Summary
الخلايا العصبية السمعية الدماغية من الطيور والثدييات هي متخصصة في الترميز العصبي السريع، عملية أساسية لوظائف السمع العادية. تنشأ هذه الخلايا العصبية من السلائف متميزة من الدماغ المؤخر الجنيني. نقدم تقنيات الاستفادة إليكتروبوراتيون للتعبير عن الجينات في الدماغ المؤخر من أجنة الدجاج لدراسة وظيفة الجينات خلال التنمية السمعية.
Abstract
إليكتروبوراتيون هو الأسلوب الذي يدخل الجينات ذات الاهتمام في الكائنات ذات الصلة بيولوجيا مثل جنين الدجاج. فمن الثابت منذ فترة طويلة أن الجنين الدجاج هو نموذج بحثي فعال لدراسة الوظائف البيولوجية الأساسية لتطوير النظام السمعي. وفي الآونة الأخيرة، أصبح جنين الدجاج قيمة خاصة في دراسة التعبير الجيني والتنظيم وظيفة المرتبطة السمع. في البيضة إليكتروبوراتيون يمكن استخدامها لاستهداف مناطق الدماغ السمعية المسؤولة عن وظائف السمعية المتخصصة للغاية. وتشمل هذه المناطق نواة الدجاج ماغنوسيلولاريس (نم) ونواة اللاميناريس (نل). نيم و نل الخلايا العصبية تنشأ من السلائف متميزة من رومبوميريز 5 و 6 (R5 / R6). هنا، نقدم في إليكتروبوراتيون البيضة من الجينات ترميز البلازميد لدراسة الخصائص المرتبطة بالجينات في هذه المناطق. نعرض طريقة للتحكم المكاني والزماني للتعبير الجيني التي تعزز إما كسب أو فقدان فينوتيب وظيفيةوفاق. عن طريق استهداف السمعية المناطق السلف العصبية المرتبطة R5 / R6، وتبين لنا ترنسفكأيشن البلازميد في نم و نل. ويمكن تحقيق التنظيم الزمني للتعبير الجيني من خلال اعتماد نظام متجه تيت-أون. هذا هو الإجراء محرض المخدرات التي تعبر عن الجينات ذات الاهتمام في وجود دوكسيسيكلين (دوكس). في تقنية إليكتروبوراتيون البيضة - جنبا إلى جنب مع إما البيوكيميائية، الدوائية، أو في المقايسات الوظيفية في الجسم الحي - يوفر نهجا مبتكرا لدراسة تطوير الخلايا العصبية السمعية والظواهر الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بها.
Introduction
الترميز العصبي السريع من الصوت أمر ضروري لوظائف السمعية العادية. وتشمل هذه القدرات توطين الصوت 1 ، والكلام في التمييز الضوضاء 2 ، وفهم إشارات الاتصال الأخرى ذات الصلة السلوكية 3 . الخلايا العصبية مماثلة تقع في الدماغ السمعي من كل من الطيور والثدييات هي متخصصة للغاية للترميز العصبي السريع 4 . وتشمل هذه نواة الدجاج المغنطيسية (نم)، نامين لاميناريس (نل) ونظيرتها الثدييات، ونواة قوقعة الأذن البطانية (أفن) والزيتون متفوقة وسطي (مسو)، على التوالي 5 . ومع ذلك، فإن الآليات التنموية التي تنظم الترميز العصبي السريع غير مفهومة جيدا في الدماغ السمعي. ولذلك، فمن المفيد لدراسة الجينات المحددة التي هي المسؤولة عن الترميز العصبي السريع من أجل فهم أفضل للتعبير والتنظيم والوظيفة في الاتحاد الافريقيديتوري التنمية.
الجنين الدجاج النامية هو أداة بحث فعالة وراسخة لدراسة المسائل البيولوجية الأساسية لتطوير نظام السمع 6 ، 7 . وقد تناولت التطورات الجزيئية الأخيرة هذه المسائل البيولوجية في الجنين الدجاج النامية من خلال التعبير عن أو طرق أسفل الجينات ذات الاهتمام من أجل تحليل في الجسم الحي وظيفة الجينات 8 ، 9 . إن التحقيق في الدور التنظيمي لجينات معينة هو تقدم كبير في فهم الأمراض المرتبطة بالعجز السمعي. هنا، نقدم في إليكتروبوراتيون البيضة من الجينات ترميز البلازميد في الدماغ الدماغ السمعي حيث الترميز العصبي السريع من الصوت يحدث 10 . من خلال استهداف السمعية المناطق السلف العصبية المرتبطة رومبوميريز 5 و 6 11 و 12 (R5 /R6)، وتبين لنا السيطرة المكانية من ترنسفكأيشن البلازميد في نم و نل. وبالإضافة إلى ذلك، نظهر التنظيم الزمني للتعبير عن طريق اعتماد نظام ناقلات تيت على. هذا هو الإجراء محرض المخدرات التي تعبر عن الجينات ذات الاهتمام في وجود دوكسيسيكلين (دوكس) 8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل جامعة نورث ويسترن جامعة رعاية الحيوان واللجان الاستخدام، ونفذت وفقا للمعاهد الوطنية للمبادئ التوجيهية الصحية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. التعامل مع البيض
- شراء البيض المخصب من بائع محلي. تخزين البيض في 13 درجة مئوية في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 5 أيام قبل الحضانة. قابلية الجنين تنخفض بشكل ملحوظ بعد 1 أسبوع.
- مسحة كل بيضة مع الايثانول 70٪ قبل وضع في الحاضنة.
- تعيين 1-2 عشرات (ق) من البيض على جانبيها في حاضنة مع درجة الحرارة المحددة إلى 38 درجة مئوية في ~ 50٪ الرطوبة. وهذا يضمن وضع الجنين المناسب ل إليكتروبوراتيون والصلاحية المثلى، على التوالي.
ملاحظة: بعد 48-52 ساعة من الحضانة، فإن البيض يكون في مرحلة هامبورجر هاميلتون (ه) ~ 12-13 وعلى استعداد لل إليكتروبوراتيون.
2. إعداد
- البلازميد ميشينغ
- إضافة 1 ميكرولتر من 0.1٪ الأخضر سريع (0.1٪ في 18 MΩ منزوع الأيونات والمقطر H 2 O [د 2 O]) لكل 7 ميكرولتر من خليط الحمض النووي.
- للمشاركة في إليكتروبوراتيون من البلازميدات متعددة، مزيج البلازميدات في نسبة 1: 1. وينبغي أن يكون تركيز الحمض النووي النهائي 5-8 ميكروغرام / ميكرولتر.
- ملء حقن ماصة
- سحب ماصات على مجتذب ميكروبيبيت. ملء ماصة مع 1-2 البلازميدات ميكرولتر باستخدام إبرة حقنة 28G.
- كسر طرف ماصة إلى 10 - 20 ميكرون باستخدام ملقط. استخدام المجهر للمساعدة في تحديد حجم طرف ماصة مكسورة. نعلق ماصة إلى حامل ماصة من بيكوسبريتزر.
3. ويندوينغ
ملاحظة: تم نشر إجراءات النافذة قبل 13 . يرجى الرجوع إلى المرجع 13 للحصول على معلومات بصرية إضافية.
- مسح جميع الأدوات ومنطقة العمل مع 70٪الإيثانول.
- اتخاذ العدد المطلوب من البيض مجموعة من الحاضنة (بين 6-10)، وترك في درجة حرارة الغرفة، وبيض مسحة بشكل فردي مع 70٪ من الإيثانول مرة أخرى. تبقى البيض قابلة للحياة لمدة 2 ساعة على الأقل بعد إزالة الحاضنة.
- وضع البيض على رأس المنور الضوء لتحديد المواقع الجنين. دائرة مركز المنطقة المظلمة ( أي الجنين) مع قلم رصاص.
- باستخدام إبرة 19G، كزة حفرة في نهاية حادة من البيض.
- كزة ثقب آخر بالقرب من دائرة مرسومة على الجانب وأشار من البيض. إزالة قطعة صغيرة من قشر البيض الخارجي (حوالي 16 ملم 2 ) مع إبرة 19G ثم إزالة قطعة صغيرة من قشر البيض الداخلي (حوالي 8 ملم 2 ) مع ملقط.
- مع حقنة 3 مل مزودة إبرة 19G، وسحب 1.5-2.5 مل من الألبومين من البيض من خلال حفرة نهاية حادة. تأكد من زاوية الإبرة أسفل في 45 درجة.
- تغطية حفرة نهاية حادة مع قطعة صغيرة من الشريط (1 سم × 1 سم). تغطية دائرة رسمهاد الثقب الثاني مع الشريط (2.5 سم × 4 سم).
- مع مقص منحني (قطع حافة = 2.5 سم)، وقطع نافذة داخل الدائرة. يجب أن يكون مقص موازية لقشر البيض وقطر النافذة يجب أن يكون أقل من 2 سم.
4. البلازميد حقن
- بدوره على بيكوسبريتزر. تعيين الضغط إلى 18 رطل والمدة إلى 5 μs. بدوره على خزان الهواء ومصباح للمجهر تشريح.
- جعل 30 مل حل الأسهم من التخفيف 1.10 من الحبر الهندي اشترى مخزن مختلطة في المالحة الفوسفات مخزنة المالحة (بس). تخزين في 4 درجات مئوية. حقن الحبر الهندي هو خطوة هامة للحصول على تصور أفضل من جنين الدجاج.
- ملء حقنة 1 مل مع حل الحبر الهندي المخفف. إرفاق إبرة 27G وطرد أي فقاعات موجودة في المحقنة.
- إدراج إبرة فقط تحت غشاء صفار ~ 2 - 3 ملم من الجنين وحقن ~ 0.2 مل من الحبر الهندي بلطف تحت الجنين. فعللا حقن أكثر من 0.5 مل من الحبر الهندي لأنها قد تقلل من البقاء على قيد الحياة الجنين.
- وضع البيض نافذة على حامل بيضة تحت المجهر تشريح. استخدام أعلى التكبير لأفضل التصور من موقع حقن البلازميد.
- باستخدام ملقط، وإزالة الغشاء على منطقة الحقن. المناطق الدماغية السمعية من الفائدة ( أي نم و نل) تنشأ من رومبوميريز 5 و 6 (R5 / R6). R5 / R6 تقع بالقرب من أوتوسيستس (وهي البنية الجنينية في الفقاريات التي تتطور إلى الأذن الداخلية) التي تكون بمثابة معالم لحقن البلازميد R5 / R6.
- خفض ماصة مليئة الحمض النووي في الأنبوب العصبي المغطي R5 / R6 المنطقة وبين أوتوسيستس باستخدام ميكرومانيبولاتور. ويرد التخطيطي للموضع المثالي في الشكل 1A .
- تطبيق ضغط الهواء (18 رطل لكل بوصة مربعة، 5 μs المدة) من بيكوسبريتزر لإخراج الحمض النووي في الأنبوب العصبي.
5. إليكتروبوراتيون
- شغل tانه الحالي / الجهد مشجعا.
- ملء حقنة 3 مل مع برنامج تلفزيوني ونعلق مرشح حقنة. إضافة 1-2 قطرات من برنامج تلفزيوني على الجنين.
- خفض القطبين القطبين إلى الجنين باستخدام ميكرومانيبولاتور مع القطب السالب فوق موقع الحقن (الإنسي) والقطب الموجب الجانبي إلى R5 / R6 ( الشكل 1A ). تجنب الاتصال المباشر مع الجنين. استخدام القطبين الأقطاب حيث المواد الكهربائي هو البلاتين الايريديوم. ضبط التباعد بين النصائح إلى 0.5 ملم مع ملقط.
- باستخدام مشجعا التيار / الجهد، نبض 20 مرة في 50 V ل 1 مس على فترات 1 ثانية.
- بعد إليكتروبوراتيون، إضافة قطرة واحدة من برنامج تلفزيوني على المنطقة المكشوفة. إزالة بلطف القطب وتنظيفه مع الأنسجة المختبرية و 70٪ من الإيثانول. إغلاق النافذة تعريض الجنين مع الشريط.
- تسمية قشر البيض مع حقن نوع البلازميد وتاريخ الفقس.
- وضع البيض مرة أخرى في الحاضنة مع نافذة الجانب حتى. احتضان عند 38 درجة مئوية مع 50٪ الرطوبة حتى يتم الوصول مرحلة التنموية المطلوب.
- إذا كان إليكتروبوراتد تيت على ناقلات للتحكم الزماني للتعبير الجيني، وتطبيق دوكسيسيكلين (دوكس) كل 24 ساعة للحث على التعبير الجيني (انظر القسم 6).
6. تيت على نظام للتحكم الزمني للتعبير الجيني
- استخدام البلازميدات التالية:
يكاغس-T2TP: ترانسبوسيز تعبر عن البلازميد.
pt2K-كاغس-رتا-M2: البلازميد الذي يعبر بشكل ثابت عن بروتين ملزمة دوكس.
pt2K-بي-تري-إغف: البلازميد الذي يحتوي على ثنائي الاتجاه تيت على المروج (تري) -driving التعبير عن مراسل إغف والجين الثاني من الفائدة.
ملاحظة: تحتاج البلازميدات الثلاثة أعلاه لتكون مشتركة إليكتروبوراتد في نسبة 1: 1: 1. - إعداد الحل الأسهم:
- حل دوكس في برنامج تلفزيوني العقيمة لإنتاج محلول المخزون 1 ملغ / مل. مخزن في -20 درجة مئوية.
- تطبيق دوكس:
- للحث على التعبيرن من الجينات ذات الاهتمام خلال مراحل تنموية معينة، وتطبيق دوكس كل 24 ساعة.
- عند تطبيق دوكس، واتخاذ البيض خارج، فتح نافذة، ماصة 50 ميكرولتر دوكس على غشاء المشيمية، إغلاق النافذة ووضع البيض مرة أخرى في الحاضنة.
7. إعداد منطقة تشريح لشرائح الدماغ
ملاحظة: تم نشر الأقسام التالية (7 - 9) والإجراءات قبل 14 . يرجى الاطلاع على هذه المراجع للحصول على معلومات بصرية إضافية.
- إعداد محلول أجار (40 ملغ / مل الاغاروز، أي 4٪ في د 2 O). صب حل أجار في طبق بتري والسماح لها لتصلب في درجة حرارة الغرفة. مخزن تغطي لوحة أجار في الثلاجة لاستخدامها في المستقبل خلال تشريح الدماغ من الأنسجة.
- باستمرار فقاعة الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (أسف) مع 95٪ O 2 و 5٪ كو 2 (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4 والأسمولية: 295-310 مم / L).
- تنظيف منطقة العمل و فيبراتوم مع 70٪ إتوه وشطف شفرة بالماء المقطر.
- وضع وسادة امتصاص السوائل نظيفة على منطقة العمل مع أدوات تشريح المناسبة.
- خذ لوحة أجار من الثلاجة، وقطع مكعب أجار صغير (10 مم × 10 مم × 8 مم). الغراء كتلة أجار إلى مرحلة غرفة فيبراتوم-تشريح باستخدام سوبيرجلو المتاحة تجاريا.
8. عزل الدجاج السمعي الدماغ
- فتح البيض في موقع نافذة مسجلة. ثقب كيس الغشاء مع مشرط وإزالة رأس الجنين الدجاج.
- قطع رأس الدجاج مع مقص حاد.
- وضع شفرة شفرة حلاقة قليلا الخلفي للعيون. شق من خلال الجمجمة في خط الوسط منقاري إلى الذيلية. تطبيق ضغط طفيف اعتمادا على عمر الجنين. الأجنة القديمة تتطلب المزيد من الضغط.
- دفع بلطف الجلد جانبا والريش لفضح الجمجمة والتحقق من خط الوسط قطع.
- تطبيق sضغط ترونغ، شريحة جزء منقاري من الجمجمة مع شفرة حلاقة. على الفور مكان شفرة الخلفي للعيون وقطع من خلال كامل الجمجمة وأنسجة المخ.
- جعل الشقوق خط الوسط إلى الجانبي مع مقص في منطقة الذيلية الجمجمة، الأمامي قليلا إلى عضلات الرقبة على جانبي الرأس.عرض الدماغ والمخيخ عن طريق سحب الجمجمة بعيدا والأنسجة الزائدة.
- قطع الأنسجة تعلق على الدماغ مع مقص وإزالة الدماغ، الذي ينفصل بحرية من الجمجمة.
9. إعداد شرائح الدماغ لفي فيفو الكهربية أو التصوير
- دبوس أسفل الدماغ من خلال تيكتا البصرية.
- إزالة المخيخ عن طريق قطع الدوالي مع مقص، وفضح أرضية البطين الرابع.
- باستخدام ملاقط، وإزالة أي الأنسجة الغشائية والأوعية الدموية من سطح الدماغ.
- لمنع الدماغ، وجعل قطع أفقي في نهاية معظم منقاري من الطابق الأربعةالبطين ث، الذيلية فقط إلى القشرة. جعل التخفيضات الجانبية عمودي من خلال تيكتا البصرية لعزل الدماغ.
- وضع كمية صغيرة من الغراء عظمى على مرحلة فيبراتوم مباشرة أمام كتلة أجار.
- رفع الدماغ في الحبل الشوكي باستخدام ملاقط ووضعه على الغراء السوبر مع الجانب منقاري إلى أسفل والجانب الظهري نحو شفرة فيبراتوم. إزالة الغراء الزائد مع الأنسجة المختبر أو ورقة الترشيح.
- صب أكسف أكسجين في مرحلة فيبراتوم. تعيين شفرة فيبراتوم في زاوية 20-22 درجة. بدء فيبراتوم في أقصى السعة التذبذب. نقل المرحلة تصل نحو شفرة حتى الجزء العلوي من الأنسجة موازية مع شفرة.
- نقل بسرعة شفرة نحو أنسجة الدماغ. إبطاء النصل إلى حد كبير قبل اتصال النصل مع الأنسجة.
- شريحة الأنسجة مع أبطأ سرعة إلى الأمام ممكن. مرة واحدة شفرة هو من خلال قسم الأنسجة الاكليلية بأكمله، وإزالة بلطف شريحة باستخدام ماصة نقل. </ لى>
- خفض المرحلة 200-300 ميكرون وشريحة مرة أخرى. كرر حتى تصبح المعالم التشريحية للنوى السمعية مرئية، على سبيل المثال، المنطقة العصبية الظهري / البطني متميزة من نل وموقع الإنسي من نم نسبة إلى نل.
- الحفاظ بعناية شرائح في أكفس. ويمكن القيام بذلك في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) أو بالقرب من الظروف الفسيولوجية (~ 41 درجة مئوية) باستخدام حمام ماء دافئ. لاحظ ترتيب تشريح. الشريحة الأولى تتوافق مع المنطقة الأكثر الذيلية من الأنسجة والشريحة الأخيرة يتوافق مع المنطقة الأكثر منقاري. وهذا يمثل تقريبا تنظيم تونوتوبيك من الدماغ السمعي، من المناطق المنخفضة إلى عالية التردد ترميز، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتبين لنا هنا في تصاريح إليكتروبوراتيون البيضة التعبير الجيني في نظام بيولوجي النامية عادة. يتم حقن الجينات المرمزة البلازميد عن طريق الحقن في الأنبوب العصبي المغطي R5 / R6. ويرد مثال التخطيطي للمواضع القطب وماصة بالنسبة إلى علامات التشريحية الهامة في الشكل 1A . يتم تأكيد الموقع الصحيح للحقن البلازميد 24 ساعة بعد إليكتروبوراتيون ويظهر في الشكل 1B . حقن المستهدفة من البلازميدات في الأنبوب العصبي المغطي R5 / R6 يسمح التعبير في مناطق محددة الدماغية السمعية، وهي نم و نل (11) . ويبين الشكل 1C شريحة المختبر في المختبر من الجنين E12 تحت تباين التدخل النقيض (ديك) الإضاءة. وترد المناطق السمعية ذات الاهتمام. مع إضاءة الفلورسنت ( الشكل 1C 1 )، يف التعبير عن الخلايا العصبية داخل NM و نل مرئية. ويبين الشكل 1D إضاءة ديك لجنين E18 تحت التكبير عالية. والهيئات الخلية أديندريتيك الكلاسيكية من العديد من الخلايا العصبية نانومتر واضحة. مع إضاءة الفلورسنت ( الشكل 1D 1 )، وهو يعبر عن العصب العصبي المتعدد نانومتر واضح للعيان في حين أن الخلايا العصبية الأخرى ترانزفكتد هي من المستوى البؤري. لأن فقط جزء صغير من الخلايا العصبية في المنطقة المستهدفة نيم ترانزفكتد، فإنه يسمح الخلايا العصبية الأخرى داخل نفس النواة لتكون بمثابة الضوابط الداخلية خلال المزدوجة المشبك التصحيح الكهربية التجارب. الجينات المحورة يمكن أيضا أن تنظم مؤقتا من قبل تطبيق المخدرات، مما يتيح التعبير الجيني والتلاعب في فترات زمنية تنموية دقيقة 8 .
الشكل 1: في أوفو إليكتروبوراتيون في الدجاج الاتحاد الافريقيديتوري برينستم. ( A ) تخطيطي من إليكتروبوراتيون في الدماغ المؤخر من المرحلة س 12 الأجنة الدجاج. يتم تعبئة ماصة الحقن مع الحمض النووي البلازميد وصبغ أخضر سريع لتصور هيندبراين حقن (رومبوميريز 5/6 [R5 / R6]). في هذه الدراسة، وهو البلازميد الذي كوكسبرسد الجينات من الفائدة، ويستخدم البروتين البروتين الأصفر الفلورسنت (يف). وتحضن الأجنة إليكتروبوراتد حتى يتم التوصل إلى مرحلة التنموية المطلوب. ( B ) الجنينية (E) يوم 4 الدجاج الجنين تظهر موقع إف التعبير عن العين اليسرى (السهم، E) واليسار أوتوسيست (السهم، O). خط أبيض متقطع يمثل الدماغ الظهري والحدود الدماغ. شريط مقياس = 480 ميكرون. ( C و C 1 ) شريحة الدماغ (300 ميكرون سميكة) من الدجاج E12 تحت تباين التدخل النقيض (ديك، C ) والفلورسنت (يف، C 1 ) إضاءة ن. الخطوط البيضاء المتقطعة تمثل حدود النواة المغنطيسية (نم) والنواة اللامية (نل). ملاحظة، شريحة الدماغ يظهر جانب واحد فقط من الأنسجة. السهام البيضاء في يمثل شق خط الوسط من شريحة الدماغ. الأسهم البيضاء تظهر يف التعبير عن مناطق نم و نل. V = بطني، M = وسطي. شريط مقياس = 240 ميكرون. ( D و D 1 ) التكبير عالية (80X غمر الماء الهدف) من E18 الدجاج الجنين شريحة الدماغ تحتوي على نم. الهيئات خلية أديندريتيك الكلاسيكية 15 مرئية بوضوح تحت إضاءة ديك (السهم التصاعدي، D ). مع إضاءة الفلورسنت لنفس الشريحة، والخلايا العصبية نم ترانزفكتد التي حددها مضان يف واضحة للعيان (السهم التصاعدي، D 1 ). أستريسكس = يف التعبير عن الخلايا العصبية نم فقط تحت الطائرة البؤرية. شريط مقياس = 30 ميكرون.large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في إليكتروبوراتيون البيضة هو وسيلة للتعبير عن أو طرق أسفل الجينات ذات الاهتمام من أجل تحليل في الجسم الحي وظيفة الجينات 8 ، 9 . في جنين الدجاج، بل هو طريقة مبتكرة للتعبير عن الجينات ترميز البلازميد في مختلف مناطق الدماغ السمعية 8 . لضمان التعبير الأمثل، هناك حاجة إلى عدة خطوات حاسمة. أولا، حقن الأجنة فقط الذين أوتوسيستس واضحة للعيان. إذا أوتوسيستس غير مرئية الجنين ليس في مرحلة التطور الصحيح لل إليكتروبوراتيون. ثانيا، نصائح ماصة أصغر تجعل من السهل اختراق الأنبوب العصبي والنتائج في تلف الأنسجة أقل. ومع ذلك، ينبغي أن يكون طرف مكسورة كبيرة بما فيه الكفاية لطرد الحمض النووي. ثالثا، ملء كامل منطقة الأنبوب العصبي المغطي R5 / R6 مع الحمض النووي (كما تصوره انتشار الحل الأخضر السريع). وأخيرا، وضع القطب مشجعا أقرب إلى الجنين ممكن هو إمبortant. ومع ذلك، تأكد من تجنب الاتصال المباشر مع الجنين، والنبضات الحالية يمكن أن يحرق وتلف الأنسجة.
التعديلات على هذه التقنية يمكن أن تساعد على تحسين بقاء الأجنة والتعبير عن البلازميدات. أولا، من المهم تعيين البيض في غضون 24 ساعة من الوصول للحفاظ على بقاء عالية. ثانيا، يجب أن تكون نافذة البيضة مغلقة بإحكام مع الشريط كما فقدان السوائل ( أي الجفاف) من خلال ختم غير كافية يزيد من وفاة الجنين. ثالثا، لتحسين التصور من أوتوسيست، حقن الحبر الهندي من الجانب منقاري من الجنين، وذلك باستخدام أصغر كمية من الحبر ممكن. وأخيرا، يمكن نقل أقطاب تحفيز قليلا بين المناطق R5 / R6 لنشر منطقة مشحونة كهربائيا دون زيادة القوة الحالية.
وعلى الرغم من الاقتراحات الواردة أعلاه، تجدر الإشارة إلى وجود قيود. وتشمل هذه معدلات متغيرة من الخلايا العصبية ترانزفكتد، موقعها داخل شريحة الدماغ، وبقاء الجنين. على الرغم من كفاءة ترنسفكأيشن يختلف بين الأجنة، ذكرنا سابقا مع المعلمة إليكتروبوراتيون وصفها هنا ~ 5-10٪ من الخلايا العصبية نم / نل هي ترانزفكتد باستمرار 8 . حتى في معدلات أعلى من ترنسفكأيشن العصبية، وإعداد نسيج الدماغ لفي المختبر التصحيح المشبك الكهربية يطرح تحديات. على سبيل المثال، شرائح الدماغ هي بين 200-300 ميكرون سميكة وأحيانا، والخلايا العصبية ترانزفكتد عميقة جدا داخل الأنسجة لتصحيح بشكل كاف وإجراء فحوصات وظيفية. وأخيرا، البقاء على قيد الحياة الجنين بعد إليكتروبوراتيون ناجحة هو أيضا متغير، وإن لم يكن بقدر معدل ترنسفكأيشن. اعتمادا على عمر الجنين المطلوب للاستخدام التجريبي، يمكن أن تقلب البقاء على قيد الحياة الغضب بين 80-20٪، وهذا الأخير الذي يتوافق مع أقدم الأجنة (> E18).
أهمية في إليكتروبوراتيون البيضة في الدجاج مفيد على أنظمة نموذج الثدييات لعدة r المواسم 16 . أولا، فمن غير مكلفة نسبيا وبديل ممتاز للحيوانات المعدلة وراثيا أو ضربة قاضية. ثانيا، أسهم الدجاج نواة مماثلة مع الثدييات التي تعالج المعلومات الزمنية للصوت في الخلوية، متشابك، ومستوى الشبكة العصبية 17 . مثال على وظيفة السمعية مماثلة يحدث بين أفن / مسو في الثدييات و نم / نل من الدجاج، مماثلة الهياكل الدماغية السمعية، على التوالي 4 ، 5 . ومع ذلك، على عكس نماذج البحث الثدييات عالية السمع التقليدية، مثل الفئران والفئران، والدجاج الاستفادة من الإشارات التي يوفرها كل من إشارات منخفضة وعالية التردد لتشفير المعلومات السمعية 18 . وأخيرا، الدجاج هي الحيوانات السمعية السابقة. أي أن نظامهم السمعي يقترب من النضج الوظيفي عند الولادة ويحدث ظهور وصقل السمع خلال المراحل الجنينية دون التأثيرات البيئية> 19 ، 20 . في المقابل، فإن بداية السمع لنماذج البحوث الثدييات نموذجية تبدأ 10-13 يوما بعد الولادة 21 ، 23 .
بالتزامن مع المقايسات البيوكيميائية، الدوائية، والوظيفية، في التلاعب الوراثية البيضا توفر نهجا مبتكرا لدراسة التنمية العصبية محددة من التخصصات التشريحية والفسيولوجية، مما يتيح السيطرة على فترات زمنية محددة جيدا في تطوير الدماغ السمعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر درس. ليزلان شيكتيرسون، يوان وانغ، أندريس بريا والسيدة زيمينا أوبتيز-أرايا للمساعدة الأولية في إعداد البروتوكول وتوفير البلازميدات. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيدسد منحة DC013841 (جتس).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
