Summary
Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.
Abstract
Elektroporatie is een methode die genen van belang stelt in biologisch relevante organismen zoals het kippenembryo. Het is lang gevestigd dat het kippenembryo een effectief onderzoeksmodel is voor het bestuderen van basis biologische functies van auditieve systeemontwikkeling. Meer recent is het kippenembryo bijzonder waardevol geworden bij het bestuderen van genuitdrukking, -regulatie en -functie in verband met gehoor. In ovo kan elektroporatie worden gebruikt om auditieve hersenstamregio's te beheren die verantwoordelijk zijn voor zeer gespecialiseerde auditieve functies. Deze gebieden omvatten de kippenkernmagnocellularis (NM) en nucleus laminaris (NL). NM en NL neuronen ontstaan uit verschillende precursoren van rhombomeren 5 en 6 (R5 / R6). Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide gecodeerde genen om genetische eigenschappen in deze regio's te bestuderen. We tonen een methode voor ruimtelijke en temporale controle van genuitdrukking die zowel winst of verlies van functioneel fenotype bevorderenes. Door middel van auditieve neurale voorloperregio's geassocieerd met R5 / R6 tonen we plasmide-transfectie in NM en NL. Temporele regulatie van genuitdrukking kan worden bereikt door een tet-on vectorsysteem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) uitmaakt. De in ovo elektroporationstechniek - samen met biochemische, farmacologische en / of in vivo functionele analyses - biedt een innovatieve aanpak voor de studie van auditieve neuronontwikkeling en bijbehorende pathofysiologische verschijnselen.
Introduction
Snelle neurale codering van geluid is essentieel voor normale auditieve functies. Deze omvatten geluids lokalisatiemogelijkheden 1 , spraak in geluidsdiscriminatie 2 en het begrip van andere gedragsrelevante communicatiesignalen 3 . Analoge neuronen in de auditieve hersenstam van zowel avia's als zoogdieren zijn zeer gespecialiseerd voor snelle neurale codering 4 . Deze omvatten de kipkern Magnocellularis (NM), de nucleaire laminaris (NL) en hun zoogdieranaloge, de anteroventrale cochleaire kern (AVCN) en de mediale superieure Olijf (MSO), respectievelijk 5 . Ontwikkelingsmechanismen die snelle neurale codering regelen, worden echter slecht begrepen in de auditieve hersenstam. Daarom is het voordelig om specifieke genen die verantwoordelijk zijn voor snelle neurale codering te bestuderen om hun expressie, regelgeving en functie beter te kunnen begrijpenDijmontwikkeling.
Het ontwikkelende kippenembryo is een effectief en goed gevestigd onderzoeksinstrument om fundamentele biologische vragen van auditieve systeemontwikkeling 6 , 7 te bestuderen. Recente moleculaire voorschotten hebben deze biologische vragen in het ontwikkelende kippenembryo aangepakt door genen van belang uit te drukken of neer te zetten om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. Het onderzoek naar de regulerende rol van specifieke genen is een belangrijke vooruitgang bij het begrijpen van pathologieën die verband houden met auditieve tekorten. Hier presenteren we in ovo elektroporatie van plasmide-gecodeerde genen in de kip auditieve hersenstam, waar snel neurale codering van geluid optreedt 10 . Door te targeten op auditieve neurale voorloperregio's geassocieerd met rombomeren 5 en 6 11 , 12 (R5 /R6), tonen wij ruimtelijke controle van plasmide transfectie in NM en NL. Daarnaast tonen we tijdelijke regulering van expressie door een tet-on vector systeem aan te nemen. Dit is een drug induceerbare procedure die de genen van belang in de aanwezigheid van doxycycline (Dox) 8 uitmaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Institusionele Dierenzorg- en Gebruikscommissies van de Noordwestelijke Universiteit, en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren.
1. Eierhantering
- Koop bevruchte eieren van een lokale leverancier. Bewaar eieren bij 13 ° C in de koelkast voor maximaal 5 dagen voor incubatie. De levensvatbaarheid van embryo neemt significant af na 1 week.
- Schep elk ei met 70% ethanol voordat u in de incubator zit.
- Zet 1-2 tientallen eieren aan hun zijden in een incubator met de temperatuur ingesteld op 38 ° C bij ~ 50% vochtigheid. Dit zorgt voor een goede embryo-positionering voor elektroporatie en respectievelijk optimale levensvatbaarheid.
OPMERKING: Na 48 tot 52 uur incubatie zullen de eieren bij Hamburger-Hamilton (HH) stadium ~ 12-13 staan en klaar zijn voor elektroporatie.
2. Voorbereiding
- Plasmide MiXing
- Voeg 1 μL 0,1% snelgroen (0,1% in 18 MΩ gedeïoniseerde en gedestilleerde H20 [ddH2O]) toe voor elke 7 μl DNA-mengsel.
- Voor co-elektroporatie van meerdere plasmiden, meng plasmiden in een 1: 1 verhouding. De uiteindelijke DNA-concentratie moet 5-8 μg / μL zijn.
- Fill Injection Pipette
- Trek pipetten op een micropipette-trekker. Vul de pipet met 1-2 μL plasmiden met een 28G spuitnaald.
- Breek de pipet tip tot 10 - 20 μm met behulp van tang. Gebruik een microscoop om te helpen bij het bepalen van de grootte van de gebroken pipettip. Bevestig de pipet aan de pipethouder van de picospritzer.
3. Winding
OPMERKING: De windowing procedure is vóór 13 gepubliceerd. Zie verwijzing 13 voor aanvullende visuele informatie.
- Veeg alle instrumenten en het werkgebied met 70%ethanol.
- Neem het gewenste aantal vaste eieren uit de broeikas (tussen 6-10), laat het bij kamertemperatuur, en individueel doei eieren met 70% ethanol opnieuw. Eieren blijven minimaal 2 uur levensvatbaar na verwijdering van incubator.
- Plaats het ei op een lichtverlichting om de embryopositie te identificeren. Omcirkel het middelpunt van het donkere gebied ( dwz embryo) met een potlood.
- Gebruik een 19G-naald en steek een gat in het stompe uiteinde van het ei.
- Poke een ander gat in de buurt van de getekende cirkel aan de punt van de ei. Verwijder een klein stukje van de buitenste eierschaal (ongeveer 16 mm 2 ) met de 19G-naald en verwijder vervolgens een klein stuk van de binnenste eierschaal (ongeveer 8 mm 2 ) met tang.
- Met een 3 ml spuit uitgerust met een 19G-naald, haal 1,5-2,5 ml albumine uit het ei door het stompe gat. Zorg ervoor dat u de naald om 45 ° kiest.
- Bedek het stompe gat met een klein stukje tape (1 cm x 1 cm). Bedek de getekende cirkel aD het tweede gat met tape (2,5 cm x 4 cm).
- Met gebogen schaar (snijrand = 2,5 cm) snijd een raam in de cirkel. De schaar moet parallel zijn aan de eierschaal en de diameter van het raam moet minder dan 2 cm zijn.
4. Plasmide injectie
- Zet de picospritzer aan. Stel de druk in op 18 psi en de duur tot 5 μs. Zet de luchttank en de lamp voor de dissectiemicroscoop aan.
- Maak 30 ml voorraadoplossing van een 1:10 verdunning van in de winkel gekocht Indische inkt gemengd in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren bij 4 ° C. Injectie van Indische inkt is een belangrijke stap om de kippenembryo beter te visualiseren.
- Vul een 1 ml spuit met de verdunde Indische inktoplossing. Bevestig een 27G-naald en verwijder eventuele bellen die aanwezig zijn in de spuit.
- Plaats de naald net onder het geelmembraan ~ 2 - 3 mm van het embryo en injecteer 0,2 ml Indische inkt voorzichtig onder het embryo. DoInjecteer niet meer dan 0,5 ml van de Indische inkt, aangezien het embryo-overleving kan verminderen.
- Plaats het raamdeeg op een eihouder onder de dissectiemicroscoop. Gebruik de hoogste vergroting voor de beste visualisatie van de plasmide injectieplaats.
- Verwijder het membraan over het injectiegebied met behulp van tang. Auditieve hersenstamgebieden van belang ( dwz NM en NL) komen voort uit Rhombomeres 5 en 6 (R5 / R6). R5 / R6 bevinden zich naast de otocyten (een embryonale structuur in vertebraten die zich in het binnenoor ontwikkelen), die dienen als landmarks voor R5 / R6 plasmide injecties.
- Verlaag het DNA-gevulde pipet in de neurale buis die over het R5 / R6 gebied en tussen otocyten leidt met behulp van de micromanipulator. Een schema van ideale plaatsing wordt getoond in figuur 1A .
- Breng de luchtdruk (18 psi, 5 μs duur) van de picospritzer aan om DNA uit de neurale buis te verwijderen.
5. Elektroporatie
- Zet t aanHij stroom / spanning stimulator.
- Vul een 3 ml spuit met PBS en bevestig het spuitfilter. Voeg 1-2 druppels PBS op het embryo toe.
- Verlaag de bipolaire elektrode naar het embryo met behulp van de micromanipulator met de negatieve elektrode boven de injectieplaats (mediaal) en de positieve elektrode lateraal naar de R5 / R6 ( Figuur 1A ). Vermijd direct contact met het embryo. Gebruik bipolaire elektroden waar het elektrode materiaal platina iridium is. Pas de afstand tussen de tips aan op 0,5 mm met tang.
- Gebruik een stroom / spanningsstimulator, 20 keer bij 50 V voor 1 ms met intervallen van 1 s.
- Na elektroporatie voegt u een druppel PBS over het blootgestelde gebied. Verwijder de elektrode voorzichtig en maak het schoon met een laboratoriumweefsel en 70% ethanol. Sluit het raam dat het embryo met tape afdicht.
- Label eierschaal met het geïnjecteerde plasmide type en de luikdatum.
- Leg eieren terug in incubator met raamzijde omhoog. Incubeer bij 38 ° C met 50% Vochtigheid tot het gewenste ontwikkelingsfase is bereikt.
- Als een tet-on vector electroporated is voor tijdelijke controle van de genuitdrukking, doe Doxycycline (Dox) elke 24 uur aan om genuitdrukking te veroorzaken (zie rubriek 6).
6. Tet-on systeem voor temporale controle van genuitdrukking
- Gebruik de volgende plasmiden:
PCAGGS-T2TP: een transposase expressieplasmide.
PT2K-CAGGS-rtTA-M2: een plasmide dat stabiel het Dox-bindende eiwit uitmaakt.
PT2K-BI-TRE-EGFP: een plasmide dat een bidirectionele tet-on promotor (TRE) -drivende expressie van de EGFP-reporter bevat en een tweede gen van belang.
OPMERKING: De bovenstaande drie plasmiden moeten gecofroporiseerd worden in een verhouding van 1: 1: 1. - Voorraadoplossing:
- Doxis oplosbaar in steriele PBS om een voorraadoplossing van 1 mg / ml te produceren. Bewaren bij -20 ° C.
- Dox-applicatie:
- De expressio inducerenN van het gen van belang tijdens bepaalde ontwikkelingsfasen, doe Dox elke 24 uur.
- Wanneer u Dox toepast, haal het ei uit, open het raam, pipet 50 μL Dox op het chorioallointoïsche membraan, sluit het raam en zet het ei terug in de incubator.
7. Voorbereiding van Dissecting Area voor Brainstem Slices
OPMERKING: De volgende paragrafen (7 - 9) en procedures zijn vóór 14 gepubliceerd. Zie deze verwijzingen voor aanvullende visuele informatie.
- Bereid een agaroplossing (40 mg / ml agarose, dwz 4% in ddH20). Giet de agaroplossing in een Petri-schotel en laat het op kamertemperatuur stollen. Bewaar overdekte agarplaat in de koelkast voor toekomstig gebruik tijdens het breinappen van het weefsel.
- Bellen kunstmatig cerebrale spinale vloeistof (ACSF) met 95% O2 en 5% CO2 (pH 7,2-7,4 en osmolariteit: 295-310 mOsm / L).
- Reinig het werkgebied en vibratomeer met 70% EtOH en spoel het mes met gedestilleerd water.
- Plaats een schoon vloeibaar absorptieblok op het werkgebied met geschikte dissectie-gereedschappen.
- Neem de agarplaat uit de koelkast, snijd een kleine agar kubus (10 mm x 10 mm x 8 mm). Plak het agarblok aan op het stadium van een vibratoom-snijkamer met gebruik van commercieel verkrijgbare superlijm.
8. Isolatie van Kip Auditory Brainstem
- Open het ei op de tapijtplaats. Doe de membraksak met een scalpel en verwijder het hoofd van het kippenembryo.
- Ontdek de kip met een scherpe schaar.
- Zet de scheermespunt een beetje achter de ogen. Inkijk door de schedel op de rostral-naar-caudale middenlijn. Pas kleine druk toe afhankelijk van de leeftijd van het embryo. Oudere embryo's hebben meer druk nodig.
- Druk de huid en de veren voorzichtig op om schedel bloot te stellen en controleer de middelste snede.
- S toepassenTrong druk, snijd het rostral gedeelte van de schedel met een scheermesje. Plaats het blad direct achter de ogen en snijd door de hele schedel en het breinweefsel.
- Maak middenlijn-naar-laterale insnijdingen met een schaar in de caudale regio van de schedel, iets voor de nekspieren aan beide kanten van het hoofd. Ontdek hersenen en cerebellum door de schedel en het overtollige weefsel weg te trekken.
- Knip weefsel vast aan de hersenstam met een schaar en verwijder de hersenstam, die vrij van de schedel loskomt.
9. Bereiding van hersenstamelschijven voor in-vivo elektrofysiologie of beeldvorming
- Knip de hersenstam door de optische tecta.
- Verwijder het cerebellum door middel van scharen met een schaar, waarbij de vloer van de vierde ventrikel wordt blootgesteld.
- Verwijder eventuele membranale weefsels en bloedvaten uit het hersenstamoppervlak met behulp van een pincet.
- Om de hersenstam te blokkeren, maakt u een horizontale snede in het meest rostrale einde van de vloer van de vierTh ventrikel, gewoon caudaal aan de cortex. Maak laterale snede loodrecht door de optische tecta om de hersenstam te isoleren.
- Plaats een kleine hoeveelheid superlijm op het vibratomeer vlak voor het agarblok.
- Breng de hersenstam aan het ruggenmerg met behulp van tweezers en plaats het op de superlijm met rostralzijde naar beneden en de dorsale kant naar het vibratomeerblad. Verwijder overtollige lijm met een laboratoriumweefsel of filterpapier.
- Giet zuurstofgezuurde ACSF in de vibratomeer. Zet het vibratomeerblad op een hoek van 20-22 °. Start vibratome bij maximale amplitude oscillatie. Verplaats het podium naar het mes zodat de bovenkant van het weefsel parallel is met het mes.
- Draai het mes snel naar breinstamweefsel. Verlaag het mes aanzienlijk voor het contact van het mes met het weefsel.
- Snij weefsel met de langste mogelijke voorwaartse snelheid. Zodra het mes door het gehele koronale weefselprofiel is, verwijder het plakje voorzichtig met een transferpipette. </ Li>
- Verlaag het stadium 200-300 μm en plak opnieuw. Herhaal tot anatomische oriëntatiepunten van auditieve kernen zichtbaar worden, bijvoorbeeld de afzonderlijke dorsale / ventrale neuropil regio van NL en de mediale locatie van NM ten opzichte van NL.
- Houd schijfjes zorgvuldig in ACFS. Dit kan bij kamertemperatuur (22 ° C) of dichtbij fysiologische omstandigheden (~ 41 ° C) worden gedaan met een warm waterbad. Let op de volgorde van het snijden. De eerste plak komt overeen met het meest caudale gebied van weefsel en de laatste plak komt overeen met het meest rostralale gebied. Dit vertegenwoordigt ruwweg de tonotopische organisatie van de auditieve hersenstam, respectievelijk van laag- tot hoogfrequente coderende gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We laten hier zien dat in ovo elektroporation genexpressie in een normaal ontwikkelend biologisch systeem toelaat. Plasmide-gecodeerde genen worden focaal geïnjecteerd in de neurale buis boven R5 / R6. Een schematisch voorbeeld van de elektrode- en pipetplaatsingen ten opzichte van belangrijke anatomische markers is getoond in figuur 1A . De juiste plaats van plasmide-injectie wordt 24 uur na elektroporatie bevestigd en getoond in figuur IB . De gerichte injectie van plasmiden in de neurale buis boven R5 / R6 maakt expressie mogelijk in specifieke auditieve hersenstamgebieden, namelijk NM en NL (11) . Figuur 1C toont een in vitro hersenstamschijf van een E12-embryo onder DIC-belichting (DIC). De auditieve regio's van belang zijn uiteengezet. Met florescerende verlichting ( Figuur 1C 1 ), expresseert YFP neuronen binnen NM en NL zijn zichtbaar. Figuur 1D toont DIC verlichting voor een E18 embryo onder hoge vergroting. De klassieke adendritische cellichamen van talrijke NM neuronen zijn duidelijk. Met florescerende verlichting ( Figuur 1D 1 ) is een YFP die NM neuron uitdrukt duidelijk zichtbaar, terwijl andere getransfecteerde neuronen buiten het brandpunt liggen. Omdat slechts een fractie van neuronen in het getraceerde NM-gebied getransfecteerd wordt, kunnen andere neuronen binnen dezelfde kern worden gebruikt als interne controles tijdens experimenten met dubbele patch-klem elektrofysiologie. Transgenen kunnen ook tijdelijk gereguleerd worden door middel van een geneesmiddeltoepassing, waardoor genexpressie en manipulatie bij nauwkeurige ontwikkelingsperioden 8 mogelijk worden gemaakt .
Figuur 1: In Ovo Electroporation in de Kip AuDijmbrein. ( A ) Schematisch van elektroporatie in het achterhoofd van HH stadium 12 kippenembryo's. De injectiepipet is gevuld met plasmide-DNA en snelle groene kleurstof voor visualisatie van het geïnjecteerde achterhuid (rhombomeren 5/6 [R5 / R6]). In deze studie werd een plasmide dat een gen van belang en de geel-fluorescente eiwit (YFP) reporter coexpresseerde gebruikt. Elektroporeerde embryo's worden verder geïncubeerd tot het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt. ( B ) Embryonische (E) dag 4 kippenembryo die plaats toont van YFP-expressie ten opzichte van het linkeroog (pijl, E) en linker otocyst (pijl, O). Gestippelde witte lijn vertegenwoordigt de dorsale hersen- en hersenstamgrens. Schaalbalk = 480 μm. ( C en C 1 ) Brainstemschijf (300 μm dik) van een E12-kip onder differentieel interferentiecontrast (DIC, C ) en fluorescerend (YFP, C 1 ) Illuminatio n. Gestippelde witte lijnen vertegenwoordigen grenzen van nucleus magnocellularis (NM) en nucleus laminaris (NL). Opmerking, de hersenstamplakje toont slechts één kant van het weefsel. Witte pijlpunten in vertegenwoordigt de middelste spleet van de hersenstamplakken. Witte pijlen tonen YFP-expressiegebieden van NM en NL. V = ventraal, M = mediaal. Schaalstang = 240 μm. ( D en D 1 ) Hoge vergroting (80X waterdichtingsdoelstelling) van een E18-kippenembryo hersenstamelschijf met NM. De klassieke adendritische cellichamen 15 zijn duidelijk zichtbaar onder DIC verlichting (opwaartse pijl, D ). Met fluorescerende verlichting voor hetzelfde segment is een getransfecteerde NM neuron geïdentificeerd door YFP fluorescentie duidelijk zichtbaar (opwaartse pijl, D 1 ). Sterretjes = YFP die NM neuronen net onder het brandpunt vlak uitdrukken. Schaalbalk = 30 μm.Large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In ovo elektroporatie is een methode om genen van belang uit te drukken of te kloppen om in vivo genfunctie 8 , 9 te analyseren. In het kippenembryo is het een innovatieve methode voor het uitdrukken van plasmide-gecodeerde genen in verschillende auditieve hersenstamregio's 8 . Om optimale expressie te waarborgen, zijn er meerdere kritische stappen nodig. Eerst, injecteer alleen embryo's waarvan de otocyten duidelijk zichtbaar zijn. Als otocyten niet zichtbaar zijn, is het embryo niet op de juiste ontwikkelingsstadium voor elektroporatie. Ten tweede, kleinere pipet tips maken het gemakkelijker om de neurale buis door te dringen en resulteert in minder weefselschade. De gebroken tip moet echter groot genoeg zijn om het DNA te verdrijven. Ten derde vul het hele neurale buisgebied over R5 / R6 met DNA (zoals zichtbaar door verspreiding van de snelle groene oplossing). Ten slotte is de plaatsing van de stimulatorelektrode zo dicht mogelijk bij het embryo important. Zorg er echter voor dat u direct contact met het embryo vermijdt, aangezien de huidige pulsen tissue kunnen beschadigen en beschadigen.
Wijzigingen in de techniek kunnen de levensvatbaarheid van embryo's en de expressie van plasmiden verbeteren. Ten eerste is het belangrijk om eieren binnen 24 uur van aankomst vast te zetten om de hoge levensvatbaarheid te behouden. Ten tweede, het venster van het ei moet stevig afgesloten zijn met tape als verlies van vloeistof ( dwz uitdroging) door een onvoldoende afdichting de embryo-dood toeneemt. Ten derde, om de visualisatie van de otocyster te optimaliseren, injecteer Indische inkt uit de rostrale kant van het embryo, gebruik de kleinste hoeveelheid inkt als mogelijk. Ten slotte kunnen stimulerende elektroden licht worden verplaatst tussen R5 / R6 gebieden om het elektrisch geladen gebied te verspreiden zonder de huidige stroom te verhogen.
Ondanks de bovenstaande suggesties, moet worden opgemerkt dat er beperkingen bestaan. Deze omvatten variabele tarieven van getransfecteerde neuronen, hun plaats binnen de hersenstamplank, enEmbryo-overleving. Hoewel transfectie-efficiëntie varieert tussen embryo's, hebben we eerder gerapporteerd bij de hier beschreven elektroporatieparameter ~ 5-10% NM / NL neuronen worden doorgaans getransfecteerd 8 . Zelfs bij hogere tarieven van neuronale transfectie vormen de voorbereiding van hersenstamweefsel voor in vitro patch-klem elektrofysiologie uitdagingen. Bijvoorbeeld, hersenstamelschijfjes zijn tussen 200 - 300 μm dik en soms zijn getransfecteerde neuronen te diep in het weefsel om adequaat te patcheren en functionele analyses uit te voeren. Tenslotte is embryo-overleving na succesvolle elektroporatie ook variabel, zij het niet zo veel als transfectiepercentage. Afhankelijk van de gewenste embryo-leeftijd voor experimenteel gebruik kan de variatie tussen de overleving tussen 80-20% raken, waarvan de laatste overeenkomt met de oudste embryo's (> E18).
Het belang van in ovo elektroporatie in kip is voor meerdere r voordelig ten opzichte van zoogdiermodelsystemen Easons 16 . Ten eerste is het relatief goedkoop en een uitstekend alternatief voor transgene of knockdown dieren. Ten tweede deelt de kip analoge kernen met zoogdieren die temporale informatie van geluid verwerken op het cellulaire, synaptische en neurale netwerkniveau 17 . Een voorbeeld van soortgelijke auditieve functie komt tussen AVCN / MSO bij zoogdieren en NM / NL van kippen, analoog auditieve hersenstamstructuren, respectievelijk 4 , 5 voor . In tegenstelling tot traditionele hoogfrequente hoorzitting onderzoeksmodellen, zoals muizen en ratten, gebruiken kippen echter cues die door zowel lage als hoogfrequente signalen worden geleverd, om auditieve informatie te coderen 18 . Ten slotte zijn kippen auditieve voorlopige dieren; Dat wil zeggen dat hun auditieve systeem bij de geboorte bijna functionele rijping is en de aanvang en verfijning van gehoorgang optreedt tijdens embryonale stadia zonder milieueffecten> 19 , 20 . In tegenstelling hiermee begint de aanvang van het gehoor voor typische zoogdier onderzoeksmodellen 10-13 dagen na de geboorte 21 , 23 .
In combinatie met biochemische, farmacologische en functionele analyses geven ovo genetische manipulaties een innovatieve aanpak om neuronspecifieke ontwikkeling van anatomische en fysiologische specialisaties te bestuderen, waardoor controle over goed gedefinieerde tijdsperioden bij auditieve hersenstamontwikkeling mogelijk is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij bedanken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria en Mevr. Ximena Optiz-Araya voor de eerste hulp bij het opzetten van protocollen en voor het leveren van plasmiden. Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
