Summary
Detta protokoll beskriver metoden för bestämning av basal och forskolinstimulerad lipolys i inguinal fettkuddar erhållna från normala chow diet (NCD) eller fettsyrat möss med hög fetthalt (HFD) ± capsaicin. Som ett index för lipolys mättes glycerolfrisättning från inguinal adiposa fettkuddar.
Abstract
Lipolys är en process genom vilken lipiden lagrad som triglycerider i fettvävnader hydrolyseras till glycerol och fettsyror. I denna artikel beskrivs metoden för mätning av basal och forskolin (FSK) -stimulerad lipolys i de inguinala fettkuddarna isolerade från vildtypsmus matade antingen normal chow diet (NCD), hög fetthalt (HFD) eller en hög fet diet innehållande 0,01 % Av capsaicin (CAP; transient receptorpotential vanilloid subfamily 1 (TRPV1) agonist) i 32 veckor. Metoden som beskrivs här för att utföra ex vivo lipolys antas från Schweiger et al. 1 Vi presenterar ett detaljerat protokoll för mätning av glycerolhalter genom UV-synlig (UV / VIS) spektrofotometri. Metoden som beskrivs här kan användas för att framgångsrikt isolera ingående fettkuddar för lipolysmätningar för att erhålla konsekventa resultat. Protokollet som beskrivs för inguinal fettkuddar kan lätt förlängas för att mäta lipolys i andra vävnader.
Introduction
Fettvävnader lagrar energi eftersom fett 2 och fettsyraoxidation krävs för termogenes 3 , 4 . Fettsyror som intagas genom dieter förpackas tillsammans med apoproteiner i chylomikroner och levereras till olika vävnader i kroppen via blodcirkulationen. Även om de flesta celler i kroppen lagrar en reserv av energi, lagrar fettvävnad överflödig energi som fett 5 , 6 . Lipolys i fettvävnad regleras av komplexa processer och molekylära detaljer av lipolys förblir fortfarande vaga 7 .
Lipolys är en process genom vilken triglycerider (TGL) som lagras i fettvävnad hydrolyseras för att producera glycerol och fettsyror (FA) av enzymet adipos triglycerid lipas (ATGL) 8 . Förändringar i basal och stimulerad lipolys är en karakteristisk egenskap hos fetma. BAsal lipolys regleras av ATGL-aktivering 9 , som omvandlar TGL till diacylglycerol (DAG), som därefter hydrolyseras till monoacylglycerol (MAG). Aktivering av hormonkänsligt lipas (HSL) via adenylylcyklas aktiverar stimulering av cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) beroende av proteinkinas A (PKA) och orsakar lipolys. Mätning av lipolys, basal och stimulerad, är därför viktigt för att analysera aktiviteten hos proteiner som är involverade i denna process. Vidare kan upplösning av molekylär reglering av lipolys vara till nytta för att utveckla nya terapeutiska strategier mot fetma 10 . Eftersom molekyler som stimulerar lipolys och fettsyraoxidation är potentiella kandidater för minskande fetter som lagras i depåer är det viktigt att använda en robust analys för reproducerbarhet.
Tidigare publicerade data antyder att aktivering av TRPV1-protein uttryckt i vit fettvävnad med CAP-förstärkt basalOch FSK (adenylylcyklasaktivator) -stimulerad lipolys i inguinal fettkuddar 11 . Tidigare forskning tyder också på att långvarig aktivering av TRPV1 genom CAP aktiverar PKA 12 . Eftersom aktiveringen av PKA stimulerar lipolys 13 , 14 , som mäter både basal och PKA-beroende stimulerad lipolys i inguinal fettkuddar isolerade från NCD eller HFD (± CAP) -födda möss efter 32 veckors utfodring av respektive dieter, kommer att validera rollen som TRPV1 Aktivering i lipolys.
Denna artikel beskriver en effektiv metod för att bestämma basal och stimulerad lipolys. Även om andra metoder som utnyttjar radioaktiva isotoper av glycerol och tråkig högprestanda vätskekromatografi eller gaskromatografi / masspektrometri för mätningar 15 , 16 är tillgängliga, erbjuder denna metod en mer direkt, enkel och kostnadseffektivTeknik för att bestämma lipolys i fettvävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll följer djurhållningsriktlinjerna vid University of Wyoming.
1. Djurhus och matning
ANMÄRKNING: Vuxna manliga vildtypsmus (C57BL / 6) (12-24 veckor i åldern) föddes i forskningsdjurets anläggning enligt de godkända protokollen för Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
- Från och med vecka 6 åldras husmöss i grupper om fyra i separata burar och slumpmässigt tilldelar dem till matningsgrupper av NCD eller HFD (± 0,01% CAP) till vecka 38.
OBS: CAP är en agonist av TRPV1-kanalprotein uttryckt i fettvävnaderna 11 , 17 . Blanda CAP med HFD i en mixer inuti huven och överför blandad blandning till en bricka som innehåller små 1 i 2 partitioner. Håll brickan inuti en -20 ° C frys. Ta bort brickan som innehåller HFD + CAP-kosten från frysen efter 24 timmar och förvara i en behållare vid -20 &# 176; C frysare tills användning. - Husmus i en klimatkontrollerad miljö (22,8 ± 2,0 ° C, 45-50% fuktighet) med en 12/12-ljus / mörk cykel med tillgång till angiven kost och vatten ad libitum .
- Vid slutet av 38 veckor, dissekera inguinala fettvävnader och använd för lipolys-experiment (avsnitt 2-7).
2. Förbereda möss för experimenten
- Bedöva möss genom att injicera ketamin och xylazinblandning (respektive 10 mg / kg respektive 80 mg / kg kroppsvikt). Injicera 0,01 ml av blandningen / 10 g kroppsvikt av mus.
- Bekräfta djupbedövning med en fast tånklämma. Om det finns en pedalreflex, testa musen igen efter minst 30 s.
- Använd veterinärsalva för att förhindra torrhet av ögonen under anestesi. Lämna inte möss obevakad under några av förfarandena.
- Euthanize möss genom att injicera en hög dos av ketamin och xylazinblandning injektion (10 mg / kg respektive 80 mg / kg kroppsvikt) mixturE (0,01 ml / 10 g kroppsvikt) följt av cervikal dislokation.
OBS: Denna metod för eutanasi är godkänd av IACUC vid University of Wyoming.
3. Isolering av fettkorgar av fettfett
- Placera musen (matad med NCD eller HFD (± CAP) i 32 veckor) ligger på vänster sida för proceduren.
ANMÄRKNING: Genom att placera musen på vänster sida ligger vänster framben och vänster bakre lim på dissektionsplattformen, medan höger framben och höger baklampa kommer att vända sig bort från plattformen. - Sterilisera hudytan med en 2 tums 2- gasväv, som blötläggs i ca 2,5 ml 70% etanol. Gör en 2 - 3 mm sidoklipp genom huden med en skalpell för att avslöja det underliggande fettlagret.
- Gör en 1 cm snitt (beroende på musens storlek) genom huden med en skalpell strax nedanför ribbburet över dorsalytan som förenar de två laterala snitten.
- Skala av fliken genom att dra den försiktigtAnvänd sterila tångar och lämna subkutan dynan intakt genom att inte skära fettkuddarna. Detta är fettkudden som ligger under huden.
- Dissektera fettkudden försiktigt från den underliggande muskeln och fascia med ett par saxar. Dra fettkudden när den skärs från den underliggande muskeln.
OBS: Vikt och storlek på fettkuddarna beror på vilken typ av möss (NCD eller HFD (± CAP) -fed). - Använd pincett för att överföra den till en petriskål som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills lipolys-experimenten, vid rumstemperatur (~ 15 min).
- Isolera fettkuddarna från höger sida av musen enligt beskrivningen i steg 3.2-3.6.
4. Basalglycerolfrisättning från fettkorgar
- Använd skarpa saxar för att skära ca 20 mg fettvävnad i 5 till 8 delar.
- Inkubera de skurna bitarna av ingående fettkuddar i 200 | il inkubationsmedium (Dulbecco's Modified Eagel's Medium (DMEM) innehållande 2% fettsyrafritt bovint serumalbumin (BSA)) vid 37 ° C, 5% CO 2 och 95% fuktighet under 60 min.
- Samla inkubationsmediet och frys vid -80 ° C för lipolysanalys.
OBS! De skurna bitarna används för bestämning av proteinkoncentration efter lipidutvinning. - Överför de feta bitarna med hjälp av pincett i 1 ml extraktionslösning (kloroform: metanol (2: 1, volym / volym) och 1% isättiksyra) och inkubera i 60 minuter vid 37 ° C under kraftig skakning vid 100 rpm. Kassera fettutvinningslösningen.
OBS: Detta steg kommer att extrahera fett från de skurna bitarna. Kassera fettuttagslösningen eftersom det kommer att störa proteinbestämningen. - Överför vävnaden (från steg 4.2.2) genom att använda pincett i ett sterilt mikrovågsrör innehållande 500 μl lysislösning (0,3 N NaOH innehållande 0,1% natriumdodecylsulfat, SDS) och inkubera över natten (12 h) vid 55 ° C under kraftig skakning Vid 100 varv per minut.
- Samla inkubationsmediet och frys vid -80 ° C för lipolysanalys.
- Bestäm proteinkoncentrationen av vävnad (steg 4.2.3) med användning av bicinchoninsyra (BCA) -reagenset och BSA som standard 18 .
- Tina det frusna mediet (steg 4.2.1) på is och bestämma glycerolhalten i mediet med användning av ett fritt glycerolreagens som beskrivet i protokollavsnitt 6 och 7 6 .
- Extrapolera koncentrationen av glycerol i prov från standardkurvan ritad med användning av glycerolstandarder 19 och uttryck lipolys som nanomolglycerol per mg protein per h 20 .
5. FSK-stimulerad lipolys
- Preincubate ca 20 mg inguinal fettkudde (5 till 8 styckade bitar) erhållna från NCD eller HFD (± CAP) -fed vildtypsmus i 200 | il DMEM innehållande 2% fettsyrafri BSA, 10 | iM FSK och 5 | iM Triacsin C vid 37 ° C i 5% CO 2 och 95% fuktighet under 60 min.
- Överföra vävnaden bitar med användning av pincett till ett identiskt medium och inkubera under ytterligare 60 min vid 37 ° C, 5% CO 2 och 95% fuktighet. Samla inkubationsmediet och förvara vid -80 ° C tills lipolysanalysen.
OBS: Stimulering av lipolys orsakar snabb frisättning av fettsyror och glycerol inom 15 minuter, vilket är linjärt under den första timmen och platåer därefter. Eftersom frekvensen av stimulerad lipolys är högre och stabil mellan den första och andra timmen av FSK-stimulering, mättes detta protokoll lipolys i det stimulerade tillståndet efter den andra inkubationsperioden som beskrivits tidigare 1 . Så, både experimentella steg (5.1 och 5.1.1) är nödvändiga.
6. Framställning av fria glycerolreagens
- Reconstitute glycerol reagenset 19 i 40 ml avjoniserat vatten i en gulfärgad glasflaska, placera ett stopp på flaskan och blanda väl genom inverterning 10 gånger. Blanda inte genom att skaka.
- Förvara injektionsflaskan vid 4 ° C i ett kylskåp skyddat mot ljus genom att helt täcka injektionsflaskan med aluminiumfolie.
- Fortsätt till beredningen av glycerolstandard (avsnitt 7).
7. Framställning av glycerolstandard och bestämning av glycerolinnehåll
- Gör ett lager av 1 mM genom att späda 35 | il av det tillförda lagret med 65 | il avjoniserat vatten.
OBS: Tillverkaren levererad glycerol standard lager är 2,8 mM glycerol. - Ta fem 1 cm långa väglängda metakrylatkuvetter. Märk kyvetterna med en markör som 0, 1,25, 2,5, 5 och 10 nmol standard.
- Tillsätt 0, 1,25, 2,5, 5 och 10 | il av 1 mM glycerolstandard till respektive märkta kyvetter. Tillsätt volymen av varje kyvett till 10 μl med avjoniserat vatten.
- Gör 1 till 10 utspädning av alla prover (från steg 4.4 eller 5.1.1) genom att tillsätta 10 μL av provet till 90 μl avjoniserat vatten i färska 500 μl för-märkta centrifugrör. Tillsätt 10 μl av de utspädda proverna i kyvetterna märkta med respektive providentifieringsnummer.
- Slå på UV-VIS-spektrofotometern och ställ in våganLängd till 540 nm.
- Värm det fria glycerolreagenset till rumstemperatur genom att hålla flaskan (steg 6.2) vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Ställ in en serie märkta kyvetter som blank "0" nmol-standard (steg 7.3), standarder (steg 7.3) och prov (steg 7.4).
- Tillsätt 10 μl av varje standard och prov i respektive märkta kyvett. Använd "0" nmol-standarden som tom.
- Tillsätt 0,8 ml fri glycerolreagens i varje kyvett, innehållande glycerolstandarderna med en 1 ml pipett.
- Täck kyvetten med en 1,5 cm kvarts plastparaffinfilm och blanda innehållet genom att vrida in kyvetten i 3 gånger och sätt åt sidan vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Placera kyvetten i UV-VIS-spektrofotometern och registrera absorbansen (540 nm våglängd).
- Plot standardkurvan med hjälp av koncentrationerna av standarderna (nmol) i X-axeln och den inspelade absorbansen i Y-axeln.
- Beräkna koncentrationen av glYcerol i proverna (nmol) genom extrapolering med användning av standardkurvan ritad i steg 7.12.
- Multiplicera koncentrationen av prover (nmol / kyvett) med utspädningsfaktorn 10 (se steg 7.4) och 20 (total volym)
- Dela koncentrationen av glycerol i varje prov (steg 7.13) med mg protein beräknat med BCA-metoden.
ANMÄRKNING: Eftersom de inguinala fettkuddarna inkuberas i 60 minuter representerar resultaten som nmol glycerol / mg protein / h.
- Gör ett lager av 1 mM genom att späda 35 | il av det tillförda lagret med 65 | il avjoniserat vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera effekten av CAP på basal och stimulerad lipolys uppmätta denna forskning lipolys i inguinal adiposa fettkuddar isolerade från NCD eller HFD (± CAP) -fed vildtyp möss. De representativa resultaten för den basala och FSK-stimulerade lipolysen för inguinal fettkuddarna ges i Tabell I. Basal och FSK-stimulerad glycerolfrisättning i närvaro av Triacsin C, som hämmar acylcoA-syntetas och förhindrar regenerering av TGL. Som visas i Figur 1 undertryckte HFD den FSK-stimulerade lipolysen och CAP ökade både basal och FSK-stimulerad lipolys. Triacsin C användes för att hämma regenerering av TGL från glycerol och fettsyror 11 . Alla data uttrycks som medel ± SEM Jämförelser mellan grupper analyseras med enkelriktad ANOVA och efterföljande analyser utfördes med hjälp av Student's t- test. Provstorlekar är inställda För att bestämma huruvida medelvärdet av en resultatvariabel i en grupp skilde sig väsentligt från det i en annan grupp. Ett p-värde <0,05 anses vara statistiskt signifikant.
Figur 1: CAP ökar basal och FSK-stimulerad glycerolfrigöring i fettpads. Streckdiagram representerar medelvärdet ± SEM för basal och FSK (10 | im) -stimulerad glycerolfrisättning (nmol / mg protein / h) i inguinalfettkuddarna isolerade från NCD eller HFD (± CAP) -fed vildtypsmus. ** Representerar statistisk signifikans för p-värde <0.05 för n = 6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
5 / 55625fig2.jpg "/>
Figur 2: Hydrolys av triglycerider (TGL) resulterar i framställning av fettsyror (FFA) och glycerol. FFA genomgår mitokondriell p-oxidation. Detta, tillsammans med uppreglering av uncoupling protein 1 (UCP-1) stimulerar termogenes. Glycerolfrisättning mäts med protokollet som beskrivs i artikeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| lipolys (Nmol-glycerol / mg protein / h) | NCD (N = 6) | HFD (N = 6) | HFD + CAP (N = 6) |
| basal | 16,22 ± 1,28 | 17,16 ± 1,48 | 52,07 ± 2,66 |
| FSK stimulerad (Med Triacsin C) | 54,88 ± 3,27 | 41,23 ± 4,43 | 72,04 ± 4,16 |
Tabell 1: Effekt av CAP på basal och FSK-stimulerad lipolys i fettpads. Medelbasal och FSK-stimulerad glycerol-frisättning ± SEM mätt i fettvävnad från inguinal fett erhållen från NCD-, HFD- eller HFD + CAP-matade vildtypsmus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uppdelningen av TGL i glycerol och fettsyror katalyseras av ATGL 9 under basal lipolys och orkestreras av en uppsättning proteiner innefattande aktiveringen av adenylylcyklas / PKA-beroende vägen under stimulerad lipolys 21 , 22 , 23 . Förbättring av lipolys ökar plasmakoncentrationerna av fettsyror för transport och energianvändning 24 . Fettsyror tas upp av mitokondrier som acetyl CoA, som används för att producera energi.
Graden och utsträckningen av lipolys kan effektivt mätas genom glycerolfrisättning från fettvävnader ( Tabell 1 och Figur 1 ). Hydrolys av TGL producerar fettsyror och glycerol. Tidigare forskning visade att kosttillskott av CAP ökade signifikant både basala och FSK-stimulerade glycerolutsläppE från inguinal och brunt fettkuddar 11 , 17 . Den ökade produktionen av fettsyror från förbättrad lipolys kan tjäna som matning för att producera värme och termogenes eftersom CAP också signifikant ökade uttrycket av mitokondriellt UCP-1 i inguinalfettkuddarna. I överensstämmelse med detta begrepp föreslår tidigare forskning att CAP ökade uttrycket av peroxisomproliferatoraktiverad receptoralfa (PPARa) i inguinal fettkuddar, som spelar en kritisk roll i mitokondriell fettsyraoxidation och vid transkriptionell uppreglering av UCP-1 25 , 26 , 27 . Följaktligen ökade CAP också metabolisk aktivitet, värmeproduktion och energiutgifter i HFD-matade möss 28 , 29 . Vidare undertryckte HFD-matning stimulerad lipolys medan CAP ökade basala och FSK-stimulerade PKA-beroendeT lipolys samt förbättrad insulinkänslighet 30 . Därför är det rimligt att tolka att CAP ökar basal och stimulerad lipolys, vilket beskrivs av modellen i figur 2 , utan att orsaka insulinresistens då överskottsfettet brinner för att ge värme genom upplösning av mitokondriell UCP-1.
Denna artikel beskriver metoden för mätning av glycerolfrisättning från vita fettvävnader. Även om flera metoder som använder stabila isotoper av glycerol är tillgängliga, kräver de antingen högprestandavätskekromatografi eller gaskromatografi / masspektrometri för mätningar 15 , 16 . Dessutom är glycerolradio-spårningsmätningar associerade med icke-specificiteter 31 . Alternativa förfaranden innefattar bestämning av mRNA och proteinnivåer av lipaser och regulatoriska proteiner involverade i lipolys. Färgimetriska metoder är också tillgängliga för dEtermin koncentrationen av långkedjiga fettsyror i omlopp. Metoden som beskrivs här är mycket effektiv vid analys av glycerolfrisättning från fettvävnader, eftersom det kan göras med användning av en plattläsare med förmåga att använda fluorescens och absorbansmätning. Den förenklade analysmetoden för glycerolfrisättning som beskrivs i denna artikel ger också förbättrad stabilitet och precision 32 .
Standard operativa procedurer bör utföras eftersom denna metod innefattar kirurgiska tekniker för att isolera fettkuddar. Detta protokoll rekommenderar användning av fettfri BSA. Detta kan orsaka luftbubbeldannande, vilket kommer att störa absorptionsavläsningen. Därför bör försiktighet åtgärdas vid hantering av prov för att förhindra luftbubblor. Försiktighet bör vidtas för att inte skaka eller invertera prover under BSA-behandling, om inte ett sådant steg rekommenderas i protokollet. Dessutom är det feta extraktionssteget från inguinet fett kritiskt eftersom närvaron av fett kommer att störa vitH bestämning av fettvävnadsprotein. Vid framställning av glycerolstandarder är det dessutom viktigt att blanda innehållet med inversion och inte skaka in flaskan.
Metoden som beskrivs här kan användas för att framgångsrikt isolera ingående fettkuddar för flera analyser inklusive lipolysmätningar. Lipolysprotokollet som beskrivits för inguinal fettkuddar kan lätt utvidgas till mätning av lipolys i andra vävnader. Metoderna är optimerade för alla typer av fettkuddar, liksom preadipocyter.
Sammanfattningsvis beskriver denna artikel metoden för att mäta basal och FSK-stimulerad glycerolfrisättning i inguinal adiposa fettkuddar isolerade från NCD eller HFD (± CAP) -fed möss. De presenterade data tyder på att TRPV1-aktivering med CAP ökade den basala och FSK-stimulerade lipolysen och förhindrade ackumulering av lipider i fettvävnaderna. Dessa data visar en kritisk roll för TRPV1-protein i regulatioN av lipolys i vit fettvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AHA-priset nr 15BGIA23250030, National Institute of General Medical Sciences av NIH under pris nummer 8P20 GM103432-12 och University of Wyoming Faculty Grant i Aid to BT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
