direkte, enkel og kostnadseffektivTeknikk for å bestemme lipolyse i fettvev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller følger retningslinjene for dyrepleie av University of Wyoming.

1. Husdyr og fôring

MERK: Voksne mannlige villtype mus (C57BL / 6) (alder 12 til 24 uker) ble oppdrettet i forskningsdyrfasiliteten i henhold til godkjente protokoller for Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC).

  1. Fra og med uke 6 går husmus i grupper på fire i separate bur og tildeler dem tilfeldig til fôringsgrupper av NCD eller HFD (± 0,01% CAP) til uke 38 i alderen.
    MERK: CAP er en agonist av TRPV1 kanalprotein uttrykt i fettvev 11 , 17 . Bland CAP med HFD i en blender i hetten og overfør den blandede blandingen til en skuff som inneholder små 1 i 2 partisjoner. Hold skuffen inne i en -20 ° C fryser. Fjern skuffen som inneholder HFD + CAP-dietten fra fryseren etter 24 timer og oppbevar den i en beholder ved -20 &# 176; C fryser til bruk.
  2. Husmus i et klimastyrt miljø (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% fuktighet) med en 12/12-lys / mørk syklus med tilgang til utpekt diett og vann ad libitum .
  3. På slutten av 38 uker, disseker inguinal adipose vev og bruk for lipolyse eksperimenter (§ 2-7).

2. Forbereder mus for forsøkene

  1. Bedøv musene ved å injisere ketamin og xylazinblanding (henholdsvis 10 mg / kg og 80 mg / kg kroppsvekt). Injiser 0,01 ml av blandingen / 10 g kroppsvekt av mus.
  2. Bekreft dyp anestesi med en fast tåsklemme. Hvis det er en pedalreflex, test musen igjen etter minst 30 s.
  3. Bruk veterinær øyesalve for å forhindre tørrhet i øynene under anestesi. Ikke la musene være uten tilsyn under noen av prosedyrene.
  4. Euthaniser mus ved å injisere en høy dose ketamin og xylazinblanding injeksjon (henholdsvis 10 mg / kg og 80 mg / kg kroppsvekt) mixturE (0,01 ml / 10 g kroppsvekt) etterfulgt av cervikal dislokasjon.
    MERK: Denne metoden for eutanasi er godkjent av IACUC ved University of Wyoming.

3. Isolering av fettputer i fettstoffer

  1. Plasser musen (matet med NCD eller HFD (± CAP) i 32 uker) ligger på venstre side for prosedyren.
    MERK: Ved å plassere musen på venstre side, vil venstre forben og venstre hindlimb være på disseksjonsplattformen, mens høyre forben og høyre bakre glidelås vender vekk fra plattformen.
  2. Steriliser hudoverflaten med en 2 tommers 2 gazepute fuktet i ca. 2,5 ml 70% etanol. Lag en 2 - 3 mm sideskjær gjennom huden ved hjelp av en skalpell for å avsløre det underliggende fettlaget.
  3. Lag en 1 cm kutt (avhengig av størrelsen på musen) gjennom huden ved hjelp av en skalpell like under ribbeholderen over dorsaloverflaten som kommer til de to sideskråtene.
  4. Skal huden klaffen ved å dra den forsiktigBruk sterile pincet og la subkutan pute intakt ved ikke å kutte fettputer. Dette er fettputen som ligger under huden.
  5. Disseksér fettputen forsiktig fra underliggende muskler og fascia ved hjelp av et saksaks. Trekk fettputen som den er kuttet fra den underliggende muskelen.
    MERK: Vekt og størrelse på fettpadsene avhenger av hvilken type mus (NCD eller HFD (± CAP) -fed).
  6. Bruk pincett til å overføre den til en petriskål som inneholder fosfatbuffert saltvann (PBS) til lipolyseforsøkene ved romtemperatur (~ 15 min).
  7. Isoler fettputer fra høyre side av musen som beskrevet i trinn 3.2-3.6.

4. Basalglycerolfrigivelse fra inufinale fettputer

  1. Bruk skarpe saks til å kutte ca 20 mg fettvev i 5 til 8 stykker.
  2. Inkuber kuttstykkene av inguinal fettputer i 200 ul inkubasjonsmedium (Dulbecco's Modified Eagel's Medium (DMEM) som inneholder 2% fettsyrebovint serumalbumin (BSA)) ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet i 60 min.
    1. Samle inkubasjonsmediet og frys ved -80 ° C for lipolysestest.
      MERK: Kuttbitene brukes til å bestemme proteinkonsentrasjonen etter lipidekstraksjon.
    2. Overfør kuttfettstykkene ved hjelp av pincett i 1 ml ekstraksjonsløsning (kloroform: metanol (2: 1, volum / volum) og 1% iseddik) og inkuber i 60 minutter ved 37 ° C under kraftig risting ved 100 rpm. Kast fettutvinningsoppløsningen.
      MERK: Dette trinnet vil trekke ut fett fra kuttstykkene. Kast fettekstraksjonsløsningen da det vil forstyrre proteinbestemmelsen.
    3. Overfør vevet (fra trinn 4.2.2) ved å bruke pinsett inn i et sterilt mikrofugerør som inneholder 500 μl lysisoppløsning (0,3 N NaOH inneholdende 0,1% natriumdodecylsulfat, SDS) og inkuber natten over (12 timer) ved 55 ° C under kraftig risting Ved 100 rpm.
  3. Bestem proteinkonsentrasjonen av vev (trinn 4.2.3) ved bruk av bicinchoninsyre (BCA) reagens og BSA som standard 18 .
  4. Tine det frosne mediumet (trinn 4.2.1) på is og bestemme glyserolinnholdet i mediet ved å bruke et fritt glycerolreagens som beskrevet i protokoll seksjonene 6 og 7 6 .
    1. Ekstrapolere konsentrasjonen av glyserol i prøver fra standardkurven plottet ved bruk av glycerolstandarder 19 og uttrykk lipolyse som nanomolglycerol pr. Mg protein pr. H 20 .

5. FSK-stimulert lipolyse

  1. Preincubate ca 20 mg inguinal fettpute (5 til 8 kutte stykker) oppnådd fra NCD eller HFD (± CAP) -fed vilt type mus i 200 μL DMEM inneholdende 2% fettsyrefri BSA, 10 μM FSK og 5 μM Triacsin C ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% fuktighet i 60 min.
  2. Overfør vevsstykkene med pinsett til et identisk medium og inkuberes i ytterligere 60 minutter ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet. Samle inkubasjonsmediet og lagre ved -80 ° C til lipolyse-analysen.
    MERK: Stimulering av lipolyse forårsaker rask frigjøring av fettsyrer og glyserol innen 15 minutter, som er lineær i løpet av den første timen, og platåer deretter. Siden frekvensen av stimulert lipolyse er høyere og stabil mellom den første og andre time med FSK-stimulering, målt denne protokollen lipolyse i den stimulerte tilstand etter den andre inkubasjonsperioden som beskrevet tidligere 1 . Så, både de eksperimentelle trinnene (5.1 og 5.1.1) er nødvendige.
  • For å trekke ut fett fra inguinal fettputer, overfør kuttstykkene av inguinal fettputer (hentet fra NCD eller HFD (± CAP) -fedmus) fra trinn 5.1 ved hjelp av pinsett i 1 ml ekstraksjonsoppløsning (kloroform: metanol (2 : 1. v /V) og 1% iseddik) og inkuber i 60 minutter ved 37 ° C under kraftig risting ved 100 rpm. Kast utvunnet fett.
  • Overfør vevet (fra trinn 5.2) ved å bruke pinsett inn i et sterilt mikrofugerør som inneholder 500 μl lysisoppløsning (0,3 N NaOH inneholdende 0,1% SDS) og inkuber natten over (12 timer) ved 55 ° C under kraftig risting ved 100 rpm.
  • Bestem proteinkonsentrasjonen og glyserolinnholdet i vev som beskrevet i henholdsvis trinn 4.3 og 4.4.

    • 6. Fremstilling av fri glycerolreagens

    1. Rekonstituer glyserolreagenset 19 i 40 ml deionisert vann i et gulfarget glassflaske, sett en stopper på hetteglasset og bland godt ved å vende 10 ganger. Ikke bland ved å riste.
    2. Oppbevar hetteglasset ved 4 ° C inne i et kjøleskap beskyttet mot lys ved å dekke hetteglasset helt med aluminiumsfolie.
    3. Fortsett til fremstilling av glyserolstandard (kapittel 7).

      7. Fremstilling av glycerolstandard og bestemmelse av innhold av glycerol

      1. Lag en beholdning på 1 mM ved å fortynne 35 μl av den tilførte lager med 65 μl avionisert vann.
        MERK: Produsenten levert glycerol standard lager er 2,8 mM glycerol.
      2. Ta fem 1 cm lange lengde engangsmetakrylatkuvetter. Merk kuvetter med en markør som 0, 1,25, 2,5, 5 og 10 nmol standard.
      3. Tilsett 0, 1,25, 2,5, 5 og 10 μl 1 mM glycerolstandard til de respektive merkede kuvetter. Fyll opp volumet av hver kuvette til 10 μL med avionisert vann.
      4. Lag 1 til 10 fortynning av alle prøvene (fra trinn 4.4 eller 5.1.1) ved å tilsette 10 μL av prøven til 90 μl avionisert vann i friske 500 μl prelablette sentrifugerør. Tilsett 10 μl av de fortynnede prøvene i kuvetter merket med respektive prøveidentifikasjonsnummer.
      5. Slå på UV-VIS-spektrofotometeret og sett bølgenLengde til 540 nm.
      6. Varm det frie glyserolreagenset til romtemperatur ved å holde hetteglasset (trinn 6.2) ved romtemperatur i 15 minutter.
      7. Sett opp en serie merkede kuvetter som blank "0" nmol standard (trinn 7.3), standarder (trinn 7.3) og prøver (trinn 7.4).
      8. Tilsett 10 μl av hver standard og prøve i den respektive merkede kuvetten. Bruk "0" nmol standard som tom.
      9. Tilsett 0,8 ml fri glyserolreagens i hver kuvette, som inneholder glycerolstandardene ved å bruke en 1 ml pipette.
      10. Dekk kyvetten med en 1,5 cm kvadratisk plastparafinfilm, og bland innholdet ved å vri kuvetten i 3 ganger og sett til side ved romtemperatur i 10 minutter.
      11. Plasser kyvetten i UV-VIS-spektrofotometeret og registrer absorbansen (540 nm bølgelengde).
      12. Plot standardkurven ved hjelp av konsentrasjonene av standardene (nmol) i X-aksen og den registrerte absorbansen i Y-aksen.
      13. Beregn konsentrasjonen av glYcerol i prøvene (nmol) ved ekstrapolering ved bruk av standardkurven planlagt i trinn 7.12.
      14. Multipliser konsentrasjonen av prøver (nmol / kuvett) med fortynningsfaktoren 10 (se trinn 7.4) og 20 (totalt volum)
      15. Del konsentrasjonen av glyserol i hver prøve (trinn 7.13) med mg protein beregnet ved BCA-metoden.
        MERK: Siden de inguinale fettpotteprøver inkuberes i 60 minutter, representerer resultatene som nmol glyserol / mg protein / time.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    For å evaluere effekten av CAP på basal og stimulert lipolyse, ble denne undersøkelsen målt lipolyse i inngangsvektfettputer isolert fra NCD eller HFD (± CAP) -fed-vildtype-mus. De representative resultatene for den basale og FSK-stimulerte lipolyse for inguinal fettputer er gitt i tabell I. Basal- og FSK-stimulert glyserolfrigivelse i nærvær av Triacsin C, som hemmer acylcoA-syntetase og forhindrer regenerering av TGL. Som vist i figur 1 undertrykte HFD den FSK-stimulerte lipolysen, og CAP økte både basal og FSK-stimulert lipolyse. Triacsin C ble brukt til å hemme regenerering av TGL fra glyserol og fettsyrer 11 . Alle data er uttrykt som middel ± SEM Sammenligninger mellom grupper analyseres ved hjelp av enveis ANOVA og post-hoc analyser ble utført ved hjelp av Student's t- test. Eksempelstørrelser er satt For å avgjøre om gjennomsnittverdien av en utfallsvariabel i en gruppe var vesentlig forskjellig fra den i en annen gruppe. En p-verdi <0,05 anses som statistisk signifikant.

    Figur 1
    Figur 1: CAP øker basal og FSK-stimulert glycerolfrigivelse i fettputer. Bardiagrammer representerer gjennomsnittlig ± SEM for basal og FSK (10 μM) -stimulert glyserolutgivelse (nmol / mg protein / time) i de inngående fettputer isolert fra NCD eller HFD (± CAP) -fed-vildtype-mus. ** Representerer statistisk signifikans for p-verdi <0.05 for n = 6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    5 / 55625fig2.jpg "/>
    Figur 2: Hydrolyse av triglyserider (TGL) resultater i genereringen av frie fettsyrer (FFA) og glycerol. FFA gjennomgår mitokondriell p-oksydasjon. Dette, sammen med oppreguleringen av uncoupling protein 1 (UCP-1) stimulerer termogenese. Glycerolfrigivelse måles ved hjelp av protokollen beskrevet i artikkelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

    lipolyse
    (Nmoles glycerol / mg protein / h)         		NCD
    (N = 6)         		HFD
    (N = 6)         		HFD + CAP
    (N = 6)
    basal 16,22 ± 1,28 17,16 ± 1,48 52,07 ± 2,66
    FSK stimulert
    (Med Triacsin C)     		54,88 ± 3,27 41,23 ± 4,43 72,04 ± 4,16

    Tabell 1: Virkning av CAP på basal og FSK stimulert lipolyse i fettpads. Gjennomsnittlig basal og FSK-stimulert glyserolutgivelse ± SEM målt i fettvev i inguinal fett oppnådd fra NCD-, HFD- eller HFD + CAP-matede villtype mus.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fordelingen av TGL i glycerol og fettsyrer katalyseres av ATGL 9 under basal lipolyse og orkestrert av en rekke proteiner, inkludert aktivering av adenylylcyklase / PKA-avhengig vei under stimulert lipolyse 21 , 22 , 23 . Forbedring av lipolyse øker plasmanivåene av fettsyrer for transport og energibruk 24 . Fettsyrer tas opp av mitokondrier som acetyl CoA, som brukes til å produsere energi.

    Graden og omfanget av lipolyse kan effektivt måles ved glyserolfrigivelse fra fettvev ( Tabell 1 og Figur 1 ). Hydrolys av TGL produserer fettsyrer og glyserol. Tidligere undersøkelser viste at kosttilskudd av CAP betydelig forbedret både basale og FSK-stimulerte glyserolutslippE fra inguinal og brune fettputer 11 , 17 . Den økte produksjonen av fettsyrer fra forbedret lipolyse kan tjene som fôr for å produsere varme og termogenese siden CAP også økt signifikant ekspresjonen av mitokondriell UCP-1 i inguinalfettpadsene. I overensstemmelse med denne oppfatningen antyder tidligere forskning at CAP forbedret uttrykket av peroksisomproliferatoraktivert reseptor alfa (PPARα) i inguinal fettputer, som spiller en kritisk rolle i mitokondriell fettsyreoksydasjon og ved transkripsjonell oppregulering av UCP-1 25 , 26 , 27 . Følgelig økte CAP også metabolisk aktivitet, varmeproduksjon og energiforbruk i HFD-matede mus 28 , 29 . Videre undertrykte HFD-fôring stimulert lipolyse mens CAP økte basal og FSK-stimulert PKA-avhengigT lipolyse samt økt insulinfølsomhet 30 . Derfor, som beskrevet ved modellen i figur 2 , er det rimelig å tolke at CAP øker basal og stimulert lipolyse uten å forårsake insulinresistens ettersom overskytende fett brennes for å produsere varme ved opphopning av mitokondriell UCP-1.

    Denne artikkelen beskriver metoden for å måle glyserolutslipp fra hvite fettvev. Selv om flere metoder som bruker stabile isotoper av glyserol er tilgjengelige, krever de enten høyytelsesvæskekromatografi eller gasskromatografi / massespektrometri for målingene 15 , 16 . Også, glycerol-radio-sporingsmålinger er forbundet med ikke-spesifisiteter 31 . Alternative metoder inkluderer bestemmelse av mRNA og proteinnivåer av lipaser og regulatoriske proteiner involvert i lipolyse. Colorimetriske metoder er også tilgjengelige for dEtermin konsentrasjonen av langkjedede fettsyrer i omløp. Metoden beskrevet her er svært effektiv ved å analysere glyserolfrigivelse fra fettvev som det kan gjøres ved bruk av en plateleser som er i stand til fluorescens og absorbansmåling. Den forenklede analysemetode for glyserolfrigivelse beskrevet i denne artikkelen gir også forbedret stabilitet og presisjon 32 .

    Standard operasjonsprosedyrer bør praktiseres da denne metoden innebærer kirurgiske teknikker for å isolere fettputer. Denne protokollen anbefaler bruk av fettfri BSA. Dette kan forårsake luftboblingsdannelse, noe som vil forstyrre absorbansavlesningen. Derfor bør det tas hensyn når du håndterer prøver for å hindre luftbobler. Forholdsregler bør tas for ikke å riste eller invertere prøver under BSA-behandling, med mindre et slikt trinn anbefales i protokollen. Dessuten er fettekstraksjonstrinnet fra inguinal fett kritisk siden nærværet av fett vil forstyrre blødningH bestemmelse av fettfettprotein. I tillegg, under fremstillingen av glycerolstandarder, er det viktig å blande innholdet ved inversjon og ikke riste hetteglasset.

    Fremgangsmåten beskrevet her kan brukes til å isolere fettpudder med høyt blodtrykk for flere analyser, inkludert lipolysemålinger. Lipolyseprotokollen beskrevet for inguinal fettputer kan lett bli utvidet til måling av lipolyse i andre vev. Metodene er optimalisert for alle typer fettputer, samt preadipocytter.

    I sammendrag beskriver denne artikkelen metoden for måling av basal og FSK-stimulert glyserolfrigivelse i inguinal adipose fat pads isolert fra NCD eller HFD (± CAP) -fed mus. De presenterte dataene antyder at TRPV1-aktivering ved CAP økte den basale og FSK-stimulerte lipolyse og forhindret akkumulering av lipider i fettvæv. Disse dataene viser en kritisk rolle for TRPV1 protein i regulatioN av lipolyse i hvitt fettvev.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingenting å avsløre.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av AHA-prisen nr. 15BGIA23250030, NIHs nasjonale institutt for generell medisinsk vitenskap, under prisnummer 8P20 GM103432-12 og fakultetstilskudd for Universitetet i Wyoming i hjelp til BT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Capsaicin Sigma, USA M2028 TRPV1 agonist
    Forskolin Sigma, USA F6886 Adenylyl cyclase activator
    DMEM GE healthcare and life sciences, UT, USA SH30081.01
    High fat diet Research diets, New Brunswick, USA D12492 Abbreviated as HFD
    Tris Amresco, USA O497
    Sodium chloride Thermofisher Scientific BP358-212
    Sodium deoxycholate Sigma, USA D6750
    Dithiothreitol Sigma, USA D9163
    Sodium orthovanadate Sigma, USA S6508
    Protease inhibitor cocktail Sigma, USA P8340
    Free Glycerol reagent Sigma USA F6428
    DMSO Sigma, USA D8779
    Triacsin C Sigma, USA T4540 Acyl CoA transferase inhibitor
    Bovine serum albumin Sigma, USA A7030
    Chloroform Sigma Aldrich 31998-8
    Methanol Thermofisher Scientific, USA A412-1
    Sodium hydroxide Amresco, USA O583
    Sodium dodecyl sulfate Sigma, USA L3371
    Bicinchoninic acid reagent Sigma, USA BCA1-1KT
    UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Biotech, NJ, USA Ultrospec 2000
    Normal chow diet Labdiet.com 500I abreviated as NCD
    C57BL/6 mice Jackson Laboratory, CT, USA Stock number000664 wild type mice
    Parafilm Heathrow Scientific, USA HS 234526A
    Glycerol standard Sigma, USA G7793

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
    2. Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
    3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
    4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
    5. Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
    6. Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
    7. Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
    8. Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
    9. Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
    10. Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
    11. Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
    12. Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
    13. Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
    14. Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
    15. Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
    16. Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
    17. Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
    18. Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
    19. Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
    20. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
    21. Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
    22. Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
    23. Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
    24. Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
    25. Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
    26. Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
    27. Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
    28. Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
    29. Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
    30. Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
    31. Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
    32. Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).

    Tags

    Biokjemi utgave 125 lipolyse hvitt fettvev inguinal adipose fettputer glyserolfrigivelse forskolin capsaicin TRPV1.
    Måling av basal og forskolinstimulert lipolyse i fettputer
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Baskaran, P., Thyagarajan, B.… More

    Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads. J. Vis. Exp. (125), e55625, doi:10.3791/55625 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter