Summary
鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门用于快速神经编码，这是正常听力功能的基本过程。这些神经元来自胚胎后脑的不同前体。我们提出利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因以研究听觉发育过程中的基因功能。
Abstract
电穿孔是将感兴趣的基因引入生物相关生物体如鸡胚的方法。长期以来，鸡胚是研究听觉系统发育基本生物学功能的有效研究模式。最近，鸡胚在研究与听力相关的基因表达，调节和功能方面已经变得特别有价值。 在ovo电穿孔可用于瞄准听觉脑干区域负责高度专业化的听觉功能。这些区域包括鸡核细胞（NM）和核层（NL）。 NM和NL神经元来自菱形体5和6的不同前体（R5 / R6）。在这里，我们介绍质粒编码基因的ovo电穿孔研究这些区域的基因相关性质。我们显示一种促进功能表型增益或丧失的基因表达空间和时间控制的方法ES。通过靶向与R5 / R6相关的听觉神经祖细胞区域，我们显示在NM和NL中的质粒转染。通过采用tet-on载体系统可以实现基因表达的时间调控。这是在多西环素（Dox）存在下表达感兴趣的基因的药物诱导性程序。 卵内电穿孔技术 - 与生物化学，药理学和/或体内功能测定一起提供了一种创新的方法来研究听觉神经元发育和相关的病理生理现象。
Introduction
声音的快速神经编码对于正常的听觉功能至关重要。这些包括声音定位能力1 ，噪音识别2中的语音，以及其他与行为相关的通信信号3的理解。鸟类和哺乳动物的听觉脑干中的类似神经元是高度专门用于快速神经编码的。其中包括鸡核细胞核（NM），核心层流（NL）及其哺乳动物类似物，前内耳蜗核（AVCN）和内侧上橄榄（MSO） 5 。然而，在听觉脑干中，调节快速神经编码的发育机制知之甚少。因此，研究负责快速神经编码的具体基因是为了更好地了解其在au中的表达，调控和功能是有利的发展。
发展中的鸡胚是研究听觉系统发展基础生物学问题的有效和成熟的研究工具。最近的分子进展已经在发展中的鸡胚中通过表达或敲低感兴趣的基因来解决这些生物学问题，以分析体内基因功能8,9 。研究特定基因的调节作用是理解与听觉缺陷相关的病理学的重大进步。在这里，我们将质子编码基因的ovo电穿孔进入鸡听觉脑干，其中声音的快速神经编码发生10 。通过靶向与菱形体5和6相关的听觉神经祖细胞区域11,12（R5 /R6），我们显示了NM和NL中质粒转染的空间控制。此外，我们通过采用tet-on向量系统显示表达的时间调节。这是在多西环素（Dox） 8存在下表达感兴趣的基因的药物诱导性程序。
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Protocol
所有程序均经西北大学机构动物护理和使用委员会批准，并按照国家卫生研究院“实验动物护理和使用指南”进行。
蛋处理
- 从当地的供应商处购买受精卵。在孵育前不要超过5天，将冰箱中的鸡蛋在13°C储存。 1周后胚胎活力明显下降。
- 用70％乙醇清洗每个鸡蛋，然后放入培养箱中。
- 在温度设定在38°C〜50％湿度的孵化器中，在其侧面设置1-2打鸡蛋。这确保了电穿孔的适当胚胎定位和最佳的生存能力。
注意：孵化48-52小时后，鸡蛋将在汉堡汉密尔顿（HH）阶段〜12-13，并准备进行电穿孔。
准备
- 质粒米兴
- 每7μLDNA混合物加入1μL0.1％快速绿色（0.1％在18MΩ去离子和蒸馏水中[ddH 2 O]）。
- 对于多重质粒的共电穿孔，以1：1的比例混合质粒。最终DNA浓度应为5-8μg/μL。
- 注射移液器
- 将移液器拉到微量吸管拔出器上。使用28G注射器针头，用1-2μL质粒填充移液管。
- 使用镊子将移液管吸头切断至10 - 20μm。使用显微镜来帮助确定破碎的移液器吸头的尺寸。将移液器连接到喷雾枪的移液器支架上。
开窗
注意：窗口过程已在13之前发布。有关其他视觉信息，请参阅参考13。
- 擦拭所有仪器和工作区域70％乙醇。
- 将所需数量的鸡蛋从孵化器中取出（6-10），离开室温，再次用70％乙醇单独取蛋。除去培养箱后，鸡蛋保持至少2小时。
- 将鸡蛋放在光照射器的顶部，以确定胚胎定位。用铅笔圈住黑暗中心（ 即胚胎）。
- 使用一根19G的针头，在鸡蛋的钝末端戳一个洞。
- 在鸡蛋的尖端旁边绘制圆圈附近的另一个洞。用19G针去除一小块外蛋壳（约16 mm 2 ），然后用镊子取出一小块内蛋壳（约8 mm 2 ）。
- 用配有19G针头的3mL注射器，通过钝头孔从鸡蛋中取出1.5-2.5mL白蛋白。确保将针角向下倾斜45°。
- 用一小块胶带（1厘米×1厘米）覆盖钝头孔。覆盖绘制的圆形d带第二个孔（2.5厘米x 4厘米）。
- 用弯曲的剪刀（切边= 2.5厘米），在圆圈内切一个窗口。剪刀应平行于蛋壳，窗口直径应小于2厘米。
4.质粒注射
- 打开picospritzer。将压力设置为18 psi，持续时间设置为5μs。打开气囊和灯泡用于解剖显微镜。
- 将30mL购买印度墨水的1:10稀释的储备溶液混合在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。储存于4°C。注射印度油墨是获得鸡胚更好的可视化的重要一步。
- 用稀释的印度墨水溶液填充1 mL注射器。安装27G针头并排出注射器中存在的任何气泡。
- 将胚胎插入距离胚胎约2-3毫米的蛋黄膜下，并在胚胎下轻轻注入〜0.2毫升印度墨水。做不会注射超过0.5毫升的印度墨水，因为它可能会降低胚胎存活。
- 将窗口蛋放在夹层显微镜下的鸡蛋架上。使用最高放大倍率进行质粒注射部位的最佳可视化。
- 使用镊子，去除注射区域上的膜。听觉脑干感兴趣区域（ 即 NM和NL）来自Rhombomeres 5和6（R5 / R6）。 R5 / R6位于邻近于作为R5 / R6质粒注射的标志的耳朵（发育成内耳的脊椎动物中的胚胎结构）。
- 将DNA填充的移液管放置在覆盖R5 / R6区域的神经管和使用显微操纵器的耳朵之间。理想放置的示意图如图1A所示 。
- 从picospritzer施加空气压力（18 psi，5μs持续时间），以在神经管中排出DNA。
电穿孔
- 打开t他电流/电压刺激器。
- 用PBS注入3 mL注射器，并连接注射器过滤器。在胚胎上加入1-2滴PBS。
- 使用显微操纵器将双极电极降低至胚胎，负极位于注射部位（内侧）上方，正电极位于R5 / R6侧面（ 图1A ）。避免与胚胎直接接触。使用双极电极，其中电极材料是铂铱。使用镊子将尖端之间的间距调整为0.5 mm。
- 使用电流/电压刺激器，以1秒的间隔在50 V脉冲20次脉冲1 ms。
- 电穿孔后，在暴露的区域添加一滴PBS。轻轻取出电极，并用实验室组织和70％乙醇清洗。关闭窗口，用胶带暴露胚胎。
- 标记蛋壳与注入的质粒类型和孵化日期。
- 将鸡蛋放回孵化器，窗口朝上。在38℃下孵育50℃湿度达到所需的发育阶段。
- 如果电穿孔对tet基因载体进行基因表达的时间控制，则每24小时应用多西环素（Dox）以诱导基因表达（参见第6节）。
6.基因表达时间控制的Tet-on系统
- 使用以下质粒：
pCAGGS-T2TP：表达转座酶的质粒。
pT2K-CAGGS-rtTA-M2：稳定表达Dox结合蛋白的质粒。
pT2K-BI-TRE-EGFP：含有双向tet-on启动子（TRE）的质粒，其表达EGFP报告基因和第二种感兴趣的基因。
注意：上述三种质粒需要以1：1：1的比率共同电穿孔。 - 储备溶液制备：
- 将Dox溶于无菌PBS中以产生1mg / mL储备溶液。储存于-20°C。
- Dox应用程序：
- 诱导表达n在某些发育阶段的感兴趣的基因，每24小时应用Dox。
- 当应用Dox时，取蛋，打开窗户，将50μLDox吸取到绒毛膜蛋白膜上，关上窗户，将鸡蛋放回培养箱。
7.脑干切片解剖区的准备
注意：以下章节（7 - 9）和程序已在14之前发布。有关其他视觉信息，请参阅这些参考。
- 制备琼脂溶液（40 mg / mL琼脂糖， 即 ddH 2 O中为 4％）。将琼脂溶液倒入培养皿中，使其在室温下固化。将冷藏的琼脂板存放在冰箱中，以便将来在组织切片过程中使用。
- 持续发泡95％O 2和5％CO 2 （pH 7.2-7.4和渗透压：295-310 mOsm / L）的人造脑脊髓液（ACSF）。
- 用70％乙醇清洁工作区域和振膜，并用蒸馏水冲洗刀片。
- 使用适当的解剖工具将干净的吸液垫放在工作区域上。
- 将琼脂板从冰箱中取出，切成小琼脂立方体（10mm×10mm×8mm）。使用市售的超级胶将琼脂块胶粘到vibratome切片室的阶段。
8.分离鸡听觉脑干
- 在录音窗口打开鸡蛋。用手术刀穿刺膜囊并清除鸡胚的头部。
- 用锋利的剪刀剁碎鸡肉。
- 将剃刀刀片尖端稍微靠近眼睛。在头尾到尾部中线切开头骨。根据胚胎的年龄施加轻微的压力。较老的胚胎需要更多的压力。
- 轻轻推开皮肤和羽毛，露出头骨，并验证中线切口。
- 申请压力很大，用剃刀刀片切割头骨的头部。立即将刀片放置在眼睛后面，切割整个头骨和脑组织。
- 使用剪刀在头骨的尾部区域，头部两侧的颈部肌肉稍微前方进行中线到外侧的切口，通过拔除头骨和多余的组织来暴露脑和小脑。
- 使用剪刀将组织切割到脑干上，并清除脑部，自由脱离头骨。
9.准备脑干切片用于体内电生理或成像
- 通过视觉图形来降低脑干。
- 用剪刀切割花梗去除小脑，暴露第四脑室的地板。
- 使用镊子，从脑干表面去除任何膜组织和血管。
- 要阻止脑干，在四分之一的最底端的水平切割第三脑室，只是尾皮到皮层。使横切通过视网膜垂直，以分离脑干。
- 在琼脂块前面的vibratome舞台上放少量超级胶水。
- 使用镊子提升脊髓的脑干，并将其放置在超级胶水上，朝向侧面向下和背侧朝向颤振片。用实验室纸巾或滤纸去除多余的胶水。
- 将氧合的ACSF倒入振动台。将vibratome刀片设置在20-22°角度。以最大振幅振荡开始振动。将舞台向上移动到刀片，使得组织的顶部与刀片平行。
- 迅速将刀片移动到脑干组织。在刀片与组织接触之前，大大减缓刀片。
- 切片组织具有最慢的前进速度。一旦叶片通过整个冠状组织切片，使用移液管轻轻取出切片/ LI>
- 放下200-300微米，再次切片。重复，直到听觉核的解剖标志变得可见，例如，NL的独特的背侧/腹侧神经纤维区域和NM相对于NL的内侧位置。
- 仔细维护ACFS中的切片。这可以使用温水浴在室温（22°C）或接近生理条件（〜41°C）下进行。注意切片的顺序。第一个切片对应于组织的最尾部区域，最后一个切片对应于最多的分布区域。这粗略地代表了从低频编码区域到高频编码区域的听觉脑干的tonotopic组织。
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Representative Results
我们在这里显示， 在ovo电穿孔允许在正常发展的生物系统中的基因表达。质粒编码的基因被重点注射到覆盖R5 / R6的神经管中。 图1A中示出了相对于重要的解剖学标记的电极和移液器放置的示意性示例。在电穿孔后24小时证实质粒注射的正确位置， 如图1B所示 。将质粒靶向注射到R5 / R6上的神经管中，允许在特定的听觉脑干区域（即NM和NL ）中表达（11） 。 图1C显示了来自E12胚胎的差异干涉对比（DIC）照射下的体外脑干切片。概述了感兴趣的听觉区域。用荧光照明（ 图1C 1 ），YFP表达神经元内NM和NL是可见的。 图1D显示了在高倍放大下E18胚胎的DIC照明。许多NM神经元的经典腺泡细胞体是明显的。使用荧光照明（ 图1D 1 ），表达NMFP的YFP表达明显可见，而其他转染的神经元不在焦平面。由于目标NM区域中仅有一部分神经元被转染，所以它允许同一核内的其他神经元在双膜片钳电生理实验期间用作内部对照。转基因也可以通过药物应用在时间上调节，使得能够在精确的发育时期进行基因表达和操纵8 。
图1： 在 鸡Au中的 Ovo 电穿孔ditory脑干（ A ）HH 12期鸡胚后脑电穿孔示意图。注射移液管充满质粒DNA和快速绿色染料，用于观察注射的后脑（菱形体5/6 [R5 / R6]）。在本研究中，使用共表达目的基因的质粒和黄色荧光蛋白（YFP）报告基因。将电穿孔的胚胎进一步孵育直到达到所需的发育阶段。 （ B ）胚胎（E）第4天鸡胚显示相对于左眼（箭头，E）和左耳肿瘤（箭头，O）的YFP表达的部位。虚线白线代表背脑和脑干边界。比例尺=480μm。 （ C和C 1 ）来自E12鸡的脑干切片（300μm厚）在差异干涉对比度（DIC， C ）和荧光（YFP， C 1 ）照度 ñ。虚线白线代表核细胞核（NM）和核层（NL）的边界。注意，脑干切片仅显示组织的一侧。白色箭头表示脑干切片的中线裂缝。白色箭头显示YFP表达的NM和NL的区域。 V =腹侧，M =内侧。比例尺=240μm。 （ D和D 1 ）含有NM的E18鸡胚脑干切片的高放大倍率（80X水浸物镜）。经典的adendritic细胞体15在DIC照明下可以清楚看见（向上箭头D ）。对于相同切片的荧光照明，通过YFP荧光鉴定的转染的NM神经元是清楚可见的（向上箭头， D 1 ）。星号=正好在焦平面下方的表达NM神经元的YFP。刻度棒=30μm。large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
ovo电穿孔是一种表达或敲低感兴趣的基因以分析体内基因功能的方法8,9 。在鸡胚中，将质粒编码的基因表达到不同的听觉脑干区域中是一种创新的方法。为了确保最佳表达，需要几个关键步骤。首先，只注射其囊肿清晰可见的胚胎。如果卵巢不可见，则胚胎不能在电穿孔的正确发育阶段。第二，较小的移液管尖端使得更容易穿透神经管并导致更少的组织损伤。然而，破碎的尖端应该足够大以排出DNA。第三，用DNA覆盖R5 / R6上的整个神经管区域（通过快速绿色溶液的扩散可视化）。最后，尽可能靠近胚胎放置刺激器电极ortant。但是，请确保避免与胚胎直接接触，因为电流脉冲可能会烧焦并损坏组织。
该技术的修改可以帮助改善胚胎的活力和质粒的表达。首先，在到达24小时内设置鸡蛋以保持高生存力是非常重要的。第二，卵的窗口必须用胶带密封，否则通过不充分的密封损失流体（ 即脱水）会增加胚胎死亡。第三，为了优化耳廓的可视化，从胚胎的发梢侧注射印度油墨，尽可能使用最少量的墨水。最后，刺激电极可以在R5 / R6区域之间稍微移动，以扩大电荷区域而不增加电流强度。
尽管有上述建议，但应该指出的是存在限制。这些包括转染的神经元的可变速率，它们在脑干切片内的位置胚胎存活。尽管转染效率因胚胎而异，我们以前报道了这里描述的电穿孔参数〜5-10％的NM / NL神经元一直转染8 。即使在更高的神经元转染率下，用于体外膜片钳电生理学的脑干组织的制备也带来挑战。例如，脑干切片的厚度在200-300μm之间，偶尔，转染的神经元在组织内太深，以适当补片并进行功能测定。最后，成功电穿孔后的胚胎生存也是可变的，尽管不如转染率那么多。根据实验用途所需的胚胎年龄，生存变异性可能在80-20％之间，后者对应于最早的胚胎（> E18）。
在鸡的卵子电穿孔中的意义在于几种r的哺乳动物模型系统是有利的乐器16 。首先，它相对便宜并且是转基因或敲除动物的优选替代物。第二，鸡与哺乳动物共享类似核，处理细胞，突触和神经网络级17的声音的时间信息。哺乳动物的AVCN / MSO和鸡的NM / NL之间发生类似听觉功能的一个例子，类似的听觉脑干结构分别为4,5 。然而，与传统的高频听力哺乳动物研究模型（如小鼠和大鼠）不同，鸡使用低频和高频信号提供的提示来编码听觉信息18 。最后，鸡是听觉早熟动物;也就是说，他们的听觉系统在出生时接近功能成熟，听觉发生和细化发生在胚胎阶段，没有环境影响> 19，20。相比之下，典型的哺乳动物研究模型的听力开始于出生后10-13天开始， 21日 ， 23日 。
结合生物化学，药理学和功能测定， 在ovo基因操作中提供了一种创新的方法来研究神经元特异性的解剖和生理专业发展，允许控制听觉脑干发展中明确定义的时间段。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们要感谢Drs。 Leslayann Schecterson，Yuan Wang，Andres Barria和Ximena Optiz-Araya太太，为协议设置和提供质粒提供初步帮助。这项工作得到NIH / NIDCD授权DC013841（JTS）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
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