Summary
I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.
Abstract
L'elettroporazione è un metodo che introduce geni di interesse in organismi biologicamente rilevanti come l'embrione di pollo. È da tempo stabilito che l'embrione di pollo è un modello di ricerca efficace per studiare le funzioni biologiche di base dello sviluppo del sistema uditivo. Più di recente, l'embrione di pollo è diventato particolarmente prezioso nello studio dell'espressione genica, della regolazione e della funzione associata all'udito. L' elettroporazione in ovo può essere impiegata per individuare le regioni del sistema cerebrale uditivo responsabili di funzioni uditive altamente specializzate. Queste regioni includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM) e nucleo laminaris (NL). Neuroni NM e NL derivano da precursori distinti di rombomeri 5 e 6 (R5 / R6). Qui, presentiamo l'elettroporazione in ovo in geni codificati da plasmidi per studiare proprietà correlate al gene in queste regioni. Mostriamo un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'espressione genica che favorisce il guadagno o la perdita di fenotipo funzionalees. Targetando regioni di progenitor neurali uditive associate a R5 / R6, mostriamo la transfezione plasmida in NM e NL. La regolazione temporale dell'espressione genica può essere ottenuta adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox). La tecnica di elettroporazione in ovo , insieme con i test funzionali biochimici, farmacologici e in vivo , fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo del neurone uditivo e dei fenomeni patofisiologici associati.
Introduction
La codifica neurale veloce del suono è essenziale per le normali funzioni uditive. Queste includono abilità di localizzazione sonora 1 , discorso in discriminazione di rumore 2 e comprensione di altri segnali di comunicazione rilevati dal comportamento 3 . I neuroni analoghi situati nel sistema cerebrale uditivo sia degli aviani che dei mammiferi sono altamente specializzati per la codifica neuronale veloce 4 . Questi includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM), il nucleo laminaris (NL) ei loro analoghi dei mammiferi, il nucleo cocleare anteroventrale (AVCN) e l'olio superiore mediale (MSO) rispettivamente 5 . Tuttavia, i meccanismi di sviluppo che regolano la codifica neuronale veloce sono poco compresi nel sistema cerebrale uditivo. Pertanto è vantaggioso studiare geni specifici responsabili della codifica veloce veloce al fine di comprendere meglio la loro espressione, regolazione e funzionalità in auLo sviluppo dei dati.
L'embrione di pollo in fase di sviluppo è uno strumento di ricerca efficace e consolidato per studiare le questioni biologiche fondamentali dello sviluppo del sistema uditivo 6 , 7 . Recenti progressi molecolari hanno affrontato queste questioni biologiche nell'embrione di pollo in fase di sviluppo esprimendo o abbattendo geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Indagare sul ruolo di regolamentazione di geni specifici è un progresso significativo nella comprensione delle patologie associate a deficit auditari. Qui presentiamo l'elettroporazione in ovo di geni codificati da plasmide nel tronco uditivo del pollo dove si verifica una veloce codifica neurale del suono 10 . Targetando regioni neuroni uditive uditive associate ai rombomeri 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostriamo il controllo spaziale della transfezione plasmida in NM e NL. Inoltre, mostriamo la regolazione temporale dell'espressione adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox) 8 .
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dai comitati di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell'Università Northwestern e sono stati eseguiti in conformità alle istruzioni nazionali di istruzione per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Gestione dell'uovo
- Acquistate uova fecondate da un venditore locale. Conservare le uova a 13 ° C in frigorifero per non più di 5 giorni prima dell'incubazione. La vitalità dell'embrione diminuisce significativamente dopo una settimana.
- Girare ogni uovo con il 70% di etanolo prima di impostare nell'incubatrice.
- Impostare 1-2 dozzine di uova sui loro lati in un incubatore con la temperatura impostata a 38 ° C a ~ 50% di umidità. Ciò garantisce rispettivamente il posizionamento appropriato dell'embrione per l'elettroporazione e la resistenza ottimale.
NOTA: Dopo 48-52 h di incubazione, le uova saranno a Hamburger-Hamilton (HH) stadio ~ 12-13 e pronte per l'elettroporazione.
2. Preparazione
- Plasmide Mixing
- Aggiungere 1 μl di 0,1% verde veloce (0,1% in 18 MΩ deionizzati e distillati H 2 O [ddH 2 O]) per ogni 7 μL di miscela DNA.
- Per la co-elettroporazione di plasmidi multipli, mescolare i plasmidi in un rapporto 1: 1. La concentrazione finale del DNA dovrebbe essere di 5-8 μg / μL.
- Riempire la pipetta di iniezione
- Tirare pipette su un estrattore a micropipetti. Riempire la pipetta con 1-2 μL di plasmidi utilizzando un ago 28G a siringa.
- Piegare la punta della pipetta a 10 - 20 μm utilizzando le pinze. Utilizzare un microscopio per aiutare a determinare la dimensione della punta pipetta rotta. Fissare la pipetta sul supporto della pipetta del picospritzer.
3. Windowing
NOTA: La procedura di finitura è stata pubblicata prima del 13 . Per ulteriori informazioni visive, vedere il riferimento 13.
- Pulire tutti gli strumenti e l'area di lavoro con il 70%etanolo.
- Prendere il numero desiderato di uova impostate dall'incubatrice (tra 6-10), lasciare a temperatura ambiente e nuovamente sostituire le uova con il 70% di etanolo. Le uova rimangono vitali per almeno 2 ore dopo la rimozione dell'incubatrice.
- Posizionare l'uovo in cima ad un illuminatore luminoso per identificare il posizionamento degli embrioni. Cerchi il centro della zona oscura ( cioè , embrione) con una matita.
- Usando un ago da 19G, pungere un buco nella fine punta dell'uovo.
- Punta un altro foro vicino al cerchio disegnato sul lato appuntito dell'uovo. Rimuovere un piccolo pezzo del guscio d'uovo esterno (circa 16 mm 2 ) con l'ago 19G e quindi rimuovere un piccolo pezzo di guscio d'uovo interno (circa 8 mm 2 ) con le pinze.
- Con una siringa da 3 ml dotata di ago da 19G, prelevare 1,5-2,5 ml di albumina dall'uovo attraverso il foro a punta. Assicurarsi di inclinare l'ago a 45 °.
- Coprire il foro a punta aperta con un piccolo pezzo di nastro (1 cm x 1 cm). Coprire il cerchio disegnato aD il secondo foro con nastro (2,5 cm x 4 cm).
- Con forbici curve (bordo di taglio = 2,5 cm), tagliare una finestra all'interno del cerchio. Forbici devono essere parallele al guscio d'uovo e il diametro della finestra dovrebbe essere inferiore a 2 cm.
4. Iniezione del plasmide
- Accendere il picospritzer. Impostare la pressione a 18 psi e la durata a 5 μs. Accendere il serbatoio dell'aria e la lampada per il microscopio di dissezione.
- Preparare una soluzione di 30 ml di una diluizione 1:10 di inchiostro indiano acquistato in negozio mescolato in soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). Conservare a 4 ° C. L'iniezione dell'inchiostro indiano è un passo importante per ottenere una migliore visualizzazione dell'embrione di pollo.
- Riempire una siringa da 1 ml con la soluzione di inchiostro indiana diluita. Fissare un ago 27G ed espellere tutte le bolle presenti nella siringa.
- Inserisci l'ago appena sotto la membrana di tuorlo ~ 2 - 3 mm dall'embrione e inietta ~ 0,2 ml di inchiostro indiano delicatamente sotto l'embrione. FareNon iniettare più di 0,5 ml dell'inchiostro indiano in quanto potrebbe diminuire la sopravvivenza dell'embrione.
- Posizionare l'uovo finestra su un supporto di uova sotto il microscopio di dissezione. Utilizzate l'ingrandimento più elevato per ottenere una migliore visualizzazione del sito di iniezione del plasmide.
- Usando le pinze, rimuovere la membrana nell'area di iniezione. Le regioni di interesse cerebrale uditivo di interesse (NM, NL) derivano dai Rhombomers 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 si trovano adiacenti agli otocisti (una struttura embrionale in vertebrati che si sviluppa nell'orecchio interno) che servono da punto di riferimento per le iniezioni di plasmidi R5 / R6.
- Abbassare la pipetta riempita di DNA nel tubo neurale sovrastante la regione R5 / R6 e tra gli otociti usando il micromanipolatore. Uno schema di posizionamento ideale è mostrato in Figura 1A .
- Applicare la pressione dell'aria (18 psi, 5 μs di durata) dal picospritzer per espellere il DNA nel tubo neurale.
5. Elettroporazione
- Accendere tStimolatore corrente / tensione.
- Riempire una siringa da 3 ml con PBS e fissare il filtro della siringa. Aggiungere 1-2 gocce di PBS sull'embrione.
- Abbassare l'elettrodo bipolare sull'embrione utilizzando il micromanipolatore con l'elettrodo negativo sopra il sito di iniezione (mediale) e l'elettrodo positivo lateralmente all'R5 / R6 ( Figura 1A ). Evitare il contatto diretto con l'embrione. Usare elettrodi bipolari in cui il materiale dell'elettrodo è iridio di platino. Regolare la distanza tra le punte a 0,5 mm con le pinze.
- Usando uno stimolatore di corrente / tensione, impulsi 20 volte a 50 V per 1 ms a intervalli di 1 s.
- Dopo l'elettroporazione, aggiungere una goccia di PBS sopra l'area esposta. Rimuovere delicatamente l'elettrodo e pulirlo con un tessuto di laboratorio e il 70% di etanolo. Chiudere la finestra che espone l'embrione con nastro.
- Etichetta guscio d'uovo con il tipo di plasmide iniettato e la data di apertura.
- Riporre le uova in incubatore con il lato rivolto verso l'alto. Incubare a 38 ° C con 50% Di umidità fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata.
- Se un vettore tet-on è elettroporato per il controllo temporale dell'espressione genica, applicare Doxycycline (Dox) ogni 24 h per indurre l'espressione del gene (vedere Sezione 6).
6. Sistema Tet-on per il controllo temporale dell'espressione di geni
- Utilizzare i seguenti plasmidi:
PCAGGS-T2TP: un plasmide esprimente di transposasi.
PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plasmide che esprime in modo stabile la proteina legante Dox.
PT2K-BI-TRE-EGFP: un plasmide che contiene un promotore bidirezionale di tet-on (TRE) -dirivante espressione del reporter di EGFP e di un secondo gene di interesse.
NOTA: i tre plasmidi di cui sopra devono essere co-elettroporati in un rapporto 1: 1: 1. - Preparazione della soluzione di base:
- Sciogliere Dox in PBS sterile per produrre una soluzione di stock di 1 mg / ml. Conservare a -20 ° C.
- Applicazione Dox:
- Per indurre l'espressioneN del gene di interesse durante alcune fasi di sviluppo, applicare Dox ogni 24 h.
- Quando si applica Dox, prelevare l'uovo, aprire la finestra, pipettare 50 μL Dox sulla membrana chorioallointoica, chiudere la finestra e mettere l'uovo in incubatore.
7. Preparazione dell'area di dissection per le fette del Brainstem
NOTA: Le seguenti sezioni (7 - 9) e le procedure sono state pubblicate prima del 14 . Consultare questi riferimenti per ulteriori informazioni visive.
- Preparare una soluzione agar (40 mg / mL agarosio, ossia 4% in ddH2O). Versare la soluzione agarica in un piatto di Petri e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. Conservare la piastra agar coperta in frigorifero per un uso futuro durante la tranciatura del tessuto cerebrale.
- Fluido spinale cerebrale artificiale (ACSF) con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,2-7,4 e osmolarità: 295-310 mOsm / L).
- Pulire l'area di lavoro e vibratome con il 70% EtOH e sciacquare la lama con acqua distillata.
- Mettere un rilievo di assorbimento del liquido pulito sull'area di lavoro con strumenti appropriati di dissezione.
- Prendete il piatto agar fuori dal frigorifero, tagliate un piccolo cubo di agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Incollare il blocco agar allo stadio di una camera di taglio vibratome utilizzando superglue commercialmente disponibili.
8. Isolamento del Brainstem auditory del pollo
- Apri l'uovo al sito della finestra con tappa. Puntare il sacchetto di membrana con un bisturi e togliere la testa dell'embrione di pollo.
- Decapitate il pollo con forbici affilate.
- Posizionare la punta della lama del rasoio leggermente posteriore agli occhi. Incise attraverso il cranio alla linea mediana rostral-caudale. Applicare una leggera pressione a seconda dell'età dell'embrione. Gli embrioni più anziani richiedono maggiore pressione.
- Spingere delicatamente la pelle e le piume per esporre il cranio e verificare la taglia della linea mediana.
- Applicare sPressione del tronco, tagliare la porzione rostrale del cranio con una lama di rasoio. Immediatamente posizionare la lama posteriore agli occhi e tagliare tutto il cranio e il tessuto cerebrale.
- Fare incisioni midline-to-lateral con forbici nella zona caudale del cranio, leggermente anteriori ai muscoli del collo su entrambi i lati della testa. Esponete il cervello e il cervelletto tirando via il cranio e il tessuto in eccesso.
- Tagliare il tessuto attaccato al tronco cerebrale con forbici e rimuovere il tronco cerebrale, che si libera liberamente dal cranio.
9. Preparazione delle fette del Brainstem per l'elettrofisiologia o l'imaging in vivo
- Infilare il cervello attraverso la tecnica ottica.
- Rimuovere il cervelletto tagliando peduncle con forbici, esponendo il pavimento del quarto ventricolo.
- Usando le pinzette, rimuovete i tessuti membranosi e i vasi sanguigni dalla superficie cerebrale.
- Per bloccare il sistema cerebrale, fare un taglio orizzontale all'estremità più rostrale del pavimento dei quattroVentricolo, appena caudale alla corteccia. Fare tagli laterali perpendicolari attraverso l'ottica tecta per isolare il sistema cerebrale.
- Posizionare una piccola quantità di colla super sullo stadio vibrativo direttamente di fronte al blocco agar.
- Sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale usando le pinzette e posizionarlo sulla colla super con il lato rostralo verso il basso e il lato dorsale verso la lama vibratome. Rimuovere la colla in eccesso con un tessuto di laboratorio o carta filtrante.
- Versare l'ACSF ossigenato nella fase vibratome. Impostare la lama del vibratore ad un angolo di 20-22 °. Avviare il vibratore ad oscillazione massima-ampiezza. Spostare il palco verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto sia parallela alla lama.
- Spostare rapidamente la lama verso il tessuto cerebrale. Rallenta lentamente la lama prima del contatto della lama con il tessuto.
- Togliere il tessuto con la velocità di avanzamento più lenta possibile. Una volta che la lama attraversa l'intera sezione del tessuto coronale, rimuovere delicatamente la fetta usando una pipetta di trasferimento/ Li>
- Abbassare lo stadio 200-300 μm e tagliare di nuovo. Ripetere fino a quando non saranno visibili punti di riferimento anatomici dei nuclei uditivi, ad esempio la distinta regione nervosa dorsale / ventrale della NL e la posizione media di NM rispetto alla NL.
- Conservare con attenzione le fette in ACFS. Ciò può essere fatto a temperatura ambiente (22 ° C) o vicino a condizioni fisiologiche (~ 41 ° C) usando un bagno d'acqua caldo. Notare l'ordine di affettatura. La prima fetta corrisponde alla regione più caudale del tessuto e l'ultima fetta corrisponde alla regione più rostrale. Questo rappresenta approssimativamente l'organizzazione tonotopica del sistema cerebrale uditivo, da regioni di codifica a bassa frequenza ad alta frequenza.
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Representative Results
Qui mostriamo che l'elettroporazione in ovo consente l'espressione genica in un sistema biologico normalmente sviluppato. I geni codificati con plasmide vengono iniettati focalamente nel tubo neurale sovrastante R5 / R6. Un esempio schematico delle posizioni dell'elettrodo e delle pipette relative a importanti marcatori anatomici è mostrato nella figura 1A . La posizione corretta dell'iniezione del plasmide è confermata 24 h dopo l'elettroporazione e mostrata in Figura 1B . L'iniezione mirata di plasmidi nel tubo neurale sovrastante R5 / R6 consente di esprimere in regioni specifiche del sistema cerebrale uditivo, vale a dire NM e NL (11) . La figura 1C mostra una fetta in vitro del ceppo cerebrale da un embrione E12 sotto l'illuminazione differenziale di differenza di interferenza (DIC). Sono evidenziate le regioni auditive di interesse. Con l'illuminazione fluorescente ( Figura 1C 1 ), YFP che esprime i neuroni all'interno di NM e NL sono visibili. La Figura 1D mostra l'illuminazione DIC per un embrione E18 ad alta ingrandimento. I classici corpi cellulari adendriti di numerosi neuroni NM sono evidenti. Con l'illuminazione fluorescente ( Figura 1D 1 ), un YFP che esprime il neurone NM è chiaramente visibile mentre altri neuroni transfettati sono fuori dal piano focale. Poiché solo una frazione di neuroni nella regione NM mirata viene transfettata, consente ad altri neuroni all'interno dello stesso nucleo di servire come controlli interni durante gli esperimenti elettrofisiologici a doppio patch-clamp. I transgeni possono anche essere regolati temporalmente mediante l'applicazione di farmaci, consentendo l'espressione e la manipolazione del gene a precisi tempi di sviluppo 8 .
Figura 1: In questa elettroporazione nel pollo AuBrainstem della dieta. ( A ) Schema di elettroporazione nell'hindbrain degli embrioni di pollo di fase HH. La pipetta d'iniezione è riempita con DNA plasmidico e colorante verde veloce per la visualizzazione dell'indietro iniettato (romboni 5/6 [R5 / R6]). In questo studio è stato utilizzato un plasmide che ha coespresso un gene di interesse e il giornalista di proteina giallo-fluorescente (YFP). Gli embrioni elettroporati vengono ulteriormente incubati fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata. ( B ) Embrione di embrioni di embrioni di giorno 4 (E) che mostrano luogo di espressione YFP rispetto all'occhio sinistro (freccia, E) e sinistra otocyst (freccia, O). La linea bianca tratteggiata rappresenta il confine dorsale del cervello e del sistema cerebrale. Barra di scala = 480 μm. ( C e C 1 ) Fetta cerebrale (300 μm di spessore) da un pollo E12 sotto contrasto di interferenza differenziale (DIC, C ) e fluorescenza (YFP, C 1 ) illuminatio n. Le linee bianche tratteggiate rappresentano i confini del nucleo magnocellularis (NM) e del nucleo laminaris (NL). Nota, la fetta del cerebrale mostra solo un lato del tessuto. Le frecce bianche rappresentano la fessura della linea mediana della fetta del cerebrale. Le frecce bianche mostrano YFP che esprimono regioni di NM e NL. V = ventrale, M = mediale. Barra di scala = 240 μm. ( D e D 1 ) Elevata ingrandimento (obiettivo di immersione in acqua 80X) di una fetta di cerebrale di embryo di pollo E18 contenente NM. I classici corpi cellulari adendriti 15 sono chiaramente visibili sotto l'illuminazione DIC (freccia verso l'alto, D ). Con l'illuminazione fluorescente per la stessa fetta, un neurone NM transfected identificato dalla fluorescenza YFP è chiaramente visibile (freccia verso l'alto, D 1 ). Asterischi = YFP che esprime NM neuroni appena al di sotto del piano focale. Barra di scala = 30 μm.Large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L' elettroporazione in ovo è un metodo per esprimere o abbattere i geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Nell'embrione di pollo, è un metodo innovativo per esprimere geni codificati da plasmide in diverse regioni del sistema cerebrale uditivo 8 . Per garantire un'espressione ottimale, sono necessari diversi passaggi critici. In primo luogo, solo iniettare gli embrioni le cui otocysts sono chiaramente visibili. Se gli otocisti non sono visibili, l'embrione non è nella fase corretta di sviluppo per l'elettroporazione. In secondo luogo, piccoli suggerimenti per pipette facilitano la penetrazione del tubo neurale e provocano un minor danno al tessuto. Tuttavia, la punta rotta dovrebbe essere abbastanza grande da espellere il DNA. In terzo luogo, riempire l'intera regione del tubo neurale sovrastante R5 / R6 con il DNA (come viene visualizzato dalla diffusione della soluzione verde veloce). Infine, il posizionamento dell'elettrodo dello stimolatore più vicino all'embrione possibile è important. Tuttavia, assicurarsi di evitare il contatto diretto con l'embrione, poiché gli impulsi attuali possono scorcere e danneggiare i tessuti.
Le modifiche alla tecnica possono contribuire a migliorare la vitalità degli embrioni e l'espressione dei plasmidi. In primo luogo, è importante impostare le uova entro 24 ore dall'arrivo per mantenere un'elevata vitalità. In secondo luogo, la finestra dell'uovo deve essere strettamente sigillata con nastro, poiché la perdita di liquido ( ossia la disidratazione) attraverso una tenuta inadeguata aumenta la morte dell'embrione. In terzo luogo, per ottimizzare la visualizzazione della otocyst, iniettare l'inchiostro indiano dal lato rostralo dell'embrione, utilizzando la minima quantità di inchiostro possibile. Infine, gli elettrodi stimolanti possono essere spostati leggermente tra le regioni R5 / R6 per diffondere l'area elettricamente caricata senza aumentare la forza corrente.
Nonostante i suggerimenti di cui sopra, va notato che esistono limitazioni. Questi includono tassi variabili di neuroni transfettati, la loro posizione all'interno della fetta del tronco cerebrale, eSopravvivenza embrionale. Sebbene l'efficienza della trasfezione varia da embrioni, abbiamo precedentemente riportato con il parametro di elettroporazione descritto qui ~ 5-10% dei neuroni NM / NL sono costantemente trasfusi 8 . Anche a tassi più elevati di trasfezione neuronale, la preparazione del tessuto cerebrale per l'elettrofisiologia in vitro di patch-clamp pone sfide. Ad esempio, le fette del tessuto cerebrale sono tra 200 e 300 μm di spessore e, occasionalmente, i neuroni transfettati sono troppo profondi all'interno del tessuto per adeguare patch e eseguire test funzionali. Infine, l'elettroporazione successiva alla sopravvivenza all'embrione è anche variabile, seppure non più della velocità di trasfezione. A seconda dell'età embrionale desiderata per l'uso sperimentale, la variabilità di sopravvivenza può esplodere tra l'80 e il 20%, il secondo dei quali corrisponde agli embrioni più vecchi (> E18).
Il significato dell'elettroporazione in ovo nel pollo è vantaggioso rispetto ai sistemi di modelli mammiferi per parecchi r Stagioni 16 . In primo luogo, è relativamente poco costoso e un'ottima alternativa agli animali transgenici o ad abbattere. In secondo luogo, i polli condividono nuclei analoghi con i mammiferi che elaborano informazioni temporali del suono a livello cellulare, sinaptico e rete neurale 17 . Un esempio di funzione uditiva simile si verifica tra AVCN / MSO nei mammiferi e NM / NL di polli, analoghe strutture del sistema cerebrale uditivo, rispettivamente 4 , 5 . Tuttavia, a differenza dei modelli tradizionali di ricerca mammiferi uditivi ad alta frequenza, quali topi e ratti, i polli utilizzano segnali forniti da segnali a bassa e alta frequenza per codificare le informazioni uditive 18 . Infine, i polli sono animali precoci uditivi; Cioè il loro sistema uditivo è vicino alla maturazione funzionale alla nascita e l'insorgenza e l'affinamento dell'udito si verifica durante stadi embrionali senza influenze ambientali> 19 , 20 . Al contrario, l'inizio dell'udito per modelli tipici di ricerca dei mammiferi inizia 10-13 giorni dopo la nascita 21 , 23 .
In combinazione con i dosaggi biochimici, farmacologici e funzionali, le manipolazioni genetiche in ovo fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo specifico del neurone delle specializzazioni anatomiche e fisiologiche, permettendo il controllo di periodi di tempo ben definiti nello sviluppo del sistema cerebrale uditivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i dottori. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e la signora Ximena Optiz-Araya per l'assistenza iniziale con il set-up del protocollo e per la fornitura di plasmidi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NIH / NIDCD DC013841 (JTS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized white leghorn chicken eggs | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, single or dual channel |
| Current/voltage stimulator | Grass Technologies | SD9 | SD9 |
| Microfil syringe needles | World Precision Instruments | MF28G67-5 | 28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5) |
| Electrode holder | Warner Instruments | 64-1280 | MP Series: Non-Electrical Pressure Applications |
| Stimulating microelectrode | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Air tank/regulator | NU Laboratory Services | Air dry 300 CF | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Clear plastic tape | Scotch | 191 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Egg refrigerator | Vissani Wine Refrigerator | 13.3 - 16.1 °C (56-61° F) | |
| Incubator | Hova-Bator | 38 ° C (100 ° F), ~50% humidity | |
| Dissection scope | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X |
| Cold-light source | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 LED |
| Micromanipulators | Narishige Japan | Model: MM-3 | 2 Micromanipulators |
| Capillary tubes | Sutter Instrument | BF150-86-10 | Thick-walled borosilicate (dimensions) |
| Syringes | 1 mL, 3 mL | ||
| Needles | BD Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Forceps | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Egg holder | Custom Made | Clay base works as well | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | |
| Syringe filter | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0.22 μm |
References
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
- Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
- Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
- Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
- Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
- Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
- Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
- Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
- Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
- Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
- Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
- Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
- Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
- Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).
