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Developmental Biology

चिकन श्रवण ब्रेनस्टम में ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55628
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

एवियन्स और स्तनधारियों के श्रवण तंत्रिकाय तंत्रों को तेजी से तंत्रिका एन्कोडिंग के लिए विशेष है, सामान्य सुनवाई कार्य के लिए एक मौलिक प्रक्रिया। ये न्यूरॉन्स भ्रूणीय अवरांति के अलग-अलग अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं। हम श्रवण विकास के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए चिकन भ्रूण के अंतराल में जीन को व्यक्त करने के लिए इलेक्ट्रोपार्य का उपयोग करने वाली तकनीकें पेश करते हैं।

Abstract

इलेक्ट्रोपोरेशन एक ऐसा तरीका है जो चिकन भ्रूण जैसे जैविक रूप से प्रासंगिक जीवों में रुचि के जीन का परिचय देता है। यह लंबे समय से स्थापित है कि श्रवण प्रणाली के विकास के मूलभूत जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए चिकन भ्रूण एक प्रभावी शोध मॉडल है। हाल ही में, चिकन भ्रूण सुनवाई के साथ जुड़े जीन अभिव्यक्ति, विनियमन और समारोह का अध्ययन करने में विशेष रूप से मूल्यवान बन गया है। ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में अत्यधिक विशेष श्रवण कार्यों के लिए जिम्मेदार श्रवण ब्रेनस्टामी क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन क्षेत्रों में चिकन न्यूक्लियस मैन्गोसेल्यूलरिस (एनएम) और न्यूक्लियस लामिनारिस (एनएल) शामिल हैं। एनएम और एनएल न्यूरॉन्स rhombomeres 5 और 6 (आर 5 / आर 6) के अलग-अलग अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं। यहां, हम इन क्षेत्रों में जीन-संबंधित गुणों का अध्ययन करने के लिए प्लाज्मिड-एन्कोडेड जीन के ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में मौजूद हैं । हम आनुवंशिक अभिव्यक्ति के स्थानिक और अस्थायी नियंत्रण के लिए एक विधि दिखाते हैं जो कार्यात्मक फेनोटाइप के लाभ या हानि को बढ़ावा देते हैंतों। आर 5 / आर 6 से जुड़े श्रवण तंत्रिका पूर्वजों के क्षेत्रों को लक्षित करके, हम एनएम और एनएल में प्लाज्मिड अभिकर्मक दिखाते हैं। जीन अभिव्यक्ति का स्थाई नियम एक टीटी-ऑन वेक्टर सिस्टम को अपनाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। यह एक दवा अप्रभावी प्रक्रिया है जो डॉक्सिस्किलाइन (डॉक्स) की उपस्थिति में रुचि के जीनों को व्यक्त करती है। ओवो इलेक्ट्रोपायर तकनीक में - जैव रासायनिक, औषधीय, या विवो कार्यात्मक assays के साथ-साथ श्रवण न्यूरॉन विकास और संबंधित रोगप्राप्ति संबंधी घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

सामान्य श्रवण कार्यों के लिए ध्वनि की तीव्र तंत्रिका एन्कोडिंग आवश्यक है इसमें ध्वनि लोकिकीकरण क्षमता 1 , शोर भेदभाव 2 में भाषण, और अन्य व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक संचार संकेतों की समझ 3 शामिल है । दोनों एवियन और स्तनधारियों के श्रवण ब्रेनस्ट्रेशन में स्थित एनालॉगस न्यूरॉन्स अत्यधिक न्यूरल एन्कोडिंग 4 के लिए बेहद विशिष्ट हैं। इनमें चिकन न्यूक्लियस मैन्गोसेल्यूलरिस (एनएम), न्यूक्लियस लामिनारिस (एनएल) और उनके स्तनधारी एनालॉग, एंट्रोवेंट्रल कोक्लियर नाभिक (एवीसीएन) और औसत दर्जे का बेहतर जैतून (एमएसओ) क्रमशः 5 शामिल हैं । हालांकि, तेजी से तंत्रिका एन्कोडिंग को विनियमित करने के विकास संबंधी तंत्र श्रवण ब्रेनस्टाम में बहुत कम समझ में आते हैं। इसलिए, यह विशिष्ट जीनों का अध्ययन करना फायदेमंद होता है जो तेजी से तंत्रिका एन्कोडिंग के लिए जिम्मेदार हैं ताकि उनकी अभिव्यक्ति, विनियमन और एयू में कार्य बेहतर ढंग से समझ सकें।Ditory विकास

विकासशील चिकन भ्रूण श्रवण प्रणाली के विकास के बुनियादी जैविक सवालों के अध्ययन के लिए एक प्रभावी और अच्छी तरह से स्थापित अनुसंधान उपकरण है 6 , 7 विवो जीन समारोह 8 , 9 में विश्लेषण करने के लिए हाल ही में आणविक अग्रिमों ने विकासशील चिकन भ्रूण में इन जैविक सवालों को संबोधित किया है या रुचि के जीनों को खटखटाया है। विशिष्ट जीनों की विनियामक भूमिका की जांच करना श्रवण घाटे से जुड़ा विद्वानों को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति है। यहां, हम चिकन-एन्कोडेड जीनों के ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन में चिकन श्रवण ब्रेनस्टैंड में पेश करते हैं जहां ध्वनि की तीव्र तंत्रिका एन्कोडिंग 10 होती है। Rhombomeres 5 और 6 11 , 12 (आर 5/5 के साथ जुड़े श्रवण तंत्रिका पूर्वज क्षेत्रों को लक्षित करके ,आर 6), हम एनएम और एनएल में प्लाज्मिड अभिकर्मक के स्थानिक नियंत्रण दिखाते हैं। इसके अलावा, हम एक टीट-ऑन वेक्टर सिस्टम अपनाने के द्वारा अभिव्यक्ति का अस्थायी विनियमन दिखाते हैं। यह एक दवा अप्रभावी प्रक्रिया है जो डॉक्सिस्कीलाइन (डॉक्स) 8 की उपस्थिति में रुचि के जीनों को व्यक्त करता है

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ दिशानिर्देशों के अनुसार देखभाल और उपयोगशाला प्रयोगशाला जानवरों के अनुसार किया जाता है।

1. अंडा हैंडलिंग

  1. स्थानीय विक्रेता से निषेचित अंडे खरीदें। ऊष्मायन से पहले 5 दिनों से अधिक समय तक एक रेफ्रिजरेटर में अंडे 13 डिग्री सेल्सियस स्टोर करें। भ्रूण की व्यवहार्यता 1 सप्ताह के बाद काफी कम हो जाती है।
  2. इनक्यूबेटर में सेट करने से पहले प्रत्येक अंडे को 70% इथेनॉल के साथ मिलाएं।
  3. तापमान के साथ एक इनक्यूबेटर में अपने पक्षों पर 1-2 दर्जन (अंड) अंडे सेट करें ~ 50% नमी में तापमान 38 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। यह क्रमशः electroporation और इष्टतम व्यवहार्यता के लिए उचित भ्रूण स्थिति सुनिश्चित करता है।
    नोट: 48-52 एच ऊष्मायन के बाद, अंडे हैम्बर्गर-हैमिल्टन (एचएच) चरण ~ 12-13 और इलेक्ट्रोपायर के लिए तैयार हो जाएगा।

2. तैयारी

  1. प्लाज्मिड एमआईजिंग
    1. डीएनए मिश्रण के हर 7 μL के लिए 1 μL 0.1% तेज हरा (18% डीओनाइज्ड और डिस्टिल्ड एच 2 ओ [डीडीएच 2 ओ] में 0.1%) जोड़ें।
    2. कई प्लास्मिड के सह-इलेक्ट्रोपायरिंग के लिए, 1: 1 अनुपात में प्लाज्मिड मिश्रण करें। अंतिम डीएनए एकाग्रता 5-8 μg / μL होना चाहिए।
  2. इंजेक्शन पिपेट भरें
    1. माइक्रोप्रिपेट खींचने पर पिपेट खींचें। एक 28 जी सिरिंज सुई का उपयोग करके 1-2 μL प्लास्मिड के साथ विंदुक भरें।
    2. तोड़ विंदुक टिप 10-20 संदंश का उपयोग कर माइक्रोन। टूटी विंदुक टिप के आकार का निर्धारण करने में सहायता के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। पििकोप्रप्रेटर के पिपेट धारक को विंदुक संलग्न करें।

3. वायुमंडल

नोट: विंडोिंग प्रक्रिया 13 से पहले प्रकाशित की गई है। कृपया अतिरिक्त दृश्य सूचना के संदर्भ 13 देखें।

  1. 70% के साथ सभी उपकरणों और कार्य क्षेत्र को मिटा देंइथेनॉल।
  2. इनक्यूबेटर (6-10 के बीच) के बाहर निर्धारित अंडों की संख्या ले लो, कमरे के तापमान पर छोड़ दें, और 70% इथेनॉल के साथ व्यक्तिगत रूप से स्वाब अंडे खोलें। इनक्यूबेटर हटाने के बाद अंडे कम से कम 2 घंटे के लिए व्यवहार्य रहे।
  3. भ्रूण की स्थिति की पहचान करने के लिए एक प्रकाश प्रकाश के शीर्ष पर अंडे रखें। एक पेंसिल के साथ अंधेरे क्षेत्र ( यानी भ्रूण) का केंद्र मंडल करें
  4. 1 9 जी सुई का प्रयोग करना, अंडा के कुंद अंत में एक छेद प्रहार करना
  5. अंडा के बिंदु पर खींची गई सर्कल के पास एक और छेद लगाओ 1 9जी सुई के साथ बाहरी अंडरशेल्ड (लगभग 16 मिमी 2 ) का एक छोटा टुकड़ा निकालें और फिर संदंश के साथ आंतरिक आंखे (लगभग 8 मिमी 2 ) का एक छोटा सा टुकड़ा निकाल दें।
  6. 1 9 जी सुई के साथ लगाए गए एक 3 एमएल सिरिंज के साथ अंडा से 1.5-2.5 मिलीलीटर एल्बुमिन वापस खांसी के अंत छेद के माध्यम से हटा दें। सुनिश्चित करें कि सुई के नीचे कोण 45 डिग्री हो जाए
  7. टेप का एक छोटा सा टुकड़ा (1 सेमी x 1 सेमी) के साथ कुंद-अंत छेद को कवर करें आरेखित चक्र को कवर करेंटेप के साथ दूसरा छेद (2.5 सेमी x 4 सेमी)
  8. घुमावदार कैंची (बढ़त = 2.5 सेंटीमीटर) के साथ, सर्कल के अंदर एक विंडो काट कर। कैंची को अंडेशेल के समांतर होना चाहिए और खिड़की के व्यास 2 सेमी से कम होना चाहिए।

4. प्लाज्मिड इंजेक्शन

  1. पिकोसप्रित्र को चालू करें 18 psi और 5 μs की अवधि के लिए दबाव सेट। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के लिए वायु टैंक और दीपक चालू करें।
  2. स्टरिल फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में मिश्रित दुकान से खरीदे गए भारतीय स्याही के 1:10 कमजोर पड़ने के 30 एमएल स्टॉक समाधान करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें चिकन भ्रूण के बेहतर दृश्य प्राप्त करने के लिए भारतीय स्याही का इंजेक्शन एक महत्वपूर्ण कदम है।
    1. पतला भारतीय स्याही समाधान के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें। एक 27 जी सुई संलग्न करें और सिरिंज में मौजूद बुलबुले को निकालें।
    2. भ्रूण के नीचे जर्दी झिल्ली के नीचे सुई डालें - 2 - 3 मिमी और भ्रूण के नीचे धीरे-धीरे भारतीय स्याही का 0.2 एमएल इंजेक्षन करें। करभारतीय स्याही की 0.5 मिलीलीटर से अधिक इंजेक्शन न करें क्योंकि इससे भ्रूण के अस्तित्व में कमी आ सकती है।
  3. विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के तहत अंडा धारक पर खिड़की वाले अंडे को रखें। प्लाज्मिड इंजेक्शन साइट के सर्वश्रेष्ठ दृश्य के लिए उच्चतम आवर्धन का उपयोग करें।
  4. संदंश का प्रयोग, इंजेक्शन क्षेत्र पर झिल्ली को हटा दें। ब्मौज़ ( यानी , एनएम और एनएल) के श्रवण ब्रेनस्टाइन क्षेत्र, रामोमोरे 5 और 6 (आर 5 / आर 6) से उत्पन्न होते हैं। आर 5 / आर 6 ऑटॉस्टिस्ट के निकट स्थित हैं (रीढ़ / आर 6 प्लाज्मिड इंजेक्शन के लिए मील का पत्थर के रूप में काम करने वाले भीतरी कानों में विकसित रीढ़ों में भ्रूण संरचना)।
  5. डीएनए से भरी हुई विंदुक को आर 5 / आर 6 क्षेत्र में स्थित न्यूरल ट्यूब में और माइक्रोमैनिपुलेटर का इस्तेमाल करते हुए ओटोसिस्ट के बीच। आदर्श स्थान का एक योजनाबद्ध चित्र 1 ए में दिखाया गया है
  6. न्यूरल ट्यूब में डीएनए को निकालने के लिए पिकासोप्रित्र से हवा का दबाव (18 साई, 5 μ की अवधि) लागू करें।

5. विद्युतचरण

  1. टी चालू करेंवह वर्तमान / वोल्टेज उत्तेजक औधधि
  2. पीबीएस के साथ एक 3 एमएल सिरिंज भरें और सिरिंज फ़िल्टर संलग्न करें। भ्रूण पर पीबीएस के 1-2 बूंदें जोड़ें।
  3. इंजेक्शन साइट (औसत दर्जे) के ऊपर नकारात्मक इलेक्ट्रोड और R5 / R6 ( चित्रा 1 ए ) के पार्श्व में सकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ micromanipulator का उपयोग करके भ्रूण को द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड को कम करें। भ्रूण के साथ सीधे संपर्क से बचें द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड का उपयोग करें जहां इलेक्ट्रोड सामग्री प्लैटिनम इरिडियम है। संदंश के साथ 0.5 मिमी के लिए युक्तियों के बीच अंतर को समायोजित करें।
  4. वर्तमान / वोल्टेज उत्तेजना का प्रयोग करके, 50 सेकंड्स के लिए 1 वी के अंतराल पर 20 बार पल्स।
  5. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, पीबीएस की एक बूंद को उजागर क्षेत्र में जोड़ें। धीरे से इलेक्ट्रोड निकाल दें और इसे प्रयोगशाला के ऊतकों और 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ करें। टेप के साथ भ्रूण को उजागर करने वाली विंडो बंद करें
  6. इंजेक्टेड प्लाज्मिड प्रकार और हैच की तारीख के साथ अंडरहेल लेबल करें
  7. अंडे को वापस खिड़की की तरफ के साथ इनक्यूबेटर में रखें। 50 डिग्री सेल्सियस के साथ 38 डिग्री सेल्सियस सेते हैं% अपेक्षित विकास चरण तक आर्द्रता पर पहुंच जाता है।
  8. यदि एक टेट-ऑन वेक्टर जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी नियंत्रण के लिए electroporated है, डीएक्सिस्कीलाइन (Dox) हर 24 घंटे जीन अभिव्यक्ति (धारा 6 देखें) को लागू करने के लिए लागू होते हैं।

6. जीन अभिव्यक्ति के टेम्पोरल नियंत्रण के लिए टेट-ऑन सिस्टम

  1. निम्नलिखित प्लास्मिड का प्रयोग करें:
    पीसीएजीजीएस-टी 2 टीपी: प्लाज्मिड व्यक्त ट्रांसपोसेज
    पीटी 2 के-सीएजीजीएस-आरटीटीए-एम 2: एक प्लास्मिड जो स्पष्ट रूप से डॉएक्स बाध्यकारी प्रोटीन को व्यक्त करता है।
    पीटी 2 के-बीआई-टीआरई-ईजीएफपी: एक प्लाज्मिड जिसमें द्विदिश टेट-ऑन प्रमोटर (टीआरई) शामिल हैं- ईजीएफपी रिपोर्टर की अभिव्यक्ति और ब्याज की दूसरी जीन।
    नोट: उपरोक्त तीन प्लास्मिड को 1: 1: 1 अनुपात में सह-इलेक्ट्रोफ़ोरेटेड होने की आवश्यकता है।
  2. शेयर समाधान की तैयारी:
    1. 1 एमजी / एमएल स्टॉक समाधान का उत्पादन करने के लिए बाँझ पीबीएस में डॉक्स को भंग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  3. डॉक्स आवेदन:
    1. एक्सप्रेसओ को प्रेरित करने के लिएकुछ विकासात्मक चरणों के दौरान रुचि के जीन के एन, हर 24 घंटे में दोओक्स लागू करें।
    2. डोक्स लगाने पर, अंडे निकालें, खिड़की को खोलें, 50 μL डोक्स को कोरियॉआएलोइनोचिक झिल्ली पर, खिड़की को बंद करें और अंडे को वापस इनक्यूबेटर में डाल दें।

7. ब्रेनस्टम स्लाइस के लिए विच्छेदन क्षेत्र की तैयारी

नोट: निम्न अनुभाग (7 - 9) और प्रक्रिया 14 से पहले प्रकाशित किए गए हैं। कृपया अतिरिक्त दृश्य जानकारी के लिए इन संदर्भों को देखें।

  1. एक एगर का समाधान तैयार करें (40 एमजी / एमएल एगरोज़, यानी 4% डीडीएच 2 ओ में)। एक पेट्री डिश में अगर समाधान डालो और इसे कमरे के तापमान पर जमने के लिए अनुमति दें। टिशू के मस्तिष्क स्लिमिंग के दौरान भावी प्रयोग के लिए रेफ्रिजरेटर में आगर की थाली को स्टोर करें।
  2. 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 (पीएच 7.2-7.4 और ओएसएमएलआरिटी: 295-310 एमओएसएम / एल) के साथ बुलबुला कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी में द्रव (एसीएसएफ) लगातार बुलबुला।
  3. 70% EtOH के साथ कार्य क्षेत्र और कंपन को साफ करें और आसुत जल के साथ ब्लेड कुल्ला।
  4. उचित विदारक उपकरण के साथ कार्य क्षेत्र पर एक साफ द्रव अवशोषण पैड रखें।
  5. अगर प्लेट को रेफ्रिजरेटर से बाहर निकालना, एक छोटा सा कगार (10 मिमी x 10 मिमी x 8 मिमी) काट लें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुपरगलू का उपयोग करते हुए एक vibratome-slicing चैंबर के स्तर पर अगर ब्लॉक गोंद।

8. चिकन श्रवण मंडल का अलगाव

  1. टेप विंडो साइट पर अंडे खोलें एक स्केलपेल के साथ झिल्ली थैली को छिद्र करें और चिकन भ्रूण के सिर को हटा दें।
  2. तेज कैंची के साथ चिकन काढ़ा।
  3. आँखों से थोड़ी सी रेजर ब्लेड टिप रखें खोपड़ी के माध्यम से उभयलिंगी से पूंछी मिडलाइन पर छिपाना भ्रूण की उम्र के आधार पर मामूली दबाव लागू करें। पुराने भ्रूणों को अधिक दबाव की आवश्यकता होती है।
  4. धीरे-धीरे खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा और पंखों को हटा दें और मिडलाइन कट को सत्यापित करें।
  5. एस लागूTrong दबाव, एक रेज़र ब्लेड के साथ खोपड़ी के उभयलिंगी भाग टुकड़ा। तुरंत ब्लेड को आंखों से पीछे रखें और पूरी खोपड़ी और मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से काट लें।
  6. खोपड़ी के दक्षिणी क्षेत्र में कैंची के साथ मिडलाइन-टू-लेडील चीरों बनाएं, सिर के दोनों किनारों पर गर्दन की मांसपेशियों के लिए थोड़ा पीछे की ओर रखें। खोपड़ी और अतिरिक्त ऊतक को खींचकर मस्तिष्क और सेरेबेलम का खुलासा करें।
  7. कैंची के साथ मस्तिष्क तंत्र से जुड़ी ऊतक को काट लें और ब्रेनडिस्ट को हटा दें, जो खोपड़ी से आज़ादी से अलग है।

9. विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या इमेजिंग में मस्तिष्क के स्लाइस की तैयारी

  1. ऑप्टिक टेक्टा के माध्यम से मस्तिष्क को पिन करें
  2. कैंची के साथ पेडुंक्सेस काटने से सेर्नलमैन निकालें, चौथे वेंट्रिकल के फर्श को उजागर करें।
  3. चिमटी का उपयोग, मस्तिष्क की सतह से किसी भी झिल्लीदार ऊतक और रक्त वाहिकाओं को हटा दें।
  4. मस्तिष्क को अवरुद्ध करने के लिए, चारों तल के सबसे उथल-पुथल अंत में एक क्षैतिज कटौती करेंवेंट्रिकल, कॉर्टैक्स को सिर्फ दुम मस्तिष्क को अलग करने के लिए ऑप्टिक टेक्टा के माध्यम से पार्श्व कटौती करें।
  5. अगर ब्लॉक के सामने सीधे vibratome चरण पर एक छोटे से सुपर गोंद रखें।
  6. चिमटी का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी में मस्तिष्क निकालें और इसे थरथराल की तरफ के साथ सुपर गोंद पर रख दें और पृष्ठीय ओर कंपन थैली की ओर रखें। एक प्रयोगशाला ऊतक या फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त गोंद निकालें।
  7. कंपन थैले में ऑक्सीजन युक्त एसीएसएफ डालें। 20-22 डिग्री कोण पर कंपन थैली सेट करें अधिकतम-आयाम दोलन पर vibratome प्रारंभ करें मंच को ब्लेड की ओर ले जाएं ताकि ऊतक के ऊपर ब्लेड के समानांतर हो।
  8. तेजी से मस्तिष्क के ऊतकों की ओर ब्लेड ले जाएं। ऊतक के साथ ब्लेड के संपर्क से काफी पहले ब्लेड को धीमा करें
  9. धीमे संभव आगे की गति के साथ स्लाइस ऊतक एक बार ब्लेड संपूर्ण राज्याभिषेक ऊतक खंड के माध्यम से होता है, एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करके धीरे-धीरे टुकड़े हटा दें/ Li>
  10. चरण 200-300 माइक्रोन कम करें और फिर से टुकड़ा। श्रवण नाभिक के रचनात्मक स्थलों को दिखाई देने से दोहराएं, जैसे, एनएल के अलग-अलग पृष्ठीय / उदर-न्यूरोपिल क्षेत्र और एनएल के मध्य एनआई के मध्यस्थ स्थान।
  11. एसीएफएस में स्लाइस को ध्यानपूर्वक बनाए रखें। यह कमरे के तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) या शारीरिक परिस्थितियों (~ 41 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म पानी के स्नान का उपयोग कर किया जा सकता है। टुकड़ा करने की क्रिया का क्रम नोट करें पहला टुकड़ा ऊतक के सबसे लहरातीय क्षेत्र से मेल खाता है और आखिरी टुकड़ा सबसे उथलपुथल क्षेत्र से मेल खाती है। यह मोटे तौर पर श्रवण ब्रेनस्टोन के टोनटोपिक संगठन का प्रतिनिधित्व करता है, जो निम्न क्रम से उच्च आवृत्ति एन्कोडिंग क्षेत्रों में क्रमशः है।

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Representative Results

हम यहां दिखाते हैं कि ओवो इलेक्ट्रोपायर में सामान्य रूप से विकसित जैविक प्रणाली में जीन की अभिव्यक्ति परमिट होता है। प्लाज्मिड-एन्कोडेड जीन को न्यूरल ट्यूब ओवरलीइंग आर 5 / आर 6 में फोकली इंजेक्ट किया जाता है महत्वपूर्ण रचनात्मक मार्करों के सापेक्ष इलेक्ट्रोड और विंदुक प्लेसमेंट का एक योजनाबद्ध उदाहरण चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। प्लाज्मिड इंजेक्शन का सही स्थान इलेक्ट्रोपायर के बाद 24 घंटे की पुष्टि है और चित्रा 1 बी में दिखाया गया है। एनआर और एनएल (11) नामक विशिष्ट श्रवण ब्रेनस्टामी क्षेत्रों में अभिव्यक्ति पर R5 / R6 पर निर्भर न्यूरल ट्यूब में प्लास्मिड का लक्षित इंजेक्शन। चित्रा 1 सी विभेदकारी हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) रोशनी के तहत एक ई 12 भ्रूण से इन विट्रो ब्रेनडिस्ट स्लाइस को दर्शाता है। ब्याज के श्रवण क्षेत्रों को रेखांकित किया जाता है। फ्लोरोसेंट रोशनी ( चित्रा 1 सी 1 ) के साथ, YFP एन के भीतर न्यूरॉन्स को व्यक्त करते हैंएम और एनएल दिखाई दे रहे हैं। चित्रा 1D उच्च बढ़ाई के तहत एक E18 भ्रूण के लिए डीआईसी रोशनी से पता चलता है। कई एनएम न्यूरॉन्स की क्लासिक एडंड्रिटिक सेल निकायों स्पष्ट हैं। फ्लोरोसेंट रोशनी ( चित्रा 1 डी 1 ) के साथ, एक एनएम न्यूरॉन व्यक्त एक वाईएफपी स्पष्ट रूप से दिखाई देता है जबकि अन्य ट्रांसफ़ेक्टेड न्यूरॉन्स फ़ोकल प्लेन से बाहर हैं। चूंकि लक्षित एनएम क्षेत्र में न्यूरॉन्स का केवल एक अंश ट्रांसफ़ेक्ट कर दिया गया है, यह दोहरे पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के दौरान एक ही नाभिक के भीतर अन्य न्यूरॉन्स को आंतरिक नियंत्रण की सुविधा देता है। ट्रांजेन्गेस को नशीली दवाओं के अनुप्रयोग द्वारा अस्थायी तौर पर विनियमित किया जा सकता है, जिससे सटीक विकास काल के 8 दिनों में जीन की अभिव्यक्ति और हेरफेर को सक्षम किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: चिकन औ में ओवो इलेक्ट्रोप्लोरेशन मेंDitory ब्रेनस्टम ( ए ) एचएच चरण 12 चिकन भ्रूण के अंतराल में इलेक्ट्रोपोरेशन के योजनाबद्ध। इंजेक्शन विंदुक इंजेक्शन दिमाग के दृश्य के लिए प्लाज्मिड डीएनए और तेज ग्रीन डाई से भर जाता है (रंबोमरे 5/6 [आर 5 / आर 6]) इस अध्ययन में, एक प्लाज्मिड जो ब्याज की एक जीन और पीले-फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) रिपोर्टर को सहने वाली थी। वांछित विकास के चरण तक पहुंचने तक इलेक्ट्रोप्रोएटेड भ्रूण आगे बढ़े हैं। ( बी ) भ्रूण (ई) दिन 4 चिकन भ्रूण बाएं आंख (तीर, ई) और बाएं ऑटोकिस्ट (तीर, हे) के सापेक्ष YFP अभिव्यक्ति की साइट दिखा रहा है। डैश व्हाइट लाइन पृष्ठीय मस्तिष्क और ब्रेनस्टैंड सीमा को दर्शाती है। स्केल बार = 480 सुक्ष्ममापी ( सी और सी 1 ) अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी, सी ) और फ्लोरोसेंट (YFP, सी 1 ) illuminatio के तहत एक E12 चिकन से मस्तिष्क टुकड़ा (300 सुक्ष्ममापी मोटी) एन। धराशायी सफेद रेखाएं नाभिक मोनोगेक्लोरिस (एनएम) और न्यूक्लियस लामिनारीस (एनएल) की सीमाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। ध्यान दें, मस्तिष्क का टुकड़ा ऊतक के केवल एक तरफ दिखाता है। मस्तिष्क टुकड़ा के मध्य रेखा के फांक में सफेद तीर के किनारे का प्रतिनिधित्व करता है। सफेद तीर एनएम और एनएल के वाईएफपी एक्सप्रेस क्षेत्र दिखाते हैं। वी = उदर, एम = औसत दर्जे का स्केल बार = 240 माइक्रोन ( डी और डी 1 ) एनएम वाले ई 18 चिकन भ्रूण ब्रेनस्टैंड स्लाइस की उच्च बढ़ाई (80 एक्स पानी विसर्जन उद्देश्य) क्लासिक एडंड्रिटिक सेल निकाय 15 डीआईसी रोशनी (ऊपर की ओर तीर, डी ) के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। उसी टुकड़ी के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ, YFP प्रतिदीप्ति द्वारा पहचाना जाने वाला एक ट्रांसफ़ेक्टेड एनएम न्यूरॉन स्पष्ट रूप से दिखाई देता है (ऊपरी तीर, डी 1 )। तारांकन चिह्न = YFP फोकल हवाई जहाज़ के ठीक नीचे एनएम न्यूरॉन्स को व्यक्त करते हैं स्केल बार = 30 माइक्रोनBig.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में विवो जीन फ़ंक्शन 8 , 9 में विश्लेषण करने के लिए ब्याज की जीन को व्यक्त या दबाने की एक विधि है। चिकन भ्रूण में, यह प्लास्मिड-एन्कोडेड जीन को विभिन्न श्रवण ब्रेनमेंस्ट क्षेत्र 8 में व्यक्त करने के लिए एक अभिनव तरीका है। इष्टतम अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए, कई महत्वपूर्ण कदमों की आवश्यकता है। सबसे पहले, केवल भ्रूण पेश करते हैं जिनके ऑटोकिस्ट स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। यदि ऑटोकिस्ट्स दिखाई नहीं दे रहे हैं, तो भ्रूण भ्रूण के लिए सही विकास के चरण में नहीं है। दूसरा, छोटे विंदुक युक्तियाँ तंत्रिका नलिका को घुसना और कम ऊतकों के नुकसान में परिणाम को आसान बनाता है। हालांकि, डीएनए को निष्कासित करने के लिए टूटी हुई टिप काफी बड़ी होनी चाहिए। तीसरा, पूरे न्यूरल ट्यूब क्षेत्र को डीएनए के साथ आर 5 / आर 6 ओवरसाइड भरें (जैसा कि तेज़ हरी समाधान के प्रसार के द्वारा देखा गया है)। अंत में, संभव के रूप में भ्रूण के करीब के रूप में stimulator इलेक्ट्रोड का स्थान छोटा सा भूत हैortant। हालांकि, भ्रूण के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए सुनिश्चित करें, क्योंकि वर्तमान दालों में ऊतक को झटका लग सकता है और नुकसान हो सकता है।

तकनीक में संशोधन भ्रूण की व्यवहार्यता और प्लास्मिड की अभिव्यक्ति में सुधार करने में मदद कर सकता है। सबसे पहले, उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आगमन के 24 घंटे के भीतर अंडे को सेट करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, अंडे की खिड़की टेप के साथ सख्ती से सील होनी चाहिए क्योंकि एक अपर्याप्त सील के कारण तरल पदार्थ ( यानी निर्जलीकरण) के कारण भ्रूण मृत्यु बढ़ जाती है। तीसरा, ऑटोकिस्ट के दृश्य को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, संभवतः जितना स्याही की सबसे छोटी राशि का उपयोग करते हुए भ्रूण के रूरलल ओर से भारतीय स्याही को इंजेक्षन करें। अंत में, विद्युतीय शक्तियों को फैलाने के लिए विद्युत् शक्तियों को फैलाने के लिए इलेक्ट्रोड को उत्तेजित करने के लिए आर 5 / आर 6 क्षेत्रों के बीच थोड़ी सी जगह ले जाया जा सकता है।

उपरोक्त सुझावों के बावजूद, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सीमाएं मौजूद हैं। इसमें ट्रांसफ़ेक्टेड न्यूरॉन्स की चर दर, ब्रेनडेस्ट स्लाइस के भीतर उनका स्थान, औरभ्रूण का अस्तित्व यद्यपि अभिकर्मक दक्षता भ्रूण में भिन्न होती है, हम पहले यहां वर्णित इलेक्ट्रोप्लेपायर पैरामीटर के साथ रिपोर्ट करते थे- एनएम / एनएल न्यूरॉन्स का 5-10% लगातार 8 ट्रांसफ़ेक्ट होते हैं। न्यूरॉनल अभिकर्मक की उच्च दर पर भी, इन विट्रो पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में मस्तिष्क के ऊतक की तैयारी चुनौतियां बनती है उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के स्लाइस 200-300 माइक्रोन मोटे होते हैं और कभी-कभी, ट्रांसफ़ेक्टेड न्यूरॉन्स ऊतकों में पर्याप्त रूप से पैच के लिए बहुत गहरा होते हैं और कार्यात्मक assays करते हैं। अंत में, सफल इलेक्ट्रोपायर के बाद भ्रूण के अस्तित्व को भी चर है, यद्यपि अभिकर्मक दर के रूप में ज्यादा नहीं। प्रयोगात्मक उपयोग के लिए वांछित भ्रूण की आयु के आधार पर, जीवित रहने की परिवर्तनशीलता 80-20% के बीच क्रोध कर सकती है, जिनमें से सबसे पुराने भ्रूण (> ई 18) से मेल खाती हैं।

चिकन में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन के महत्व को कई आर के लिए स्तनधारी मॉडल प्रणालियों पर फायदेमंद है ईसंस 16 सबसे पहले, यह अपेक्षाकृत सस्ती है और ट्रांसजेनिक या पछाड़ना पशुओं के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है। दूसरा, चिकन शेयरों के समानांतर नाभिक हैं जो सेलुलर, अन्तर्ग्रथनी, और तंत्रिका नेटवर्क स्तर 17 में ध्वनि की अस्थायी जानकारी को प्रोसेस करते हैं। स्तनधारियों और एनएम / एनएल के मुर्गियों में एसीवी / एमएसओ के बीच समान श्रवण समारोह का एक उदाहरण होता है, क्रमशः 4 , 5 हालांकि, चूहों और चूहों जैसे पारंपरिक उच्च आवृत्ति सुनवाई वाले स्तनधारी अनुसंधान मॉडल के विपरीत, मुर्गियां श्रवण संबंधी जानकारी को सांकेतिक करने के लिए दोनों कम और उच्च आवृत्ति संकेतों द्वारा प्रदान की जाने वाली संकेतों का उपयोग करती हैं। अंत में, मुर्गियां श्रवण अछूत जानवर हैं; अर्थात्, उनकी श्रवण प्रणाली जन्म के समय कार्यात्मक परिपक्वता के निकट होती है और पर्यावरण प्रभावों के बिना भ्रूण चरण के दौरान सुनवाई शुरू होती है और सुधार होता है> 1 9 , 20 इसके विपरीत, विशिष्ट स्तनधारी अनुसंधान मॉडल के लिए सुनने की शुरुआत 21 , 23 जन्म के 10-13 दिनों के बाद शुरू होती है।

जैव रासायनिक, औषधीय और कार्यात्मक assays के साथ, ओवो आनुवंशिक जोड़तोड़ में शारीरिक और शारीरिक विशेषज्ञता के न्यूरॉन-विशिष्ट विकास का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, जो श्रवण ब्रेनस्मिथ विकास में अच्छी तरह से परिभाषित समय अवधि के नियंत्रण की अनुमति देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम डीआरएस को धन्यवाद देना चाहेंगे। लेस्लेयान स्कीक्टसन, युआन वैंग, एंड्रेस बैरिया और श्रीमती एक्समेना ऑप्टिज़-अरिया प्रोटोकॉल सेट अप के साथ प्रारंभिक सहायता के लिए और प्लास्मिड प्रदान करने के लिए यह काम एनआईएच / एनआईडीसीडी अनुदान DC013841 (जेटीएस) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer Parker Hannifin 052-0500-900 Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator Grass Technologies SD9 SD9
Microfil syringe needles World Precision Instruments MF28G67-5 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder Warner Instruments 64-1280 MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode FHC PBSA1075 PBSA1075
Air tank/regulator NU Laboratory Services Air dry 300 CF
Fast green Sigma Aldrich F7258-25G F7258-25G
Clear plastic tape Scotch 191
Doxycycline hyclate Sigma Aldrich D9891-1G
Egg refrigerator Vissani Wine Refrigerator 13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator Hova-Bator 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope Zeiss 4.35E+15 SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source Zeiss 4.36E+15 CL6000 LED
Micromanipulators Narishige Japan Model: MM-3 2 Micromanipulators
Capillary tubes Sutter Instrument BF150-86-10 Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes 1 mL, 3 mL
Needles BD Precision Glide  27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps Stoelting No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder Custom Made Clay base works as well
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97
Syringe filter Ultra Cruz sc-358811 PVDF 0.22 μm

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References

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

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विकास जीवविज्ञान अंक 124 श्रवण बौद्धिक तंत्र एवियन विकास, न्यूक्लियस लामिनारिस नाभिक मोनोगेक्लुलरिस प्लाज्मिड
चिकन श्रवण ब्रेनस्टम <em>में ओवो</em> इलेक्ट्रोप्लोरेशन में
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Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. … More

Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem. J. Vis. Exp. (124), e55628, doi:10.3791/55628 (2017).

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