Summary
Bu protokol, normal yem diyetinden (NCD) veya yüksek yağlı diyetten (HFD) ± kapsaisin ile beslenen vahşi tipli farelerde elde edilen kasık yağ tabletlerinde bazal ve forkolinin uyardığı lipoliz belirleme metodunu açıklamaktadır. Lipoliz için bir indeks olarak, inguinal yağlı yağ pedlerinden gliserol salınımı ölçülmüştür.
Abstract
Lipoliz, yağ dokularında trigliserit olarak depolanan lipitin, gliserol ve yağ asitlerine hidrolize edilmesiyle ilgili bir işlemdir. Bu makale, normal yemeklik diyet (NCD), yüksek yağlı diyet (HFD) ya da 0.01'i içeren yüksek yağlı bir diyet ile beslenen vahşi tipli farelerden izole edilen kasıktaki yağ yastıklarında bazal ve forskolin (FSK) uyarılmış lipolizin ölçülmesine yönelik yöntemi açıklamaktadır % Kapsaisin (CAP; geçici reseptör potansiyeli vaniloid altfamilı 1 (TRPV1) agonisti) 32 hafta boyunca. Ex vivo lipoliz gerçekleştirmek için burada tarif edilen yöntem Schweiger ve ark. 1 UV-Görünür (UV / VIS) spektrofotometri ile gliserol düzeylerini ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Burada açıklanan yöntem, tutarlı sonuçlar elde etmek için kasık yağ pedlerinin lipoliz ölçümleri için başarıyla izole edilmesi için kullanılabilir. Kasık yağ pedleri için tanımlanan protokol, diğer dokulardaki lipolizin ölçülmesi için kolaylıkla genişletilebilir.
Introduction
Yağ dokuları yağ 2 olarak enerji depolarlar ve termojenez 3 , 4 için yağ asidi oksidasyonu gerekir. Diyetle yutulan yağ asitleri apoproteinler ile birlikte şilomikronlara paketlenir ve kan dolaşımıyla vücuttaki farklı dokulara aktarılır. Vücuttaki çoğu hücrenin bir enerji rezervi depolamasına rağmen, yağ dokusu yağ olarak fazla enerji depolar 5 , 6 . Yağ dokusundaki lipoliz kompleks proseslerle düzenlenir ve lipolizin moleküler detayları halen belirsiz kalmaktadır 7 .
Lipoliz, yağ dokusunda depolanan trigliseridlerin (TGL), yağlı trigliserid lipaz (ATGL) 8 enzimi ile gliserol ve yağ asitleri (FA) üretmek üzere hidrolizlenmesiyle oluşan bir işlemdir. Bazal ve uyarılmış lipolizdeki değişiklikler obezitenin karakteristik bir özelliğidir. BAsal lipoliz, TGL'yi diasilgliserol (DAG) haline getiren, daha sonra monoasil gliserole (MAG) hidrolize edilen ATGL aktivasyonu 9 ile düzenlenir. Adenillyla siklaz yoluyla hormona duyarlı lipazın (HSL) aktivasyonu siklik adenozin monofosfat (cAMP) bağımlı protein kinaz A (PKA) uyarılmasını aktive eder ve lipolize neden olur. Bu nedenle, bazal ve uyarılmış lipoliz ölçümü, bu prosese dahil olan proteinlerin aktivitesini analiz etmek için önemlidir. Ayrıca, lipoliz moleküler düzenleme çözülüyor obezite 10 karşı yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi faydalı olabilir. Lipoliz ve yağ asidi oksidasyonunu uyaran moleküller, depolarda depolanan yağları azaltmak için potansiyel aday olduğundan, tekrarlanabilirlik için sağlam bir test kullanmak önemlidir.
Daha önce yayınlanmış veriler, beyaz yağ dokusunda ifade edilen TRPV1 proteininin CAP ile güçlendirilmiş bazalVe kasık yağ pedlerinde FSK (adenillyla siklaz aktivatörü) uyarılmış lipoliz 11 . Önceki araştırmalar ayrıca, TRPV1'in CAP tarafından uzun süreli aktive edilmesinin PKA 12'yi aktive ettiğini ileri sürmektedir. PKA'nın aktivasyonu, lipozizi uyardığından , 13 , 14 , ilgili diyetlerin beslenmesinden 32 hafta sonra NCD veya HFD (± CAP) ile beslenen farelerden izole edilmiş kasık yağ pedlerinde bazal ve PKA'ya bağlı uyarılmış lipolizin ölçülmesiyle TRPV1'in rolü doğrulanacaktır Lipoliz aktivasyonu.
Bu makale, bazal ve uyarılan lipolizin belirlenmesinde etkili bir yöntem anlatmaktadır. Gliserolün radyoaktif izotoplarını kullanan diğer yöntemler ve ölçümler 15 , 16 için sıkıcı yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya gaz kromatografisi / kütle spektrometresi mevcut olsa da, bu yöntem daha doğrudan, basit ve uygun maliyetli bir yöntem sunmaktadırYağ dokusundaki lipolizi belirleme tekniği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm protokoller, Wyoming Üniversitesi'ndeki hayvan bakım kılavuzlarına uymaktadır.
1. Hayvan Barınağı ve Beslenme
NOT: Yetişkin vahşi tipli fareler (C57BL / 6) (12-24 haftalık yaşlar), Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) onaylı protokollere göre araştırma hayvan tesislerinde yetiştirilmiştir.
- Yaşın 6. haftasından itibaren ev fareleri dört grup halinde ayrı kafeste gruplandı ve rastgele onları 38 yaşına kadar NBH veya HFD (±% 0.01 CAP) beslenme gruplarına atadılar.
NOT: CAP, yağ dokuları 11 , 17'de ifade edilen TRPV1 kanal proteininin bir agonistidir. Kaput içinde bir karıştırıcıda HFD ile CAP karıştırın ve küçük 1 2 bölümleri ihtiva eden bir tepsiye harmanlanmış karışımın aktarın. Tepsiyi -20 ° C dondurucuda saklayın. HFD + CAP diyetini içeren tepsiyi 24 saat sonra dondurucudan çıkarın ve -20 ° C'de bir kapta saklayın.# 176; C dondurucu kullanana kadar. - Evde beslenen fareler, iklimle kontrol edilen bir ortamda (22.8 ± 2.0 ° C,% 45-50 nem) 12/12 ışık / karanlık döngüsü ile belirlenmiş diyet ve suya serbestçe erişebilirler.
- 38 haftanın sonunda, inguinal yağ dokularını inceleyin ve lipoliz deneyleri için kullanın (bölümler 2-7).
2. Deneyler için Fare Hazırlama
- Ketamin ve ksilazin karışımı (sırasıyla 10 mg / kg ve 80 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte ederek farelere anestezi uygulayın. 0.01 mL karışım / 10 g vücut ağırlığı fare enjekte edin.
- Sıkı bir anestezi sıkı bir ayak parmağı çimdikle teyit edin. Pedal refleksi varsa fareyi en az 30 saniye sonra tekrar test edin.
- Anestezi sırasında gözlerin kuruluğunu önlemek için veteriner merhemi kullanın. İşlemlerden herhangi birisi sırasında fareleri gözetimsiz bırakmayın.
- Yüksek dozda ketamin ve xylazine karışım enjeksiyonu (sırasıyla 10 mg / kg ve 80 mg / kg vücut ağırlığı) karışımını enjekte ederek fareleri euthanize edinE (0.01 ml / 10 g vücut ağırlığı) ve ardından servikal dislokasyon.
NOT: Bu ötenazi yöntemi Wyoming Üniversitesinin IACUC tarafından onaylanmıştır.
3. Inguinal Adipose Fat Pad'lerin İzolasyonu
- Prosedür için solunda kalan fareyi (NCD veya HFD (± CAP) ile 32 hafta boyunca beslenir) yerleştirin.
NOT: Fareyi sol tarafa yerleştirerek sağ ön ayak ve sağ arka platform platformdan uzaklaşırken sol ön ayak ve sol arka bacak diseksiyon platformunda olacaktır. - 2.5 inç% 70 etanol batırılmış 2 inç 2 gazlı bezle cilt yüzeyini sterilize edin. Altta yağ tabakası ortaya çıkarmak için bir neşter kullanarak deriden 2 - 3 mm'lik bir yanal kesim yapın.
- Dorsal yüzeyin iki yanal kesisini birleştiren kaburga kafesinin hemen altında bir neşter kullanarak cilt boyunca 1 cm'lik bir kesik yapın (fare boyutuna bağlı olarak).
- Deriyi sürükleyerek deriyi soyun.Steril forseps kullanarak ve yağ pedleri keserek cilt altı pedini sağlam bırakın. Bu, cildin altında yatan yağ yastığı.
- Bir çift makas kullanarak yağ bandını alttaki kas ve fasyadan dikkatlice ayırın. Yağ pedini, alttaki kası kesildiği için çekin.
NOT: Yağ yastıklarının ağırlığı ve boyutu farelerin türüne (NCD veya HFD (± CAP) -fed) bağlıdır. - Oda sıcaklığında (~ 15 dakika) lipoliz deneyi olana kadar fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir Petri kabına aktarmak için cımbız kullanın.
- Adımlar 3.2-3.6'da açıklandığı gibi yağ yastıklarını farenin sağ tarafından ayırın.
4. İnguinal Yağ Keçelerinden Bazal Gliserol Salınımı
- 5 ila 8 parçaya yaklaşık 20 mg yağ dokusu kesmek için keskin makas kullanın.
- Inüinal yağ yastıklarının kesme parçalarını 200 uL inkübasyon ortamında (% 2 yağ asidi içeren Dulbecco Modifiye Eagel's Medium (DMEM) kuluçkalayın37 ° C 'de içermeyen sığır serum albümini (BSA)),% 5 CO2 ve 60 dakika için% 95 nem.
- İnkübasyon ortamı toplayın ve lipoliz testi için -80 ° C'de dondurun.
NOT: Kesilen parçalar, lipit ekstraksiyonu sonrası protein konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılır. - Kesilen yağ parçalarını cımbız yardımıyla 1 mL ekstraksiyon çözeltisine (kloroform: metanol (2: 1, v / v) ve% 1 buzlu asetik asit) aktarın ve 100 ° C'de çalkalarken 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin rpm. Yağ ekstraksiyon çözeltisini atın.
NOT: Bu adım kesilen parçalardan yağ çıkaracaktır. Yağ ekstraksiyon çözeltisini, protein belirlenmesini etkileyeceğinden atın. - Dokuyu (adım 4.2.2'den), cımbızı kullanarak, 500 μL lizis çözeltisi (% 0.1 sodyum dodesil sülfat içeren 0.3 N NaOH; SDS) içeren steril bir mikrofuge tüpüne aktarın ve gece boyunca (12 saat) 55 ° C'de kuvvetli çalkantı altında inkübe edin 100 rpm'de.
- İnkübasyon ortamı toplayın ve lipoliz testi için -80 ° C'de dondurun.
- Doku (aşama 4.2.3) standart 18 olarak bisinkoninik asit (BCA) reaktif ve BSA kullanılarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
- Donmuş ortamı buz üzerinde çözün (adım 4.2.1) ve protokol bölümleri 6 ve 7'de açıklandığı gibi serbest bir gliserol reaktifi kullanarak ortamın gliserol içeriğini belirleyin 6 .
- Gliserol standartları 19 ile çizilen standart eğriden alınan örneklerdeki gliserol konsantrasyonunu hesaplayın ve lipoliz, saat 20 başına mg protein başına nanomole gliserol olarak ifade edin.
5. FSK ile uyarılan lipoliz
- % 2 yağ asidi içermeyen BSA, 10 uM FSK ve 5 uM Triacsin C içeren 200 μL DMEM'de NCD veya HFD (± CAP) ile beslenmiş yabani tip fareden elde edilen yaklaşık 20 mg kasık yağ yastığını (5 ila 8 kesilmiş parça) önceden inkübe edin. 60 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem.
- 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir 60 dakika daha aynı ortama cımbız kullanarak doku parçaları aktarın ve inkübe edilir. Kuluçka ortamı toplayın ve lipoliz testine kadar -80 ° C'de saklayın.
NOT: Lipoliz stimülasyonu, ilk saatlerde doğrusal olan 15 dakika içinde yağ asitleri ve gliserol'ün hızlı bir şekilde serbest bırakılmasına ve bundan sonraki yaylalara neden olur. Uyarılmış lipoliz oranı FSK Uyarımın birinci ve ikinci saat arasında daha yüksek ve stabil olduğu daha önce tarif edildiği gibi 1, uyarılmış halde bu protokol ölçülen lipoliz ikinci kuluçka dönemi geçirmektedir. Bu nedenle, hem deneysel adımlar (5.1 ve 5.1.1) gereklidir.
6. Serbest Gliserol Reaktifinin Hazırlanması
- Gliserol reaktifi 19'u , amber renkli bir cam şişede 40 mL'lik deiyonize su içinde yeniden bir araya getirin, şişeye bir tıpa yerleştirin ve 10 kez ters çevirerek iyice karıştırın. Çalkalamak suretiyle karıştırmayın.
- Şişeyi, alüminyum folyo ile tamamen kaplayarak, ışığa karşı korunan bir buzdolabının içine 4 ° C'de saklayın.
- Gliserol standardının hazırlanmasına geçin (bölüm 7).
7. Gliserol Standardının Hazırlanması ve Gliserol İçeriğinin Belirlenmesi
- Sağlanan stok 35 mcL deiyonize su 65 mcL seyreltilerek 1 mM stok olun.
NOT: Üreticiden temin edilen gliserol standart stok 2.8 mM gliserol'dür. - 1 cm uzunluğunda yol uzunluğunda tek kullanımlık metakrilat küvetler alın. Bir işaretleyiciyi 0, 1.25, 2.5, 5 ve 10 nmol standart olarak kullanarak küvetler etiketleyin.
- Etiketli küvetler için 0, 1.25, 2.5, 5 ve 10 uL 1 mM gliserol standardı ekleyin. Deiyonize su ile her küvette 10 μL'ye kadar hacim oluşturun.
- Taze 500-μL önceden etiketlenmiş santrifüj tüplerine 90 μL deiyonize suya 10 uL örnek ekleyerek tüm örneklerin (adım 4.4 veya 5.1.1'den) 1 ila 10 seyreltmesini yapın. 10 uL seyreltilmiş numuneleri ilgili numune tanımlama numarasıyla etiketlenmiş küvete ekleyin.
- UV-VIS spektrofotometresini açın ve dalgayı ayarlayınUzunluğunu 540 nm'ye çıkarır.
- Şişeyi (adım 6.2) oda sıcaklığında 15 dakika tutarak serbest gliserol reaktifini oda sıcaklığına ısıtın.
- Boş "0" nmol standardı (adım 7.3), standartlar (adım 7.3) ve örnekler (adım 7.4) olarak bir dizi etiketlenmiş küvet ayarlayın.
- Standardın ve numunenin her birinden 10 uL, ilgili etiketli küvete ekleyin. "0" nmol standardını boş olarak kullanın.
- Gliserol standartlarını 1 mL'lik bir pipet kullanarak içeren, her bir küvete 0,8 mL serbest gliserol reaktif ekleyin.
- Küveti 1.5 cm kare plastik parafin film ile örtün ve küveti 3 kez ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
- Küveti UV-VIS spektrofotometresine yerleştirin ve absorbansı (dalga boyu 540 nm) kaydedin.
- Standart eğrileri, X ekseni standartlarının (nmol) konsantrasyonlarını ve kaydedilen absorbansı Y ekseni ile çizin.
- Gl konsantrasyonunu hesaplaÖrnek 7.12'de çizilen standart eğri kullanılarak ekstrapolasyon ile örneklerde (nmol) yserol.
- Seyreltme faktörü 10 (adım 7.4'e bakın) ve 20 (toplam hacim) ile numunelerin konsantrasyonunu (nmol / küvet) çarpın
- Her numunedeki (adım 7,13) gliserol konsantrasyonunu BCA metodu ile hesaplanan protein mg oranında bölün.
NOT: Kasık yağ yastığı numuneleri 60 dakika kuluçka yapılacağından, sonuçlar gluterol / mg protein / saat olarak nmol olarak gösterilir.
- Sağlanan stok 35 mcL deiyonize su 65 mcL seyreltilerek 1 mM stok olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CAP'nin bazal ve uyarılmış lipoliz üzerindeki etkisini değerlendirmek için, bu araştırma, NCD veya HFD (± CAP) -fed vahşi tipli farelerden izole edilmiş inguinal yağlı yastıklardaki lipolizi ölçtü. Kasık yağ pedleri için bazal ve FSK ile uyarılan lipoliz için temsili sonuçlar Tablo I'de verilmektedir. Asil coA sentetazı inhibe eden ve TGL'nin yenilenmesini önleyen Triacsin C'nin varlığında bazal ve FSK ile uyarılmış gliserol salınımı. Şekil l' de gösterildiği gibi, HFD, FSK ile uyarılan lipoliziyi bastırdı ve CAP, hem bazal hem de FSK ile uyarılan lipolizeyi arttırdı. Triasin C gliserol ve yağ asitleri 11'den TGL yenilenmesini inhibe etmek için kullanılmıştır. Tüm veriler ortalamalar olarak ifade edilmiştir. ± SEM Gruplar arası karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA kullanılarak analiz edilmiş ve post hoc analizler Student's t testi kullanılarak yapılmıştır. Örnek boyutları ayarlandı Bir gruptaki sonuç değişkeninin ortalama değerinin başka bir grubun ortalamasından anlamlı olarak farklı olup olmadığını belirlemek. <0.05 p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.
Şekil 1: CAP, İnguinal Yağ Tabakasında Bazal ve FSK ile uyarılmış Gliserol İndirimini Artırır. Çubuk grafikler, NCD veya HFD (± CAP) -fed vahşi tipli farelerden izole edilen kasıktaki yağ yastıklarında, bazal ve FSK (10 uM) uyarılmış gliserol salınımının (nmol / mg protein / saat) ortalama ± SEM'i temsil etmektedir. ** n = 6 için p-değeri <0.05 için istatistiksel önemi temsil eder . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
5 / 55625fig2.jpg "/>
Şekil 2: Trigliseridlerin (TGL) Hidrolizi Serbest Yağ Asitleri (FFA) ve Gliserol Üretimi Sonuçlar. FFA mitokondriyal β oksidasyonuna maruz kalır. Bu, ayrıştırma proteininin (UCP-1) yukarı doğru düzenlenmesiyle birlikte termojenezi uyarır. Gliserol salınımı, makalede açıklanan protokol ile ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Lipoliz (Nmol gliserol / mg protein / saat) | NCD (N = 6) | HFRD (N = 6) | HFD + CAP (N = 6) |
| Bazal | 16.22 ± 1.28 | 17.16 ± 1.48 | 52.07 ± 2.66 |
| FSK Uyarılmış (Triacsin C ile) | 54.88 ± 3.27 | 41.23 ± 4.43 | 72.04 ± 4.16 |
Tablo 1: İnguinal Yağ Keçilerinde CAP'nin Bazal ve FSK Uyarılmış Lipoliz Üzerine Etkisi. NCD, HFD veya HFD + CAP ile beslenen vahşi tipli farelerden elde edilen kasık yağlı yağ dokusunda ortalama bazal ve FSK ile uyarılan gliserol salınımı ± SEM ölçülmüştür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TGL'nin gliserol ve yağ asitleri haline dönüşümü, bazal lipoliz sırasında ATGL 9 ile katalize edilir ve uyarılan lipoliz 21 , 22 , 23 sırasında adenil siklaz / PKA'ya bağımlı yolağın aktivasyonu da dahil olmak üzere bir dizi protein ile düzenlenir. Lipolizin arttırılması, ulaşım ve enerji kullanımı için yağ asitlerinin plazma seviyelerini arttırır 24 . Yağ asitleri, enerji üretmek için kullanılan asetil CoA olarak mitokondriyum tarafından alınır.
Lipoliz derecesi ve derecesi, yağ dokularından gliserol salımıyla etkin şekilde ölçülebilir ( Tablo 1 ve Şekil 1 ). TGL'nin hidrolizi yağ asitleri ve gliserol üretir. Önceki araştırmalar, CAP'nin diyetle desteklenmesinin, bazal yanı sıra FSK tarafından uyarılan gliserol salınımlarını önemli ölçüde arttırdığını gösterdiKasık ve kahverengi yağ yastıklarından 11 , 17 . Artmış lipolizden yağlı asitlerin artan üretimi, CAP'nin kasık yağ pedlerinde mitokondriyal UCP-1'in ifadesini önemli ölçüde arttırdığı için ısı ve termojenez üretmek için yem görevi görebilir. Bu görüşe uygun olarak, daha önceki araştırmalar, CAP'nin mitokondriyal yağ asidi oksidasyonunda ve UCP-1 25 , 26'nın transkripsiyonel upregülasyonunda kritik bir rol oynayan kasık yağ pedlerinde peroksizom proliferatör aktive reseptör alfa (PPARα) ekspresyonunu arttırdığını ileri sürmektedir , 27 . Sonuç olarak, CAP aynı zamanda HFD ile beslenen farelerde metabolik aktivite, ısı üretimi ve enerji harcamasını artırdı 28 , 29 . Dahası, HFD beslemesi bastırılmış lipoliz uyarısı yaparken, CAP bazal ve FSK ile uyarılan PKA bağımlılığını arttırmıştırT lipoliz ve artmış insülin duyarlılığı 30 . Bu nedenle, Şekil 2'deki modelle açıklandığı üzere, mitokondriyal UCP-1 upregülasyonu ile fazla yağ biriktiğinden insülin direncine neden olmaksızın CAP'nin bazal ve uyarılmış lipolizi arttırdığını yorumlamak mantıklıdır.
Bu makalede, beyaz yağ dokularından gliserol salınımının ölçülme yöntemi açıklanmaktadır. Gliserolün kararlı izotoplarını kullanan birkaç yöntem mevcut olsa da, ölçümler 15 , 16 için yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya gaz kromatografisi / kütle spektrometresi gerektirir. Ayrıca, gliserol radyo-tracer ölçümleri spesifik olmayan 31 ile ilişkilidir. Alternatif yöntemler, lipolizle ilgili düzenleyici proteinlerin ve lipazların mRNA ve protein düzeylerini belirlemeyi içerir. Kolorimetrik yöntemler de dDolaşımdaki uzun zincirli yağ asitlerinin konsantrasyonunu belirler. Burada açıklanan yöntem, floresan ve absorbans ölçümü yapabilen bir plaka okuyucu kullanılarak yapılabileceği için, yağ dokularından gliserol salınımını analiz etmede çok etkilidir. Ayrıca, bu makalede açıklanan gliserol salınımı için basitleştirilmiş analitik yöntem, geliştirilmiş kararlılık ve hassaslık sağlar 32 .
Bu yöntem, yağ yastığını izole etmek için cerrahi teknikler içerdiğinden, standart ameliyat prosedürleri uygulanmalıdır. Bu protokol yağsız BSA kullanımını önermektedir. Bu, absorbans okumasına müdahale edecek hava kabarcığı oluşumuna neden olabilir. Bu nedenle, hava kabarcığı önlemek için numuneler taşınırken dikkat edilmelidir. Protokolde böyle bir adım tavsiye edilmediği sürece, BSA tedavisi sırasında numunelerin sallamaması veya ters çevrilmemesi için tedbir alınmalıdır. Ayrıca, inguinal yağdan yağ ekstraksiyon basamağı kritiktir çünkü yağ varlığı etkilenirInguinal adipoz doku proteini tayini. Buna ek olarak, gliserol standartlarının hazırlanması esnasında içerikleri ters çevirerek karıştırmak ve şişeyi sallamamak önemlidir.
Burada açıklanan yöntem, lipoliz ölçümleri de dahil olmak üzere birçok test için kasık yağ pedlerini başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılabilir. Kasık yağ pedleri için tanımlanan lipoliz protokolü, diğer dokulardaki lipolizin ölçülmesine kadar kolayca genişletilebilir. Metodlar, preadipositler kadar her türlü yağ yastığı için optimize edilmiştir.
Özetle, bu makalede, NCD veya HFD (± CAP) -fed farelerden izole edilmiş inguinal yağlı yastıklardaki bazal ve FSK ile uyarılan gliserol salımını ölçmek için kullanılan yöntem açıklanmaktadır. Sunulan veriler, CAP ile TRPV1 aktivasyonunun bazal ve FSK ile uyarılan lipolizi arttırdığını ve yağ dokularında lipitlerin birikmesini önlediğini ortaya koymaktadır. Bu veriler TRPV1 proteininin regülasyonda kritik bir rol oynadığını göstermektedirN beyaz yağ dokusundaki lipoliz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, AHA Ödülü No. 15BGIA23250030, NIH Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü, 8P20 GM103432-12 ödülü ve Wyoming Üniversitesi Teknik Destek Bursu adı altında BT tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
